TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN.DOC

TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN

PhÇn 1: Tæng quan1.1 Tæng quan vÒ Tobramycin

phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thờng dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính Hiện nay, tobramycin đợc dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày nh trớc đây Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu

aeruginosa ở ngời giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều

dài hơn 24 giờ Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6]

1.1.5 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí Thuốc không

có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí

Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận

Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin

Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11]

1.1.6 Chỉ định

Đợc chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân cha rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-)

Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam

Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -

Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc

benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ [2]

Dạng thuốc hít qua đờng miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P

aeruginosa đờng hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11]

pH sau khi tiệt trùng : 7,8 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15]

pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử

Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch

đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml và 40 IU/ml

- Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phơng pháp hoạt lực kháng sinh

- DĐVN III

1.2.1.3 Phơng pháp 3:[14], [20]

- Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phơng pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14

- Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633

- Môi trờng nuôi cấy : Môi trờng đặc

- Dung dịch chuẩn

Cân chính xác một lợng tobramycin chuẩn, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính

xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt

độ từ 5οC đến 15οC và sử dụng trong vòng 30 ngày Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ

8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực)

- Dung dich thử:

Cân chính xác một lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực)

1.2.2 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ VIS

UV-1.2.2.1 Phơng pháp 1: [4]

Cân một lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nớc cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO4 Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 400C trong 60 phút

Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin

Mẫu trắng tiến hành nh mẫu thử nhng không có tobramycin

Sau khi đun cách thuỷ ở 400C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bớc sóng 425 nm, cuvet dày 1cm

1.2.2.2 Phơng pháp 2: [19]

Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3 Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm Định luật Lambert-Beer đợc áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml

1.2.3 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC

1.2.2.1 Phơng pháp 1 [14]

- Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8àm).

- Nhiệt độ cột: 55 0C

- Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nớc đã loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã đợc chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric

- Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%

- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút.

- Detector UV: 230 nm

- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 àg/ml trong nớc

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 700C

Pha động A (%)

Pha động B (%)

- Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat

và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm

- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100

ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút Thêm 1,5 ml dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4 lắc đều

- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml nớc Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ

1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005)

1.2.2.7 Phơng pháp 7 [9]

• Dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình

định mức 20,0 ml Hòa tan và pha loãng bằng nớc vừa đủ đến vạch Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml Thêm 0,5 ml thuốc

thử X, đem đun cách thủy ở 80 0C trong 60 phút Thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 àm.

• Dung dịch chuẩn (đối chiếu)

Tiến hành tơng tự nh dung dịch thử nhng thay tobramycin nguyên liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu)

- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm

* Nhận xét: Qua các phơng pháp định lợng nêu trên, chúng tôi nhận thấy:

- Định lợng bằng phơng pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết

bị phức tạp nhng có nhợc điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự

có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao

- Định lợng bằng phơng pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng

và có thể áp dụng định lợng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nớc Tuy nhiên, nhợc điểm của phơng pháp là: Tính đặc hiệu cha cao (sự có mặt của chất khác

có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến nh benzalkonium clorid, một chất bảo quản hay dùng, sẽ ảnh hởng kết quả định lợng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất

- Định lợng bằng phơng pháp HPLC :

 u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất

 Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền vì detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất

Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV Nhng với các hợp chất hấp thụ UV yếu

nh tobramycin thì thờng phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc biệt đắt tiền

Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc thử tạo dẫn xuất nh các phơng pháp hiện nay với hi vọng có thể đa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng các sản phẩm chứa tobramycin

1.3 Tổng quan về phơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3.1 Nguyên tắc

Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và

định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha

động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng đợc hiển thị trên màn hình hoặc đa ra máy in [8]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột

Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách đợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc

đồ [8], [11]

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm

6 bộ phận chính sau:

1.3.3.1 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 -

400 bar)

1.3.3.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 àm ) và đuổi khí hòa tan

1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu

Để đa mẫu phân tích vào cột

Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động

Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0,45àm trớc khi tiêm

Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách Nếu

sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm Ví dụ dung môi có tính chất acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm

1.3.3.5 Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay sử dụng là detector hấp thụ

UV - VIS

Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt

động của phơng pháp đo quang phổ hấp thụ Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa

1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết quả

Có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu dới dạng pic [8], [14]

động Bơm

Detector Bộ phận tự ghi

Van tiêm mẫu

t

Wb2

0.5-2 W 0.5-1

W

b1 W R2

R2 t' t'R1

R1 t

Thời gian lu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số

đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

k

0

R 0

0 R 0

R = − = −

=

t

t '

k '

k

0 1 R

0 2 R 1

Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:

− α

= +

−

= +

−

1 k ' w

w

t

t w

w

t t

B

B A

2 / 1 B 2 / 1

A , R B , R A

B

A , R B ,

4 N 18

, 1

AF = w1 / 20

[8], [14]

Trong đó:

W1/20: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lợng, yêu cầu: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22]

2

hay N=5,54   w t   

B 2 / 1 R

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.3.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18]

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Nó là một chất rắn xốp có kích thớc hạt rất nhỏ, đờng kính cỡ hạt từ 3 - 10 àm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m2/g

Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:

• Phải trơ và bền vững trong môi trờng HPLC

• Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định

* R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl đợc chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl) Do các nhóm OH thân nớc đợc thay bằng các gốc R kỵ nớc nên bề mặt trở nên ít

phân cực Silica đã alkyl hóa đợc sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion.

1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18]

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu

tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp Pha động có thể là nớc, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

Pha động trong HPLC ảnh hởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc

ký nh độ chọn lọc α, thời gian lu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải RS , độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

Yêu cầu của pha động:

• Phải trơ với pha tĩnh

• Hòa tan đợc chất cần phân tích

• Bền vững theo thời gian

• Có độ tinh khiết cao

• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

• Phù hợp với detector

• Có tính kinh tế và đảm bảo môi trờng

Trong sắc ký pha thuận, pha động thờng là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nớc) nh: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform Các pha động này th-ờng đợc bão hoà

Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực nh: nớc, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lợng nhỏ acid hay base hữu cơ

Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:

• Bản chất của dung môi để chạy pha động

• Thành phần của các chất trong pha động

• pH của pha động

• Tốc độ dòng của pha động

1.3.5.3 Chọn đệm pH

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan

có tính acid hay base thờng phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký

Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký [12], [18]

1.3.5.4 Tốc độ dòng

Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn

để quá trình tách tốt hơn là tốc độ dòng [12], [18]

1.3.6 Cách đánh giá pic

* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tơng ứng với tổng lợng

chất đó Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân điện

tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %) Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả pic có đờng nền bị trôi Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc nhận ra chính xác và cho và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao

* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic

và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lợng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất

Các phơng pháp định lợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Một số phơng pháp

định lợng hay áp dụng trong HPLC:

 Phơng pháp chuẩn ngoại (external standard method)

Đây là phơng pháp định lợng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều đợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu đợc từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ

 Phơng pháp chuẩn nội (internal standard method)

Là phơng pháp cho thêm những lợng giống nhau của chất chuẩn thứ hai

có thời gian lu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và

mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội

 Phơng pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation)

+ Nguyên tắc: Hàm lợng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần đợc tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ

Phơng pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều đợc rửa giải và

đợc phát hiện, và tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector nh nhau

+ Áp dụng: ít dùng để định lợng, chỉ dùng trong xác định hàm ợng tạp chất khi coi đáp ứng của các chất là nh nhau [12], [18]