CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ SINH pot

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.1 Khái niệm cơng nghệ sinh học Có nhiều định nghĩa công nghệ sinh học (Biotechnology), tùy theo tác giả khác nhau, tất thống khái niệm sau đây: Công nghệ sinh học sản xuất sản phẩm quy mô công nghiệp, nhân tố tham gia trực tiếp định tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật) Mỗi tế bào sống thể sinh vật hoạt động lĩnh vực sản xuất xem lò phản ứng nhỏ Vào năm 1980, công nghệ sinh học chuyển sang giai đoạn là giai đoạn công nghệ sinh học đại với việc sử dụng thành tựu kỹ thuật gen, lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học tế bào biến đổi di truyền Cơ sở sinh học áp dụng bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, ngun lý kỹ thuật máy tính Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học cách tổng quát nhất: - Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ sử dụng phận hay tế bào riêng rẽ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm chúng - Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học công nghệ chuyển hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm chức gen Sự khác biệt rõ rệt hai định nghĩa thuộc đối tượng tác động công nghệ sinh học: UNESCO xem quan, phận, tế bào chức riêng rẽ sinh vật đối tượng, Trường Luật Stanford lại coi gen đối tượng tác động cơng nghệ Từ định nghĩa trên, phân biệt hai nhóm cơng nghệ sinh học là: - Công nghệ sinh học truyền thống (Traditional Biotechnology) Bao gồm: + Thực phẩm lên men truyền thống (Food of Traditional Fermentations) + Công nghệ lên men vi sinh vật (Microbial Fermentation Technology) + Sản xuất phân bón thuốc trừ sâu vi sinh vật (Production of Microbial Fertilizer and Pesticide) + Sản xuất sinh khối giàu protein (Protein-rich Biomass Production) + Nhân giống vơ tính ni cấy mơ tế bào thực vật (Plant Micropropagation) + Thụ tinh nhân tạo (In vitro Fertilization) - Công nghệ sinh học đại (Modern Biotechnology) Bao gồm: + Nghiên cứu genome (Genomics) + Nghiên cứu proteome (Proteomics) + Thực vật động vật chuyển gen (Transgenic Animal and Plant) + Động vật nhân (Animal Cloning) + Chip gen (DNA chip) + Liệu pháp tế bào gen (Gen and Cell Therapy) + Công nghệ sinh học nano (Nanobiotechnology) + Tin sinh học (Bioinformatics) + Hoạt chất sinh học (Bioactive Compounds) + Protein biệt dược (Therapeutic Protein) Sự phân loại công nghệ sinh học dựa vào tác nhân sinh học tham gia vào q trình cơng nghệ, chia thành nhóm sau: - Cơng nghệ sinh học thực vật (Plant Biotechnology) - Công nghệ sinh học động vật (Animal Biotechnology) - Công nghệ sinh học vi sinh vật (Microbial Biotechnology) - Công nghệ sinh học enzyme hay công nghệ enzyme (Enzyme Biotechnology) Gần đây, tác nhân sinh học tế bào cịn hình thành khái niệm công nghệ protein (Protein Engineering) công nghệ gen (Gen Engineering) Công nghệ Protein công nghệ gen xun suốt trở thành cơng nghệ chìa khóa nằm công nghệ sinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật công nghệ sinh học vi sinh vật Nhờ kỹ thuật đọc trình tự gen kỹ thuật DNA tái tổ hợp, công nghệ gen đạt thành tựu to lớn mang tính định, mở giai đoạn phát triển Đó nghiên cứu tồn genome nhiều sinh vật, đáng ý việc giải mã genome người lúa Đó việc hình thành phương hướng nghiên cứu, ứng dụng kinh doanh sinh vật chuyển gen (Gentically Modified Organism-GMO) thực phẩm chuyển gen (Gentically Modified Food-GMF) Cơng nghệ protein có tiềm ứng dụng lớn việc sản xuất protein tái tổ hợp (Recombinant Protein) dùng làm dược phẩm điều trị bệnh hiểm nghèo như: interferon, interleukin, insulin Mặt khác, tùy vào đối tượng phục vụ công nghệ sinh học, phân lĩnh vực công nghệ sinh học khác như: - Công nghệ sinh học nông nghiệp (Biotechnology in Agriculture) - Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm (Biotecnology in Food Processing) - Công nghệ sinh học y dược (Biotechnology in Medicine-Pharmaceutics) - Công nghệ sinh học môi trường (Environmental Biotechnology) - Công nghệ sinh học vật liệu (Material Biotechnology) - Công nghệ sinh học hóa học (Biotechnology in Chemical Production) - Công nghệ sinh học lượng (Biotechnology in Energy Production) 1.2 Lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học Bốn lĩnh vực công nghệ sinh học quan tâm nhiều là: Cơng nghệ sinh học nông nghiệp Là lĩnh vực công nghệ sinh học có nhiều đóng góp việc cải thiện giống trồng, xây dựng kỹ thuật canh tác mới, nghiên cứu trình cố định đạm không thuộc họ đậu - Công nghệ sinh học cải thiện nhân nhanh giống trồng Lĩnh vực có bốn ứng dụng chính: Ứng dụng kỹ thuật chọn dòng tế bào biến dị soma, nhân giống ống nghiệm (nhân giống in vitro), lai vơ tính hay cịn gọi dung hợp tế bào trần, kỹ thuật sản xuất đơn bội (1n) - Cố định đạm biến nạp gen nif Dùng kỹ thuật gen tách gen nif từ thể cố định đạm chuyển sang trồng quan trọng lúa, ngơ mơ hình lý tưởng nhà tạo giống - Các phương pháp canh tác mới, bao gồm: Phương pháp màng dinh dưỡng, hệ thống thủy canh - Công nghệ sinh học chăn nuôi, bao gồm: Kỹ thuật cấy chuyển phơi, tạo chế phẩm phịng tránh bệnh cho động vật Công nghệ sinh học y dược Nhiều cơng trình nghiên cứu công nghệ sinh học ứng dụng thành công y dược, đặc biệt sản xuất thuốc chuẩn đoán bệnh Trong năm qua, lĩnh vực ứng dụng công nghệ di truyền mạnh y tế nghành sản xuất thuốc kháng sinh, vác xin, kháng thể đơn dịng protein có hoạt tính sinh học Hiện nay, nghiên cứu nhằm tìm kiếm chất kháng sinh tăng mạnh tượng vi sinh vật kháng lại tác dụng kháng sinh ngày nhiều Phạm vi ứng dụng kháng thể đơn dòng ngành y tế ngày tăng phân tích miễn dịch, định vị khối u, phát số protein có liên quan đến hình thành khối u, xác định có mặt loại vi khuẩn khác nhau, giúp cho bác sĩ xác định bệnh cách nhanh chóng xác Kháng thể đơn dịng tập hợp phân tử kháng thể đồng mặt cấu trúc tính chất Kháng thể đơn dịng tạo cách cho lai tế bào lympho hệ miễn dịch động vật người với tế bào ung thư Một số thể lai có khả tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Chọn thể lai nhân lên sản xuất kháng thể đơn dịng Các tế bào lai có khả tăng sinh vĩnh viễn môi trường nuôi cấy - tính chất nhận từ tế bào ung thư Nhờ công nghệ sử dụng DNA tái tổ hợp mà người ta sản xuất số protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh insulin chữa bệnh tiểu đường, interferon chữa bệnh ung thư, hormon tăng trưởng cho người Bản chất công nghệ làm thay đổi máy di truyền tế bào cách đưa gen mã hóa cho protein đặc hiệu bắt hoạt động để tạo lượng lớn loại protein mà người cần Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm Công nghệ lên men lĩnh vực quan trọng sản xuất thực phẩm Việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men tốt, đem lại hiệu cao cần thiết Các nghiên cứu sử dụng công nghệ di truyền phục vụ cho công nghệ lên men chủ yếu vào hai hướng là: - Phân tích di truyền loại vi sinh vật sử dụng trình lên men, xác định gen mã hóa cho tính trạng mong muốn nhằm tạo suất chất lượng sản phẩm lên men - Tạo vi sinh vật chuyển gen phục vụ cho qui trình lên men Ví dụ sản xuất rượu, ngày người ta dùng chủng vi sinh vật có khả tạo rượu cao cho hương vị tốt Phần lớn chủng nghiên cứu, tuyển chọn, lai tạo công nghệ di truyền Để sản xuất rượu vang, trước đây, người ta phải dùng hai loại vi sinh vật S Cerevisiae để tạo hàm lượng rượu dịch lên men sau đó, sử dụng Leuconostos lên men phụ trình tàng trữ, nhằm nâng cao chất lượng rượu Ngày nay, người ta tiến tới dùng chủng vi sinh vật chuyển gen để thực hai trình Đối với sản phẩm lên men sữa phomat sữa chua, trước kia, người ta thường sử dụng vi sinh vật tự nhiên có mặt sữa để lên men, vậy, người ta khó lịng kiểm sốt q trình lên men hiệu khơng cao Ngày người ta tạo chủng với tính chất xác định điều khiển trình lên men theo định hướng mong muốn Bằng công nghệ vi sinh vật, công nghệ gen người ta tạo chủng vi sinh vật có khả tổng hợp enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt để sản xuất enzyme Enzyme λ-amylase chịu nhiệt sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bột Trước đây, công nghiệp thực phẩm nghiên cứu công nghệ sinh học sử dụng chủ yếu để hoàn thiện quy trình cơng nghệ lên men truyền thống Cịn nay, nghiên cứu công nghệ sinh học chủ yếu liên quan đến việc tạo chủng có suất sinh học cao việc áp dụng chúng vào công nghệ lên men đại, sản xuất chế biến loại sản phẩm sau: - Công nghiệp sản xuất sữa - Công nghệ sinh học chế biến tinh bột - Sản xuất nước uống lên men, như: bia, rượu nho, rượu chưng cất - Sản phẩm chứa protein, như: protein vi khuẩn đơn bào, protein từ tảo lam cố định đạm cyanobacteria vi tảo - Sản xuất chất tăng hương vị thực phẩm, như: citric acid, amino acid, vitamin màu thực phẩm, chất tăng vị thực phẩm, keo thực phẩm - Chế biến rau Công nghệ sinh học bảo vệ môi trường Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, loài người phải bắt đầu tìm cách giải vấn đề nhiễm mơi trường biện pháp khác Trong đó, biện pháp công nghệ sinh học ngày tỏ ưu việt so với biện pháp khác Nói chung, vấn đề bảo vệ môi trường giải theo ba hướng sau: - Phân hủy độc chất vô hữu - Phục hồi chu trình trao đổi chất C, N, P S tự nhiên - Thu nhận sản phẩm có giá trị dạng nhiên liệu hợp chất hữu - Xử lý chất thải, như: xử lý sinh học hiếu khí, xử lý lên men phân hủy yếm khí - Thu nhận chất có ích từ lên men yếm khí, như: xử lý dạng nước thải khác tái sử dụng chúng để phục vụ cho ngành công nghiệp nặng - Xử lý chất thải công nghiệp, như: xử lý chất thải công nghiệp chế biến sữa, xử lý chất thải công nghiệp dệt 1.3 Lược sử phát triển cơng nghệ sinh học Lịch sử hình thành phát triển công nghệ sinh học trải qua giai đoạn sau: Giai đoạn thứ Đã hình thành từ lâu việc sử dụng phương pháp lên men vi sinh vật để chế biến bảo quản thực phẩm, ví dụ: sản xuất mát, dấm ăn, làm bánh mì, nước chấm, sản xuất rượu bia… Trong đó, nghề nấu bia có vai trị đáng kể Ngay từ cuối kỷ 19, Pasteur vi sinh vật đóng vai trị định trình lên men Kết nghiên cứu Pasteur sở cho phát triển ngành công nghiệp lên men sản xuất dung môi hữu aceton, ethanol, butanol, isopropanol… vào cuối kỷ 19, đầu kỷ 20 Giai đoạn thứ hai Nổi bật q trình phát triển cơng nghệ sinh học giai đoạn hình thành công nghiệp sản xuất thuốc kháng sinh penicillin, khởi đầu gắn liền với tên tuổi Fleming, Florey Chain (1940) Trong thời kỳ xuất số cải tiến mặt kỹ thuật thiết bị lên men vô trùng cho phép tăng đáng kể hiệu suất lên men Các thí nghiệm xử lý chất thải bùn hoạt tính cơng nghệ lên men yếm khí tạo biogas chứa chủ yếu khí methane, CO2 tạo nguồn phân bón hữu có giá trị tiến hành hoàn thiện Giai đoạn thứ ba Bắt đầu từ năm 50 kỷ 20, song song với việc hồn thiện quy trình cơng nghệ sinh học truyền thống có từ trước, số hướng nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học hình thành phát triển mạnh mẽ nhờ loạt phát minh quan trọng ngành sinh học nói chung sinh học phân tử nói riêng Đó việc lần xác định cấu trúc protein (insulin), xây dựng mơ hình cấu trúc xoắn kép phân tử DNA (1953) Tiếp theo việc tổng hợp thành công protein (1963-1965) đặc biệt việc tổng hợp thành công gen buộc thể tế bào vi sinh vật (1980) Chính phát minh tạo tiền đề cho phát triển nhanh chóng nghiên cứu ứng dụng thực tế sau lĩnh vực công nghệ sinh học đại Giai đoạn tứ tư Kể từ 1973, thí nghiệm khởi đầu dẫn đến đời kỹ thuật DNA tái tổ hợp thực xuất insulin-sản phẩm vào năm 1982, thí nghiệm chuyển gen vào trồng năm 1982 thành cơng đến cơng nghệ sinh học đại có bước tiến khổng lồ lĩnh vực nông nghiệp (cải thiện giống trồng ), y dược (liệu pháp gen, liệu pháp protein, chẩn đoán bệnh ), công nghiệp thực phẩm (cải thiện chủng vi sinh vật ) Công nghệ sinh học phát triển ngày chủ yếu dựa ba cơng nghệ là: - Cơng nghệ vi sinh - Công nghệ tế bào (nuôi cấy mô tế bào ) - Công nghệ sinh học đại, tức công nghệ gen Cũng có tác giả gắn q trình phát triển công nghệ sinh học với ba cách mạng sinh học - Cách mạng sinh học lần thứ (đầu kỷ 20): sử dụng trình lên men để sản xuất sản phẩm acetone, glycerine, citric acid, riboflavin - Cách mạng sinh học lần thứ hai (sau chiến thứ 2): sản xuất kháng sinh, sản phẩm lên men công nghiệp glutamic acid, polysaccharide, có thành tựu đột biến, tạo chủng vi sinh vật cho suất hiệu cao, phát triển trình lên men liên tục phát phương pháp bất động enzyme để sử dụng nhiều lần - Cách mạng sinh học lần thứ ba (bắt đầu từ thập niên 1970): với phát quan trọng enzyme hạn chế, enzyme gắn, sử dụng plasmid làm vector tạo dịng, đặt móng cho cơng nghệ sinh học hồn tồn cơng nghệ DNA tái tổ hợp Hai giai đoạn đầu, công nghệ vi sinh công nghệ tế bào, sử dụng hoạt động sinh học tế bào tách biệt, chưa biến đổi cấu trúc di truyền chúng, nên xem hai giai đoạn công nghệ sinh học truyền thống Phải đến cách mạng sinh học lần thứ ba nêu trên, đời công nghệ sinh học đại, giai đoạn phát triển cao công nghệ sinh học, mở kỷ nguyên sinh học 1.4 Vị trí công nghệ gen công nghệ sinh học Công nghệ gen mũi nhọn công nghệ sinh học Năm 1972-1973 kỹ thuật gen đời, mở đầu cho giai đoạn cách mạng công nghệ sinh học Con người có khả vượt giới hạn tiến hố, chuyển gen từ lồi sang lồi khác, điều mà khơng thể thực đường chọn lọc tự nhiên Đến người ta giải mã gen mhiều sinh vật gen vi khuẩn E coli, nhiều virus, giun tròn, lúa đến năm 2003 giải mã gen người Trên sở kỹ thuật gen nhà khoa học tạo nhiều giống trồng có đặc tính ưu việt chống chịu hạn, chịu mặn, có suất cao góp phần tăng giá trị kinh tế cho xã hội Nhiều chủng vi sinh vật có khả tổng hợp enzym cao tạo công nghệ gen sử dụng công nghiệp Sự hiểu biết cách chi tiết cấu tạo vận hành gen cho phép người có khả can thiệp cách xác vào trình sống để phục vụ lợi ích Những thành tựu công nghệ gen gắn với ứng dụng thực tiễn nhằm phục vụ lợi ích người Tóm lại nói cơng nghệ gen mũi nhọn, trung tâm phát triển công nghệ sinh học 1.5 Khái niệm tế bào gốc Tháng năm 1997, Wilmut cơng bố cơng trình nhân vơ tính động vật, tạo cừu Dolly, đánh dấu mốc cho phát triển nhân giống nhiều loài động vật từ tế bào dinh dưỡng (tế bào soma) Năm 1999 tế bào gốc (Somatic stem cell) phat Tế bào gốc tế bào giữ nguyên tính chất tế bào phơi, tức chúng có khả phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên biệt khác tế bào tim, tế bào thần kinh, tế bào thận vv từ phát triển thành thể Như nhân vơ tính động vật từ tế bào gốc dễ dàng nhiều Từ đến việc nhân vơ tính động vật từ tế bào gốc nhiều nhà khoa học giới quan tâm Những thành công nhân vơ tính động vật mở khả nhân vơ tính người Đây vấn đề nhiều nhà khoa học, nhà quản lý, người đứng đầu quốc gia quan tâm bàn cãi có số nước cấm không cho tiến hành nhân người 1.6 Thực phẩm chuyển gen Cho đến nhiều loài sinh vật chuyển gen (GMO) xuất với qui mô sản xuất công nghiệp, ngô chuyển gen, đậu tương chuyển gen, cà chua, lúa vv Những chuyển gen thường có nhiều đặc tính ưu việt suất cao, chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi chống chịu sâu bệnh, chống chịu hạn, chịu mặn vv Nhờ trồng chuyển gen thường đem lại hiệu kinh tế cao Cây trồng thực phẩm cho người động vật nên phải chịu giám sát tổ chức quản lý an tồn sinh học, loại chuyển gen đưa sản xuất phải đảm bảo tiêu chuẩn định Ví dụ Mỹ nơi mà công nghệ sinh học đầu tư phát triển mạnh giới, vấn đề quản lý chặt chẽ Hệ thống quản lý Mỹ nhằm đảm bảo an toàn lương thực bao gồm Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA), Cục Bảo vệ Môi trường (EPA), Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm (FDA), quản lý loại lương thực có nguồn gốc thực vật tạo nhờ công nghệ sinh học Theo Đạo luật Lương thực, Dược phẩm Mỹ phẩm (FD&C), FDA có thẩm quyền bảo đảm độ an tồn tất lương thực nước nhập cho người động vật thị trường Mỹ Cơ quan Kiểm tra Sức khoẻ Thực vật Động vật USDA (APHIS) có chức giám sát an tồn nơng nghiệp an tồn mơi trường trồng trọt thử nghiệm trường giống trồng tạo nhờ công nghệ sinh học Tuy cần lưu ý việc tạo GMO, gen kháng kháng sinh kanamycine, ampicillin hygromycine thường dùng kèm để làm gen thị Chúng tồn sản phẩm GMO có ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp thông qua dây chuyền thức ăn sinh đến người 1.7 Một số khía cạnh kinh tế khoa học công nghệ sinh học đại Các phương tiện thông tin đại chúng đăng tải không ý kiến phản đối ứng dụng số thành tựu công nghệ sinh học sản xuất, chí thành tựu giới khoa học đánh giá sáng chói Thật vậy, cơng nghệ sinh học khoa học hạt nhân, bên cạnh ứng dụng to lớn cho lợi ích phát triển lồi người, cịn mang lại nhiều hiểm họa lường trước hậu Sau tìm hiểu hiểm họa tiềm tàng công nghệ sinh học Về khoa học Sự dè dặt sử dụng sản phẩm chuyển gen làm thực phẩm cho người gia súc nhiều lý khác nhau, chia thành hai nhóm sau: - Bộ máy di truyền sinh vật mang tính hồn thiện cao tiến hóa qua hàng trăm triệu năm, gen lắp thêm vào cho trồng vật nuôi để tăng suất chất lượng nơng sản, phá vỡ tính hồn thiện, tính cân sống sinh vật Và người khơng thể yên tâm với việc hàng ngày nuốt vào thể số lượng lớn sản phẩm thiếu tígnh hồn thiện, cân hay nói cách khác có dị tật - Cho đến việc tạo GMO, gen kháng kháng sinh kanamycine, ampicillin hygromycine thường dùng kèm để làm gen thị Chúng tồn sản phẩm GMO có ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp thông qua dây chuyền thức ăn sinh đến người Hiện nay, người ta tìm cách thay gen chọn lọc cũ gen hại gen mã hố protein phát huỳnh quang màu xanh lục (Green Fluorescence Protein-GFP) Gen GFP coi gen thị tốt, làm cho GMO phát sáng xanh rực rỡ đặt tia tử ngoại Nhưng dù nghi ngại cịn, gen GFP có nguồn gốc từ loài cá Bắc Băng Dương, khơng từ động vật có nguồn gốc gần với người Về kinh tế 2.1 Những công ty đa quốc gia công nghệ sinh học Tổ chức quốc tế nông nghiệp tiến RAFI (Rural Advancement Foundation International) tổ chức quốc tế phi phủ Canada hoạt động nhằm hạn chế ảnh hưởng công ty đa quốc gia giống Theo RAFI, kỷ 21 năm tung hoành ngang dọc công ty đa quốc gia công nghệ sinh học, công ty phát triển nhanh chóng nhờ thâu tóm cơng ty nhỏ trước hết nhờ lợi nhuận khổng lồ thu độc quyền bán sản phẩm GMO Chẳng hạn cách 15 năm, công ty Monsanto chuyên sản phẩm hóa dầu, thuốc trừ sâu, trừ cỏ Tuy nhiên thời gian gần đây, Monsanto đầu tư lớn triển khai công nghệ gen thực vật để tạo giống GMO trở thành công ty giống lớn giới RAFI gọi Monsanto "Microsoft cơng nghệ sinh học" từ năm 1996 đến Monsanto mua lại nhiều công ty trước vốn người khổng lồ thị trường hạt giống 2.2 Sự lệ thuộc vào công ty đa quốc gia công nghệ sinh học RAFI tiên đốn người nơng dân hầu giới, kể nước công nghiệp phát triển, sẽ bị lệ thuộc vào nhóm nhỏ cơng ty cơng nghệ sinh học đa quốc gia Với quy chế ngặt nghèo quyền tác giả IPR (Intellectual Property Right) hành quan hệ kinh tế giới, người nông dân bị tước bỏ hồn tồn quyền tự trồng mảnh đất bán cho sản phẩm Lý để cơng ty Monsanto có nhiều quyền hạn tiến công nghệ sinh học Chẳng hạn, gen terminator quan đăng ký quyền Mỹ thức cấp phát minh cho cơng ty Delta Pine (3/1998) Khi chuyển gen vào giống nào, hạt bán nảy mầm hệ Nếu người nông dân lấy hạt để trồng vụ sau, gen tạo hợp chất giết chết mầm, hạt hồn tồn khơng nảy mầm Với gen terminator tay, công ty đa quốc gia bắt nông dân nước hàng năm phải mua hạt giống họ Mặt khác, cơng ty giống thơn tính dần công ty chế biến lương thực, thực phẩm đầu sản phẩm nông nghiệp Một mặt độc quyền hạt giống GMO, mặt nắm công ty chế biến nông sản, công ty đa quốc gia công nghệ sinh học không chừa lối cho nơng dân nước phát triển 1.8 Những vấn đề pháp lý công nghệ sinh học đại Kỹ thuật tái tổ hợp DNA giúp nhà khoa học thay đổi chế tiến hóa tự nhiên, sáng tạo sản phẩm gen, tạo dạng sinh vật Ngày có nhiều chứng hiển nhiên lợi ích kỹ thuật DNA tái tổ hợp Nhưng phải cân nhắc đến nguy tiềm tàng nó, thực tế nảy sinh số vấn đề pháp lý quan trọng buộc phải xem xét lại cách thận trọng Có nhiều vấn đề pháp lý công nghệ sinh học, nhiên phạm vi giảng đề cập đên số khía cạnh sau: Vấn đề an tồn sinh học Mục đích cơng nghệ sinh học phục vụ cho lợi ích người Tuy nhiều vấn đề nảy sinh tác động đến sinh vật, số khơng chúng kẻ thù người vi sinh vật gây bệnh Vấn đề an toàn sinh học đạo lý quan tâm xã hội Công nghệ gen đem lại nhiều lợi ích cho người, nhiên bên cạnh khơng nỗi lo ngại, vấn đề an toàn sinh học đặt từ ngày đầu An toàn sinh học bảo vệ người, xã hội mơi trường khỏi tác động có hại, tác động nguy hiểm độc tố hay sản phẩm công nghệ gen gây cho hôm hệ mai sau Nó địi hỏi phải đánh giá mức độ an toàn tất sản phẩm biện pháp sử dụng vật nuôi trồng, liệu pháp chữa trị người Ngay từ năm đầu công nghệ gen (1972-1973) mối lo ngại xuất loại vi sinh vật nguy hiểm cho người động vật xảy làm cho nhà nghiên cứu dừng thí nghiệm Ngay từ vấn đề an tồn sinh học đặt Ngày nhà nghiên cứu phải tuân thủ theo nguyên tắc đạo quản lí thức đưa nhằm đảm bảo vi sinh vật tái tổ hợp nghiên cứu khơng phát triển bên ngồi phịng thí nghiệm, đồng thời nhân viên phịng thí nghiệm phải bảo vệ để không xảy rủi ro Các sản phẩm chuyển gen kiểm tra, thử nghiệm cách nghiêm ngặt trước đưa vào sử dụng Ví dụ năm 1999, có khoảng 6000 thử nghiệm thiên nhiên thực Mỹ số chấp nhận Tuy nhiên nhà mơi trường ln lo lắng có nghiên cứu cho chuột ăn khoai tây chuyển gen hệ thống miễn dịch bị tổn thương, hay hạt phấn từ bắp chuyển gen Bt huỷ hoại quần thể bướm "hoàng hậu", hay bi kịch bệnh viêm não bò Anh số nước Kết thông tin dấy lên phản ứng chống lại chuyển gen Quản lý đánh giá độ an toàn thực phẩm Tại Mỹ số nước phát triển vấn đề quản lý đánh giá độ an tồn thực phẩm nghiêm ngặt Tính an toàn lương thực từ trồng thành phần thực phẩm, bao gồm hương vị, chất phụ gia, thành phần dinh dưỡng, chất gây dị ứng vv phải đánh giá kỹ trước cho phép tiêu thụ Tuy đơi có lỗ hỗng quản lý, lợi nhuận cao làm giảm phần tính nghiêm ngặt, vấn đề tranh cãi tồn việc sử dụng tryptophan gây hội chứng đau bị nghi ngờ sản xuất từ dòng vi khuẩn tạo công nghệ gen hay việc sử dụng hormon tăng trưởng bò (Somatotropin bò viết tắc BST) Người ta thấy tiêm BST cho bị sữa làm tăng đáng kể lượng sữa lượng BST tồn dư sữa không cao so với đối chúng nên khơng có hại cho người, nhiên BST tự nhiên thu nhận với giá thành cao nên BST sản xuất nằng công nghệ gen đời (rBST) Các nhà quản lý nhà khoa học Mỹ kiểm tra kỹ có kết luận thịt sữa bò xử lý với rBST an toàn cho người Tuy nhiên người phản đối sử dung rBST cho việc sử dụng rBST làm gia tăng nhiễm vi khuẩn vào tuyến sữa gây chứng viêm vú Tranh cãi sâu sử dung rBST phải dùng kháng sinh cao để ổn định sức khoẻ gia súc dẫn đến làm tăng dư lượng kháng sinh thịt sữa, điều gây dị ứng nhiều người tiêu đứng cạnh (Hình 6-2) Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase chất keo phân tử để kết dính mẫu DNA lại với 1,- Nối đầu bằng: Nối đầu xảy hai đoạn DNA đầu đứng cạnh Dưới tác dụng enzyme ligase, liên kết phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hình thành hai nucleotide nối lại với (Hình 6-3a) Khả nối hai đoạn DNA đầu thấp Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ đoạn DNA 2,- Nối đầu lệch: Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch có bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại để tạo liên kết hydro bazơ nitơ bổ sung Sau đó, hai nucleotide hai đầu nối tạo liên kết este OH(3’) P(5’) tác dụng enzyme DNA ligase Phản ứng nối thực theo sơ đồ biểu diễn Hình 2-3b Plasmid tách từ tế bào E Coli tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo plasmid hở có hai đầu lệch 2.3 Các phương pháp tạo AND tái tổ hợp 2.3.1 Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch 1,- Chọn xử lý AND plasmid Plasmid tách từ tế bào E coli tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách AND plasmid Sau dùng enzym RE II cắt để tạo plasmid hở có hai đầu lệch 2,- Chọn xử lí đoạn cài: DNA đoạn cài thu nhận lựa chọn, tinh chế theo mục đích nghiên cứu Cắt DNA enzyme RE loại II loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo vết cắt giống 3,- Tạo plasmid tái tổ hợp: Ghép đoạn cài vào plasmid cách ủ DNA đoạn cài với plasmid với có mặt enzyme DNA ligase, ta thu DNA tái tổ hợp Phản ứng nối xảy theo sơ đồ c biu din trờn Hỡnh 2-4 Nối đầu bằng: OH C C G G P 3’ 5’ + 5’ 3’ A T T A OH P OH P C C A T T A G G DNA ligase OH P C C A T G G T A Nèi ®Çu lƯch: G C C T A G + G A T C T A Bắt cặp bazơ bổ sung P OH 5’ 3’ G G A T C T DNA ligase C C T A G A G G A T C T A C C T A G 3’ P Hình 2-3: DNA phản ứng nối 5’ OH 2.3.2- Các phương pháp sử dụng đoạn nối 1,- Chọn xử lí vector plasmid: (tương tự trên) 2,- Chọn xử lí đoạn cài: Linker đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, tổng hợp phương pháp hóa học, cho linker phải có trình tự nhận biết enzyme cắt hạn chế loại II Ví dụ EcoRI có chuỗi đích G/AATTC cDNA đầu tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme chép ngược theo chế nuclease S1 Metyl hóa vùng hạn chế có đoạn cDNA sợi đôi nhận biết enzyme EcoRI Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai Cắt phân tử DNA lai enzyme EcoRI, ta phân t lai cú hai u lch DNA lạ Cắt bëi Eco RI (REH ) Aatt Aatt C¾t bëi Eco RI (REH ) TtAa TtAa a Tt Aatt a TtAa Tt aa DNA ligase Aa Aa tt tt aa Tt Tt aa DnA tái tổ hợp Hỡnh 2-4: Phng phỏp dùng đầu lệch §iĨm nhËn biÕt cđa Eco RI C C G A A T T C GG GG C T T A A G C C Các phân tử linker Linker DNA l¹ (cDNA) DNA ligase DNA plasmid Eco RI Eco RI DnA tái tổ hợp Hỡnh 2-5: Dựng đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp 3,- Tạo vector tái tổ hợp: Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid mà cắt enzyme EcoRI Nhờ tác dụng enzyme DNA ligase mà vector tái tổ hợp tạo thành (Hình 6-5) 2.3.3- Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính enzyme terminal transferase có khả gắn loại nucleotide vào đầu 3’(OH) phân tử DNA Cách tạo DNA tái tổ hợp phương pháp tiến hành theo bước sau (Hình 6-6): 1,- Bước 1: Chọn phân lập DNA lạ đầu plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích nhận biết enzyme BamHI (G/GATCC) Cắt plasmid enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính Cắt DNA lạ enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch 2,- Bước 2: Ủ DNA lạ với loại nucleotide dCTP với có mặt enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyC đầu 3’(OH) DNA lạ Ủ plasmid với loại nucleotide dGTP với có mặt enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG đầu 3’(OH) plasmid hở 3,- Bước 3: Đưa DNA lạ vào plasmid với có mặt enzyme DNA ligase, đầu mút homopolymer có trình tự bổ sung ( -GGGG 3’/3’CCCC -) bắt cặp với 4,- Bước 4: Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester cuối tạo plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích nhận biết enzyme BamHI Ưu điểm phương pháp ghép DNA lạ đầu vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp chế tác DNA đầu lệch từ DNA đầu 5 GGA T C C C C T A GG Plasmid chứa chuỗi đích BamHI C¾t DNA b»ng E exonuclease 3 C¾t b»ng E BamHI 5 PolyC ETT (3’) GA T C C G G C C T A G (3’) PolyG ETT CCC CCC (3’) GGGGGA T C C G C C T A GGGGG (3’) G GGGGGA T C C CCC G CCC G C C T A GGGGG BamHI BamHI GGGG G A T C C C C C C C T A GG GGA T C C C C C C C T A G G GGG DNA tái tổ hợp Linker Linker DNA lạ Hỡnh 2-6: Cách tạo DNA tái tổ hợp dùng enzyme terminal transferase 2.4- Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ 2.4.1- Hóa biến nạp Hiện tượng biến nạp chìa khóa giúp ta hiểu biết sở phân tử gen, công cụ để thực thao tác tạo tính di truyền vật sống Theo Mandel Higa cho thấy rằng, E Coli trở nên dễ bị biến nạp DNA ngoại lai tế bào vi khuẩn xử lí mơi trường có CaCl2 trước sốc nhiệt 42°C Hóa biến nạp phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Quá trình thực theo hai buớc sau: Xử lí tế bào chủ dung dịch CaCl2 nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ xử lí Hiệu suất phương pháp hóa biến nạp vào khoảng 105 đến 106 tế bào biến nạp 1mg DNA tái tổ hợp Qua kết thực nghiệm, người ta thấy rằng, tế bào phát triển pha sớm đến pha dễ biến nạp Những nghiên cứu sau cho thấy việc xử lí tế bào ion kim loại hóa trị hai Mg+2, Mn+2 Ba+2 cho khả biến nạp lớn Ngồi ra, hiệu suất biến nạp cịn phụ thuộc vào kích thước plasmid, plasmid nhỏ hiệu suất biến nạp cao 2.4.2- Điện biến nạp Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao cục theo xung để tạo lỗ nhỏ màng sinh học tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có lên tới 70% Hiệu suất phương pháp phụ thuộc vào yếu tố sau: - Độ mạnh điện trường tác động khác loại tế bào khác nhau, - Độ dài số thời gian (thời gian ngắt xung - ms) Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết loại tế bào sinh vật, hiệu biến nạp cao số thời gian đạt khoảng 6ms, - Nồng độ tế bào chủ, - Nồng độ DNA tái tổ hợp, - Giai đoạn phát triển tế bào (tế bào già non khơng thích hợp), - Mơi trường dung dịch đệm, - Cấu trúc màng tế bào 2.4.3- Biến nạp tế bào trần (p rotoplast) Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ xử lí polyetylen glycol (PEG) Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40% Đây phương pháp chuyển gen có hiệu cao tế bào thực vật Bằng phương pháp này, người ta nhận mang gen biến nạp ổn định di truyền qua nhiều hệ (Potrykus cộng - 1995) Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen thị gen cần biến nạp cao Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast loại Đặc biệt loại có giá trị kinh tế cao lúa, ngô, đại mạch Nhược điểm: Việc tái sinh protoplast cịn khó khăn số lồi 2.4.4- Phương pháp bắn gen Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng bao bọc DNA bắn trực tiếp vào tế bào Ưu điểm: Phương pháp biến nạp cho tất loại tế bào thực vật Thao tác dễ dàng, bắn lần nhiều tế bào Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận biến nạp khảm (cây có tế bào biến nạp tế bào không biến nạp) Một số thành tựu đạt phương pháp bắn gen: Năm 1988, Mc Cabe cộng nhận đậu tương biến nạp phương pháp bắn gen Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm cộng nhận ngô biến nạp nhiều phịng thí nghiệm Những năm gần có hàng loạt cơng bố biến nạp thành công lúa Năm 1996, Zthang cộng biến nạp đu đủ, mía bơng Điều khẳng định tính ưu việt phương pháp 2.4.5- Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào định Đây trình lai ghép cho tế bào bậc cao tế bào hợp tử Tùy thuộc trường hợp cụ thể, người ta chọn phương pháp cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu cao Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào định đưa DNA vào loại tế bào Đưa xác chí vào tận nhân tế bào quan sát Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn, tế bào tiền phơi tiến hành cách xác Có thể biến nạp cho giống Nhược điểm: Một phát tiêm tế bào thao tác cần phải khéo léo tỉ mỉ 2.4.6- Tải nạp Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, có trình chuyển gen tái tổ hợp gen vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage) Thực nghiệm chứng minh tải nạp E Coli qua phage λ, phage P1 Bacillus subtilis qua phage SP10 So với phương pháp trên, tải nạp cho hiệu suất cao Như vậy, đến có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, học sinh học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ Tùy đối tượng yêu cầu cụ thể, phương pháp hay phương pháp khác có hiệu sử dụng nhiều 2.5- Kỹ thuật tách dòng (tạo dòng) Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài mảnh (chuỗi) DNA lạ vào vector (plasmide phage λ) phương pháp hóa sinh Sau đó, đưa phân tử lai vào tế bào chủ chọn lựa phương pháp biến nạp tải nạp Trường hợp muốn tạo dịng tổng hợp enzyme mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc enzyme 2.5.1- Mục đích tách dòng - Thiết lập ngân hàng gen, - Thiết lập ngân hàng cDNA, - Sản xuất protein, enzyme, - Sản xuất vaccine, - Sản xuất kháng sinh 2.5.2- Các bước phương pháp tách dòng Q trình thực thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia mục đích trình tách dịng Tuy nhiên để tạo dịng, cần phải thực bước sau: 2.5.2.1- Tách lập DNA lạ cần tạo dòng Chọn cắt DNA lạ tế bào cho enzyme cắt hạn chế (RE) Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector mục đích cần tạo dịng Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng gen chưa biết, người nghiên cứu tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dịng dự đốn cấu trúc protein gen huy tổng hợp tổng hợp cDNA từ mRNA Tạo đầu dính cần thiết 2.5.2.2- Chọn xử lí vector Chọn vector cần phải ý yêu cầu sau: độ lớn gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector phương pháp ứng dụng Xử lí vector: cắt vector enzyme cắt hạn chế loại với enzyme cắt DNA nói (để tạo vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại 2.5.2.3- Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) Việc tạo DNA tái tổ hợp cách ghép DNA lạ vào vector cắt enzyme cắt hạn chế loại II, đó, chúng ghép đơi đầu dính lại với nhờ bắt cặp bổ sung Một phản ứng ghép nối xảy với có mặt enzyme DNA ligase E Coli phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai 2.5.2.4- Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ phương pháp biến nạp tải nạp Công đoạn nhằm mục đích sử dụng máy tế bào chủ để chép vector tái tổ hợp thành số lượng lớn Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa có khả thấm vector tái tổ hợp Sự thấm xảy cách tự nhiên cảm ứng Tuy nhiên, phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector phụ thuộc vào định vị vùng cài lắp chứa bên vector mà người nghiên cứu chọn phương pháp biến nạp tải nạp Biến nạp tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần tiếp xúc hai tế bào nhân tố trung gian phage virus Biến nạp thực với vector chuyển gen plasmid Có nhiều phương pháp biến nạp hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen phương pháp vi tiêm Tải nạp tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian virus Tải nạp thực với vector chuyển gen có nguồn gốc virus phage, cosmid, 2.5.2.5- Phát dòng cần tìm Cơng việc kiểm tra diện gen mong muốn Việc chọn lựa chủng ý muốn khơng đơn giản, cách tiến hành thí nghiệm hỗn hợp khơng đồng nên dịng vi khuẩn mọc lên theo ba khả năng: - Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp, - Tế bào nhận plasmid khơng có gen lạ, - Tế bào vi khuẩn nhận plasmid tái tổ hợp Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có phương pháp khác để xác định dịng cần tìm Nếu mục đích nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dị Nếu đoạn DNA biết (cDNA), cơng việc đơn giản nhanh chóng 2.5.2.6- Kiểm tra thu nhận sản phẩm gen tái tổ hợp Tùy trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa phương pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm gen tái tổ hợp Nếu mục đích thiết lập ngân hàng cDNA, ta phải tiến hành bước sau: Đầu tiên người ta phải tách plasmid tái tổ hợp khỏi dịch ni cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp enzyme RE loại II thu hai băng DNA, có độ dài khung vector, cịn băng khác có độ dài tương ứng cDNA Cách kiểm tra lại cDNA cắt cách điện di gel agaroza 0,8% kiểm tra lại độ dài băng cDNA thu Những đoạn có kích thước khác di chuyển khoảng cách khác gel Nếu sản phẩm gen tái tổ hợp protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh, người ta thu nhận sản phẩm phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn trao đổi ion 2.6- Một số phương pháp xác định dịng cần tìm 2.6.1- Phương pháp lai axit nucleic 1,- Khái niệm đầu dò: Các đầu dò mảnh DNA đánh dấu, có khả nhận biết chuỗi DNA RNA đồng đẳng qua lai hóa 2,- Đặc điểm đầu dò: Là đoạn axit nucleic (DNA RNA) sợi đơn Đầu dò phải bổ sung bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết Đầu dị phải so mốc được, đầu đánh dấu phóng xạ 3,- Các loại đầu dị: cDNA làm đầu dị cực tốt, ngồi ra, mRNA oligonucleotide làm đầu dị Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh lượng nhỏ protein tương ứng với DNA nghiên cứu từ tổng hợp đầu dị Cịn phần DNA phải so mốc biết cơng việc dễ dàng để tổng hợp đầu dò 4,- Nguyên tắc phương pháp lai axit nucleic: Dựa vào khả biến tính nhiệt độ tăng hồi tính hạ nhiệt độ từ từ DNA Khi tăng nhiệt độ DNA lên nhiệt độ sinh lý (thường khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA tách rời liên kết hydro bị đứt Khi hạ nhiệt độ từ từ khối DNA biến tính với điều kiện thích hợp khác, mạch đơn bắt cặp trở lại Sự bắt cặp xảy hai trình tự DNA hồn tồn bổ sung cho Tính đặc hiệu cực lớn phản ứng lai cho phép trình tự mạch đơn tìm gặp mạch bổ sung với nó, chúng nằm hàng triệu trình tự DNA RNA khác Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát đoạn lai 5,- Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đánh dấu đồng vị phóng xạ hóa chất Biến tính dịng cần tìm dạng sợi, sau hạ nhiệt độ từ từ, sợi đơn tương đồng bắt cặp với Sự bắt cặp xảy DNA DNA, RNA DNA, RNA RNA 2.6.2- Phương pháp sử dụng kháng thể 1,- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng số protein kháng thể mà nhận biết qua phản ứng đặc trưng phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa 2,- Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein) Tách protein biểu q trình tạo dịng Ủ protein với kháng thể đặc trưng Sau tiến hành nhận biết thơng qua dấu hiệu phản ứng đặc trưng protein kháng thể 3,- Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu gắn vào vector phải biểu protein tạo dòng đồng thời, vector tạo dòng phải vector biểu (ví dụ vector λgt11) Protein biểu cần phải có kháng thể đặc trưng 2.6.3- Phương pháp phát hoạt tính xen đoạn Nguyên tắc: Dựa vào khả kháng thuốc vi khuẩn mang vector tái tổ hợp chúng nuôi cấy môi trường kháng sinh Phạm vi sử dụng: Phương pháp dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ vector pBR322 Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc AmPR TetR Trên gen có điểm nhận biết RE nơi cài đặt DNA lạ Khi gắn DNA lạ vào hai gen nói gen nhận đoạn cài khả kháng thuốc Quan sát khuẩn lạc bị gen kháng thuốc, chứng tỏ khuẩn lạc có chứa gen cần tạo dòng Ưu điểm phương pháp tốn so với phương pháp lai 2.6.4- Phương pháp phát thay đổi kiểu hình 1,- Nguyên tắc: Dựa vào thay đổi màu sắc khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc có chứa gen lạ 2,- Cách tiến hành: Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dịng có chứa gen lacZ (ví dụ dãy pUC), mẫu để so sánh mẫu để cài DNA lạ vào gen lacZ Sau đó, ni cấy hai mẫu mơi trường có chất cảm ứng X-Gal (5 brom4chloro-3indolyl D-galactopynoside) Chất cảm ứng bị phân hủy enzyme β-galactosidase tạo galactose X (dẫn xuất indol), ngồi mơi trường, dẫn xuất bị oxy hóa cho màu xanh đậm Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase Còn plasmid thứ cho khuẩn lạc màu trắng, điều chứng tỏ chứa DNA lạ cài gen lacZ chọn khuẩn lạc màu trắng 2.7- Ngân hàng gen (Genomic library) Ngân hàng gen sinh vật tập hợp trình tự DNA cấu thành gen gắn vào vector, biểu diễn tổng số gen Ngân hàng tạo từ sưu tập DNA tái tổ hợp chuỗi mã hóa lẫn chuỗi khơng mã hóa Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng gen thiết lập loại tế bào sinh vật nghiên cứu Các bước thiết lập ngân hàng gen: - Tách làm DNA sinh vật, - Cắt DNA thành đoạn có kích thước xác định enzyme RE loại II thơng thường, người ta sử dụng EcoRI, - Vector chọn để tạo dòng gen thường cosmid phage λ xử lý EcoRI, - Tạo vector tái tổ hợp đóng gói vỏ phage, - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ tạo dịng, - Xác định đặc tính biểu dòng vi khuẩn vừa lập, - Tiến hành sàng lọc, nghĩa phải tách vector có đoạn DNA ưa chuộng, từ xây dựng ngân hàng gen Đặc điểm ứng dụng: - Ngân hàng gen chứa đoạn DNA lớn 100 lần so với cDNA - Giải mã thông tin di truyền chứa gen, đặc biệt cấu trúc intron exon gen xác định - Tạo dịng trình tự DNA khơng mã hóa nằm cạnh gen mã hóa đóng vai trị định điều hòa biểu gen 2.8- Ngân hàng cDNA 2.8.1- Thiết kế ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA tập hợp cDNA từ tất mDNA tế bào Như vậy, ngân hàng thiết lập từ loại tế bào xác định (tế bào biệt hóa), thế, cDNA mang tính tế bào cao Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm bước sau đây: - Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết sau đó, làm mRNA, - Chọn lựa mRNA chứa nhiều A (polyA) cách tách cột xenlulose oligo dT, - Tổng hợp cDNA sợi kép đầu từ mRNA tác dụng enzyme chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 kỹ thuật Gubler-Hoffman, - Metyl hóa vùng hạn chế (có đoạn cDNA sợi đôi) nhận biết enzyme EcoRI để bảo vệ vùng không bị cắt thao tác với EcoRI, - Tạo đầu dính cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết EcoRI, sau đó, cắt enzyme EcoRI Trong trường hợp này, có đoạn nối bị cắt cịn cDNA cịn ngun vẹn (do metyl hóa) Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp, - Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp mở EcoRI khử nhóm phosphat, - Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp, - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ nuôi cấy điều kiện thích hợp để tạo dịng, - Xác định dịng cần tìm thành lập ngân hàng cDNA Mục đích việc thiết lập ngân hàng cDNA nhằm nghiên cứu biểu gen xác định với vấn đề liên quan đến điều hòa biểu gen mối tương tác gen q trình sống Chú ý: Khi phân tích kết thu ngân hàng cDNA, cần ý tác dụng sinh lí thời điểm thí nghiệm 2.8.2- Sàng lọc ngân hàng cDNA Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA DNA plasmid từ mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro-xenlulose (màng lai) bị biến tính lai với mRNA tổng số Mỗi mRNA khác lai nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung Các mRNA bám vào màng lọc tách dùng để tổng hợp protein mà mã hóa hệ thống dịch mã invitro Protein hình thành đem phân tích xem có phải sản phẩm mRNA cần tìm hay khơng, từ đó, xác định vi sinh vật ni cấy chứa gen mong muốn Sàng lọc tất mẻ ni cấy theo cách để xác định dịng đơn thể gen tìm kiếm CHƯƠNG I: KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC (5 tiết) 1.1 Khái niệm công nghệ sinh học 1.2 Các lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học 1.3 Lược sử phát triển công nghệ sinh học 1.4 Vị trí cơng nghệ gen cơng nghệ sinh học 1.5 Khái niện tế bào gốc 1.6 Thực phẩm chuyển gen 1.7 Một số khía cạnh kinh tế, khoa học công nghệ sinh học đại 1.8 Các vấn đề pháp lý công nghệ sinh học đại CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 2.1- Khái niệm DNA tái tổ hợp 2.2- Các cơng đoạn tạo DNA tái tổ hợp 2.3- Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 2.4- Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ 2.5- Kỹ thuật tách dòng (tạo dòng) 2.6- Một số phương pháp xác định dịng cần tìm 2.7- Ngân hàng gen (Genomic library) 2.8- Ngân hàng cDNA ... Engineering) công nghệ gen (Gen Engineering) Công nghệ Protein công nghệ gen xuyên suốt trở thành cơng nghệ chìa khóa nằm cơng nghệ sinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật công nghệ sinh học vi sinh. .. cách mạng sinh học lần thứ ba nêu trên, đời cơng nghệ sinh học đại, giai đoạn phát triển cao công nghệ sinh học, mở kỷ nguyên sinh học 1.4 Vị trí cơng nghệ gen cơng nghệ sinh học Công nghệ gen... chủng vi sinh vật ) Công nghệ sinh học phát triển ngày chủ yếu dựa ba cơng nghệ là: - Cơng nghệ vi sinh - Công nghệ tế bào (nuôi cấy mô tế bào ) - Công nghệ sinh học đại, tức cơng nghệ gen Cũng