Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Điều chế hạt nano chitosan trái nhàu và xác định khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trái nhàu trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC DIEU CHE HẠT NANO CHITOSAN TRÁI NHÀU VA XAC DINH KHA NANG KHANG KHUAN CUA HAT NANO CHITOSAN TR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

DIEU CHE HẠT NANO CHITOSAN TRÁI NHÀU

VA XAC DINH KHA NANG KHANG KHUAN CUA HAT NANO CHITOSAN TRAI NHAU

TREN VI KHUAN Streptococcus agalactiae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

DIEU CHE HẠT NANO CHITOSAN TRAI NHÀU

VA XAC DINH KHA NANG KHANG KHUAN CUA HAT NANO CHITOSAN TRAI NHAU

TREN VI KHUAN Streptococcus agalactiae

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN PHÚC CAM TU ĐINH THỊ THU HÀNG

TP Thủ Đức, 03/2023

i

LOI CAM ON

Lời đầu tiên con xin cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ đã tạo điều kiện và nuôi đưỡng con

từ những bước đi đầu đời Cảm ơn gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc dé con có thé antâm hoàn thành tốt mọi công việc

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường đại học Nông Lâm thảnh phố HồChí Minh và đặc biệt là quý thầy cô Khoa Khoa học Sinh Học Thay cô luôn là ngườitận tình giúp đỡ em trong những năm học vừa qua, vừa truyền đạt kiến thức vừa truyềnđạt kinh nghiệm dé cho em có thêm những bài học bồ ích từ chuyên môn đến xã hội

Em kính gửi lời cảm ơn chân thành đến thay TS Nguyễn Phúc Cam Tú — KhoaThủy Sản và cô TS Nguyễn Ngọc Hà — Khoa Khoa Học Sinh Học đã luôn tận tình chỉ

dạy, bảo ban, hướng dan và giúp đỡ em hoàn thành dé tài nghiên cứu này

Em xin cảm ơn cô TS Hồ Thị Trường Thy — Khoa Thủy Sản đã tận tình chỉ day

dé em có thêm những kiến thức mới về lĩnh vực vi sinh và hướng dan em hoàn thành tốtnội dung nghiên cứu của mình.

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Thùy Dung, chị Thái Thị Thanh Thủy,các bạn khóa 17 và các em phòng RIBE 106 đã giúp đỡ, động viên để em có thê tậptrung hoàn thành tốt cuốn khóa luận

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các bạn phòng 405, kí túc xá E, đại

học Nông Lâm, cảm ơn các bạn đã luôn chăm sóc, giúp đỡ và động viên mình, cảm ơn

đã trở thành “ngôi nhà thứ 2” trên quãng đời sinh viên đầy sống động của mình

Một lần nữa em xin cảm ơn tất cả mọi người đã, đang sát cánh bên cạnh em, sựquan tâm, chăm sóc của mọi người chính là động lực to lớn dé em có thé vượt qua nhữnggiai đoạn khó khăn trong hành trình phát triển bản thân của em Em xin chân thành cảm

on moi người.

11

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Dinh Thi Thu Hang, MSSV: 17126031, lớp: DH17SM (số di động:

0378662284, Email: 17176031 @st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh Họcđại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan đề tài “Điều chế hạt nano

chitosan trái nhàu và xác định khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trái nhàutrên vi khuẩn Streptococcus agalactiae” là do bản thân tôi trực tiếp thực hiện Các số

liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội động về những cam kết này

TP Thủ Duc, ngay thang năm 2023

Sinh viên thực hiện

Đinh Thị Thu Hằng

11

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành dé đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của hạt nanochitosan trái nhàu (Morinda citrifolia L.) đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae gâybệnh trên cá rô phi Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cao chiết là tỉ lệ bộtnhàu và dung môi Methanol 80% và thời gian ngâm, thu nhận được điều kiện tối ưu bao

gồm tỉ lệ 1:10 (bột nhàu và dung môi) được ngâm trong 36 giờ với hàm lượng

polyphenol là 1,42 + 0,06 mg GAE/g cao chiết và flavonoid là 0,09 + 0,009 mg QE/gcao chiết Cac hạt nano chitosan được tạo ra nhờ vào phương pháp gel ion giữa chitosan

và STPP, hạt nano có kích thước trung bình là 312,6 mm Với v1 khuẩn Streptococcus

agalactiae, dung dich nano chitosan trái nhàu tao vòng vô khuẩn có đường kính là 8,667+ 0,577 mm Bên cạnh đó, giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dung dịch nano

chitosan trái nhàu được xác định là 250 mg/I và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC là

500 mg/l.

Từ khóa: chitosan, trái nhau, hat nano, Morinda citrifolia L., Streptococcus agalactiae.

iv

The study was conducted to evaluate the antibacterial activity of noni fruit (Morinda citrifolia L.) chitosan nanoparticles against Streptococcus agalactiae causing disease in tilapia The factors affecting high extraction efficiency were surveyed, the optimal conditions including a ratio of 1:10 (Morinda citrifolia powder: Methanol 80% solution) was soaked for 36 hours, with a polyphenol concentration of 1.42 + 0.06 mg

GAE/g of extraction and flavonoid concentration of 0.09 + 0.009 mg QE/g of extraction The chitosan nanoparticles were generated through the ion gel method between chitosan and STPP, with an average size of 312.6 nm With Streptococcus agalactiae, the Morinda citrifolia nano chitosan solution formed an inhibition zone with a diameter of 8.667 + 0.577 mm In addition, the minimum inhibitory concentration (MIC) of the

Morinda citrifolia nano chitosan solution was determined to be 250 mg/L, and the minimum bactericidal concentration (MBC) was 500 mg/L.

Keywords: chitosan, Morinda citrifolia L., nano, noni fruit, Streptococcus agalactiae.

MỤC LỤC

MAC NHÂN VA CAM DOAN cere nme nemo encmncnnesearemoateavniaernmies i

Fe ăaeeeeesnssreeseeeeeieysoeeeyp-gessreroySigoggig950-02080068n6600000001603910g202800/0//09% iv

0n) 2.2 V MUC LUC 22 H VI

ĐANTT Bá 06T Ta suenuanouusganotiotuidutgidiSiohigiiigiiiZbEG0146030/0006801 G81g08 ixDANH: BC A nan gennierhntbpnsdsthoeeobthonslSitcrns0i6ïg7ss0A.00nugioxeg9pmsedemosl x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU -22 -2222222222222 22222 re |

LiL Dat 1.7 11.2 Mục tiêu đỀ tài - 2-5222 2122122122121271221211121212121211212121212121121 re 5

Wie IN OUTS HHWGTHIỆTTosuataghnigirihiuiitttibiSGDGRNGS00001-058031984888/880588108E3GNGSBSRGHAICDSDSERERNHIEHIAIBRGGHDM0 03846 2

2.1 Tổng quan về cây mau cccccccccccssessesseeseseeesessssesesstsesstsstesessessessessessesseeseeeeees 3

2›:1„1: Phẩm lõại MNOS, HO cicsaeneoniiddtdithiäikiãtti6018iLI3180465648 38I005131480.31SS84GSNSSENGSASNESRRUEGIS448805 E08.)

1.12 Đặc điềm TRS SãÄt e-eieiiniekinH in H1 nieneiemnanernesiaomwnviemnacsieunenewerl2.1.3 Phân bĩ sinh thái - 222¿222++22zrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrre

22.22: ele ee 4

2.2.1 Thành phan hĩa học của trái nhàu 2-2: ©2¿522S2E22E£2EEEEE2EZE2E2Ezxczxred 4

2.2.2) Cơng:dụng của trấi rÌHĐ‹ :oss«ossessessssseeskcsESesaeLiEELEdeSBB Hi ko 5g DÁ4 ng ggutHgckuEEugais6 de 4

2.3 Chitosan va nano Chitosan 1n g4ỏĩỪ 5

2 Bly ChIiLOS AM csccseerecasernenweennaceusensennensmsacrmanceneracwaennnemanenmnreneonne: 5

2.3.2 Nano Chitosan 1 ố.ố.ố xa-ỶŸÝŸỶŸẢ 6

2.3.3 Một số nghiên cứu về nano chitosan của trái nhàu 2: 2¿22222s+2z2222ze- 6

2.4 Bémh thury n6 Ỹ

2.4.1 Vi khuẩn Streptococcus agaÏa€fi46 - +22: ©2++2+2©+22E2E+22322E22232122232232222 + 72.4.2 Bệnh mắt lồi và xuất huyết ở cá rơ phi - 2 222+22++EE2E++2E2E+zExzzxrzrree §

VI

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2- 2-2 +2£22E££E2E+E£E£EzErxrxrxee 9 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2-22 2+222E++EE2EE2EE2E+2EE2ZE+2EEeEEzErzrree 9

Dds, Wat HỆU IgHIỂHI/9U¿cgssg:sz25s8:z022565529295g816E925BIEMBENSMiS4G2300801-3011232IE.BLEtEBEEAES0SS.i8[SEisstxett 9

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu -2 2©2++22+222122E12211221122112711221122122212211 21121 xe 9 3.2.2 /9401.01)1 0u 8N ố 9 3.2.3 Hóa chất và dựng cụ -s -4 20201 111020121110120210 00010110115 01.0018010200.0 re 10

3.3 Phương phap Nehien CWU xssnscses eo eee 10

3.3.1 Khảo sát các yếu tố anh hưởng đến điều chế cao trái nhàu - - 10

A a ee 11 °ESN P8?) 080i), 12

3.3.1.3 Định lượng Polyphenol tổng sé (Total phenolic content - TPC) 12

3.3.1.4 Định lượng Flavonoid tổng số (Total flavone content - TEC), 13

3.3.2 Tao hat nano chitosan trái nhau bằng phương pháp gel ion - - 15

3.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng đĩa thạch khuếch tán 5-2 16 3.3.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 2: 222222222222Ez2Ez22+zzzzzzxzex 17 3.3.5 Nong độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 2-22 2222222222E22222212222221 22222 18 CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 2-2 222+E+2E22E££E2EZEzErrerree 19 4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cao chiết trái nhàu -: 2272552 19 4.1.1 Tỉ lệ bột nhàu và dung môi methanol 80% ảnh hưởng đến hiệu suất cao chiét 21 4.1.2 Thời gian ngâm ảnh hưởng đến hiệu suất cao chiết 2 22 55z22z+2+2 25

4.2 Tạo hat nano chitosan trái nhầàu - - 2 2 22 3222218322213 3 225181221 2E 2xx czzrrcrrxy 29

4.3 Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch chứa nano chitosan trái nhàu 3⁄2

4.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) -2¿©2¿©222222E2E22E2E22E22522322122323222e2xe2 34

4.5 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) -2-©2252+SS2EE22E22E22E£2E22E22EZE222222ezxe2 35

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 22 sScEeEzEzEerxerersererreerxeeec 3 7

5.1 Kết luận - 2-2 522S22E221221212212112121211212111211111121111112111121121111211 2211 re 37

ST en 37

Vil

TÀI LIEU THAM KHẢO - 2 5222222EE22E122E2E122122112212211211211211211211211 21121 xe

PHU LLỤC 2-©22222222E22221221122112211221127112111211121112111211211211211221122112122221 xe

Vill

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ANOVA Analysis of Variance, phân tích phương sai

Ctv Cộng tác viên

MeOH Methanol

EtOH Ethanol

MIC Minimum Inhibitory Contrentration

MBC Minimum Bactericidal Concentration

STPP Sodium Tripolyphosphate

TSA Tryptone Soya Agar

TSB Tryptone Soya Broth

1X

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 2.1 Phân loại vi khuẩn Streptococcus agaÏaefiđe -: 2:©5+©2+52s+25z255z<: 7Bang 3.1 Danh sách hĩa chất, thuốc thử sử dụng trong thí nghiệm 10Bang 3.2 Danh sách thiết bị sử dụng trong thí nghiệm - 2-22 222522222222 10

Bảng 3.3 Các phan ứng hĩa học định tính FÏavono1d - - 5+ +-+<sc+sc+<czeces 12Bảng 4.1 Kết quả phản ứng xảy ra khi định tính Flavonoid 2-5: 55z25z25s2 19

Bảng 4.2 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết giữa tỉ lệ bột nhàu

Val UTS MGT GHI SOG a li kosinzsereogtcigik di dS013101us80015122880À935u58803035.:G85g8iLzu338:000g81.00/48900338 23

Bảng 4.3 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết giữa tỉ lệ bột nhàu

và dung mơi MeOH 80% là l:Š 2 2222211221121 123 12511531551 153 1521151111111 1 E1 xe 23

Bảng 4.4 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết giữa tỉ lệ bột nhàu

‘va dung m61, MEOH SOV là 107 seesssssvostexsessdloosssgBilossetlbssoos5SEEpsssge2ietodbiosislogildGnesslaee 24

Bảng 4.5 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết giữa tỉ lệ bột nhàu

va dung m61 MeOH 80% 0.080050022 24

Bang 4.6 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết với thời gian ngâm

lãi 12: 810 bus ngu g2 S55 S5 93585 gig gSư3ïSG95E988804G018GIBSSTHÍGIGESEISENSSESIGNHISG/11830319388533588043812000.080c3p3qgS0 25

Bảng 4.7 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết với thời gian ngâm

lỗ DAs BO css ngang n0 By 14038956848538835.G003599 2L2GEHĐSSSESD2W-SSgCENLSSG3E018039-GHSE84ESS0EiQđiDmS030Đ301G835388 26

Bang 4.8 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết với thời gian ngâm

LA 36 00 ƠỎ 37

Bảng 4.9 Hàm lượng Polyphenol, Flavonoid và hiệu suất cao chiết với thời gian ngâm

Bang 4.10 Bang số liệu phân bố kích thước hat nano chifosan -252s2¿ 31

Bang 4.11 Đường kính vịng vơ khuẩn của các mẫu dung dich - - 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của Chitin và Chitosan 2-2 + +s+SzE+E+Ev£xzEeEzxrrrxee 5

Hình 2.2 Khuan lạc Streptococcus agalactiae trên môi trường TSA 7

Hình 2.3 Dấu hiệu khi cá nhiễm khuẩn Streptococcus agaÌaetiae : - §

Hình 3.1 Trái nhàu khô và bột trái nhàu - - 222222 S222 ##*22EE£££2EE£zzEEeezreeezrees 9 Hình 3.2 Streptococcus agalactiae trên môi trường TSA -52ccc2cccccs<S2 9

Hình 3.3 Quy trình điều chế cao trái nhảu - 52222 ©22222+22E+2EE222EE2EEEzrErerrree 11Hình 3.4 Day chuẩn gallic acid trong định lượng Polyphenol . - 12

Hình 3.5 Quy trình định lượng Poly phen | o ccosescscwsseonmseasnessenasonvenunssnseanevenonnaensswees 13

Hình 3.6 Day chuẩn Quercetin trong định lượng Flavonoid -2 5-55- 14Hình 3.7 Quy trình định lượng Flavonoid scsscscsussscessessasvexssaavvarcasocsasvasnsarsosanexeoezeners 15 Hình 3.8 Quy trình tạo hạt nano chitosan trái nhàu ¿- 55+ 5++£++xs+eexeeerexxrs 16

Hình 4.1 Kết quả định tính flavonoid - 2: 2¿22222E£2E2EE22E22EE22E222222Ez2Ezzxcrev 19

Hình 4.2 Cao trái nhàu - - 2c 2222111211231 151 12112 11 112 11 11111 TH HT HH kg 20

Hình 4.3 Biéu đồ thé hiện hiệu suất cao chiết theo các yếu tố khảo sát - 21Hình 4.4 Biéu đồ thể hiện hàm lượng polyphenol theo các yêu tố khảo sát 21Hình 4.5 Biéu đồ thé hiện hàm lượng flavonoid theo các yếu tố khảo sát 22

Hình 4.6 Quá trình tao hat nano chitosan trái nhảu - 555 22222 2S2<*£<+>zc<>sz 29 Hình 4.7 Hình chụp FESEM của hạt nano chitosan trái nhàu - -3Ö

Hình 4.8 Hình anh DLS của hạt nano chitosan trái nhàu 555555 +5s=+s<5+ 30

Hình 4.9 Vòng vô khuẩn của các mẫu dung dịch -2- 2z5s5szcsc=sscse-sc .+32Hình 4.10 Hình ảnh kết quả giá trị nồng độ tối thiểu MIC 2- 2525525522 35Hình 4.11 Hình ảnh kết quả MIC sau khi cho INT DYE 0,05% - 25252: 35Hình 4.12 Hình ảnh kết qua MBC của giếng 1, giếng 2 và giếng 3 - 36

x1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong các thời điểm giao mùa hay vào mùa hè thu của miền Bắc và mùa khô ởmiền Nam thì bệnh mắt lồi, xuất huyết lại xảy ra phổ biến trên cá rô phi Được biết tạiViệt Nam cá rô phi lại là một trong những loài cá nước ngọt mang lại giá trị kinh tế cao

và có nhiều tiềm năng phát triển lớn, do đó, khi bệnh này xuất hiện đã gây thiệt hại lớn

cho ngành nuôi trồng thủy sản vì tỉ lệ chết cao và đặc biệt gây tác động lớn tới kinh tếcho ba con nông dân Bệnh này được xác định do con vi khuẩn Streptococcus agalactiae

là tác nhân chính gây ra Hiện nay, biện pháp được sử dụng phô biến là dùng thuốckháng sinh hay hóa chat dé tiêu diệt vi khuân gây bệnh Mặc dù vậy, việc sử dụng khángsinh, hóa chat còn có nhiều van đề bat cập, đặc biệt là hiện tượng khang kháng sinh đang

gia tăng mạnh mẽ trên toàn thé giới, ngoài ra còn gây ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái, 6

nhiễm môi trường, vấn đề tồn lưu kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản cũng đượcchú trọng rất nhiều Với phương châm phát triển ngành thủy sản theo hướng an toàn vàbền vững, các nhà khoa học đã, đang sử dụng nguồn thảo dược quý giá trong phòng, trịbệnh nhiễm khuẩn Nguồn nguyên liệu này rất phong phú, đa dạng, nhất là tại Việt Nam

— đất nước có điều kiện khí hậu nóng ẩm, thảm thực vật phát triển mạnh mẽ Trong

nguồn dược liệu quý báu đó, từ xa xưa, ở các bài thuốc đông y, trái nhàu được sử dụng

như một loại thuốc quý dùng dé chữa các bệnh như tăng huyết áp, táo bón, tiểu đường

hay giúp nhuận tràng, tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể Tuy nhiên, hầu hết các hợpchất có trong trái nhàu có sinh khả dụng thấp vì chúng không phân cực, có vị đắng, mùikhó chịu và thời gian bảo quản ngắn, do đó sử dung chitosan làm vật liệu bao bọc nano

để tăng sinh khả dụng các hợp chất hoạt động có trong trái nhàu Chitosan được đến là

sản phẩm của quá trình deacetyl hóa của chitin, được sử dụng nhiều trong quá trình xử

lý nước thải hay tạo ra mảng sinh học giúp bảo quản thực phẩm, trong nông nghiệp được

sử dung như một chất chính dé kháng sâu bệnh do có tính kháng khuẩn, kháng nắm ỞViệt Nam hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào kết hợp hai nguồn nguyên liệu này trongvan đề phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn, do đó, đề tài “Điều chế hat nano chitosan tráinhàu và xác định khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trái nhàu trên vi khuẩnStreptococcus agalactiae” đã được thực hiện, nhằm kết hợp cao trái nhàu và chitosan

dé tạo ra các hạt nano, từ đó, xác định và đánh giá khả năng kháng khuẩn của sản phẩm

1

này đối với vi khuân Streptococcus agalactiae, nhờ vậy có thé tìm ra được những hướng

đi mới trong việc giải quyết các van dé về bệnh thủy sản

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trái nhàu đối với vi khuân

Streptococcus agalactiae gây bệnh trên cá rô phi.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát các điều kiện điều chế cao trái nhàu

Nội dung 2: Tạo hạt nano chitosan trái nhàu

Nội dung 3: Xác định khả năng kháng khuẩn của hỗn hop dung dich nano

chitosan trái nhàu

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về cây nhàu

Tên khoa học: Morinda citrifolia L Cây nhàu còn có một số tên gọi khác như

nhàu núi, nhàu rừng, cây ngao, một số tên nước ngoài như Great morinda, India

Mulberry, Nunaakai (India), Wild pine (Barbados), Cheese fruit (Hawaiian), Mengkudu (Malaysia).

2.1.1 Phan loai khoa hoc

Thuộc bộ Long Dom (Gentianales), họ Cà phé/Thién thao (Rubiaceae), chi Nhau

(Morinda), loài Morinda citrifolia L

2.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây Nhàu là cây gỗ đứng, cao khoảng từ 4 đến 8 m Lá đơn, mọc đối Phién lá

to, hình bầu dục hai đầu thuôn nhọn; đài 15 - 30 em rộng 10 - 15 em Lá màu xanh bóng

đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn Bìa lá hơi don song Gan lá hình lông chim, noi rõ

ở mặt dưới, 6 - 7 cặp gân phụ Cuống lá 1 - 2 cm Lá kèm nằm giữa 2 lá mọc đối, hình

xoan, cao | - 1,5 cm, màu xanh nhạt Cụm hoa là đầu hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài

nách lá Trục cụm hoa hình tru, màu xanh, nhãn, dai 1 - 2 cm Đáy cụm hoa có 3 phiếnhẹp, dai 5 - 8 mm Hoa nở quanh năm, tập trung nhiều nhất từ tháng 11 đến tháng 2.Quả hạch kép do bầu noãn và một phần lá đài của các hoa trên cụm hoa dính nhau tạothành, cây cho quả từ tháng 3 đến thang 5 Quả non có màu xanh nhạt, dai 5 - 7 cm, rộng

3 - 4 em Qua giả màu ngà vàng, nhan bóng, mùi khai, trên qua còn vết tích các đĩa

mật Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen (Đỗ Tấn Lợi, 2004).

2.1.3 Phân bố sinh thái

Cây nhàu có nguồn gốc từ Nam A, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới An ĐộDương — Thái Bình Dương bao gồm phía đông Polynesia (Marquesas, Hawaii), phía tây

Polynesia (Samoa, Tonga, Rothmas va Tuvalu), Melanesia (New Guinea, Fiji) và

Micronesia (Pohnpei) Ngoài ra cây nhàu còn tập trung ở An Độ, Indonesia và TrungQuốc Tại Việt Nam, cây nhàu thường phát triển nhiều ở miền Nam và một số tỉnh miền

Trung như Quảng Binh, Quảng Trị hay Thừa Thiên — Huế Cây Nhàu có thé sinh trường

ở các kiểu môi trường khác nhau, ở vùng dat cát hay đồng bằng, khe núi, trong các khu

rừng âm thấp với cường độ ánh sáng kém, ngoài ra, cây có thể thích ứng với môi trường

khô hạn.

2.2 Trái nhàu

2.2.1 Thành phần hóa học của trái nhàu

Dựa vào các nghiên cứu gần đây, có khoảng 200 hợp chất sinh học được tìm thấy

trên các bộ phận khác nhau của cây nhau (Almeida và ctv, 2019) Trong bài nghiên cứu

của Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) cho thấy trong quả nhàu chín có

chứa tới 5,27 g/100 g đường khử; 0,033 g/100 g protein; 8,750 g/100 g lipid và 19,33%

cellulose Bên cạnh đó, quả nhàu được xác định có chứa một số hợp chất như Alaninie,

Arginine, Aspartic acid, Cysteine, Glutamic acid, Glycine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine, Tryptophan, Tyrosine, Valine, Alizarin, Lucidin, Morindadiol, Rubiadin, B-Carotene, Scopoletin, Caprylic acid, Rutin, Narcissoside, Quercetin, Aucubin, Asperulosidic acid, Deacetylasperulosidic acid, Americanin A, Calcium, Cobalt, Iron, Phosphor, Magnesium, Molybdenum, Potassium, Selentum, Sodium, Zinc, Methyl-a- Dfructofuranoside, Nonioside A, Nonioside B, Nonioside C, Nonioside D, Nonioside E,

Nonioside F, Nonioside G, a-B Glicose, B-sitosterol, Ascorbic acid (C), Biotin (B7), Cobalamin (B12), Folic acid (B9), Niacin (B3), Pyridoxine (B6), Riboflavin (B2), Thiamine (B1), Tocopherol (E), Pantothenic acid (B5) (Almeida va ctv, 2019).

2.2.2 Công dung cua trai nhau

Các bộ phan của cây nhàu gồm qua, hat, lá hay hoa đều có những giá trị dinhdưỡng và công dụng nhất định, tuy nhiên, trái nhàu vẫn được xem là nơi có chứa cáchợp chất hóa học có giá trị nhất Trái nhàu được coi là một thực phẩm chức năng, mộthoạt chat tăng cường cho sức khỏe của con người Từ xa xưa trái nhàu được sử dụng déđiều trị bệnh khó tiêu, làm nhuận tràng, điều hòa kinh nguyệt hay làm tăng hệ miễn dịchcho cơ thé Ngoài ra, nước ép trái nhàu còn có khả năng cải thiện giấc ngủ, giảm nhẹ di

ứng và bệnh hen suyễn (Westendorf J và ctv, 2009) Trong một số bài báo khác, trái

nhàu còn được nghiên cứu trong các hoạt động kháng khuẩn, kháng viêm, hay hoạt độngchống ung thư, chữa lành vết thương (Reem Abou Assi va ctv, 2015) Nước của tráinhàu còn được chứng minh tính kháng khuẩn dựa trên sự phát triển của mười chủng vikhuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Sina và ctv, 2021) Ngoài ra tinhdầu từ trái nhàu cũng được nhận định là có tiềm năng trong việc kiểm soát sự xâm nhập

4

nam Sclerotium rolfsii lên cây lúa, có khả năng tiêu diệt loại nắm nay ma không gây ra

các tác động tiêu cực lên hệ sinh thái môi trường (Osorio và ctv, 2021).

2.3 Chitosan và nano chitosan

2.3.1 Chitosan

Chitosan là một polysaccharide mach thang có nguồn gốc từ quá trình deacetylhóa của chitin Chitin được biết tới là thành phần cấu trúc trong vỏ của côn trùng hayđộng vật giáp xác, đa phan la tôm, cua Chitosan có cau tao từ D-glucosamine được liênkết với B-(1-4) và N-acetyl-D-Glucosamine Phần lớn các polysaccharide thường trungtính hoặc mang điện tích âm trong môi trường axit, do đó chitosan có thể tạo thành cácphức hop tĩnh điện có cấu trúc đa lớp với các polyme tổng hợp (Aranaz và ctv, 2021)

HOH

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của Chitin va Chitosan

Chitosan được sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng sinh học và y sinh nhờ tínhchất độc đáo của nó Chitosan không độc và có khả năng phân hủy sinh học nên không

gây ra phản ứng phụ va không gây ảnh hưởng đến môi trường Cụ thé, chitosan có thé

được sử dụng trong quá trình xử lý nước như thu hồi ion kim loại, hap phụ thuốc nhuộm

hoạt tính, làm vật liệu chữa lành vết thương, làm hoạt chất mang thuốc hoặc có tiềm

năng trong điều trị béo phì vì có khả năng làm hạn chế hấp thu chất béo Ngoài ra,

chitosan còn có thé làm tăng sắc mau trong vải nhuộm, làm phụ gia thực phẩm, bao quảnnguyên liệu duy trì được hương vị và màu sắc tự nhiên Bên cạnh đó, chitosan cũng

được nghiên cứu nhiều trong hoạt động kháng khuẩn, ngay cả ở vi khuẩn gram âm và vi

khuẩn gram dương Điện tích dương của các nhóm amino có thé gây phá vỡ màng tếbảo hoặc thanh tế bào của vi khuẩn, gây cản trở quá trình trao đổi chất dinh dưỡng dẫnđến chết tế bào vi sinh vật va chitosan có thé xuyên qua thành tế bào sau đó tác động

đến quá trình tổng hợp DNA/RNA và protein (Yan và ctv, 2021) Một nghiên cứu khác

chỉ ra rằng chitosan hoạt động như một tác nhân chelate liên kết với nguyên tố kim loại

vi lượng gây ra sự sản sinh độc tô và ức chế sự phát triển của vi sinh vật (Divya và ctv,

2017).

2.3.2 Nano chitosan

Nano chitosan là vật liệu thiên nhiên không gây hại tới môi trường xung quanh,

ngoài ra nano chitosan còn có nhiều hoạt tính sinh học có tác dụng kháng nam, kháng

khuẩn, chống virus Nó còn được sử dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong y học,

nano chitosan có khả năng chống ung thư hay làm vật liệu bao gói thuốc vào cơ thé.Hiện tại có năm phương pháp dé chế tao nano chitosan bao gồm phương pháp micellespha đảo, phương pháp lọc qua rây, phương pháp liên kết chéo trong nhũ tương, phươngpháp gel ion, phương pháp kết hợp giọt nhũ tương Trong đó phương pháp gel ion được

ứng dụng nhiều nhờ tính chất không độc hại và dé thực hiện Nguyên tắc cơ bản củaviệc tạo hạt bằng phương pháp này là do sự hiện diện của lực hút tĩnh điện giữa các phân

tử điện tích trái dau bao gồm các phân tử điện tích dương của chitosan và các phân tử

điện tích âm của STPP (Agnihotri va ctv, 2004; Shah va ctv, 2004) Việc sử dụng STPP

trong quá trình tao hat nano chitosan là do nó làm chất liên kết ngang giúp ôn định các

hạt nano.

2.3.3 Một số nghiên cứu về nano chitosan của trái nhàu

Trong nghiên cứu của Choiri và cộng sự (2016), tác giả đã chế tạo thành cônghạt nano chitosan bao bọc chiết xuất nhàu với kích thước là 534 mm và đánh giá hoạt

tính oxy hóa của hạt nano này là 60,5% Aisyah và cộng sự (2016) cũng tạo ra các hat

nano bao địch chiết nhàu có kích thước từ 27 đến 59 nm, các hạt nano này còn đượcchứng minh có khả năng chống tế bào ung thư trên chuột đực với tỉ lệ ức chế là 54,75%

Ningsih và cộng sự (2019) tạo ra được viên bao nano trái nhàu có kích thước 778 nm và

khi sử dụng các viên bao này vao trong nước uống của gà nghiên cứu cho thấy tác độngtích cực đến mô hỗng tràng của gà Còn trong báo cáo của Zuprizal và cộng sự (2020),

khi thêm viên bao nano chứa dịch chiết trái nhàu vào nước uông hang ngay cua ga, viên

bao cho không gây ảnh hưởng tới hình thái vi khuẩn, tuy nhiên nó làm giảm quần thể

Escherichia coli.

2.4 Bệnh thủy san

2.4.1 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Streptococcus agalactiae hay được gọi là Streptococcus nhóm B (GBS), lần đầutiên được phân biệt với các liên cầu khuẩn khác bởi Rebecca Lancefield vào những năm

1930 sau khi nó được phân lập từ sữa bò (Lancefield và ctv, 1933).

Bang 2.1 Phân loại vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Hinh 2.2 Khuan lac Streptococcus agalactiae

trên môi trường TSA.

Vi khuan Streptococcus Agalactiae được biết đến là vi khuẩn gram dương, códạng hình cau, kích thước từ 0,6 đến 1 um và không sinh ra nha bào (TCVN 8710-

21:2019), phát triển mạnh mẽ ở nhiệt độ cao khoảng từ 30 đến 37°C và có khả năng phát

triển ở độ mặn từ 0 %o đến 35 %o

2.4.2 Bệnh mắt lồi và xuất huyết ở cá rô phi

Hình 2.3 Dấu hiệu khi cá nhiễm khuẩn Streptococcus agalactiae (Ortega và ctv,

2018).

Loài cá rô phi là loài cảm nhiễm đặc biệt đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae(TCVN 8710-21:2019) Khi nhiễm khuẩn cá có dấu hiệu bơi bất thường như bơi quayvòng hoặc bơi xoắn ốc, một hoặc hai bên mắt có hiện tượng lỗi ra và đục màu, xuất hiệnhiện tượng xuất huyết ở vây, xương nắp mang và trương bung Vì loài vi khuẩn này ưuphát triển ở nhiệt độ cao nên bệnh thường phổ biến vào mùa hè ở miền Bắc và mùa hanhkhô ở miền Nam Bệnh lây nhiễm ở tat cả các giai đoạn phát triển của cá, bat ké lứa tuôihay kích thước Thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ 2 đến 3 ngày, có khi đến 7 ngày tùy

vào sô lượng vi khuân va sức dé kháng của giông cá.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022 tại phòng Độc

chất học Môi trường (RIBE 106), thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, ĐạiHọc Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh và phòng Bệnh thủy sản (PV 309), khoa ThủySản, Đại Học Nông Lam, thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng là trái nhàu khô được mua trên thị trường

Say 60 °C

—>

Xay

Hình 3.1 Trái nhàu khô và bột trái nhàu.

3.2.2 Vi khuẩn nghiên cứu

Chung vi khuan Streptococcus agalactiae được cung cấp bởi phòng Bệnh họcThủy Sản (PV 309), khoa Thủy sản, Đại Học Nông Lâm, thành phó Hồ Chí Minh Vikhuẩn được nuôi trên môi trường TSA trong vòng 24 giờ

Hình 3.2 Streptococcus agalactiae

trên môi trường TSA.

Chitosan (deacetyl > 75%, HiMedia)

Thuốc nhuộm Int Dye

Sinh khối vi khuẩn:

Streptococcus agalactiae Ampicillin (10 pg) thuộc Công ty TNHH dich vu va thuong mai Nam Khoa

NaCl BaC]› 1%

H2SO, 1%

Môi trường Tryptone Soya Agar Môi trường Tryptone Soya Broth

Bảng 3.2 Danh sách thiết bị sử dung trong thi nghiệm

Bếp đun cách thủy Tủ cay vi sinh

Hộp hút 4m Tủ sấy

Tủ sấy Nồi hấp tiệt trùng

Máy đo quang phổ UV-Vis Đĩa petri

Máy khuấy MicropIpet

Máy Vortex

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều chế cao trái nhàu

Khảo sát hai yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất điều chế cao chiết là tỉ lệ giữa bột

nhàu với dung môi MeOH 80% (1:3, 1:5, 1:7, 1:10) và thời gian ngâm (12 giờ, 24 giờ,

36 giờ và 48 giờ) Các yếu tố được thực hiện đồng thời với nhau, các nghiệm thức lặplại ba lần

10

Cân 5 g bột nhàu được ngâm cùng với dung môi MeOH 80% trong bình tam giác

250 ml, lắc nhẹ và ngâm qua đêm Sau đó lọc, thu dịch chiết, tiến hành cô cạn dịch dé

làm bay hơi dung môi, tạo ra cao nhàu Cao được bảo quản ở nhiệt độ 59C.

Tỉ lệ bột nhàu : dung môi

l3 lã 17 1110 , „ Cô „

Bột nhàu >| Loc lây dịchchit |———> Cao chiệt

Thời gian ngâm (giờ) l2 24 36 48

|

Hinh 3.3 Quy trinh diéu ché cao trai nhau.

Công thức tính hiệu suất cao chiết:

H=~x 100

—M

Trong đó:

H: hiệu suất cao chiết (%)

m: khối lượng cao chiết thu được (g)

M: khối lượng nguyên liệu (g)

Khi điều chế cao trái nhàu cần thực hiện thêm một số chỉ tiêu bao gồm: xác định

độ 4m bột nhàu, định lượng Polyphenol, định tính và định lượng Flavonoid

3.3.1.1 Xác định độ 4m

Sử dụng đĩa petri và sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi, xác địnhkhối lượng của đĩa petri sau khi sấy (g) Sau đó, cho một khối lượng bột nhàu nhất định

vào dia petri, sử dụng cân bốn số dé xác định khối lượng ban đầu Đặt đĩa vào tủ say ở

nhiệt độ 105°C, sau khi say đến khối lượng không đổi, đưa đĩa mẫu vào hộp hút âmtrong vòng từ 30 phút đến 1 tiếng và ghi nhận kết quả

Công thức tính độ ẩm:

_ Le Cag

m1 — n0 Trong đó:

W: độ âm dược liệu (%)

m0: Khối lượng đĩa sau khi sấy đến khối lượng không đôi (g)

II

m1: Khối lượng của đĩa và mẫu trước khi sấy (g)

m2: Khối lượng của đĩa và mẫu sau khi say đến khối lượng không đổi (g)

3.3.1.2 Dinh tính Flavonoid

Bang 3.3 Cac phan ứng hóa học định tinh Flavonoid

Phan ứng với Phản ứng với Phản ứng với NaOH 1% AIC] 1% FeCl; 1%

- 2 ml dịch chiết 2 ml dịch chiết 2 ml dịch chiết

Mau thử ;

+2 giotNaOH 1% +2 giọt AIC] 1% +2 giọt FeCh 1%

Dung dịch sẽ đậm Dung dich sé Dung dịch sẽ

Kết quả màu hơn so với chuyên sang màu chuyển sang mau

dung dịch ban đầu vàng tươi hơn xanh đen hoặc xanh

lục

3.3.1.3 Định lượng Polyphenol tổng số (Total phenolic content - TPC)

Định lượng Polyphenol tổng số theo TCVN 9745:2013 (ISO 1450-1:2005).Mau gallic acid chuẩn: cân chính xác 25 mg gallic acid, hòa tan trong nước cất

và định mức 25 ml, tao ra được dung dich chuẩn 1000 pg/ml Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5

ml từ dung dich gallic acid gốc, sau đó pha loãng và định mức trong bình định mức 100

ml, tạo ra dãy nồng độ lần lượt: 10, 20, 30, 40 và 50 pg/ml

Hình 3.4 Dãy chuẩn gallic acid trong định lượng Polyphenol

Thuốc thử Folin Ciocalteu 10%: hút 20 ml thuốc thử, hòa tan với nước cất va

định mức trong bình định mức 200 ml.

12

Mẫu NazCO; 7,5%: cân 37,5 + 0,01 g Naz2CO3, hòa tan với nước cất và định mức

trong bình định mức 500 ml (sử dụng trong 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

Mẫu cao nhàu: cân 25 mg cao chiết, hoa tan với MeOH 80% và định mức ở bình

định mức 25 mI.

1 ml mẫu trắngmẫu cao chiết as 5 ml Folin Ciocalteu 10%

mau chuan gallic acid

|| Chờ từ 3 đến 8 phút

4 ml Na2CO3 10%

|Ì Chờ | tiếng ở trong tối

Đo ở bước sóng 765 nm

Hình 3.5 Quy trình định lượng Polyphenol.

Tién hành: lay 1 ml mẫu trang/ mau cao chiết/ mẫu chuẩn gallicacid (đã phaloãng) vào ống falcon, cho phản ứng với 5 ml thuốc thử Folin Ciocalteu 10% và ủ từ 3

đến 8 phút Sau đó thêm 4 ml NazCO: 10% Dé mau ở chỗ tối trong vòng 1 tiếng, dung

dịch được đo độ hap thu tại bước sóng 765 nm bang máy đo quang phố UV-Vis

Công thức tính hàm lượng Polyphenol:

cxV

m

TPC =

Trong đó:

TPC: hàm lượng Polyphenol tổng (mg GAE/g cao chiết)

c: giá tri x từ đường mẫu chuẩn gallic acid (g/ml)

V: thé tích dich chiết (ml)

m: khối lượng cao chiết có trong V thể tích (g)

3.3.1.4 Định lượng Flavonoid tổng số (Total flavone content - TFC)

Tổng hàm lượng Flavonoid được thí nghiệm bằng phương pháp Nhôm Clorua

theo Meilawati (2021).

13

Mẫu Quercetin chuẩn: cân chính xác 25 mg Quercetin, hòa tan với dung môi

MeOH và định mức trong bình định mức 25 ml, dung dịch chuẩn đạt nồng độ 1000ug/ml.

Mẫu NaNO? 5%: cân 2,5 g NaNOz, hòa tan với nước cất và định mức trong bình

Hình 3.6 Day chuẩn Quercetin trong định lượng Flavonoid

Tiến hành: lay 5 ml mẫu trắng/ mẫu cao nhàu vào ống Falcon, cho thêm 20 ml

nước cất vào Sau đó thêm 1,5 ml NaNO2 5%; chờ 5 phút rồi cho tiếp tục 1,5 ml AICI

10% Sau 6 phút hút thêm 20 ml NaOH 1M vào ống và định mức 50 ml bằng nước cat

Ở các ống chuẩn Quercetin được pha loãng thành dãy nồng độ: 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5

ug/ml (hút lần lượt 50; 125; 250; 375; 500; 625 pl mẫu chuẩn Quercetin), sau đó tiếptục thực hiện các bước tương tự như mẫu cao nhàu Dung dịch được đo độ hấp thu tại

bước sóng 510 nm bằng máy đo quang phô UV - Vis

14

5 ml mẫu cao nhàu/ mẫu trắng

Hoặc mẫu chuẩn Quercetin oP 20 ml nước cat

Hình 3.7 Quy trình định lượng Flavonoid.

Công thức tính hàm lượng Flavonoid:

cxV TFC = ——

m

Trong đó:

F: hàm lượng Flavonoid (mg QE/ g cao chiết)

c: giá trị x từ đường mẫu chuẩn Quercetin (ug/ml)

V: thé tích dịch chiết (ml)

m: khối lượng cao chiết có trong V thể tích (g)

3.3.2 Tạo hạt nano chitosan trái nhàu bằng phương pháp gel ion

Trong phan tao hat nano chitosan, sử dụng kết quả ở mục 3.3.1 để tạo ra một

lượng lớn cao trái nhàu nhằm sử dụng vào trong thí nghiệm này

15

Dựa vào kết quả từ bài nghiên cứu của Calvon và cộng sự (1997) tiến hành các

bước tạo hạt nano chitosan trái nhàu: 25 ml dung dich cao trái nhàu hòa đồng nhất với

25 ml dung dich chitosan 0,35% Sau đó nhỏ từ từ 20 ml STPP 0,6125% vào hỗn hợp

dung dịch trên với tốc độ khuấy là 1500 rpm Lấy thành phẩm đi phân tích hình thái bềmặt hạt nano bằng kính hiển vi quét phát xạ trường SU 8010, Hitachi và xác định kíchthước hạt và phạm vi phân bố kích thước hạt trong dung dịch bằng thiết bị phân tích

kích thước hat (Particle Size Analyzer) LB550, Horiba.

25 ml chitosan 0,35% dh 25 ml cao trai nhau

Hình 3.8 Quy trình tạo hat nano chitosan trái nhau.

3.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng đĩa thạch khuếch tán

Chuẩn bị môi trường Tryptone Soya Agar (TSA): cân 8 g TSA hòa tan với 200

ml nước cat, hấp tiệt trùng ở 120°C trong 15 phút Sau đó đồ 20 ml môi trường ra đĩa

petri, để nguội cho thạch đông Trước khi sử dụng, phơi đĩa thạch bên đèn cồn trong tủ

cay tir 15 dén 30 phut dé mặt thạch ráo nước

Chuẩn bị MeFarland 0.5: dung dịch BaCl; 1% (0,5 ml) trộn với dung dịchH;SO¿ 1% (99,5 ml) Day kin và dé được 6 tháng trong bóng tối Kiểm tra độ chính xáccủa McFarland 0.5 bang bước sóng 625 nm, OD = 0,08 — 0,1 va nong d6 cua McFarland

sẽ là 108 CFU/ml.

16

Nước muối sinh lý: 0,85 g NaCl hòa trong 100 ml nước cất 2 lần, hap tiệt trùng ở121°C trong 15 phút, để trong chai kín tránh bay hơi, sử dụng trong vòng 6 tháng ở nhiệt

độ phòng.

Tang sinh vi khuẩn: dùng que cây vô trùng lay vi khuẩn S Agalactiae từ ông

giống cấy ra đĩa môi trường TSA, ủ ở 37°C trong vòng 24 giờ

Chuẩn bị dịch khuẩn: sử dụng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ đĩa tăng sinh

hòa vào nước muối sinh ly và vortex mẫu đều, sau đó so sánh với dung dịch McFarland

0.5, điều chỉnh dịch khuẩn bằng cách thêm vi khuẩn hoặc nước muối sinh lý sao cho đạtnồng độ là 108 CFU/ml

H6n hợp dung dich nano chitosan trắng: các bước làm tương tự như hạt nanochitosan trái nhau ở mục 3.3.2 gồm 25 ml nước cất hòa với 25 ml dung dich chitosan

0,35%; sau đó nhỏ từ từ 20 ml STPP 0,6125% vào; hỗn hợp dung dịch tạo thành có chứa

các hạt nano chitosan trắng

Tiến hành: dùng micropipette hút 1 ml địch vi khuẩn cho lên đĩa thạch TSA, tranđều dich và để khô Nhỏ 40 pl dung dich chứa hạt nano chitosan trái nhàu, nano chitosantrắng và cao trái nhàu trên đĩa giấy tiệt trùng 6 mm, dé các dung dịch thấm đều, sau đódùng kẹp gắp các đĩa giấy đặt vào đĩa thạch đã cấy vi khuân Đối chứng dương được sửdụng là kháng sinh Ampicillin (10 ug), đối chứng âm là nước cất Các đĩa được úp

ngược và ủ ở 37°C trong vòng 24 gid.

Đọc và ghi nhận kết qua: sau 24 giờ, các dung dịch từ đĩa giấy khuếch tán ra

ngoài môi trường thạch và làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, tạo ra vòng trònkhông có vi khuan hay còn gọi là vòng vô khuẩn Dựa vào đường kính vòng vô khuan

dé xác định khả năng kháng vi khuan của các dung dịch (Muanza va ctv, 1994), cụ thé:

Đường kính < 6 mm: không kháng

Đường kính từ 7 — 9 mm: kháng yếu

Đường kính từ 10 — 14 mm: kháng vừa

Đường kính > 14 mm: kháng mạnh

3.3.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Chuẩn bị môi trường Tryptone Soya Broth (TSB): cân 1,5 g TSB pha trong 50

ml nước cắt, hấp tiệt trùng ở 120°C trong 15 phút

Chuẩn bi day nông độ của dung dich nano chitosan trái nhau: từ nồng độ gốc

cua dung dich nano chitosan trái nhàu là 1250 mg/] pha loãng dung dịch thành mười dãy

17

với các nồng độ lần lượt: 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,8125; 3,91; 1,95mg/l (tương ứng với các nồng độ từ giếng số 1 đến giếng số 10).

Tiến hành: cho lần lượt 100 pl TSB vào giếng đối chứng âm, đối chứng dương

và giếng dãy nồng độ từ 2 đến 10 Ở giếng số 1 hút 40 ul TSB vào, cho thêm 160 uldung dịch nano chitosan trái nhàu có nồng độ 0,125% và trộn đều Sau đó, hút 100 ul

dung dich từ giếng số 1 vào giếng số 2 và trộn đều, tiếp tục thực hiện thao tác nay cho

đến giếng số 10 (100 ul dung dịch tại giếng này sẽ được hút bỏ) Cho thêm 50 ul dich

khuẩn vào tat cả các giếng (từ giếng số 1 đến giếng số 10), tại giếng đối chứng đươngcũng cho thêm 50 pl dịch khuẩn, còn giếng đối chứng âm hút thêm 50 pl nước muốisinh lý Phần đĩa giếng sẽ được ủ ở 37°C trong vòng 24 giờ Sau thời gian trên, cho thêm

20 ul thuốc thử INT DYE 0,05% vào tat cả các giếng, chờ khoảng 30 phút va xem xét

hiện tượng xảy ra.

Đọc kết quá: MIC (Minimum Inhibitory Concentration) là nồng độ tối thiểu củakháng sinh có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, thê hiện rõ mối tương quangiữa độ nhạy cảm của vi sinh vật đối với thuốc hay các loại kháng sinh Khi cho thuốc

thử INT DYE 0,05% vào, tại các giếng có sự xuất hiện của vi khuẩn sẽ làm thay đôi

màu dung dich, dung dịch sẽ chuyển sang màu hồng, từ đó ghi nhận các giá trị MIC.3.3.5 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

MBC được xác định là nồng độ mà tại đó không có sự xuất hiện cùa vi khuẩn có

trên môi trường thạch cay lên đĩa thạch TSA Sử dụng que cấy vòng lấy dung dịch của

các nồng độ đã chọn và cấy ria trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37°C trong vòng 24 giờ,

quan sát sự sống sót của vi khuẩn MBC được xác định là nồng độ mà tại đó không có

sự xuất hiện của loại khuẩn lạc nào có trên đĩa môi trường thạch TSA

18

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cao chiết trái nhàu

Định tính Flavonoid

Dich NaOH AICI; l FeCl, j

| _ chiết 1% 1% ihe te

Hinh 4.1 Két qua dinh tinh flavonoid.

Bang 4.1 Kết qua phan ứng xảy ra khi định tinh Flavonoid

Ong nghiệm Hiện tượngDịch chiết Màu nâu nhạtDịch chiết + NaOH 1% Màu nâu đậm

Dịch chiết + AICI; 1% Ánh vàng, tươi hon mau dich chiếtDịch chiết + FeCl; 1% Màu xanh đậm, đục

Từ những phan ứng xảy khi cho thêm một sô hóa chất như NaOH 1%, AICla 1%hay FeCl; 1%, các kết quả đều cho thấy trong mẫu nguyên liệu đều dương tính với cả

ba phản ứng trên Do đó, có thé kết luận rằng mẫu nguyên liệu đều chứa flavonoid

Cao trái nhàu được điều chế có màu nâu sam, phần bột nhàu được xác định có độ

ầm là 11,5%

19