DANH SÁCH CÁC BANG
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022 tại phòng Độc chất học Môi trường (RIBE 106), thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại Học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh và phòng Bệnh thủy sản (PV 309), khoa Thủy Sản, Đại Học Nông Lam, thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng là trái nhàu khô được mua trên thị trường.
Say 60 °C
—>
Xay
Hình 3.1. Trái nhàu khô và bột trái nhàu.
3.2.2. Vi khuẩn nghiên cứu
Chung vi khuan Streptococcus agalactiae được cung cấp bởi phòng Bệnh học Thủy Sản (PV 309), khoa Thủy sản, Đại Học Nông Lâm, thành phó Hồ Chí Minh. Vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA trong vòng 24 giờ.
Hình 3.2. Streptococcus agalactiae trên môi trường TSA.
3.2.3. Hóa chất và dụng cụ
Bảng 3.1. Danh sách hóa chất, thuốc thử sử dụng trong thí nghiệm
Methanol NaOH 1%
AIC]; 1%
FeCl; 1%
Folin Ciocalteu 10%
Naz2CO3 7.5%
Acid gallic NaNO? 5%
AIC]; 10%
NaOH 1M Quercetin
Chitosan (deacetyl > 75%, HiMedia)
Thuốc nhuộm Int Dye
Sinh khối vi khuẩn:
Streptococcus agalactiae
Ampicillin (10 pg) thuộc Công ty TNHH dich vu va thuong mai Nam Khoa
NaCl BaC]› 1%
H2SO, 1%
Môi trường Tryptone Soya Agar Môi trường Tryptone Soya Broth
Bảng 3.2. Danh sách thiết bị sử dung trong thi nghiệm Bếp đun cách thủy Tủ cay vi sinh Hộp hút 4m Tủ sấy
Tủ sấy Nồi hấp tiệt trùng Máy đo quang phổ UV-Vis Đĩa petri
Máy khuấy MicropIpet
Máy Vortex
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều chế cao trái nhàu
Khảo sát hai yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất điều chế cao chiết là tỉ lệ giữa bột
nhàu với dung môi MeOH 80% (1:3, 1:5, 1:7, 1:10) và thời gian ngâm (12 giờ, 24 giờ,
36 giờ và 48 giờ). Các yếu tố được thực hiện đồng thời với nhau, các nghiệm thức lặp lại ba lần.
10
Cân 5 g bột nhàu được ngâm cùng với dung môi MeOH 80% trong bình tam giác
250 ml, lắc nhẹ và ngâm qua đêm. Sau đó lọc, thu dịch chiết, tiến hành cô cạn dịch dé
làm bay hơi dung môi, tạo ra cao nhàu. Cao được bảo quản ở nhiệt độ 59C.
Tỉ lệ bột nhàu : dung môi
l3 lã 17 1110 , „ Cô „ Bột nhàu >| Loc lây dịchchit |———> Cao chiệt
Thời gian ngâm (giờ) l2 24 36 48
|
Hinh 3.3. Quy trinh diéu ché cao trai nhau.
Công thức tính hiệu suất cao chiết:
H=~x 100
—M
Trong đó:
H: hiệu suất cao chiết (%)
m: khối lượng cao chiết thu được (g) M: khối lượng nguyên liệu (g).
Khi điều chế cao trái nhàu cần thực hiện thêm một số chỉ tiêu bao gồm: xác định độ 4m bột nhàu, định lượng Polyphenol, định tính và định lượng Flavonoid.
3.3.1.1. Xác định độ 4m
Sử dụng đĩa petri và sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi, xác định khối lượng của đĩa petri sau khi sấy (g). Sau đó, cho một khối lượng bột nhàu nhất định vào dia petri, sử dụng cân bốn số dé xác định khối lượng ban đầu. Đặt đĩa vào tủ say ở nhiệt độ 105°C, sau khi say đến khối lượng không đổi, đưa đĩa mẫu vào hộp hút âm trong vòng từ 30 phút đến 1 tiếng và ghi nhận kết quả.
Công thức tính độ ẩm:
_ Le Cag
m1 — n0 Trong đó:
W: độ âm dược liệu (%)
m0: Khối lượng đĩa sau khi sấy đến khối lượng không đôi (g)
II
m1: Khối lượng của đĩa và mẫu trước khi sấy (g)
m2: Khối lượng của đĩa và mẫu sau khi say đến khối lượng không đổi (g).
3.3.1.2. Dinh tính Flavonoid
Bang 3.3. Cac phan ứng hóa học định tinh Flavonoid
Phan ứng với Phản ứng với Phản ứng với NaOH 1% AIC] 1% FeCl; 1%
- 2 ml dịch chiết 2 ml dịch chiết 2 ml dịch chiết
Mau thử ; . .
+2 giotNaOH 1% +2 giọt AIC] 1% +2 giọt FeCh 1%
Dung dịch sẽ đậm Dung dich sé Dung dịch sẽ
Kết quả màu hơn so với chuyên sang màu chuyển sang mau dung dịch ban đầu vàng tươi hơn xanh đen hoặc xanh
lục
3.3.1.3. Định lượng Polyphenol tổng số (Total phenolic content - TPC)
Định lượng Polyphenol tổng số theo TCVN 9745:2013 (ISO 1450-1:2005).
Mau gallic acid chuẩn: cân chính xác 25 mg gallic acid, hòa tan trong nước cất và định mức 25 ml, tao ra được dung dich chuẩn 1000 pg/ml. Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5 ml từ dung dich gallic acid gốc, sau đó pha loãng và định mức trong bình định mức 100 ml, tạo ra dãy nồng độ lần lượt: 10, 20, 30, 40 và 50 pg/ml.
Hình 3.4. Dãy chuẩn gallic acid trong định lượng Polyphenol.
Thuốc thử Folin Ciocalteu 10%: hút 20 ml thuốc thử, hòa tan với nước cất va
định mức trong bình định mức 200 ml.
12
Mẫu NazCO; 7,5%: cân 37,5 + 0,01 g Naz2CO3, hòa tan với nước cất và định mức
trong bình định mức 500 ml (sử dụng trong 1 tháng ở nhiệt độ phòng).
Mẫu cao nhàu: cân 25 mg cao chiết, hoa tan với MeOH 80% và định mức ở bình
định mức 25 mI.
1 ml mẫu trắng
mẫu cao chiết as 5 ml Folin Ciocalteu 10%
mau chuan gallic acid
|| Chờ từ 3 đến 8 phút
4 ml Na2CO3 10%
|Ì Chờ | tiếng ở trong tối
Đo ở bước sóng 765 nm
Hình 3.5. Quy trình định lượng Polyphenol.
Tién hành: lay 1 ml mẫu trang/ mau cao chiết/ mẫu chuẩn gallicacid (đã pha loãng) vào ống falcon, cho phản ứng với 5 ml thuốc thử Folin Ciocalteu 10% và ủ từ 3 đến 8 phút. Sau đó thêm 4 ml NazCO: 10%. Dé mau ở chỗ tối trong vòng 1 tiếng, dung dịch được đo độ hap thu tại bước sóng 765 nm bang máy đo quang phố UV-Vis.
Công thức tính hàm lượng Polyphenol:
cxV
m
TPC = Trong đó:
TPC: hàm lượng Polyphenol tổng (mg GAE/g cao chiết) c: giá tri x từ đường mẫu chuẩn gallic acid (g/ml)
V: thé tích dich chiết (ml)
m: khối lượng cao chiết có trong V thể tích (g)
3.3.1.4. Định lượng Flavonoid tổng số (Total flavone content - TFC)
Tổng hàm lượng Flavonoid được thí nghiệm bằng phương pháp Nhôm Clorua
theo Meilawati (2021).
13
Mẫu Quercetin chuẩn: cân chính xác 25 mg Quercetin, hòa tan với dung môi MeOH và định mức trong bình định mức 25 ml, dung dịch chuẩn đạt nồng độ 1000
ug/ml.
Mẫu NaNO? 5%: cân 2,5 g NaNOz, hòa tan với nước cất và định mức trong bình
định mức 50 ml.
Mau AICI; 10%: cân 5 g AICã, hòa tan với nước cat và định mức trong bình định
mức 50 ml.
Mẫu NaOH 1M: cân 10 g NaOH, hòa tan với nước cất, để nguội và định mức
trong bình định mức 250 ml.
Mẫu cao nhàu: cân 25 mg cao chiết, hòa tan với MeOH 80% và định mức ở bình
định mức 25 ml.
eS
Hình 3.6. Day chuẩn Quercetin trong định lượng Flavonoid.
Tiến hành: lay 5 ml mẫu trắng/ mẫu cao nhàu vào ống Falcon, cho thêm 20 ml nước cất vào. Sau đó thêm 1,5 ml NaNO2 5%; chờ 5 phút rồi cho tiếp tục 1,5 ml AICI 10%. Sau 6 phút hút thêm 20 ml NaOH 1M vào ống và định mức 50 ml bằng nước cat.
Ở các ống chuẩn Quercetin được pha loãng thành dãy nồng độ: 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5 ug/ml (hút lần lượt 50; 125; 250; 375; 500; 625 pl mẫu chuẩn Quercetin), sau đó tiếp tục thực hiện các bước tương tự như mẫu cao nhàu. Dung dịch được đo độ hấp thu tại bước sóng 510 nm bằng máy đo quang phô UV - Vis.
14
5 ml mẫu cao nhàu/ mẫu trắng
Hoặc mẫu chuẩn Quercetin oP 20 ml nước cat
(50. 125. 250. 375. 500. 625 ul)
1,5 ml NaNO) 5%
I] Chờ 5 phú
1,5 ml ALCL; 10%
Il Chờ 6 phút
20 ml NaOH 1M
J
Dinh mức 50 ml
|
Do ở bước sóng 510
>
Hình 3.7. Quy trình định lượng Flavonoid.
Công thức tính hàm lượng Flavonoid:
cxV TFC = ——
m
Trong đó:
F: hàm lượng Flavonoid (mg QE/ g cao chiết) c: giá trị x từ đường mẫu chuẩn Quercetin (ug/ml) V: thé tích dịch chiết (ml)
m: khối lượng cao chiết có trong V thể tích (g)
3.3.2. Tạo hạt nano chitosan trái nhàu bằng phương pháp gel ion
Trong phan tao hat nano chitosan, sử dụng kết quả ở mục 3.3.1 để tạo ra một lượng lớn cao trái nhàu nhằm sử dụng vào trong thí nghiệm này.
15
Dựa vào kết quả từ bài nghiên cứu của Calvon và cộng sự (1997) tiến hành các bước tạo hạt nano chitosan trái nhàu: 25 ml dung dich cao trái nhàu hòa đồng nhất với
25 ml dung dich chitosan 0,35%. Sau đó nhỏ từ từ 20 ml STPP 0,6125% vào hỗn hợp dung dịch trên với tốc độ khuấy là 1500 rpm. Lấy thành phẩm đi phân tích hình thái bề mặt hạt nano bằng kính hiển vi quét phát xạ trường SU 8010, Hitachi và xác định kích thước hạt và phạm vi phân bố kích thước hạt trong dung dịch bằng thiết bị phân tích
kích thước hat (Particle Size Analyzer) LB550, Horiba.
25 ml chitosan 0,35% dh 25 ml cao trai nhau
ÿ 1500 rpm
20 ml STPP 0,6125%
J Nhỏ từ từ
Dung dịch chứa hạt nano chitosan trái nhàu
Ù
Xác định hình thái, kích thước hạt
Hình 3.8. Quy trình tạo hat nano chitosan trái nhau.
3.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng đĩa thạch khuếch tán
Chuẩn bị môi trường Tryptone Soya Agar (TSA): cân 8 g TSA hòa tan với 200 ml nước cat, hấp tiệt trùng ở 120°C trong 15 phút. Sau đó đồ 20 ml môi trường ra đĩa petri, để nguội cho thạch đông. Trước khi sử dụng, phơi đĩa thạch bên đèn cồn trong tủ cay tir 15 dén 30 phut dé mặt thạch ráo nước.
Chuẩn bị MeFarland 0.5: dung dịch BaCl; 1% (0,5 ml) trộn với dung dịch H;SO¿ 1% (99,5 ml). Day kin và dé được 6 tháng trong bóng tối. Kiểm tra độ chính xác của McFarland 0.5 bang bước sóng 625 nm, OD = 0,08 — 0,1 va nong d6 cua McFarland
sẽ là 108 CFU/ml.
16
Nước muối sinh lý: 0,85 g NaCl hòa trong 100 ml nước cất 2 lần, hap tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút, để trong chai kín tránh bay hơi, sử dụng trong vòng 6 tháng ở nhiệt
độ phòng.
Tang sinh vi khuẩn: dùng que cây vô trùng lay vi khuẩn S. Agalactiae từ ông giống cấy ra đĩa môi trường TSA, ủ ở 37°C trong vòng 24 giờ.
Chuẩn bị dịch khuẩn: sử dụng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ đĩa tăng sinh hòa vào nước muối sinh ly và vortex mẫu đều, sau đó so sánh với dung dịch McFarland 0.5, điều chỉnh dịch khuẩn bằng cách thêm vi khuẩn hoặc nước muối sinh lý sao cho đạt nồng độ là 108 CFU/ml.
H6n hợp dung dich nano chitosan trắng: các bước làm tương tự như hạt nano chitosan trái nhau ở mục 3.3.2 gồm 25 ml nước cất hòa với 25 ml dung dich chitosan 0,35%; sau đó nhỏ từ từ 20 ml STPP 0,6125% vào; hỗn hợp dung dịch tạo thành có chứa các hạt nano chitosan trắng.
Tiến hành: dùng micropipette hút 1 ml địch vi khuẩn cho lên đĩa thạch TSA, tran đều dich và để khô. Nhỏ 40 pl dung dich chứa hạt nano chitosan trái nhàu, nano chitosan trắng và cao trái nhàu trên đĩa giấy tiệt trùng 6 mm, dé các dung dịch thấm đều, sau đó dùng kẹp gắp các đĩa giấy đặt vào đĩa thạch đã cấy vi khuân. Đối chứng dương được sử dụng là kháng sinh Ampicillin (10 ug), đối chứng âm là nước cất. Các đĩa được úp
ngược và ủ ở 37°C trong vòng 24 gid.
Đọc và ghi nhận kết qua: sau 24 giờ, các dung dịch từ đĩa giấy khuếch tán ra ngoài môi trường thạch và làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, tạo ra vòng tròn không có vi khuan hay còn gọi là vòng vô khuẩn. Dựa vào đường kính vòng vô khuan dé xác định khả năng kháng vi khuan của các dung dịch (Muanza va ctv, 1994), cụ thé:
Đường kính < 6 mm: không kháng
Đường kính từ 7 — 9 mm: kháng yếu
Đường kính từ 10 — 14 mm: kháng vừa Đường kính > 14 mm: kháng mạnh
3.3.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Chuẩn bị môi trường Tryptone Soya Broth (TSB): cân 1,5 g TSB pha trong 50 ml nước cắt, hấp tiệt trùng ở 120°C trong 15 phút.
Chuẩn bi day nông độ của dung dich nano chitosan trái nhau: từ nồng độ gốc
cua dung dich nano chitosan trái nhàu là 1250 mg/] pha loãng dung dịch thành mười dãy 17
với các nồng độ lần lượt: 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,8125; 3,91; 1,95 mg/l (tương ứng với các nồng độ từ giếng số 1 đến giếng số 10).
Tiến hành: cho lần lượt 100 pl TSB vào giếng đối chứng âm, đối chứng dương và giếng dãy nồng độ từ 2 đến 10. Ở giếng số 1 hút 40 ul TSB vào, cho thêm 160 ul dung dịch nano chitosan trái nhàu có nồng độ 0,125% và trộn đều. Sau đó, hút 100 ul dung dich từ giếng số 1 vào giếng số 2 và trộn đều, tiếp tục thực hiện thao tác nay cho đến giếng số 10 (100 ul dung dịch tại giếng này sẽ được hút bỏ). Cho thêm 50 ul dich khuẩn vào tat cả các giếng (từ giếng số 1 đến giếng số 10), tại giếng đối chứng đương cũng cho thêm 50 pl dịch khuẩn, còn giếng đối chứng âm hút thêm 50 pl nước muối sinh lý. Phần đĩa giếng sẽ được ủ ở 37°C trong vòng 24 giờ. Sau thời gian trên, cho thêm 20 ul thuốc thử INT DYE 0,05% vào tat cả các giếng, chờ khoảng 30 phút va xem xét
hiện tượng xảy ra.
Đọc kết quá: MIC (Minimum Inhibitory Concentration) là nồng độ tối thiểu của kháng sinh có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, thê hiện rõ mối tương quan giữa độ nhạy cảm của vi sinh vật đối với thuốc hay các loại kháng sinh. Khi cho thuốc thử INT DYE 0,05% vào, tại các giếng có sự xuất hiện của vi khuẩn sẽ làm thay đôi màu dung dich, dung dịch sẽ chuyển sang màu hồng, từ đó ghi nhận các giá trị MIC.
3.3.5. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
MBC được xác định là nồng độ mà tại đó không có sự xuất hiện cùa vi khuẩn có trên môi trường thạch cay lên đĩa thạch TSA. Sử dụng que cấy vòng lấy dung dịch của các nồng độ đã chọn và cấy ria trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37°C trong vòng 24 giờ, quan sát sự sống sót của vi khuẩn. MBC được xác định là nồng độ mà tại đó không có sự xuất hiện của loại khuẩn lạc nào có trên đĩa môi trường thạch TSA.
18