Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu công thức tạo viên hoàn kết hợp nghệ vàng (Curcuma longa) và đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)

Chính vì thé đề tài “Nghiên cứu công thức tạo viên hoàn kết hợp Nghệ vàng Curcuma longa và Đông trùng hạ thảoCordyceps militaris” được thực hiện nhằm mục đích tìm ra công thức tạo ra sản

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC TẠO VIÊN HOÀN KÉT HỢP

NGHỆ VÀNG (Curcuma longa)

VA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : LÊ THỊ LAN THẢO

Mã số sinh viên — : 18126152

Niên khóa : 2018 - 2022

Thủ Đức, 03/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC TẠO VIÊN HOÀN KÉT HỢP

NGHỆ VÀNG (Curcuma longa)

VÀ ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS LÊ THỊ DIỆU TRANG LÊ THỊ LAN THẢO

TS PHÙNG VO CAM HONG

Thủ Đức, 03/2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủnhiệm Khoa Khoa học sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình truyền đạt kiến thức

trong quá trình học tập tại trường.

Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện về cơ sởvật chất, trang thiết bị trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Diệu Trang và TS Phùng Võ Câm Hồng

đã tận tình quan tâm và hết lòng truyền đạt cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm quýbáu Cô luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình làm

đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị, các bạn Phòng Nghiên cứu

và phát triển Cordyceps đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt thời gian em thựchiện và hoàn thành dé tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn quý thay cô, anh chị

và các bạn Phòng VI sinh, Phòng Hoá sinh đã hỗ trợ và tạo điều kiện trong quá trìnhthực hiện đề tài

Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thé lớp DH18SHB đã luôn bên cạnhủng hộ tinh thần, động viên em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại trường

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Thị Lan Thảo, MSSV: 18126152, Lớp: DHI8SHB (Số diđộng: 0394739369, Email: 18126152@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệSinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Tôi xác nhận kết quả trình bay trong tiêu luận nay là do chính tôi thực hiện Détài trung thực và không có sự sao chép hay sử dụng kết quả của đề tài nghiên cứu nào

tương tự Đề tài có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn nguồn vàchú thích rõ ràng Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về những cam kết

nảy.

Tp Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 02 năm 2023

Người việt cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)

Lê Thị Lan Thảo

1

TÓM TẮT

Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng công thức viên hoàn kết hợp Nghệ vàng(Curcuma longa), Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) và một số tá dược Các chitiêu khảo sát các công thức phối trộn của viên hoàn bao gồm đánh giá hoạt tính chốngoxy hóa trên cơ sở của phản ứng bắt gốc tự do DPPH và đánh giá hoạt tính khángkhuẩn đối với ba loài vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus, Salmonella và

Escherichia coli Đồng thời, nghiên cứu thực hiện khảo chỉ tiêu sát độ ẩm, độ đồng đều

và chỉ tiêu giới hạn vi sinh vật theo tiêu chuan Dược điển Việt Nam V, tập 2 Cuốicùng, nghiên cứu thực hiện đánh giá cảm quan của người sử dụng đối với nghiệm thứclựa chọn cuối cùng thông qua các chỉ tiêu về hình dạng, màu sắc, mùi và vị

Trong nghiên cứu này, kết quả định lượng bằng phương pháp HPLC cho thấyhàm lượng Curcuminoid tông số trong bột nghệ vàng là 45191 mg/kg va hàm lượngAdenosine, Cordycepin trong bột DTHT lần lượt là 1098,4 + 0,014 mg/kg và 5798,7 +0,015 mg/kg Kết quả khảo sát ba công thức phối trộn cho thấy nghiệm thức 3 với tỷ

lệ bột nghệ:bột DTHT:mat ong là 10:2:10 thé hiện kha nang khang oxy hoa cao nhatvới ICso = 6095,66 + 0,02 mg/L Thử nghiệm khang khuan của viên hoàn ở nghiệmthức 3 cho kết qua kháng mạnh đối với Salmonella, kháng yêu đới với Staphylococcusaureus và không thê hiện tính kháng đối với Escherichia coli Kết quả khảo sát độ 4m

và độ đồng đều cũng cho kết quả đáp ứng yêu cầu của Dược điển Việt Nam V Kết quảkhảo sát cảm quan của người dùng theo TCVN 3215-79 đối với viên hoàn ở mức Khá

Từ khóa: Curcuma longa, Cordyceps militaris, hàm lượng được chat, khang oxy hoá,kháng khuẩn

il

This study was conducted to investigate a pill formulation that combines

Turmeric (Curcuma longa), Cordyceps militaris, and other excipients The antioxidant

activity of pill was evaluated on the basis of the DPPH free radical scavenging method.

The antibacterial activity of pills against Staphylococcus aureus, Salmonella, and

Escherichia coli was also investigated Simultaneously, the study carried out evaluated moisture, uniformity, and microbial limits according to Vietnam Pharmacopoeia V, volume 2 Finally, the study was conducted the evaluation organoleptic of users for the formulation of selected pill through the criteria of shape, color, smell, and taste.

In this study, the analytical quantification Turmeric power and Cordyceps power were found 45191 mg/kg total curcuminoid, 1098,4 + 0,014 mg/kg adenosine,

and 5798,7 + 0,015 mg/kg cordycepin The pill formulation with the ratio of 10:2:10

(turmeric powder:turmeric powder:honey) was the best properties of antioxidant and antibacterial The selected pill formulation showed good antioxidant ability with the value of ICso = 6095,66 + 0,02 mg/L The antibacterial activity test showed good antimicrobial properties against Salmonella but less effective on Staphylococcus aureus and not effective on Escherichia coli The evaluation of moisture and uniformity met the requirement of the Vietnam Pharmacopoeia V The evaluation

organoleptic of users for the selected pill formulation according to TCVN 3215-79 was

in a Good level.

Keywords: Curcuma longa, Cordyceps militaris, drug content, antioxidant, antibacterial.

1V

MỤC LỤC

Trang

LOI CAM 09) iXÁC NHAN VA CAM DOAN u s:ssssssssessessesessessesessesssesssessssessesiesesseesessseeaseesseesees iiTIẾT TE cnn I A 0.00480168010001 iti

rood Ra Cl Ae 1V

J#”\.112.,1B)®2#77% #2188 g1 j8 TT ỐỐỐẺỐẺẺẻẻẻẻẽ ViiiiDANH MỤC CAC BẢNG ¿- 5s S212 1E1121112112111111211111121111 2111112 e6 VIDANH MỤC CÁC HÌNH 2- 2 22S2+S22E9EE2E12321211212121121121211211212112121 2112 x6 ixChurong 1 MO DAU osecsccsscsssesssesssesssesssesssesssssssessuesssesssesssssisessssssssssessesssesssessseesseestees |1.1 Đặt vấn đề - 5-21 221221211212121121212112111211212111111112112111211212122122 ae |

1.2 Mục tiÊU - - + 5-2 St 2 3 TT TT 1T TH TT nh 2

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2- 2 25222222222++EE2E+2EE2EE+EEzEEzzxzzxerxez 32.1 Tổng quan về ĐTHT Cordyceps SpỤ -2-©22©22-52222222+22E2EE2EE22E222E2Ezzxervez 321⁄1 Tổng quan TT TT C m HN ccs accemsonionneneunimannnnsenamnenimencsmnteneidMCA occa, CF 16S 52.2 Tổng quan về Nghệ Curcuima SP - 5 52-52-552©2222222222E+22E2EE2EE2E2EEzEzzrrrsez 62.2.1 Tổng quan về Nghệ vàng C 7Ø7ia 2-2 222222222222EE£2E+2EE22E22Exczxzre 62.2.2 Giới thiệu về viên hoàn bột nghệ vàng - 2-2 ©++22++EE++£z++£x+zzxzzr+z 82.3 Tổng quan về hoạt tinh sinh học của Nghệ vàng va ĐTHT - 82.4 Tổng quan về mat ong - 2-22 2+2222222EE22E+2EE22322212211221221211221 2122212 xe 9

24.1: CONS GUNS của mật ONG creesseesestssnnnsritnididiilinriiigtse10014301000183439036791800630010088/400000Ä 9

2.4.2 Thành phan hoá học của mật ong 2-2-©2222+222+222++22+2ES+z2zzzzxrsrsree 10

25 Tone rao viễn HBÕNaseseaessioiosotoostorletiglotGi0400AIGG101GI4G0/E4GG0G30GGI8005G00 43006 112.5.1 Thành phan của viên Hoan cccccccecsecsessessesseesessessessessessessesseesessessessesseeeeeseees 11

2.3.2 Phưỡng plap tạo viễn NOAM ssccvssssssscanancssssssrvvnenesssvsasaxenswsassnse seasserscossosivanesneenens 11

2.6 Tổng quan về một số phương pháp phân tích va đánh giá - - 122.6.1 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) -22©55252555522 123.6.3, Phiưwng phần khiếu: tấn: ỦĨA, e sen Ha HH ncecoss 30H37 cEtS0H Hong 122.6.3 Phương pháp đánh giá tính kháng 0x1 hoá - cece S+cs+cs+ceereerrrrrs 122.6.4 Phương pháp sấy nhiệt - 22222 22S221222122212221227122212221221121121122 e6 133.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu 2: 2 2222222E+EE2EE+EE2E+2EEzErzrxrrxrsree 143.2 Vật liệu và thiết bị 5: 2522S2212212522122121212112112122121212121121211212111 22 xe 14

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu - - 5 5252 +2 £+£+e£xerersrerrrerrreree 143.3.1 Nội dung 1: Đánh giá hàm lượng dược chat của nguyên liệu đầu vào 143.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ty lệ phối trộn bột nghệ vàng và ĐTHT itis)

2 :2:25La INDY GIG Hịpiaesgbssxsotiov2 tg00USE00VS0ROSGIEGUESEEIAGEEIGE)EGIEGIQ.U5013.S082%0100)801C0033u6i200rsE 15

3.3.2.2 Xây dựng các nghiệm thức phối trộn từ các dược liệu - 15

3.3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá - - 16

3.3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật - 18

CO, «con ao nh nh CHƯng.EEUHHHÓE 2.2/00 00000 00.271000000227200120150.00010100 19

3.3.2.6 Khảo sát độ đồng đều 2-22¿©222222222122212221221127112711221.221 21c xcee 20

3.4 Nội dùng 3: Chon công tht Cres cssssccsessesevesessensensesesseresrneverevenunesyesvevessnmseveeseressnes 20

3.4.1 Khao sát chỉ tiêu giới hạn nhiễm khuẩn -2- 2 2 222z+2z22+zzxz2zzzxze 203.4.2 Khảo sát cảm quan về hình dạng, mùi, vị và màu sắc của viên hoàn 21Chrome 4 KẾT GI1Á Xã THÁO TAIN ss saiecsoavesncnnasasnceneonsaurvnre niente tienoncinvastons 23

AD Kt QUa eee ceccccc cece cccseccseessesssecsssesssessscssecsssssnsesisesssssiestessieesnessieesseeseesesseeseeeseesees 234.1.1 Nội dung 1: Hàm lượng được chất của nguyên liệu đầu vào 234.1.1.1 Hàm lượng Adenosine và Cordycepin trong bột ĐTHT 234.1.1.2 Hàm lượng Curcuminoid tổng số trong bột nghệ - 2-5222: 25

4.1.2 Nội dung 2: Khảo sát tỷ lệ phối trộn bột nghệ vàng và ĐTHÍT 25

4.1.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả nang kháng oxy hoá - 5-5 25

4.1.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật - 28s8 KTinrffiffTlTtaeeeesaaetrrergroerrttiEtin en 294.1.2.4 Khảo sát độ đồng đều 2-22 2S2221221221122122112112212211221211211 2212 xe 304.1.3 Nội dung 3: Chọn công thức - - - ¿5-5 S+cs+ssessrrsresrrrrrsrrrrrrrererrreerr2Ô4.1.3.1 Khảo sát giới hạn nhiễm khuân 22-©222+2222+222+rreErrrrrrrrrrrrrrrrer 314.1.3.2 Khảo sát cảm quan về hình dạng, mùi, vi và mau sắc của viên hoàn 31

AD THAG: I BT exes 868565613596138506156856513M638:1E53ESEIGBIESu 1GS61E.G038.105 H04583HGHIGG60018u6g9GL358E050-18855 G08gggi80 324.2.1 Nội dung 1: Hàm lượng được chat của nguyên liệu đầu vào 32

4.2.2 Nội dung 2: Khảo sát tỷ lệ phối trộn bột nghệ vàng va ĐTHÍT 334.2.3 Nội dung 3; Chọricðng tte: cscs caccscisaumssssdeuisateauiieas venti nenstadiedanissis savanna 34

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHI 0 cscsscssessecseeseeseesseseesecsevsseseveeveseeeeeseeeesseee363L], Nất THẾ boraebgabaoniosrtonhoicogriAibuiotroibistiogiS00S4GTNnSMEIBNRGUNHGG)SEONGNNGESRGSGDGEGEiSSMi 36

TL ee 36

PHỤ LỤC

VI

DANH MỤC CAC CHỮ VIET TAT

Don vị khuẩn lac (Colony — Forminh Unit)

Cong tac vién Cuscuta chinensis polysaccharide 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

Dược điển Việt Nam

Đông trùng hạ thảo Lipopolysaccharide Interleukin

Nghiệm thức Acid ribonucleic

Tiêu chuẩn Việt Nam

Interferon

Vi sinh vật hiéu khí

Vil

DANH MỤC CAC BANG

Trang

Bảng 3.1 Các nghiệm thức phối trộn từ các loại dược liệu -. -z-z 16

Bang 3.2 Giới hạn chênh lệch khối lượng cho phép đối với viên hoản 20

Bang 3.3 Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo mùi, vị và màu sắc 22

Bang 4.1 Kết quả đường chuẩn Adenosine bằng phương pháp HPLC 23

Bảng 4.2 Kết quả đường chuẩn Cordycepin bằng phương pháp HPLC 24

Bảng 4.3 Hàm lượng Adenosine và Cordycepin trong bột ĐTHT bằng phương pháp HE ceca me 0 68n n8 24 Bảng 4.4 Hàm lượng Curcuminod tổng số của mẫu bột nghệ bằng phương pháp HPLC ¬—— 25

Bảng 4.5 Kết quả xác định ICso theo phương pháp DPPH của Ascorbic acid 25

Bang 4.6 Kết qua xác định ICs0 theo phương pháp DPPH của ba nghiệm thức 26

Bảng 4.7 Kết quả đường kính vòng vô khuẩn của ba nghiệm thức phối trộn 29

Bảng 4.8 Độ ầm của viên hoàn ở ba nghiệm thức phối trỘn -cccS<<ccssesss 30 Bảng 4.9 Độ lệch khối lượng của viên hoàn ở ba nghiệm thức phối trộn so với khối Twong trung DIN 0 30

Bang 4.10 Kết quả phân tích mức độ nhiễm vi sinh của viên hoàn ở NT3 31 Bảng 4.11 Kết quả đánh giá cảm quan các chỉ tiêu theo điểm chung của viên hoàn NT3

Si a i ce tre tm ie ra Saal om Sa 32

vill

CHRGHIHGTDGIHDEE tangnERNGhỊA HN REA'V.NNSLREONESERUNGENREDRNGINEEEESSGEEHSRSSS00G14103090089.0Egrit 6

Cấu trúc của Curcumii 2-2 52+SE+2E+2E22E22121221121211211211211211211212 2120 7Biểu đồ đường chuẩn Adenosine bằng phương pháp HPLC 23Biểu đồ đường Cordycepin bằng phương pháp HPLC - 24

Hoạt tính kháng oxy hóa cua Ascorbic acid trong thử nghiệm DPPH 26

Hoạt tính khang oxy hóa của viên hoàn ở NT1 trong thử nghiệm DPPH 27 Hoạt tính kháng oxy hóa của viên hoàn ở NT2 trong thử nghiệm DPPH 27

Hoạt tính kháng oxy hóa của viên hoan ở NT3 trong thử nghiệm DPPH 27Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 2-2 ©2222222E22z2222z+zzzzzx2 28Thử nghiệm hoạt tính kháng khuân - - 2-2-2 ©5222++czczesrxrrrz 29

Ty lệ đánh gia cảm quan về hình dạng, mùi, vi va mau sắc đôi với NT3 32

1X

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong bối cảnh kinh tế, xã hội ngày càng phát triển, đời sống người dân đượcnâng cao và đặc biệt là vừa trải qua thời kỳ ảnh hưởng nghiêm trọng do dịch bệnh

Covid-19, con người càng có ý thức hon trong việc bảo vệ sức khoẻ của mình một cach

khoa học Hiện nay, việc sử dụng các loại dược liệu hỗ trợ phòng và điều trị bệnh đã vàđang trở thành xu hướng phát triển mạnh mẽ, không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiềunước trên thế giới vì hầu hết các được liệu này đều có độ an toàn cao, ít gây ra tác dụngphụ va dé dang sử dụng Việc kết hợp các loại được liệu với thành phan và ty lệ phù hợp

đề tạo ra sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh, cải thiện và nâng cao sức khoẻ con người đangđược các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.

Nghệ vàng (Curcuma longa) là loài cây có ứng dụng rộng rai trong việc hỗ trợ

điều trị bệnh cùng với việc làm dep, làm gia vi và pham mau trong ché bién thuc pham.

Thành phan hóa học của nghệ rat giàu curcuminnoids, terpenoid, steroid, các acid béo,

là những chất có hoạt tính sinh học quý có tác dụng hỗ trợ chữa các bệnh về dạ dày, các

chứng bệnh về gan diệt khuẩn, chống viêm nhiễm và bảo vệ da (Kì Anh, 2008) Bột

nghệ vàng thường được dùng trực tiếp bằng cách pha với nước ấm hay phối trộn tạomàu cho thực pham Hiện nay trên thị trường chủ yếu thương mại sản phâm bột nghệ ở

dang thô hay viên hoàn cứng.

Đông Trùng Hạ Thảo từ lâu đã được xem là một trong những loại dược liệu quýtheo Đông y có tác dụng lớn trong việc hỗ trợ chữa trị bệnh và bồi bé cơ thể ĐTHTchứa hàm lượng lớn các hoạt chất sinh học quý như adenosine, cordycepin,polysaccharide đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, giúp bổ thận trángdương, tăng cường sinh lực cho nam giới, chống ung thu, (Zhang và ctv, 2006) DTHTthường được sử dụng ở dang tươi hoặc sau khi sấy khô Người dùng có thé ham, nấuuống như chè hoặc ngâm rượu, Hiện nay đã có một số sản phẩm viên hoàn DTHT vớimục đích mang lại sự tiện dụng cho người tiêu dùng mà vẫm đảm bảo chất lượng sảnphẩm Nghiên cứu đề tìm ra những sản phẩm từ bột khô ĐTHT là việc làm hết sức quantrọng dé nâng cao giá trị sử dụng của loại dược liệu quý giá này

Trên thị trường Việt Nam hiện đã có những sản phẩm viên hoàn nghệ vàng,ĐTHT đơn lẻ nhưng chưa có sản phẩm viên hoàn kết hợp nghệ vàng, ĐTHT với các

thành phần dược liệu khác như mật ong va bạc hà Chính vì thé đề tài “Nghiên cứu công

thức tạo viên hoàn kết hợp Nghệ vàng (Curcuma longa) và Đông trùng hạ thảo(Cordyceps militaris)” được thực hiện nhằm mục đích tìm ra công thức tạo ra sản phẩmviên hoàn có chất lượng, nâng cao giá tri sử dụng của các loại dược liệu, mang lại tínhtiện dung cao, dé dàng bảo quản, mang theo khi ở dang sấy khô và góp phan da danghóa sản phẩm trên thị trường

1.2 Mục tiêu

Tim ra công thức tối ưu của viên hoàn kết hợp giữa bột nghệ vàng, DTHT cùngcác loại dược liệu khác.

1.3 Nội dung thực hiện

Đánh giá chất lượng nguyên liệu đầu vào (hàm lượng adenosine và cordycepincủa bột ĐTHT, hàm lượng curcuminoid tổng số của bột nghệ vàng)

Đánh giá tỷ lệ phối trộn bột nghệ vàng và bột DTHT dựa trên khả năng ức chế

vi sinh, hoạt tính khang oxi hoa, cảm quan về mùi và mau sắc, độ âm.

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về DTHT Cordyceps spp

Cordyceps spp còn được gọi la winter worm summer grass hay ở Trung Quốc là'Dong Chong Xia Cao' Đây một loại đông được quý có bản chất là dạng ký sinh củaloài nam Cordyceps sinensic (thuộc nhóm Ascomycetes) trên cơ thé sâu Hepialusfabricius (Yue và ctv, 2013) Tên gọi Đông Trùng Hạ Thảo (ĐTHT) là xuất phát từ việcquan sát thực tế vào mùa hè nam lây nhiễm vào vật chủ, sinh trưởng và phát triển trênvat chủ và giết chết vật chủ vào mùa thu Khi mùa đông đến, nam sẽ giết chết hoàn toànvật chủ, hình thành stroma - cấu trúc bào tử, phát triển lên trên mặt đất vào mùa hè sau

kế tiếp (Đặng và ctv, 2016)

Chi nắm Cordyceps với hơn 750 loài được chọn lọc và định danh theo loại kýchủ và hình dạng quả thé Tuy nhiên, chỉ một vài loài được chọn lọc có khả năng sửdụng làm dược liệu bao gồm Cordyceps sinensis, C militaris, C ophioglossoides,

C sobolifera, C liangshanensis, và C cicadicola (Li va ctv, 2022) Trong đó, 2 loài đã

được sử dụng rộng rãi trong y học cô truyền châu A là Cordyceps sinensis và Cordyceps

militaris (Holliday va Cleaver, 2008).

2.1.1 Tong quan DTHT C militaris

Phan loai khoa hoc:

Gidi (regnum): Fungi

Phân giới (subregnum): Dikarya

Nam C militaris là duoc sử dung như một loại dược liệu quý ở chau Á (Hur,

2008) Quả thé nắm có màu cam, chiều dai từ 8 10 em Các nang bào tử dai từ 300

-3

510 pm, bề rộng khoảng 4 pum Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kíchthước 3,5 - 6,0 x 1,0 - 1,5 um Các bào tử nang nay chồi tao các bao tử thứ cấp(Ainsworth, 2008) Nam C militaris là loài DTHT được nhân nuôi phổ biến nhất trênquy mô công nghiệp hiện nay do có dược tinh cao và thời gian sản xuất ngắn, chứa cácchat có hoạt tính sinh học như ở loài Cordyceps sinensis (Li va ctv, 2006).

Thành phần hóa học chính:

Hai thành phan hợp chất của nam C militaris có giá trị cao về mặt được tính làadenosine và cordycepin Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinhkhối nam Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thé có hàm lượng cao gap 3 lần sovới sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hur, 2008)

(a) Adenosine; (b) Cordycepin

Adenosine là một nucleoside purine tự nhiên và hình thành từ sự phân hủy cua

ATP qua vai phản ứng sẽ tạo thành adenosine với sự tham gia xúc tác của enzyme nucleotidase Adenosine giúp cải thiện hệ tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, tăng lượngoxi trong máu, giảm sinh trưởng của các tế bào thoái hóa Adenosine là nguồn dự trữnăng lượng cho cơ thể, là cơ chất cho nhiều enzyme và là chất điều biến ngoại bào

5’-(Nakamura va ctv, 2015).

Cordycepin là một purin alkaloid, có cấu trúc tương tự adenosine nên RNApolymerase không thể phân biệt nên nó ngăn chặn quá trình kéo đài các RNA làm ngưngquá trình tổng hợp phân tử RNA, tạo các phân tử RNA kết thúc sớm Do đó, cordycepinđược xem là có hiệu quả kháng ung thư Cordycepin là một hợp chất quan trọng, quyếtđịnh phẩm chat, chất lượng của nam DTHT (Singpoonga va ctv, 2020)

Các thành phần hoá học khác:

Theo số liệu của Viện sinh thái ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm khoa học TrungQuốc, thành phần hóa học của thé qua nam C militaris như sau:

Protein chiếm phần lớn tỷ lệ (40,69%) bao gồm nhóm hợp chất quan trọng:

cordycepin, cordycepic axit và polychaccarit.

Acid amin: trong qua thé nam C militaris có chứa lượng acid amin tông số caohơn trong sinh khối nam (69,32 mg/g trong qua thé va 14,03 mg/g trong sinh khối

nam).

Acid béo: Quả thé nam C militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70%tong số acid béo, lượng acid béo no chủ yếu là palmitic acid, chiếm 24,5% trong quathể và 33,0% trong sinh khối

Polysaccharide: Cac polysaccharide CPS - 1 và CPS - 2 được tách chiết từ nắm

C militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường

monosaccharide, mannose va galactose có khả năng phục hồi các tôn thương gan

Ngoài ra còn có các loại vitamin như vitamin A (34,7 mg/g), vitamin B1 (13,0mg/g), vitamin B6 (62,2 mg/g), vitamin B12 (70,3 mg/g), và các nguyên tố khoáng

Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thay hợp chat CM-hs-CPS2 chứatrong dich chiết nắm C militaris có tinh kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng

độ (8 mg/mL) là 89%, 1,188 và 85% (Ahn va ctv, 2020).

Khang khuan kháng nam: Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu tráchnhiệm điều hòa bệnh tiéu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụthuộc NF-KB, điều trị các bệnh về miễn dịch (Shi và ctv, 2009)

Tinh kháng viêm: Dịch chiết từ quả thé nam C militaris được thử nghiệm về tácdụng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS), làm giảm đáng kế LPS, TNF-a cho thấy rằng

C militaris có tac dung ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của

tế bào (Zhou và ctv, 2008)

Mặt khác các nghiên cứu cô truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác

định DTHT hau như không có tác dụng phụ đối với co thé người và động vật

2.2 Tong quan về Nghệ Curcuma spp

Nghệ có tên khoa học là Curcuma hay trong Đông y còn gọi là Khương Hoànghay Uất Kim Curcuma spp thuộc họ Zingiberaceae (họ gừng) là một trong những loàicây phổ biến tại châu A, có giá trị kinh tế cao và có vai trò quan trọng trong y học vàdinh dưỡng Nghệ bao gồm 47 chi với trên 1000 loài Trong đó có 3 loài được trồng phổbiến ở Việt Nam và có giá trị kinh tế, dược tinh cao: Curcuma longa, Curcuma rotunda,

Curcuma zedoaria.

Trong nghệ có chứa các chat phytochemical có hoạt tinh sinh học, bao gồm cáchợp chat phenolic và tinh dầu có nhiều tác dung y học được sử dụng dé điều trị các rốiloạn khác nhau bao gồm các van đề về gan và da Trong y học dân gian, nó đã được sửdụng dé điều trị một số bệnh như trĩ, hen suyén, viém nhiém, bénh phong, (Takhtajan,

2009).

2.2.1 Tống quan về Nghệ vàng C longa

Phân loại khoa học:

Giới (regnum): Plantae

Phan gidi (subremum): Angiospermae

Chi (genus): Curcuma Hinh 2.3 Curcuma longa

Loai (species): Curcuma longa (Singh va ctv, 2013)

Nghệ vàng (Curcuma longa) là một loại cây thân thân thảo thuộc ho gừng(Zingiberaceae) Loài cây này có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Nam Á nhưng hiện nay

đã được trồng phô biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới (Li va ctv,

6

2011) Nghệ vàng có chiều cao khoảng 1 m, thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi det, khicắt ngang có màu vàng cam sam, lá nhọn hai đầu, bề mặt của lá nhẫn, lá dài 45 cm vàrộng 28 cm, hoa hình phéu, có mùa trắng hoặc tím nhạt mọc lên từ giữa các lá tạo thànhcụm hình nón Thân rễ của cây có nhiều ứng dụng trong y học, công nghiệp và thựcphẩm (Leonel và ctv, 2003) Nghệ vàng được xem là một chất khử trùng tự nhiên tuyệtvoi có tac dụng chống viêm và giảm đau, hỗ trợ tiêu hóa, cải thiện hệ vi khuẩn đườngruột và điều trị kích ứng da (Verma và ctv, 2018).

Thành phần hoá học chính:

Curcuma longa là loài Curcuma được nghiên cứu về mặt hóa học nhiều nhất Chođến nay, ít nhất 235 hợp chất, chủ yếu là các hợp chất phenolic và terpenoit đã được xácđịnh, bao gồm cả những chất thường được gọi là curcuminoids, monoterpen,

sesquiterpenes, diterpenes, triterpenoids, alkaloid và sterol, (Li va ctv, 2011).

Curcuminoid là thành phan chính, tao nên màu vàng đặc trưng của củ nghệ Day

là tên gọi chung của nhóm 3 hoạt chất chính curcumin (curcumin I), demethoxycurcumin(curcumin II) và bisdemethoxycurcumin (curcumin II) Trong đó curcumin chiém

71,5%, 19,4% la demethoxycurcumin va 9,1% bisdemethoxycurcumin Curcumin 1a

chat có hoạt tinh sinh học nhiều nhất trong các curcuminoid (Steele, 2010)

Curcumin [1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1,6-heptadiene-3,5-dione]

còn được gọi là diferuloylmethane có công thức hoá học C21H200¢ Curcumin có thé tồntại ở 2 dạng tautome là keto và enol Curcumin cấu trúc gồm hệ thống vòng thom là cácpolyphenol được nối bởi 2 nhóm cacbonyl ơ,j- chưa bão hòa Hai nhóm cacbonyl tạothành diketon Diketon tạo thành các enol 6n định hay dễ dàng khử proton va tạo thành

(TNF, IL-1, IL-6) và các gen kháng độc tố (BCL2), BCL2L1) nên có tác dụng kháng

viêm mạnh mẽ (Shehzad và Lee, 2010).

Các thành phần hoá học khác:

Terpenes: Cho đến nay, ít nhất 185 hợp chat của terpens đã được được phân lập

hoặc phát hiện từ lá, hoa, rễ và thân rễ của C /onga, bao gồm 68 monoterpen, 109

esquiterpenes, năm diterpenes, và ba triterpenoids Những chat này là thành phan chính

của tinh dau của thân, lá nghệ, là chất dé bay hơi

Sesquiterpenes: Thân rễ nghệ khô thường thu được 1,5 đến 5% tỉnh dầu có thànhphần là sesquiterpenes chiếm ưu thế, tạo nên vị và mùi thơm của nghệ Turmerone làcác ketonic sesquiterpenes chính của tinh dầu, chiếm ít nhất 40% tinh dầu của thân rễnghệ (Steele, 2010).

Ngoài ra trong nghệ còn chứa một số terpenes khác cùng steroids và acid béo.2.2.2 Giới thiệu về viên hoàn bột nghệ vàng

Viên hoàn bột nghệ vàng phối trộn cùng mật ong đã được rất nhiều người biết

đến và đang sử dụng mỗi ngày dé nâng cao sức khỏe cũng như làm đẹp Các sản phamnhư viên nghệ mật ong mang tính tiện lợi cho người sử dụng, không tốn thời gian phatrộn mà chỉ cần ăn hoặc uống

Viên hoàn bột nghệ chủ yếu sử dụng công nghệ phối trộn truyền thống Đây làmột phương pháp thủ công và lâu đời nhất trong việc bào chế thảo dược, phương phápchủ yếu sử dụng cơ học dé nghién, tach, lọc, chiết các hoạt chất và phối trộn với chất

mang hoặc tá được khác (bồ sung thêm hoạt tính khác cho sản phâm mà không làm anhhưởng hay biến đổi các hoạt tính chính của thảo mộc) Phương pháp này dễ thực hiện,

ít tốn kém, và ứng dụng nhiều trong sản xuất bào chế thuốc viên

Hiện nay có nhiều sản phẩm viên hoàn bột nghệ trên thị trường Việt Nam như:

Viên nghệ mật ong sữa ong chúa Quê Việt, Viên tinh nghệ mat ong Tanaco, Viên nghệOsala, nhưng chưa có sản phẩm kết hợp giữa bột nghệ vàng, ĐTHT và một số thảo

dược khác.

2.3 Tống quan về hoạt tính sinh học của Nghệ vàng và DTHT

Dịch chiết trong ethanol của nghệ ở nồng độ từ 20 wg/mL đến 90 pg/mL đã đượcchứng minh là có tác dụng chống lại các loài vi khuẩn gram dương và gram âm khácnhau phan lớn là do tác động của Curcuminoid làm phá vỡ các kênh ion trên màng tếbào vi khuẩn (Isrhad và ctv, 2018) Theo nghiên cứu của Altunatmaz và ctv năm 2016

§

xác định hiệu qua kháng khuẩn của curcuminoid với các chủng vi sinh gây bệnh trongthực phẩm với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 125 ug/mL đối với L monocytogenes

và S aureus, 250 wg/mL đối với S Typhimurium và E coli O157:H7

Cac polysaccharide CPS - 1 va CPS - 2 được tách chiết từ nam C militaris đãđược chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lai Escherichia coli,

Staphyloccocus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella paratyphi và Pseudomonas

aeruginosa MIC đôi với Escherichia coli là 0,10 mg/mL Ngoài ra, polysaccharide của

có thé thay đổi tính thắm của thành tế bao và màng tế bào, phá hỏng protein mang của

E coli, dẫn đến phá hủy cấu trúc và giải phóng các thành phan tế bào vi khuan (Zhang

va ctv, 2017).

Trong nghiên cứu nay, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus va Salmonella

spp là ba chủng được sử dung dé đánh giá khả năng ức chế dé lựa chọn tỷ lệ phối trộntinh bột nghệ vàng và DTHT.

Theo nghiên cứu của Trường đại học Bách Khoa, ĐHQG TPCM cho thấyCurcuminoid (ICso = 198 mg/L) thé hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao hon so vớichất đối chứng acid ascorbic (ICso = 227 mg/L) chứng tỏ vai trò rất lớn của nhóm OCH3trong cơ chế trung hòa gốc tự do DPPH của curcumin (Phan Thị Hoàng Anh, 2013)

Theo nghiên cứu của Đại học Công nghiệp Thực phẩm TPHCM, hoạt tính chốngoxy hóa của dich chiết C militaris (ICso là 217,85 + 33,16 mg/L), thấp hơn so với chatđối chiếu vốn có hoạt tính kháng oxy hoá mạnh như acid ascorbic (5,31 + 0,79 mg/L).Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết C militaris do sự hiện điện của các hợp chấthoạt tinh sinh học như cordycepin, adenosine, flavonoid và phenolics, (Trần Hoang

Ngâu, 2022).

Những kết quả này cho thấy rằng các chất chuyên hóa thứ cấp của chiết xuất C.militaris và Curcuma longa có thé hiện khả năng chống oxy hóa Phương pháp DPPHđược sử dụng dé đánh giá khả năng kháng oxy hoá của ba NT phối trộn trong nghiên

cứu này.

2.4 Tổng quan về mật ong

2.4.1 Công dụng của mật ong

Mật ong có hoạt tính kháng khuan là do hydro peroxid được hình thành bởi

enzym glucose oxyase, sự có mặt của flavonoid kết hợp với áp suất thâm thấu cao và

tính axit tự nhiên của mật ong Nhiều nghiên cứu đã chứng minh mật ong có khả năng

9

ức chế nhiều loại vi khuẩn, vi dụ như E coli, S typhimurium, P aeruginosa, A.baumannii, Ngày nay, sử dụng mật ong trong băng bó vết thương đang ngày càng trở

nên phổ biến (Quỳnh, 2021)

Nhiều tài liệu hiện nay cho thay mật ong làm giảm phản ứng viêm, nuôi cấy tếbào và thử nghiệm lâm sàng Mật ong điều hòa miễn dịch bằng cách làm tăng tế bào

lympho T và B, kháng thé, bạch cầu ái toan, bach cầu trung tính trong các phan ứng

miễn dịch nguyên phát và thứ phát trong nuôi cấy mô (Al-Waili và Haq, 2004)

Nhờ các tác dụng sinh học nói trên, mật ong không chỉ có lợi trong chữa lành vếtthương, điều trị đái tháo đường, chống ung thư, giảm triệu chứng hen suyén, giảm nguy

cơ mắc các bệnh tim mạch và thần kinh, điều trị các bệnh đường tiêu hóa đặc biệt là cácchứng bệnh về viêm loét dạ dày Vì thế, trong đề tài này, mật ong được sử dụng làmchất tá dược kết dính đồng thời là chất bảo quản tự nhiên của sản phẩm

2.4.2 Thành phần hoá học của mật ong

Tính chất và thành phần của mật ong phụ thuộc vào loại hoa mà ong lấy mật,điều kiện địa lý, khí hậu, và cả các điều kiện nuôi ong, bảo quản, cũng như chế biến mật

ong Tuy nhiên, thành phần cơ bản và giá trị dinh dưỡng của các loại mật ong là tương

tự nhau Mật ong chứa các thành phần cơ bản như:

Cacbohydrat: Mật ong chứa khoảng 80% cacbohydrat, 20% nước và hơn 180 hợp

chất khác với hàm lượng rất nhỏ Hau hết cacbohydrat trong mật ong là monosaccarid,trong đó fructose nhiều hon glucose (Cilia, 2022)

Mật ong chứa các enzym như diastase, invertase, glucose oxidase, catalase, vaaxit phosphatase có vai trò chuyên mật hoa và chất tiết của côn trùng thành mật ong.Enzym quan trọng nhất là invertase, xác định hoạt độ enzym invertase giúp đánh giá

độ tươi của mật ong (Muley và Jadhav).

Một số vitamin có mặt trong mật ong bao gồm axit ascorbic, axit pantothenic,

niacin va riboflavin; cùng với các khoáng chất như canxi, đồng, sắt, magie, mangan,photpho, kali, kém, Ngoài ra, còn có axit gluconic, là axit hữu cơ chính có trong mat

ong vả lượng nhỏ axit acetic, axit formic, axit citric, và một số axit khác Sự có mặt củacác axit hữu cơ này làm cho mật ong có tính axit (độ pH từ 3,2 đến 4,5) Trong mật ongcòn có chứa một lượng nhỏ polyphenol, đặc biệt là flavonoid và axit phenolic và 23 axit

amin (Dai va ctv, 2021).

10

2.5 Tổng quan về viên hoàn

Theo DĐVN, hoàn là dạng viên rắn, hình cầu, được bào chế từ bột hoặc cao dượcliệu với các loại tá được thích hợp, thường dùng dé bồi bổ cơ thể hoặc điều trị các bệnh

mạn tính.

2.5.1 Thành phần của viên hoàn

Dược liệu:

Thành phần dược liệu của viên hoàn thường là các loại thảo mộc, động vật say

khô ở dang bột hoặc ở dạng cao lỏng, dac,

Tá dược:

Tá được được thêm vào nhằm đảm bảo khối lượng cho viên, đồng thời cải thiện

độ kết dính, khả năng hút ầm, độ ồn định dược chất cũng như tính sinh khả dụng của

thuốc

Có thé phân loại tá dược theo nhiều cách khác nhau:

e Phân loại theo dạng thuốc: tá được viên nén, viên nang, viên hoàn,

e Phân loại theo chức năng: tá được làm mềm, tăng cường hap thu, tăng độ nhớt,tạo màu, điều hương, điều vị,

2.5.2 Phương pháp tạo viên hoàn

Thuốc hoàn được điều chế bằng 2 phương pháp:

Phương pháp chia viên: Bột thuốc được trộn với tá được dính thành khối bánhđồng nhất rồi thành viên theo kích thước mong muốn

Phương pháp bồi viên: Tá dược đính lỏng và bột thuốc được bồi dần từng lớp lênnhân đã gây sẵn kết hợp với sấy cho đến khi viên đạt kích thước mong muốn (DDVN)2.5.3 Yêu cầu của viên hoàn

Tính chất: Hoàn phải tròn, đều, có khối lượng từ 0,05 — 9,00 g tuỳ theo dang

thuốc, đồng nhất về hình dạng, màu sắc, có mùi đặc trưng của dược liệu.

Độ âm:

e Hoan mật ong, hoàn chứa cao đặc (hoàn mềm): Không quá 15%

e Hoàn nước có kết hợp sirô, mật ong (hoàn cứng): Không qua 12%

e Hoàn nước và hoàn hồ (hoàn cứng): Không quá 9%

11

Độ đồng đều khối lượng: Không quá + 12% chênh lệch khối lượng của từng viên

so với khối lượng trung bình, không được có quá 2 viên vượt giới hạn cho phép và khôngđược có viên nào gấp đôi giới hạn cho phép

2.6 Tổng quan về một số phương pháp phân tích và đánh giá

2.6.1 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng đề tách, nhậnbiết, định lượng từng thành phan trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bom déđây dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cộtsắc ký Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ,nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách cácthành phần khi mà chúng chảy ra khỏi cột

HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, y

dược, Trong nghiên cứu này, phương pháp HPLC dùng để dánh giá hàm lượngCurcuminoids trong tinh bột nghệ vàng và hàm lượng Cordycepins trong bột quả théĐTHT khô ban đầu và trong viên hoàn sau khi sấy

2.6.2 Phương pháp khuếch tán đĩa

Phương pháp khuếch tán đĩa phù hợp với vi sinh vật mọc nhanh Huyền phù của

vi sinh vật phân lập được trải đều lên thạch sau đó đặt đĩa ngâm tâm với nồng độ khángsinh khác nhau lên bề mặt thạch Sau khi ủ (thường từ 16 đến 24 giờ), đo đường kínhcủa vùng ức chế xung quanh mỗi đĩa

Trong nghiên cứu này, phương pháp cấy trải được sử dụng dé đánh giá khả năng

ức chế vi sinh của các nghiệm thức phối trộn đối với: Escherichia coli, Staphyloccocus

aureus và Salmonella spp trên môi trường LB.

2.6.3 Phương pháp đánh gia tính khang oxi hoa

Kha năng chống oxi hóa được xác định bằng phương pháp

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) dựa trên khả năng loại bỏ các gốc tự do, làm giảm màu của

DPPH xác định bằng độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng đo tại bước sóng

517 nm Ascorbic acid (vitamin C) được sử dung làm chất đôi chứng (Tabart và ctv,

2.6.4 Phương pháp sấy nhiệt

Say là quá trình bốc hơi nước từ bề mặt vật liệu ra môi trường bên ngoài do sựchênh lệch áp suất hơi riêng phần ở bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh

Truyền nhiệt bằng đối lưu là sự truyền nhiệt xảy ra khi có sự chuyên động tươngđối trong một khối lưu chất mà giữa các phần của nó có nhiệt độ khác nhau Thường thì

sự khác biệt này đo tiếp xúc của khối lưu chất với một bề mặt rắn có nhiệt độ khác vớinhiệt độ của lưu chất Quá trình truyền nhiệt được thực hiện từ bề mặt bên trong vật sấy,nhiệt bề mặt vật lớn hơn nhiệt bên trong vật sấy, do đó độ chênh lệch nhiệt độ này ảnhhưởng đến quá trình dẫn ẩm từ bên trong vật say ra ngoài gây nên do gradient nồng độcàng lớn thì càng tăng độ chênh lệch độ âm giữa bề mặt và bên trong vật liệu, do đócàng làm gia tăng ứng suất dư bên trong vật say và có thé làm cho vật liệu bi vỡ vụn ra

Phương pháp say nhiệt có ưu điểm là tốc độ sấy cao, giá thành thấp, đơn giản vatiện lợi khi sử dung Tuy nhiên say nhiệt cũng có những nhược điểm như chất lượng sảnphẩm không còn nguyên vẹn (màu sắc, cau trúc, hương vi), có thé bị mắt hoạt tính sinh

học hoặc các vitamin.

13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022 tại Phòng nghiên cứu

và phát triển Cordyceps, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trườngDai học Nông Lâm Thanh phô H6 Chí Minh

Bột nghệ vàng từ Công ty TNHH Hồ tiêu Việt (Vipep)

Mật ong từ Công ty TNHH GU Foods Việt Nam.

e Cân OHAUS PA214 (Trung Quốc)

e Máy lắc siêu âm Power Sonic 510 (Hwashin — Hàn Quốc)

e Máy HPLC 1260 Infinity II LC (Agilent — Mỹ)

e Va một số dung cu co ban khac

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá hàm lượng dược chất của nguyên liệu đầu vào

3.3.1.1 Định lượng adenosin và cordycepin trong bột ĐTHT bằng phương pháp

HPLC

Thí nghiệm định lượng được thực hiện bang phương pháp HPLC theo quy trình

của Phòng phân tích Hoá sinh Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường,

14

Trường đại học Nông Lâm TPHCM với các điều kiện sắc ký cố định như sau: dung môipha động gồm ACN 5% trong KH2PO, 25mM, tốc độ dòng 0,8 mL/phút, bước sóng 254

nm, sử dụng đầu do DAD với thê tích mẫu là 20 pL

Dung dịch chuẩn stock adenosine và cordycepin 100 mg/1 được pha loãng thànhdãy các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 mg/L Đồ thị đường chuẩn adenosine và cordycepinđược xây dựng bằng phần mềm Excel với trục tung là diện tích peak (mAU), trục hoành

là nồng độ chất khảo sát

Mẫu được chiết xuất bằng phương pháp siêu âm trong 20 mL dung môi nước khửion trong 15 phút, lọc mẫu qua giấy lọc Newstar (Trung Quốc), cặn lọc được bồ sungnước khử ion và tiếp tục quy trình chiết trong 3 lần Gộp dich lọc ở 3 lần chiết, định mứcđến 50 ml Tiến hành phân tích định lượng adenosine va cordycepin bằng hệ thống

HPLC 1260 Infinity II LC.

Xác định hàm lượng Adenosine va Cordycepin có trong mẫu bang công thức:

_CxFxVv

m

Trong đó: W là ham lượng Adenosine hoặc Cordycepin (mg/kg)

C là nồng độ Adenosine hoặc Cordycepin (mg/L)

3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát tỷ lệ phối trộn bột nghệ vàng và ĐTHT

Theo DDVN V, tập 2, Chuyên luận Dược liệu, tiêu chuẩn của về liều dùng của

nghệ ở dạng bột như sau:

e Ngày dùng từ 6 g đến 12 g, dạng thuốc sắc hoặc dang bột

e Dùng ngoài dưới dang dịch tươi bôi vào vết thương dé chóng lên da non.Theo Yang và ctv (2014), bao cáo trên Tap chi Journal of Food and DrugAnalysis, sử dung Cordyceps militaris liều 0,5 — 3 g/ngày có tác dụng điều chỉnh giảmhoạt động của các cytokine gây viêm và chemokine.

Tạp chí Cây thuốc quý, mã số C628, do Tạ Ngọc Dũng biên soạn, ĐTHT đượckhuyên cáo sử dụng với liều lượng như sau:

e Hỗ trợ điều trị bệnh: 2 — 3 g/ngay

© Bồi bé sức khoẻ: 1 — 2 g/ngày

Theo Dược học cô truyền (NXB Y học) do PGS.TS Phạm Xuân Sinh biên soạn,

mật ong nên sử dụng ở liều lượng 15 — 30 g/ngay

Bồ trí thí nghiệm:

Từ các nghiên cứu và tiêu chuẩn trên, có thé xác định công thức phối trộn cho

viên hoàn như sau:

Bảng 3.1 Các nghiệm thức phối trộn từ các loại dược liệu

Khối lượng tông (g) 22 22 22

Các thành phần dược liệu được trộn đều với nhau theo tỷ lệ ở Bảng 3.1 Sau đó,hỗn hợp được tiến hành vo thành viên có trọng lượng 0,5 g/viên Mỗi nghiệm thức phốitrộn được lặp lại ba lần, mỗi lần 100 viên

Tiến hành sấy các viên hoàn của ba nghiệm thức phối trộn ở 70°C trong 8 giờ(khảo sát sơ bộ thời gian sấy thê hiện ở Phụ lục 2 — Bảng 3) Sau khi say, tiền hành chiếu

xạ diệt khuẩn bằng tia cực tím trong 30 phút (Begg và ctv, 2006) Các nghiệm thức nàyđược dùng dé đánh giá các chỉ tiêu tiếp theo

3.3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá

l6

Đối tượng nghiên cứu

Viên hoàn ở ba nghiệm thức phối trộn Bảng 3.1 được dùng dé khảo sát khả năng

kháng oxy hoá.

Phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý: Hoạt tính chống oxy hóa được khảo sát thông qua khả năng trung hòacác gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH dựa trên cơ sở phản ứng trung hòagốc tự do và làm giảm cường độ màu thuốc thử từ tím sang vàng Sự thay đổi màu sắcnày được giải thích bằng việc electron tự do của DPPH bat cặp với một nguyên tử hydro

từ chất chống oxy hóa đề tạo thành DPPH-H khử Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng

tỉ lệ nghịch với nồng độ các chất chống oxy hóa hiện diện trong hỗn hợp khảo sát (Blois,

mM pha trong methanol va lắc đều Thực hiện song song một mẫu đối chứng âm bangcách thay dung dịch thử bằng nước cất và chất đối chiếu là ascorbic acid Hỗn hợp được

dé yên trong tối 30 phút và đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm

Đồ thị đường chuẩn hoạt tính chống oxy hóa được xây dựng bằng phần mềmExcel với trục tung là tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa, trục hoành là nồng độchất khảo sát

Chỉ tiêu theo dõi

Hoạt tính kháng oxy hoá hay hoạt tinh bắt gốc tự do DPPH (IC) được tinh theocông thức:

17

Trong đó: IC là hoạt tính kháng oxy hoá (%)

ODc là giá trị mật độ quang của đối chứng

OD, là độ hap thu của mẫu thử

Từ tỉ lệ phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, xây dựng phương trình tươngquan tuyến tính y = ax + b với y là tỉ lệ phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, x lànồng độ mẫu thử Nồng độ mẫu thử có thé bắt 50% góc tự do DPPH gọi là ICso Tínhgiá trị ICso của mẫu thử dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính khángoxi hóa của chúng, theo công thức sau:

50—b

ICzo =

Từ đó, xác định được ICso (nồng độ mà 50% gốc tự do DPPH được trung hòa).Đây là co sở dé so sánh kha năng kháng oxy hóa giữa các mau Mẫu nào có giá trị ICsocàng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao

Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị

trung bình + SD.

3.3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật

Đối tượng nghiên cứu

Viên hoàn ở ba nghiệm thức phối trộn ở Bảng 3.1 được dùng để khảo sát khảnăng ức chế vi sinh vật đối với ba chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphyloccocusaureus và Salmonella spp được cung cấp bởi Phòng Vi sinh (Ribe 311), Viện CNSH và

MT, Trường đại học Nông Lâm TPHCM.

Phương pháp nghiên cứu

Đánh giá khả năng ức chế vi sinh của các nghiệm thức phối trộn Nghệ và ĐTHTvới các chủng vi khuẩn và nam theo phương pháp Kirby — Bauer (1959) thông qua sựhình thành vòng kháng khuẩn trên môi trường LB (Phụ lục 2 - Bảng 4)

Bồ trí thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường LB Dùng que cấy vòng vôkhuẩn bắt lấy các khuẩn lạc, phân tán mẫu vào dung dịch NaCl 0,85% va tiễn hànhvortex Độ đục của huyền phù vi khuân được xác định ở 0,08 — 0,10 theo độ đục củachuân McFarland 0,5 ở bước sóng 625 nm, tương đương với nồng độ vi khuẩn 1,5x108

CFU/mL (Phụ lục 2 - Bảng 5), rồi tiến hành thí nghiệm

18

Mẫu được chiết xuất bằng phương pháp siêu âm trong 20 mL dung môi ethanol

70 % trong 15 phút, lọc mẫu qua giấy lọc Newstar (Trung Quốc), cặn lọc được bồ sung

dung môi chiết và tiếp tục quy trình chiết trong 3 lần Gộp dịch lọc ở 3 lần chiết Cô cạndung môi, sau đó hoà tan bằng DMSO 10 % đến nồng độ 50 mg/mL Sử dụng giấy lọc

vô trùng có đường kính 5 mm đã thấm dich thử, sau đó đặt lên bề mặt thạch Đối chứngdương (+) sử dung là kháng sinh Tetracycline 30 pg/L được cung cấp bởi Công ty Nam

Khoa Biotek TP.HCM, đối chứng âm (-) là nước cất đối với mẫu dịch chiết trong nước

và DMSO 10% đối với mẫu dịch chiết trong ethanol Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Ủđĩa thạch trong 24 — 72 giờ ở nhiệt độ phòng.

Quan sát và ghi nhận đường kính vòng kháng khuẩn dé đánh giá mức độ ức chế

vi sinh vật của ba nghiệm thức Khả năng kháng khuẩn càng mạnh thì đường kính vòng

ức chế vi sinh vật càng lớn và ngược lại Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quảđược biểu diễn dưới dang giá trị trung bình + SE

Chỉ tiêu theo dõi

Hoạt tính kháng vi sinh vật của các nghiệm thức phối trộn được tính bằng đườngkính vòng kháng khuân AD:

AD = D - d (mm)Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm)

d là đường kính giấy thâm vô trùng (mm)3.3.2.5 Khảo sát độ ẩm

Đối tượng nghiên cứu

Viên hoàn của ba nghiệm thức phối trộn ở Bảng 3.1 được dùng để khảo sát độ

Phương pháp nghiên cứu

Theo Dược điển Việt Nam (phần Phu lục 9.6 — Xác định mat khối lượng do làmkhô), độ âm của mau thử được xác định bằng phương pháp sấy nhiệt ở 105°C Cân 2 gviên hoàn đã được nghiền nhỏ đồng nhất vào chén thuỷ tinh có nắp đậy Tiến hành say

ở nhiệt độ 105°C trong tối thiểu 4 giờ Sau khi sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng cântrong bình hút âm có silicagel rồi cân ngay Tiếp tục say đến khối lượng không đổi hay

sự chênh lệch sau khi say thêm 1 giờ so với lần sấy trước đó không quá 5 mg

Chỉ tiêu theo dõi

19

Độ âm của viên hoàn được xác định bằng công thức theo Tiêu chuẩn Việt Nam Xác định độ âm - Phương pháp khối lượng (TCVN 10788:2015) như sau:

-M1 — M2

= —_— x

W Mi 100

Trong do: W: Âm độ sản phẩm (%)

MI: Khối lượng ban đầu của sản phẩm (g)M2: Khối lượng sản phẩm sau khi giảm 4m (g)3.3.2.6 Khảo sát độ đồng đều

Đối tượng nghiên cứu

Viên hoàn của ba nghiệm thức phối trộn ở Bảng 3.1 được dùng để khảo sát độđồng đều

Phương pháp nghiên cứu

Độ đồng đều của viên hoàn được xác định bằng cách cân khối lượng 10 viênhoàn So sánh sự chênh lệch khối lượng từng viên với khối lượng trung bình phải nằmtrong giới hạn + 12% theo Dược điển Việt Nam V tập 2, Phụ lục 1, Bang 1.11.1 Trong

đó, không có quá 2 viên vượt giới hạn cho phép và không có viên nào gâp đôi giới hạn cho phép.

Bảng 3.2 Giới hạn chênh lệch khối lượng cho phép đối với viên hoàn

Khối lượng trung bình 1 viên (g) Giới hạn cho phép (%)

Từ 0,05 đến 1,5 +12

Trên 1,5 đến 5,0 +10

Trên 5,0 đến 9,0 +7

Trên 9,0 +5

3.4 Nội dung 3: Chọn công thức

Sau khi hoàn thành các thí nghiệm ở nội dung | và nội dung 2, tiến hành phântích tong kết và chọn ra 1 nghiệm thức cho kết quả tốt nhất ở các chỉ tiêu khảo sát Kiểmtra, phân tích giới hạn nhiễm khuẩn trong mẫu nghiệm thức đã chọn và tiến hành đánhgiá điểm cảm quan của người dùng đối với nghiệm thức cuối cùng

3.4.1 Khảo sát chỉ tiêu giới hạn nhiễm khuẩn

Đối tượng nghiên cứu

20

Viên hoàn ở nghiệm thức tối ưu trong ba nghiệm thức ở Bảng 3.1 được dùng dékhảo sát chỉ tiêu giới hạn vi khuẩn.

Phương pháp nghiên cứu

Chỉ tiêu giới han vi sinh vat để định lượng E coli theo TCVN 6848:2007 (ISO4832:2007), tong vi khuân hiếu khí theo TCVN 4884-1:2015 bằng phương pháp đếmkhuẩn lạc và định tinh Salmonella theo TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2004)

Các kết quả định tính và định lượng được đối chiếu với tiêu chuẩn giới hạn nhiễmkhuẩn theo Dược điển Việt Nam tập 2, Phụ lục 13, Bảng 13.6.6 về giới hạn E coli(không phát hiện E coli trong 1 g hoặc 1 mL), tong vi khuẩn hiếu khí (không qua 10°CFU/g hoặc CFU/mL) và theo QCVN 8-3:2012/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đốivới ô nhiễm vi sinh vật trong thực phâm về giới han Salmonella (Không phát hiện

Salmonella trong 1 g hoặc 1 mL).

3.4.2 Khao sát cảm quan về hình dang, mùi, vị và mau sắc của viên hoàn

Viên hoàn ở nghiệm thức lựa chọn được tiến hành khảo sát mức độ chấp nhậntheo Tiêu chuẩn Việt Nam Về sản phẩm thực phẩm — Phân tích cảm quan — Phươngpháp cho điểm (TCVN 3215-79) Các chỉ tiêu khảo sát cảm quan đối với viên hoàn bao

gồm: hình dạng, mùi, vị và màu sắc Khảo sát được thực hiện bởi 30 người tham gia và

đánh giá cảm quan theo thang điểm 5 với mức điểm thấp nhất là 1 và cao nhất là 5 chomỗi chỉ tiêu đánh giá Ý nghĩa của từng mức điểm như sau:

Bảng 3.3 Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo hình dạng, mùi, vị và màu sắc

PHIEU ĐÁNH GIA CẢM QUANTén san pham: Vién hoan bét Nghé vang va Dong tring ha thao

Ho tén:

Ngày thu:

Ban được nhận 3 mẫu sản phẩm, hãy đánh giá mức độ yêu thích theo

mùi, vị và màu sắc đối với sản phẩm băng cách cho điểm mỗi mẫu dựa trên

thang điểm 5 (với mức điểm thấp nhất là 1 và cao nhất là 5 cho mỗi chỉ tiêuđánh giá ở các mau).

Điểm số (từ 1 đến 5)Chỉ tiêu Ghi chú

1L |2 |3 |4 |5 Hình dạng

Chương 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Nội dung 1: Hàm lượng dược chất của nguyên liệu đầu vào

Với các ưu diém như áp suat cao, độ phân giải cao, van toc sắc ký nhanh, HPLC

không làm hư hại đến mẫu phân tích và không giới hạn về tính chat của mẫu phân tích

Do đó, lựa chọn phương pháp định lượng bằng HPLC Kết quả được thể hiện như sau:4.1.1.1 Hàm lượng Adenosine và Cordycepin trong bột DTHT

Adenosine được phát hiện ở thời gian trung bình là 3,755 phút va cordycepin là

4,922 phút trên hệ thống HPLC Việc xác định khoảng tuyến tính của dãy chuan có ýnghĩa quan trọng trong phân tích và tính toán kết quả

Bảng 4.1 Kết quả đường chuẩn adenosine bằng phương pháp HPLC

STT Nông độ (mg/L) Diện tích peak (mAu*S)

Hình 4.1 Biéu đồ đường chuẩn adenosine bang phương pháp HPLC

Phương trình đường chuẩn của adenosine là y = 36,833x + 6,75 với hệ số tươngquan R2 = 0,9999 cho thay mức độ tuyến tính cao trong khoảng nồng độ khảo sát

23