3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022 tại Phòng nghiên cứu và phát triển Cordyceps, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Dai học Nông Lâm Thanh phô H6 Chí Minh.
3.2. Vật liệu và thiết bị
3.2.1. Vật liệu
Bột say khô C. militaris do phòng Nghiên cứu va phát triển Cordyceps, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
Bột nghệ vàng từ Công ty TNHH Hồ tiêu Việt (Vipep).
Mật ong từ Công ty TNHH GU Foods Việt Nam.
3.2.2. Hóa chất và thiết bị Hoá chất
e Chất chuẩn Adenosine (CAS: 58-61-7) va Cordycepin (CAS: 73-03-0) (Sigma Aldrich) nhập khẩu bởi Công ty TNHH Thiết bi khoa học Sinh hoá Vina
e DPPH (CAS: AC05150100) e Môi trường LB,...
e Và một số hoá chất co bản khác Thiết bị và dụng cụ
e Cân OHAUS PA214 (Trung Quốc)
e Máy lắc siêu âm Power Sonic 510 (Hwashin — Hàn Quốc)
e Máy HPLC 1260 Infinity II LC (Agilent — Mỹ)
e Va một số dung cu co ban khac
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Đánh giá hàm lượng dược chất của nguyên liệu đầu vào
3.3.1.1. Định lượng adenosin và cordycepin trong bột ĐTHT bằng phương pháp
HPLC
Thí nghiệm định lượng được thực hiện bang phương pháp HPLC theo quy trình
của Phòng phân tích Hoá sinh Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường,
14
Trường đại học Nông Lâm TPHCM với các điều kiện sắc ký cố định như sau: dung môi pha động gồm ACN 5% trong KH2PO, 25mM, tốc độ dòng 0,8 mL/phút, bước sóng 254 nm, sử dụng đầu do DAD với thê tích mẫu là 20 pL.
Dung dịch chuẩn stock adenosine và cordycepin 100 mg/1 được pha loãng thành dãy các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 mg/L. Đồ thị đường chuẩn adenosine và cordycepin được xây dựng bằng phần mềm Excel với trục tung là diện tích peak (mAU), trục hoành là nồng độ chất khảo sát.
Mẫu được chiết xuất bằng phương pháp siêu âm trong 20 mL dung môi nước khử ion trong 15 phút, lọc mẫu qua giấy lọc Newstar (Trung Quốc), cặn lọc được bồ sung nước khử ion và tiếp tục quy trình chiết trong 3 lần. Gộp dich lọc ở 3 lần chiết, định mức đến 50 ml. Tiến hành phân tích định lượng adenosine va cordycepin bằng hệ thống
HPLC 1260 Infinity II LC.
Xác định hàm lượng Adenosine va Cordycepin có trong mẫu bang công thức:
_CxFxVv
m
Trong đó: W là ham lượng Adenosine hoặc Cordycepin (mg/kg)
C là nồng độ Adenosine hoặc Cordycepin (mg/L) F là hệ số pha loãng
V là thể tích định mức mẫu (mL) m là khối lượng mẫu ban đầu (g)
3.3.1.2. Định lượng curcuminoid tổng số trong bột nghệ vàng bằng phương pháp
HPLC
Gửi mẫu tai Trung tâm phân tích dịch vụ thí nghiệm TPHCM (CASE) để xác định hàm lượng Curcuminoid tổng số trong bột nghệ vàng. Mẫu được phân tích bằng
phương pháp HPLC nội bộ CASE.SK.0073.
3.3.2. Nội dung 2: Khảo sát tỷ lệ phối trộn bột nghệ vàng và ĐTHT
3.3.2.1. Mục đích
Tìm ra công thức phối trộn bột nghệ vàng và DTHT tốt nhất trong ba nghiệm thức phối trộn dựa trên các chỉ tiêu về khả năng ức chế vinh vật, kháng oxy hoá, cảm quan, độ am và độ đồng đều.
3.3.2.2. Xây dựng các nghiệm thức phối trộn từ các được liệu
15
Theo DDVN V, tập 2, Chuyên luận Dược liệu, tiêu chuẩn của về liều dùng của
nghệ ở dạng bột như sau:
e Ngày dùng từ 6 g đến 12 g, dạng thuốc sắc hoặc dang bột.
e Dùng ngoài dưới dang dịch tươi bôi vào vết thương dé chóng lên da non.
Theo Yang và ctv (2014), bao cáo trên Tap chi Journal of Food and Drug
Analysis, sử dung Cordyceps militaris liều 0,5 — 3 g/ngày có tác dụng điều chỉnh giảm
hoạt động của các cytokine gây viêm và chemokine.
Tạp chí Cây thuốc quý, mã số C628, do Tạ Ngọc Dũng biên soạn, ĐTHT được khuyên cáo sử dụng với liều lượng như sau:
e Hỗ trợ điều trị bệnh: 2 — 3 g/ngay
© Bồi bé sức khoẻ: 1 — 2 g/ngày
Theo Dược học cô truyền (NXB Y học) do PGS.TS. Phạm Xuân Sinh biên soạn, mật ong nên sử dụng ở liều lượng 15 — 30 g/ngay.
Bồ trí thí nghiệm:
Từ các nghiên cứu và tiêu chuẩn trên, có thé xác định công thức phối trộn cho
viên hoàn như sau:
Bảng 3.1. Các nghiệm thức phối trộn từ các loại dược liệu
Nghiệm thức NII NT2 NT3 Bột nghé/Tinh bột (g) 6 8 10
DTHT (g) 2 2 2
Mat ong (g) 10 10 10
Ta dược vừa du (g) 4 2, 0 Khối lượng tông (g) 22 22 22
Các thành phần dược liệu được trộn đều với nhau theo tỷ lệ ở Bảng 3.1. Sau đó, hỗn hợp được tiến hành vo thành viên có trọng lượng 0,5 g/viên. Mỗi nghiệm thức phối trộn được lặp lại ba lần, mỗi lần 100 viên.
Tiến hành sấy các viên hoàn của ba nghiệm thức phối trộn ở 70°C trong 8 giờ (khảo sát sơ bộ thời gian sấy thê hiện ở Phụ lục 2 — Bảng 3). Sau khi say, tiền hành chiếu xạ diệt khuẩn bằng tia cực tím trong 30 phút (Begg và ctv, 2006). Các nghiệm thức này được dùng dé đánh giá các chỉ tiêu tiếp theo.
3.3.2.3. Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá
l6
Đối tượng nghiên cứu
Viên hoàn ở ba nghiệm thức phối trộn Bảng 3.1 được dùng dé khảo sát khả năng
kháng oxy hoá.
Phương pháp nghiên cứu
Nguyên lý: Hoạt tính chống oxy hóa được khảo sát thông qua khả năng trung hòa các gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH dựa trên cơ sở phản ứng trung hòa gốc tự do và làm giảm cường độ màu thuốc thử từ tím sang vàng. Sự thay đổi màu sắc này được giải thích bằng việc electron tự do của DPPH bat cặp với một nguyên tử hydro từ chất chống oxy hóa đề tạo thành DPPH-H khử. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ nghịch với nồng độ các chất chống oxy hóa hiện diện trong hỗn hợp khảo sát (Blois,
1958; Bondet và ctv, 1997).
Phản ứng kháng oxy hóa được thực hiện theo phương pháp của Chanda và
Dave (2009) có hiệu chuẩn:
Cân mẫu với khối lượng 1 g. Mẫu được chiết xuất bằng phương pháp siêu âm trong 20 mL dung môi ethanol 70 % trong 15 phút, lọc mẫu qua giấy lọc Newstar (Trung Quốc), cặn lọc được bồ sung dung môi chiết và tiếp tục quy trình chiết trong 3 lần. Gộp dich lọc ở 3 lần chiết, định mức đến 50 ml. Dịch chiết mỗi nghiệm thức được pha loãng bang ethanol 70 % thành dãy nồng độ: 2000, 4000, 6000, 8000 và 10000 mg/L. Sử dung ascorbic acid ở dãy nồng độ 10 — 50 mg/L làm chất đôi chiếu. Hút 0,5 mL dung dich thử vào các ống nghiệm có chứa sẵn 3 mL ethanol 96%, tiếp tục thêm vào 1 mL DPPH 0,5 mM pha trong methanol va lắc đều. Thực hiện song song một mẫu đối chứng âm bang cách thay dung dịch thử bằng nước cất và chất đối chiếu là ascorbic acid. Hỗn hợp được dé yên trong tối 30 phút và đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm.
Đồ thị đường chuẩn hoạt tính chống oxy hóa được xây dựng bằng phần mềm Excel với trục tung là tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa, trục hoành là nồng độ chất khảo sát.
Chỉ tiêu theo dõi
Hoạt tính kháng oxy hoá hay hoạt tinh bắt gốc tự do DPPH (IC) được tinh theo
công thức:
17
Trong đó: IC là hoạt tính kháng oxy hoá (%)
ODc là giá trị mật độ quang của đối chứng OD, là độ hap thu của mẫu thử
Từ tỉ lệ phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, xây dựng phương trình tương quan tuyến tính y = ax + b với y là tỉ lệ phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, x là nồng độ mẫu thử. Nồng độ mẫu thử có thé bắt 50% góc tự do DPPH gọi là ICso. Tính giá trị ICso của mẫu thử dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính kháng
oxi hóa của chúng, theo công thức sau:
50—b ICzo =
Từ đó, xác định được ICso (nồng độ mà 50% gốc tự do DPPH được trung hòa).
Đây là co sở dé so sánh kha năng kháng oxy hóa giữa các mau. Mẫu nào có giá trị ICso càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.
Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị
trung bình + SD.
3.3.2.4. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật Đối tượng nghiên cứu
Viên hoàn ở ba nghiệm thức phối trộn ở Bảng 3.1 được dùng để khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật đối với ba chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphyloccocus aureus và Salmonella spp. được cung cấp bởi Phòng Vi sinh (Ribe 311), Viện CNSH và
MT, Trường đại học Nông Lâm TPHCM.
Phương pháp nghiên cứu
Đánh giá khả năng ức chế vi sinh của các nghiệm thức phối trộn Nghệ và ĐTHT với các chủng vi khuẩn và nam theo phương pháp Kirby — Bauer (1959) thông qua sự hình thành vòng kháng khuẩn trên môi trường LB (Phụ lục 2 - Bảng 4).
Bồ trí thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường LB. Dùng que cấy vòng vô khuẩn bắt lấy các khuẩn lạc, phân tán mẫu vào dung dịch NaCl 0,85% va tiễn hành vortex. Độ đục của huyền phù vi khuân được xác định ở 0,08 — 0,10 theo độ đục của chuân McFarland 0,5 ở bước sóng 625 nm, tương đương với nồng độ vi khuẩn 1,5x108 CFU/mL (Phụ lục 2 - Bảng 5), rồi tiến hành thí nghiệm.
18
Mẫu được chiết xuất bằng phương pháp siêu âm trong 20 mL dung môi ethanol 70 % trong 15 phút, lọc mẫu qua giấy lọc Newstar (Trung Quốc), cặn lọc được bồ sung dung môi chiết và tiếp tục quy trình chiết trong 3 lần. Gộp dịch lọc ở 3 lần chiết. Cô cạn dung môi, sau đó hoà tan bằng DMSO 10 % đến nồng độ 50 mg/mL. Sử dụng giấy lọc vô trùng có đường kính 5 mm đã thấm dich thử, sau đó đặt lên bề mặt thạch. Đối chứng dương (+) sử dung là kháng sinh Tetracycline 30 pg/L được cung cấp bởi Công ty Nam Khoa Biotek TP.HCM, đối chứng âm (-) là nước cất đối với mẫu dịch chiết trong nước và DMSO 10% đối với mẫu dịch chiết trong ethanol. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ủ
đĩa thạch trong 24 — 72 giờ ở nhiệt độ phòng.
Quan sát và ghi nhận đường kính vòng kháng khuẩn dé đánh giá mức độ ức chế vi sinh vật của ba nghiệm thức. Khả năng kháng khuẩn càng mạnh thì đường kính vòng ức chế vi sinh vật càng lớn và ngược lại. Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biểu diễn dưới dang giá trị trung bình + SE.
Chỉ tiêu theo dõi
Hoạt tính kháng vi sinh vật của các nghiệm thức phối trộn được tính bằng đường kính vòng kháng khuân AD:
AD = D - d (mm)
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm) d là đường kính giấy thâm vô trùng (mm) 3.3.2.5. Khảo sát độ ẩm
Đối tượng nghiên cứu
Viên hoàn của ba nghiệm thức phối trộn ở Bảng 3.1 được dùng để khảo sát độ
Phương pháp nghiên cứu
Theo Dược điển Việt Nam (phần Phu lục 9.6 — Xác định mat khối lượng do làm khô), độ âm của mau thử được xác định bằng phương pháp sấy nhiệt ở 105°C. Cân 2 g viên hoàn đã được nghiền nhỏ đồng nhất vào chén thuỷ tinh có nắp đậy. Tiến hành say ở nhiệt độ 105°C trong tối thiểu 4 giờ. Sau khi sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng cân trong bình hút âm có silicagel rồi cân ngay. Tiếp tục say đến khối lượng không đổi hay sự chênh lệch sau khi say thêm 1 giờ so với lần sấy trước đó không quá 5 mg.
Chỉ tiêu theo dõi
19
Độ âm của viên hoàn được xác định bằng công thức theo Tiêu chuẩn Việt Nam - Xác định độ âm - Phương pháp khối lượng (TCVN 10788:2015) như sau:
M1 — M2
= —_— x
W Mi 100
Trong do: W: Âm độ sản phẩm (%)
MI: Khối lượng ban đầu của sản phẩm (g) M2: Khối lượng sản phẩm sau khi giảm 4m (g) 3.3.2.6. Khảo sát độ đồng đều
Đối tượng nghiên cứu
Viên hoàn của ba nghiệm thức phối trộn ở Bảng 3.1 được dùng để khảo sát độ đồng đều.
Phương pháp nghiên cứu
Độ đồng đều của viên hoàn được xác định bằng cách cân khối lượng 10 viên hoàn. So sánh sự chênh lệch khối lượng từng viên với khối lượng trung bình phải nằm trong giới hạn + 12% theo Dược điển Việt Nam V tập 2, Phụ lục 1, Bang 1.11.1. Trong
đó, không có quá 2 viên vượt giới hạn cho phép và không có viên nào gâp đôi giới hạn cho phép.
Bảng 3.2. Giới hạn chênh lệch khối lượng cho phép đối với viên hoàn
Khối lượng trung bình 1 viên (g) Giới hạn cho phép (%) Từ 0,05 đến 1,5 +12
Trên 1,5 đến 5,0 +10 Trên 5,0 đến 9,0 +7
Trên 9,0 +5
3.4. Nội dung 3: Chọn công thức
Sau khi hoàn thành các thí nghiệm ở nội dung | và nội dung 2, tiến hành phân tích tong kết và chọn ra 1 nghiệm thức cho kết quả tốt nhất ở các chỉ tiêu khảo sát. Kiểm tra, phân tích giới hạn nhiễm khuẩn trong mẫu nghiệm thức đã chọn và tiến hành đánh giá điểm cảm quan của người dùng đối với nghiệm thức cuối cùng.
3.4.1. Khảo sát chỉ tiêu giới hạn nhiễm khuẩn Đối tượng nghiên cứu
20
Viên hoàn ở nghiệm thức tối ưu trong ba nghiệm thức ở Bảng 3.1 được dùng dé khảo sát chỉ tiêu giới hạn vi khuẩn.
Phương pháp nghiên cứu
Chỉ tiêu giới han vi sinh vat để định lượng E. coli theo TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007), tong vi khuân hiếu khí theo TCVN 4884-1:2015 bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và định tinh Salmonella theo TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2004).
Các kết quả định tính và định lượng được đối chiếu với tiêu chuẩn giới hạn nhiễm khuẩn theo Dược điển Việt Nam tập 2, Phụ lục 13, Bảng 13.6.6. về giới hạn E. coli (không phát hiện E. coli trong 1 g hoặc 1 mL), tong vi khuẩn hiếu khí (không qua 10°
CFU/g hoặc CFU/mL) và theo QCVN 8-3:2012/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phâm về giới han Salmonella (Không phát hiện
Salmonella trong 1 g hoặc 1 mL).
3.4.2 Khao sát cảm quan về hình dang, mùi, vị và mau sắc của viên hoàn
Viên hoàn ở nghiệm thức lựa chọn được tiến hành khảo sát mức độ chấp nhận theo Tiêu chuẩn Việt Nam Về sản phẩm thực phẩm — Phân tích cảm quan — Phương pháp cho điểm (TCVN 3215-79). Các chỉ tiêu khảo sát cảm quan đối với viên hoàn bao gồm: hình dạng, mùi, vị và màu sắc. Khảo sát được thực hiện bởi 30 người tham gia và đánh giá cảm quan theo thang điểm 5 với mức điểm thấp nhất là 1 và cao nhất là 5 cho mỗi chỉ tiêu đánh giá. Ý nghĩa của từng mức điểm như sau:
1 điểm: Rất không thích 2 điểm: Không thích 3 điểm: Bình thường 4 điểm: Thích
5 điểm: Rat thích
Khảo sát được thực hiện theo mẫu phiếu ở Bảng 3.3.
21
Bảng 3.3. Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo hình dạng, mùi, vị và màu sắc PHIEU ĐÁNH GIA CẢM QUAN
Tén san pham: Vién hoan bét Nghé vang va Dong tring ha thao
Ho tén:
Ngày thu:
Ban được nhận 3 mẫu sản phẩm, hãy đánh giá mức độ yêu thích theo mùi, vị và màu sắc đối với sản phẩm băng cách cho điểm mỗi mẫu dựa trên thang điểm 5 (với mức điểm thấp nhất là 1 và cao nhất là 5 cho mỗi chỉ tiêu
đánh giá ở các mau).
Điểm số (từ 1 đến 5)
Chỉ tiêu Ghi chú 1L |2 |3 |4 |5
Hình dạng Mùi
Vị
Màu sắc
Chất lượng viên hoàn khảo sát được đánh giá dựa vào tong điểm trung bình
của các chỉ tiêu khảo sát theo TCVN 3215-79 (Phụ lục 2 - Bảng 19).
22