Báo cáo thí nghiệm hóa học hóa sinh thực phẩm (ch2049) bài 03 protein – amino acid ninhydrin, formol

Bảng thí nghiệm kết quả...1 IV/ Biện luận kết quả thí nghiệm...1 B/ Định lượng Nitơ Axit Amin bằng phương pháp chuẩn độ Formol Phương pháp Sorensen:...4 I/ Nguyên tắc thí nghiệm:...4 II/

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA HỌC HÓA SINH THỰC PHẨM

(CH2049) BÀI 03 PROTEIN – AMINO ACID: Ninhydrin, Formol

Nhóm: 7 – Lớp: L03 – Học kỳ: 232

GVHD: Nguyễn Thị Nguyên Sinh viên thực hiện

1 221349 4 Nguyễn Nhật Tín

2 221392 8 Nguyễn Tường Vi

TP HỒ CHÍ MINH

Mục Lục

A/ Axit Amin phản ứng với Ninhydrin: 1

I/ Nguyên tắc thí nghiệm: 1

II/ Tiến trình thí nghiệm 1

1 Chuẩn bị 1

2 Tiến trình các bước 1

III/ Kết quả thí nghiệm 1

1 Bảng thí nghiệm kết quả 1

IV/ Biện luận kết quả thí nghiệm 1

B/ Định lượng Nitơ Axit Amin bằng phương pháp chuẩn độ Formol (Phương pháp Sorensen): 4

I/ Nguyên tắc thí nghiệm: 4

II/ Tiến trình thí nghiệm 4

1 Chuẩn bị 4

2 Tiến trình các bước 5

2.1 Chuẩn bị thang màu pH 7 và pH 9.2 5

2.2 Tiến hành phân mẫu 5

2.3 Tính kết quả 6

III/ Kết quả thí nghiệm 6

1 Bảng thí nghiệm kết quả 6

IV/ Biện luận kết quả thí nghiệm 7

Tài liệu tham khảo 8

A/ Axit Amin phản ứng với Ninhydrin:

I/ Nguyên tắc thí nghiệm:

− Phản ứng màu đặc trưng của ninhydrin với các α-aminoaxit và cường độ màu phụ thuộc nồng độ axit amin là cơ sở của việc sử dụng ninhydrin trong các phương pháp định tính và định lượng axit amin bằng kỹ thuật so màu

II/ Tiến trình thí nghiệm

1 Chuẩn bị

- Dụng cụ: Ống nghiệm, kẹp, pipette, nồi cách thủy/tủ sấy

- Hóa chất:

+ Thuốc thử ninhydrin: dung dịch ninhydrin 1% trong aceton 95%

+ Các dung dịch axit amin: glutamic, leucin, prolin có nồng độ 0.05% + Dung dịch thủy phân (proteolysat) chứa hỗn hợp axit amin

2 Tiến trình các bước

- Bước 1: Chuẩn bị 5 ống nghiệm có đánh dấu từ (1) tới (5)

- Bước 2: Dùng pipette lấy vào 5 ống nghiệm đã ghi số thứ tự

+ Ống thứ nhất: 1 mL dung dịch glutamic

+ Ống thứ hai: 1 mL dung dịch leucin

+ Ống thứ ba: 1 mL dung dịch prolin

+ Ống thứ tư: 1 mL dung dịch hỗn hợp axit amin

+ Ống thứ năm: 0.5 mL hỗn hợp axit amin và 0.5 mL nước cất

- Bước 3: Dùng pipette lấy 0.2 mL thuốc thử ninhydrin và lắc đều ống nghiệm

- Bước 4: Đặt các ống nghiệm vào nồi cách thủy/ tủ sấy ở 90 C trong 10 phút.o

- Bước 5: Lấy 5 ống nghiệm ra giá đỡ, quan sát màu, so sánh giải thích và viết phản ứng

III/ Kết quả thí nghiệm

1 Bảng thí nghiệm kết quả

Màu sắc Xanh tím Xanh tím Vàng cam Xanh tím Xanh tím

IV/ Biện luận kết quả thí nghiệm

- Giải thích kết quả thí nghiệm trên dựa vào phản ứng của ninhydrin với amino acid Ban đầu ninhydrin có khả năng tautomerize thành 1,2,3-indantrione, phản

ứng với NH trong amino acid tạo thành 1 base Schiffs Sau khi trải qua phản 2 ứng decarboxyl hóa, một aldehyde đi kèm cùng với 2-amino-l,3-indandione

Sự ngưng tụ amin trung gian này với một ninhydrin khác sẽ tạo ra một diketohydrin Hợp chất sau phản ứng làm cho dung dịch có màu xanh tím.1

Hình 1 Ninhydrin phản ứng với amino acid sinh ra Ruhemann's Purple

- Thành phần (tỉ lệ) theo khối lượng nhóm amino càng nhiều trong mẫu phân tích phân tích thì màu xanh tím càng đậm Có thể giải thích cho kết quả thí nghiệm như sau:

+ Hỗn hợp amino acid ở ống 4 có thành phần nhóm amino cao nhất nên có màu xanh tím đậm nhất (++++)

+ Hỗn hợp amino acid được pha loãng ở ống 5 được pha loãng với 0.5 mL nước cất nên độ đậm màu xanh tím bị giảm (+++)

+ Leucine là 1 monoamino monocarboxylic acid nên độ đậm của màu xanh tím chỉ là vừa phải (++)

+ Theo Friedman and Sigel đề xuất thì đây là phản ứng với động hóa học bậc

2 Bậc 1 đối với ninhydrin và acid amin, gốc phản ứng chính của acid amin là dạng (NH2CHRCOO -) Trong ống 1 có glutamic là 1 monoamino dicarboxylic acid nên có tính acid cao hơn, pH nhỏ hơn so với ống 2 Điều này làm cho 1 phần NH2CHRCOO - được chuyển thành H3N +CHRCOO- nên màu xanh tím ở ống 1 sẽ nhạt nhất (+)

+ Riêng với trường hợp proline là một imino acid (không chứa nhóm amino mà chứa nitrogen dạng vòng) thì sản phẩm tạo ra hợp chất khác Sau phản ứng tạo

ra một hợp chất có hệ liên hợp ngắn hơn, khác biệt so với các ống nghiệm khác

và có màu vàng cam (*)

Hình 2 Ninhydrin phản ứng với proline tạo ra hợp chất màu vàng cam

- Vậy kết luận, phương pháp sử dụng ninhydrin là hiệu quả để định tính amino acid, và bằng kỹ thuật so màu có thể định lượng nhóm amino trong amino acid

B/ Định lượng Nitơ Axit Amin bằng phương pháp chuẩn độ Formol (Phương pháp Sorensen):

I/ Nguyên tắc thí nghiệm:

 Các aldehyde dễ kết hợp với nhóm amino Khi cho formaldehyde tác dụng với amino acid, nhóm amino bị methylen hóa tạo thành dẫn xuất methylene amino acid:

Hình 3 Phản ứng tổng quát của phương pháp chuẩn độ formol

 Hợp chất tạo thành có tính acid mạnh hơn amino acid tự do, các nhóm carboxyl của chúng dễ dàng định phân bằng kiềm, qua đó gián tiếp tính được lượng nitrogen amino của các amino acid có trong dung dịch

 Để cho phản ứng tạo methylene amino acid tiến hành hoàn toàn, cần có dư một ít dung dịch formaldehyde và phản ứng trung hòa hoàn toàn các nhóm carboxyl được thực hiện khi pH môi trường đạt tới 9,2 9,5÷

 Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật loãng vì nếu màu đậm thì rất khó nhận biết sự thay đổi màu khi chuẩn độ

 Dùng phương pháp này kết quả chỉ thật đúng đối với trường hợp của monoamino monocarboxylic acid Để kết quả đúng với mọi trường hợp cần phải trung hòa dung dịch đến pH 7,0 trước khi phân tích

 Để xác định điểm bắt đầu ( pH 7,0) và điểm kết thúc ( pH 9,2), người ta dùng phương pháp so màu: tạo ra 2 thang màu chuẩn ở pH 7,0 và pH 9,2 rồi đưa pH của mẫu về 7,0 (so sánh màu với màu chuẩn pH 7,0) sau đó định phân đến pH 9,2 (so sánh màu với màu chuẩn pH 9,2)

II/ Tiến trình thí nghiệm

1 Chuẩn bị

- Dụng cụ:

- Hóa chất:

+ Dung dịch đệm pH 7, pH 9.2 + Formol trung tính

+ NaOH 0.05N + Phenolphtalein

2 Tiến trình các bước

2.1 Chuẩn bị thang màu pH 7 và pH 9.2

Lấy 2 bình nón dùng để chứa dung dịch màu chuẩn, đánh dấu số thứ tự:

- Cho vào bình thứ nhất: 20 mL dung dịch có pH 7 và 5 giọt bromthymol blue 0,04%

- Cho vào bình thứ hai: 20 mL dung dịch có pH 9.2 và 5 giọt bromthymol blue 0,04% và 3 giọt phenolphthalein 0.5%

2.2 Tiến hành phân mẫu

Hình 4: Sơ đồ khối trình tự thí nghiệm

- Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nước cất

2.3 Tính kết quả

Số gam nitrogen amino acid có trong 1L nước mắm được tính bằng công thức:

20× V

Trong đó: x−¿lượng gam nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm

a (ml): thể tích NaOH0,05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm;

b (ml): thể tích NaOH 0,05 N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng;

T: hệ số điều chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn;

III/ Kết quả thí nghiệm

1 Bảng thí nghiệm kết quả

0

- Giá trị a = 4.5 4.5 4.55+ 3+ ≈ 4.516 mL

Số gam nitrogen amino acid có trong 1L nước mắm được tính:

x=(4.516 0− ) × ×1 0,0007×100×1000

IV/ Biện luận kết quả thí nghiệm

- So sánh kết quả vừa tính được với cả 6 nhóm còn lại cùng thực hiện trên mẫu nước mắm các nhóm có các giá trị khác nhau, chủ yếu dao động trong khoảng từ 15đến

17 gam nitrogen amino acid Nguyên nhân của sai lệch này có thể là do:

+ Thao tác tay không đều và chưa chuẩn giữa các thành viên Đặc biệt là trong khâu chuẩn độ trên burette

+ Khả năng quan sát và nhận diện so màu giữa các thành viên không giống nhau dẫn đến giá trị thu về và tính toán chỉ mang tính tương đối

+ …

- Theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5107:2018 về Nước mắm thì hàm lượng2 nitrogen amino acid được quy định là không nhỏ hơn 35 % so với hàm lượng nitrogen tổng số, mà hàm lượng nitrogen tổng số được quy định là không nhỏ hơn 10 g/L , vậy hàm lượng nitrogen amino acid được quy định là không nhỏ hơn 3.5g/L Vậy kết quả thực nghiệm là thỏa đáng, phương pháp thực nghiệm là hiệu quả để định lượng nitrogen amino acid

- Các đề xuất giúp thí nghiệm thu được kết quả tốt:

+ Thống nhất cùng 1 cách so sánh với màu chuẩn

+ Cần luyện tập và sử dụng burette, các dụng cụ khác để hạn chế sai số

Tài liệu tham khảo

Carey B Bottom, et al.(1977) “Mechanism of the ninhydrin reaction”, Biochemical education, Vol 6 No 1, pp 4-5

2 https://caselaw.vn/van-ban-phap-luat/345127-tieu-chuan-quoc-gia-tcvn-5107-2018-ve-nuoc-mam-nam-2018