Khóa luận tốt nghiệp Hóa học: Định lượng Paracetamol trong thuốc bằng phương pháp trắc quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các phương pháp đã được ứng dụng trong định lượng paracetamol như xác định paracetamol bằng phương pháp vôn-ampe với điện cực làm việc là điện cực vàng, định lượng paracetamol trong chế

Trang 1

* ĐỊNH G NA ON BANG PHƯƠNG PHAP TRACQUAN a

PHUONG PHAR ASC KY PONG HIỆU NANG CAO

Trang 2

KHOA LUAN TÓT NGHIỆP NGUYEN HIEU PHƯƠNG

“Để hoàn thành được khoá luận tốt r

giúp đỡ, động viên từ gia đình, thầy cô

ie SỐ th xin oR cám om đóa

luôn bên con s

-3 Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sất nh đến thầy Lê Ngọc Tử đã động

viên, giúp đỡ nhiệt tình và tận tâm hướng dẫn em trong suốt thời gian qua.

Em xin cảm on tit cả các thầy cô trong khoa Hoá đã quan tâm, tạo điều kiện cho

em trong suốt thời gian qua, đặc biệt thầy cô trong tổ Phân Tích và tô Nông

ip này, tôi đã nhận được rất nhiều sự

ằ em gái tôi, cảm ơn gia đình đã

Em xin chân thành cảm ơn cô ên đã giúp đỡ chúng em nhiệt

tình về dụng cụ, trang thiết bị, hoá chất thời gian làm khoá luận

Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn cả các bạn của tôi, những người đã

đồng hành và luôn bên cạnh tôi trong suốt thời gian quai”

Trang 3

KHĨA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG

BI: 0Á Đố tt cá i6it0S407701186G020110 102030 6GGy5504(006242⁄44020ÿạ4ï604402Qi005944(0)01464sã08514)i1a43x4 I

MƠ DẨ ¡80020 26<c 00t ttcs0tsgs)x2c664444G01002/60201804/4G355038691018/04666336463/001Q06G 5

1 1W" 1,5 5; a HH xxx a ee 7BANH MỤC HÌNN ccs cst saci RNS a i 10

MEE L4, 33109) SOR WS | ý li ở: | li NGDBNII NDREDERBRARUB mm 11CHƯƠNG | ĐẠI CUONG VE PHAN TICH TRAC QUANG 14

THIỆN ) ng GB Ố.Ố 6 1 " l4

1.2 Cae mức năng lượng trong phản tư - 5 àc-ScSs<ccscssesereeeerzrrree 14

bã G44 EE kneenaeaveedeanessei»eodtdekeesennenessianseee l4

1.4 Cơ sở hố học của màu sắc - s c-soccszerescocczctcessgk4tccee 15

14 CÁedRnh buntlines tiga c0 Waitt icscsscczesccnsisccaanscensconcsvcsasccsteinc us pbbecbanecbapansnecave 16

L6 RRR AR IN i a i 18

1% ERBODNEDpPRRBUNST:oueakefeetieocaqGeoiaodidaectiytvd0700sassodie 19

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ CHUNG VE PHƯƠNG PHAP SAC KỶ - 22

2.1 Cơ sở chung cia phương pháp sắc ký cocecooeeoocoooo 22

2.2 Sie ky lỏng hiệu năng cao (HPLC) -—-2 22c cosssconssssbuiiunten 23

2.4, Tiêu chuẩn của sắc ký đồ và peak Gaussianian 0ccc0ccsessesessesssseseeneeesreeees 29

2.5 Nguyên tắc của quá trình HPLC trong cột - 66 52555252<2s1<cxee 30

2365; Câácđ@ | NO tUDNNGGG066662(02A620-ic6ã00)02v442 L4 31

Trang 4

KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYEN HIỂU PHƯƠNG

———cc ———————— —-=—————_————

SMC to he |, 40

28: Clete Gini Mele wat isch cise a se cee ain seats igs 42

CHƯƠNG 3 GIỚI THIẾU VE PARACETAMOL 0 cccccscseccceecssessuesseeeceeeeeneesseeens 47

30: Chhng CHỈ Ciel sess icscssnscasts ss cee FEE 50

0U, 2887 CRONIN CONES DI D \ ssescssepiens isis nenssaeppasil iiierneimebbihten iss tebe sanenneninen’ ty paneannappiteetiirensh $0

3:1Ì "Thnng tho N0 24G các 6G16ï0 G66 G040 020 G0cd0àscbe880Ai6tiae 51

212, STC GU ass caccsrcncscopnninn icone insmnctinn th rannasnsoneiicas seb inenenadabeis nckshdamndsanes iiss 51

3/3 Liền NON 22400 36006126110660/00\/042G0080941620ã aces 52

Trang 5

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIEU PHƯƠNG

CHUONG 5 ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL BẰNG PHƯƠNG PHAP TRAC QUANG

I eS RS NI eS RA an ta $7

W1 f0 GB hsaeeeedweaexexeetoohkeesesduGesesseoeenokudee 57

5.2 Khao sát các điều kiện tối UU sccccsscsscossesssnssscsvecessosecsenecsensvenssersssvaseereversesee 57

5.3 Định lượng paracetamol trong mẫu tự pha -. 5-5511 1e 62

5.4 Định lượng paracetamol trong thuốc bằng phương pháp thêm chuan T2

Tis; KẾ Maia ssssisccaias cass cca ected idea sel 87

PHAN RET EUAN VÀ: ĐỀ XUẤT (uáia b2 ucï 0626 á06/0066GQGGdAai8uii 88

{` ) a ee 89

2 :DỆNHỄGGG2GGGUGGGGGGQQGIGGGGAAdGitititt(dliaqixguad 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 ieee RRR SRR 91

CÁC CONG THUC TÍNH GIA TRI THONG KE o c.csssssecsssesssvessseessneecnneesessetneeeanee 92

Trang 6

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

MO DAU

Chat lượng thuốc hiện nay đang là một trong những yếu tổ được quan tâm hàng dau

của ngành Dược Việt Nam, vì thế việc quản lý và nâng cao chất lượng thuốc cũng nhưcông tác kiểm tra, danh gia chất lượng và biết rõ về loại thuộc dang sử dụng đã trở thành

nhu câu không thé thiếu của mọi người Paracetamol là chất có ứng dụng rộng rãi vả phổ

biến trong y học cũng như trong đời sống có tinh năng giảm đau, trị sốt Da số các công tyđược đã ứng dụng paracetamol vào sản xuất hàng loạt các loại thuốc cảm do giá thành

tương đối rẻ và khá dé sử dụng Do đó việc xác định hàm lượng paracetamol trong thuốc là

thiết thực và hữu ích Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chon dé tài: “ XÁC ĐỊNH HAM

LƯỢNG PARACETAMOL TRONG THUỐC BANG PHƯƠNG PHAP TRAC QUANG

VA PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO”.

Qua tham khảo và nghiên cứu một sé tài liệu và thực tế chúng tôi nhận thấy có

nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng paracetamol Các phương pháp đã

được ứng dụng trong định lượng paracetamol như xác định paracetamol bằng phương pháp

vôn-ampe với điện cực làm việc là điện cực vàng, định lượng paracetamol trong chế phẩm

được hỏa tan trong huyết tương người bằng sắc ký long cao áp, phương pháp phân tích da câu tử (MCA), phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc định lượng bằng phương pháp quang phô UV-VIS Mỗi phương pháp điều có ưu và nhược điểm riêng của

mình Tuy nhiên dé chọn được một phương pháp vừa có hiệu quá kinh tế cao vừa đạt được

chất lượng tốt mà lại phù hợp với từng loại thuốc là một van dé không nhỏ, phải qua nhiều

giai đoạn và phải tốn nhiều thời gian, chỉ phí đầu tư.

Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng phương pháp trắc quang là một phương

pháp thực hiện nhanh chóng, thiết bị đơn giản, tiết kiệm và phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao lả một phương pháp hiện đại đang được đa số các công ty được cùng như các trung tâm kiểm tra chất lượng, các công ty chế biến lương thực thực phẩm sử dụng để

kiểm định chất lượng sản phẩm của cơ sở mình Và chúng tôi áp dụng hai phương pháp

trên để xác định hàm lượng paracetamol trong thuốc.

Trang 7

Trong khóa luận, chúng tôi giới thiệu tổng quan về phương pháp trắc quang và

phương pháp sắc ky lông hiệu năng cao (HPLC) Sau đó đi vào ứng dụng, nghiên cứu và

tiễn hành xác định ham lượng paracetamol trong thuốc.

O đây chúng tôi sử dụng các phương pháp như nghiên cứu, tham khảo tai liệu,

phương pháp thực nghiệm, thống kê xử lí các kết quả phân tích.

Trang 8

————ễễễ====ềã:ăằ=ằẶ.~——————ẽa:: ——

DANH MỤC BANG Bảng Š.l Sự phụ thuộc của độ hap thụ vào % metanol - -. -55- 55552 58 Bang 5.2 Sự phy thuộc của độ hấp thụ vào pH c.ceeccececccessesscseeteecssnennnecennensnns 59 Bang 5.3 Sự phụ thuộc của độ hap thụ vào thời giaM cc.ccseessssssesesneeennsneeensnnne 60 Bảng 5.4 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào ndng độ: - -. -555- 5555: 61 Bang 5.5 Các mẫu dung dich thử của paracetamol - 55-5 63 Bảng 5.6 Các mẫu dung dich thứ trong phương pháp đường chuẩn 63

Bảng 5.7 Kết quả thực nghiệm mẫu thử | trong phương pháp đường chuân 63

Bang 5.8 Kết quả thực nghiệm mẫu thử 2 trong phương pháp đường chuẩn 63

Bảng 5.9 Kết quả thực nghiệm mẫu thử 3 trong phương pháp đường chuân 64

Bang 5.10 Các dung dịch của mẫu thử 1 bằng phương pháp thêm chuẩn 64

Bảng 5.11 Kết quả thực nghiệm mẫu thử ! bằng phương pháp thêm chuẩn 65

Bảng 5.12 Kết quả thực nghiệm mẫu thử | bằng phương pháp thêm chuẩn 66

Bang 5.13 Các dung dịch của mẫu thử 2 bằng phương pháp thêm chuẩn 66

Bang 5.14 Kết quả thực nghiệm mẫu thử 2 bằng phương pháp thêm chuẩn 66

Bang 5.15 Kết quả thực nghiệm mẫu thử 2 bằng phương pháp thêm chuẩn 67

Bang 5.16 Các dung dich của mẫu thử 3 bằng phương pháp thêm chuan 67

Bảng 5.17 Kết quả thực nghiệm mẫu thử 3 bằng phương pháp thêm chuắn 68

Bang 5.18 Kết quả thực nghiệm mẫu thir 3 bằng phương pháp thêm chuẩn 69

Bảng 5.19 Các dung dịch của mẫu thử 4 trong phương pháp thêm chuẩn 69

Bảng 5.20 Kết quả mẫu thử 4 trong phương pháp thêm chuẳn -.- 69

Bảng 5.21 Kết quả mẫu thử 4 trong phương pháp thêm chuắn 70

Bang 5.22 Kết quả xứ lí thống kê các số liệu thực nghiệm các mẫu dung dịch thử trong

phương pháp đường elnino is eS eS 71

Trang 9

KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG

Bảng 5.23 Kết qua tông hợp vả xử lí thống ké các số liệu thực nghiệm 4 mẫu thử bằng

Bảng 5.24 Các dung dịch của mẫu thật | bằng phương pháp thêm chuan 72

Bang 5.25 Các dung dich của mẫu thật 2 bằng phương pháp thêm chuẩn 72

Bảng 5.26 Các dung dịch của mẫu thật 3 bang phương pháp thêm chuan 73

Bảng 5.27 Kết quả thực nghiệm mẫu thật 1 2 © 22222222 221222 73 Bang 5.28 Kết quả thực nghiệm mẫu thật Ì 22-52 E211 2221120211202 74 Bảng 5.29 Kết quả thực nghiệm mẫu thật 2 ccccssssessssesseesssssessssvsesssnnenscsenneneee 74 Bang $.30 Kết quả thực nghiệm mẫu that 2 -.0cccce-sesscsesseesorecoeecsessveseoerecrsesseanse 75 Bảng 5.31 Kết quả thực nghiệm mẫu thật 3 52 20222261 e6 75 Bang 5.32 Kết quả thực nghiệm mẫu thật 3 -2sScSscccczzccckercree 76 Bang 5.33 Kết quả tổng hợp và xử lí thống kê các số liệu thực nghiệm 3 mẫu thật 76

Bảng 5.34 Hàm lượng paracetamol trong gói efferalgan -5 77

Bang 5.35 Các dung dịch của mẫu thật 4 - 22 2 22 SE 35231 31 222122, 77 Bang 5.36 Kết quả thực nghiệm mẫu thật 4 : ccccscssscsseesssncesnsnesssnsensoneessnneeesseves 78 “Bang 5.37 Kết quả thực nghiệm mẫu thật 4 2222222224141211922222022271727276 78 Bang 5.38 Kết qua tổng hợp và xử lí thống kê các số liệu thực nghiệm mẫu thật 4 79

Bang 5.39 Ham lượng paracetamol trong gói efferalgan << << 79 Bảng 6.1 Sy phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ 5 82 Bang 6.2 Các dung dịch của mẫu thử bằng phương pháp đường chuẩn 82

Bang 6.3 Kết qua diện tích peak 3 mẫu thử bằng phương pháp đường chuan 83

Bảng 6.4 Kết quả mẫu thử | bằng phương pháp đường chuẩn - 83

Bảng 6.5 Kết quả mẫu thử 2 bảng phương pháp đường chuẩn 83

Bảng 6.6 Kết quả mẫu thir 3 bằng phương pháp đường chuẩn §3

Trang 10

KHÓA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

Bang 6.7 Các dung địch mẫu thử bằng phương pháp thêm - 84

Bảng 6.8 Kết quả thực nghiệm mẫu thử bang phương pháp thêm chuẩn §4

Bảng 6.9 Kết quả tông hợp và xử lí thống kê các số liệu thực nghiệm 3 mẫu thử trong

trong pho đường MMMM is sss ies ÌĂŸG kia 0kcecakeobaaosdeeesdkd)d6ex 85

Bảng 6.10 Kết quả tông hợp và xử lí thống kê các số liệu thực nghiệm mẫu thử bằng

Di ri Tiện: (h7 0 NIỂN c con 005 a ooo aan 85

Bảng 6.11 Các dung dich của mẫu thật bằng phương pháp thêm chuẩn 86

Bang 6.12 Kết quả điện tích peak của mẫu thật bằng phương pháp thêm chuẩn 86

Trang 11

KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYEN HIẾU PHƯƠNG

Hình 2.5 Mô tả thời gian lưu của peak - St se 28

Hình 2.6 Trang thái của peak theo chuẩn Gaussian với p = 20 ; ø =l 28

¡¡ HP SN 0 _““ “s 28

Hình 2.8 Sy tách các chất khác nhau khi ra khói cột s.svcre 31

HAR2SL Te Yt saseitaaidcjdfeseoitrtGeedssereiiougaesasaoseo 34

Hình 2.10 Xác định độ lệch chuẩn o của peak tir độ rộng của peak 35

Hình 2.11 Sự phụ thuộc hệ số R vảo chiều dai của cột (phụ thuộc vào N — cột càng dai thìg0:0†x ý Quyết cùng TỐ c0 062GG02:60002600201060022 0G162600.1G501G01Aw 020 37

og ee 38

Hình 2.13 Mô tả phương trình Van Deemter ccccscccseseeseeesersssesesenessneensseteeesnes 39

Hình 2.14 Sự ảnh hưởng của thành phần pha động trong sắc ký lỏng đến khả năng tách

đán in án ca ác dán 0 Cà N3 0 604422005019) À10602 106 66/4400204220250 56265 146554044056G1/404205260021)11022012662LG6101)//22 3326 4ì

Hình 2.15 Sự phụ thuộc ba thông số trong sắc ký . .5 555422 42

Hình 2.17 Lập đường chuẩn trong phương pháp ngoại chuẩn + 43

Hình 2.18 Sắc ký đồ trong phương pháp nội chuẩn - 5© 55555552 44

Hinh 5.1 - Đề thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào tỉ lệ phần trăm metanol58

Hình 5.2 Đỏ thị biểu điển sự phụ thuộc của độ hap thụ vào pH 60

Trang 12

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

Hình Š.3.

Hinh 5.4.

Hình Š.§.

Hinh Š.6.

Hình 5.7.

Hình 5.8.

Hinh 5.9.

Hình 5.10.

Hình 5.11.

Hình Š§ I2.

Hinh 5.13

Hinh 6.1.

Phó hap thụ của paracelAMOl scceceseesersseciseeenseseeseessssnneneneennseerereneess 60

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hap thụ vào thời gian 61

Đà thị biểu điển sự phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ của paracetamol 62 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ của mẫu L - 65

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hap thụ của mẫu 2 67

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hap thụ của mẫu 3 - 68

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hap thụ của mẫu 4 70

Đồ thị biểu diễn sy phụ thuộc độ hấp thụ day dung dich của mẫu thật 1 74 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hap thụ của dãy 2 75

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ của dãy 3 - 76

Đô thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hap thụ của đãy 4 - 78

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nông độ của paracetamol

Trang 13

KHÓA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao.

tr : thời gian lưu

12

Trang 14

Phân Tổng Quan

Trang 15

KHÓA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG

CHUONG1 ĐẠI CƯƠNG VE PHAN

TICH TRAC QUANG

1.1 Dinh nghia

Phân tích trắc quang hay các phương pháp phân tích quang học dựa trên sự tương tác chọn lọc giữa chất cần xác định với năng lượng bức xạ thuộc vùng tử ngoại, khả kiến hoặc

vùng hồng ngoại

Nguyên tắc chung của phương pháp phân tích trắc quang là muốn xác định một cấu tử

X nào đó, ta chuyển nó thành hợp chất có kha năng hap thụ ánh sáng rồi đo sự hap thụ ánh

sáng của nó và từ đó suy ra hàm lượng cấu tử X cần xác định,

1.2 Các mức năng lượng trong phân tử

Nội năng trong phân tử bao gồm ba phân chính:

- Nang lượng chuyển động của electron (electron hóa trị), kí hiệu E,.

- Nang lượng dao động của các nguyên tử trong phân tử, kí hiệu E,.

- Nang lượng chuyển động quay của toàn phân tử, kí hiệu E,.

Ngoài ra còn năng lượng chuyển động tịnh tiên của phân tử mà người ta thường không

_xét tới vì năng lượng này liên tục.

Do đó, ta có thể biểu diễn nội năng E của phân tử đưới dạng biểu thức gần đúng sau:

1.3 Co sở vật lý mau sắc

Anh sang là những dao động điện từ có bước sóng khác nhau hay là đồng photon

có năng lượng khác nhau Khi phân tử hap thy bức xa tử ngoại hoặc kha kiến (1 = 100-4000

l4

Trang 16

và 4000-7600 ) với tấn sé v sec”, thì những electron hóa trị của nó bị khích thích và chuyển

từ trạng thái cơ bản lên trang thái kích thích Phé thu được gọi là phô tử ngoại (UV)- khả

kiến (VIS-Visible spectra), cũng còn được gọi là phổ hap thy electron hay phé electron.

Hiệu các mức năng lượng được xác định bởi phương trình:

1.4, Cơ sở hoá học của màu sắc

Sự hap thy tia sáng thuộc miền khả kiến hay tử ngoại làm kích thích hệ electron củaphân tử Từ trạng thái kích thích có năng lượng cao trở vẻ trạng thái cơ bản có năng lượngthấp, phân tử lại giải toả ra năng lượng đưới 3 dạng chủ yếu sau:

- Nang lượng giải toa gây ra sự biến đổi tinh chất hoá học của chất Nghiên cứu sự

biến đổi hoá học này thuộc ngành quang hoá Hiện tượng quang hoá hiện nay ítđược sử dụng trong phân tích trắc quang

- Nang lượng giải toa ra dưới dạng ánh sáng Hiện tượng nay gọi là phát quang Hiện

tượng này được ứng dụng rộng rãi trong phân tích định tính và định lượng, là cơ sở

của phân tích phát quang Màu sắc của ánh sáng thu được có màu bù với màu của

ánh sáng bị hap thụ Ví dụ:

thụ thi màu thu được là màu trắng

Mien phô hông

ngoại

Miễn pho tử ngoại | Miền pho khả kiến

15

Trang 17

KHÓA LUAN TÓT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

- Trong dai đa số trường hợp, nang lượng kích thích biến thành chuyển động nhiệt,

được phân bố cho các mức dao động của phân tử và của sự solvat Sự chuyến năng

lượng kích thích của hệ electron thành chuyển động nhiệt là cơ sở của phân tích trắc

quang dùng để xác định hàm lượng chất phân tích theo độ hấp thụ ánh sáng

1.5 Các định luật hấp thụ cơ bản

1 Š.1 Định luật Bughe-Lamber

Khi chiếu một đòng ánh sáng có cường độ lạ vào một cuvet trong suốt có thànhsong song đựng dung dịch chất hap thụ thì cường độ dong sáng sau khi đi ra khỏi lớp dung

dich có chiều day | yếu hơn so với Ip Năm 1920, bằng thực nghiệm nhà bác học Bughe

(Pháp), vả sau đỏ là Lamber (Đức) đã thiết lập được định luật Bughe-L.amber: “Những lớp

chất có chiêu dày đồng nhất trong những điều kiện khác như nhau luôn luôn hấp thụ một tỉ

lệ như nhau của dòng sáng rọi vào dung dịch đó”.

1=1,.10TM (1.1)

Trong đó: lạ- Cường độ dòng sáng tới chiếu vào dung dịch.

1 - Cưởng độ dòng sang sau khi qua lớp dung dịch.

16

Trang 18

KHÓA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG

k- Hệ số tắt, phụ thuộc vào ban chat chat hap thụ và bước sóng ánh sáng tới.

| - Chiều day lớp dung dich mau

1.5.2 Định luật Beer

Sự hap thy dòng quang năng tỉ lệ bậc nhất với số phân tử hap thụ ma dòng quang

năng đó đi qua.

K=eC (1.2)

C - Nông độ chat hap thy (ion/l mol/l)

e - Hệ số không phụ thuộc nòng độ.

1.5.3 Định luật cơ bản của sự hấp thụ ánh sáng Bughe-Lamber-Beer

Tông hợp phương trình (1.1) và (1.2) ta được phương trình:

Gia thiết hệ có n cấu tử như vậy: A, B, C, N theo định luật cộng tính:

Trang 19

KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYEN HIEU PHUONG

1.6 Phương pháp đồ thị

Dé xác định nông độ theo phương pháp nảy phải đựng đường chuẩn A -C đối với

chất cần xác định (ở những điều kiện tối ưu) Sau đó pha dung dich nghiên cứu, đo C, rồi

dựa vào đường chuẩn hoặc phương trình đường chuẩn dé xác định C, tương ứng.

Dựng đường chuẩn:

Pha một day dung dịch chuẩn có Cy khác nhau khoảng 30% và thường phải có 5-8 dung dịch chuẩn Đối với mỗi giá tri của Cy, phải pha song song không ít hơn 3 dung dich

chuẩn, đo Ay, của mỗi dung dich và lấy giá trị trung bình Ay cho một điểm trên đường

chuẩn Trong trường hợp dung địch tuân theo định luật Beer thì đường chuẩn là một đường

thăng đi qua gốc tọa độ.

Khi chọn vùng nông độ dé xây dựng đường chuan phải lưu ý:

- Vùng nông độ của dãy chuẩn phải bao gồm ca C,.

- Với vùng nòng độ đã chọn dung dich phải tuân theo định luật Beer.

- Các giá trị Aw ứng với nồng độ đã chọn phải sao cho khi đưa lên máy đo có độ lập

lại cao và bảo đảm sự tuyến tính A -C (tốt nhất chỉ nên dùng những dung dich chuẩn có A

Trang 20

Khi | = const là một đường thăng đi qua gốc toa độ nên có thé viết:

A=bC

Trong đó b là hệ số góc của đường chuẩn

Tuy nhiên, nêu như phép phân tích gặp phải một sai số hệ thống nào đó thì đường A

= f{C) có thể không đi qua góc toa độ ma cất trục tung ở một giá trị a nào đó ứng với

phương trinh có dạng:

A=bC ta Với:

Ưu điểm của phương pháp đường chuẩn là với một đường chuan cho phép phân

tích hàng loạt mẫu, dung dịch cũng không đòi hỏi phải tuân theo định luật Beer một cách

nghiêm ngặt (nhưng lúc đó phải pha dung dich chuẩn có nồng độ khác nhau it hơn là 10%

ma thôi) Tat nhiên độ chính xác của phương pháp không cao lắm

1.7 Phương pháp thêm

Phương pháp thêm là một dạng của phương pháp so sánh Theo phương pháp này,

độ hap thụ của dung dịch nghiên cứu được so sánh với chính dung dịch 46 có cho thêmnhững lượng xác định của chất nghiên cứu a

Phương pháp này được dùng để đơn giản bớt quá trình phân tích nhưng chủ yếu là

để loại trừ ảnh hưởng cán trở của các tạp chất lạ vì nó cho phép tạo ra những điều kiện

giống nhau cho dung địch chuẩn và dung địch nghiên cứu Phương pháp được dùng rộngrãi đẻ xác định những vi lượng của chất nghiên cứu khi có mặt những chất cản trở Tuy

vậy, phương pháp này cũng chỉ áp dụng được cho những dung dich tuân theo định luật hap

thụ cơ bản.

THU VIỆN

Trương Dai-Hoc Su-Pham 19

TP HO-CHI-MING

Trang 21

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

Có thé dùng phương pháp tính hoặc phương pháp dé thị:

1.7.1 Phương pháp tính

Pha dung dịch mau nghiên cứu với C, chưa biết.

Pha dung dịch màu chuẩn cũng chính là dung dịch màu nghiên cứu có cho thêm một lượng a của chat can xác định dé cho C= C,+C, Do độ hap thy A, và A với củng

loại cuvet, so sánh với dung dịch so sánh.

Pha dung dich màu nghiên cứu với C, và đo A,.

Pha một dãy dung dịch chuẩn cũng chính là dung dịch nghiên cứu có cho thêm những lượng chính xác a; của chat cin xác định dé đo nồng độ của dãy chuẩn là C,.,), Cyrus Crusade «+ » Caras và do độ hấp thy A tương ứng.

Dựng đề thị A,.„ — C„ dé xác định C,Kết qua xác định bằng phương pháp thêm sẽ càng chính xác nếu như C„ càng bé décho A,.„ cảng gần nhau và gần với A, giá trị tuyệt đối từ A đến gốc toa chính bằng C,

Khi vì một lí do nao đó dung dịch màu không tuân theo định luật Beer, nghĩa là

không có sự tuyến tinh giữa A - € thì phải dùng phương pháp tính dựa trên sự uốn thẳngđường cong trong một phạm vi hẹp của nồng độ như sau: Pha 2 dung dịch mau nghiên cứu

có nồng độ chat cần xác định 1a C, và C./n (pha loãng n lần dung dịch có nồng độ C,) vadung dich màu nghiên cứu có cho thêm một lượng chất cần xác định để có C,,, sao cho

Cyn <€, < Ca để cho An < Ay< A,,, nhưng rất gần nhau thi sai số sẽ giảm

Nếu như đưa lên đồ thị mà đường biểu diễn không phải là một đường thing như ở

hình dưới đây thi trong một phạm vi hẹp ta có thể coi như đường thẳng và tính C, như sau:

20

Trang 22

——- => —ễ—ễ———

A, 6 Cyl

n n

A, = eC\)

Ave = E Cš¿ư = 8 (Cy +C,)I

A,- A,/n c— Gi/n

Aya - Ax , Cua = GS

A,- A, /n

C, = C,.0a (2-1 )— L_

Aus = Ax

Trang 23

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ CHUNG VE

2.1 Cơ sở chung của phương pháp sắc ký

Quá trình sắc ký là một quá trình hóa lý trong đó có sự phân tách giếng như quá

trình chưng cất, kết tinh hay trích ly Phương pháp được xem là một phương pháp tách các cấu tử trong mẫu hiện đại nhất từ trước tới nay mà Tswett được xem là cha đẻ của phương

pháp sắc ký Chuẩn bị cho quá trình sắc ký gồm rất nhiêu khâu, mục đích là dé tách va làm

tinh khiết các thành phan trong mẫu như mẫu chuẩn ding cho kỹ thuật phân tích Cho đến bây giờ, sắc ký có thể tách các phần rất nhỏ phục vụ trong lĩnh vực hóa học, sinh học

Quá trình tách sắc ky gồm 3 giai đoạn chính:

- Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh: Vi dụ chấm lên bảng mỏng dé lên trên cột, tiêm sắc

- Cho pha động chạy qua pha tĩnh: Ví dụ cho dung môi chạy trên bảng mỏng kéo

theo các tinh chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau va

có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc đỏ, gọi là sắc ký khai triển Nếu cho

dung môi pha động chạy liên tục qua cột sắc ký thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra

ngoài pha tĩnh Dé là sắc ky rửa giải.

22

Trang 24

KHOA LUAN TỐT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

———————— — CC—————=nmnnnnnmB— Sa s“mmnnanannnnnnnnnnnannnnnfnnnn mm ST CC

Phát hiện chất: các chất màu có thé phát hiện dé dang, các chất không màu có thé

phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng thuốc thứ Trong sắc ký rửa giải có thé phat

hiện các chất khi chúng ra khỏi cột bằng đetector.

Phương pháp sắc ký đạt đến đỉnh cao là vào năm 1940 khi mà con người cở thé làm ra

những cột Những cột nay có thé xác định thời gian lưu trú của các câu tứ khi đi ra khỏi cột với những thành phan rat nhỏ (vai nano gam) Tín hiệu của detector do một câu tử nao đó

khi ra khỏ cột, được ghi nhận bằng một mũi, xác định ở một vị trí trong sắc ký đà.

Khi cột ding là phù hợp với quá trinh chạy sắc ký, sắc ký đề thu được là rất đẹp và những thông số cho quá trình tách đáng tin cậy Vi vậy, dé có một kết quả tốt người ta phải

chuẩn bị cho qua trình với thời gian dai và có thé vai giờ mà không thé một vai giây.

Sắc ký long hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc ký kỹ

thuật phân tích được dùng rộng nhất Các quá trình sắc ký có thể được định nghĩa

như các công nghệ phân ly gồm nhiều khối chuyển đời giữa các pha tĩnh va động.

HPLC ding một pha động lỏng để phân ly các thành phan của một hỗn hợp.

Các thành phần này (hay các chất phân tích) được hòa tan đầu tiên trong một dung môi vả sau đó đi xuyên qua một cột sắc ký đưới áp suất cao Bên trong cột, hỗn hợp

được phân giải thành các thành phần của nó Độ lớn của độ chính xác là quan trọng.

phụ thuộc trên khoảng rộng của sự tương tác giữa các thành phan tan và pha tinh.

23

Trang 25

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG

Pha tĩnh được định nghĩa như gói vật chất bắt động trong cột Sự tương tác của chấttan với pha động vả tĩnh có thẻ được thao tác nhờ nhiều sự lựa chọn khác nhau của

khả năng hòa tan vả pha tĩnh Kết quả HPLC thu được một mức độ cao của tỉnh linh

hoạt không có trong các hệ thống sắc ký khác và có khả năng phân tích một cách dẻ

đảng một khoảng rộng của các hỗn hợp hóa học.

2.2.2 Lịch sử của HPLC

Hình 2.2 Lược đồ các bộ phận quá trình sắc ky lỏng

Trước thập niên 1970, có rất ít những phương pháp sắc ký đáng tin cậy có sẵn trên thị trường dé các nhà khoa học sử dụng trong thí nghiệm Trong thập niên 1970, hau hét những sự phân tích hóa học được thực hiện bằng nhiều kỳ thuật đa dang bao gồm sắc ký

cột mở sắc ký giấy, và sắc ký lớp móng

Tuy nhiên, những kỹ thuật sắc ký đó không phù hợp cho việc định lượng những hợp

chat và không đạt được độ phân giải cao đủ dé phân biệt những hợp chat tương tự nhau.

Trong khoảng thời gian này, sắc ký lóng áp suất cao bắt đầu được sứ dụng đề giảm lưu

lượng theo thời gian, nhờ đó giảm những lần lọc những hợp chất được tách bằng phương

pháp sắc ký cột Tuy nhiên, tốc độ dòng lại không nhất quán, và câu hỏi gay tranh cai 1aliệu việc giữ tc độ dòng ồn định hay một áp suất ôn định là tốt hơn?

Trang 26

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được phát triển trong những năm

1970 và nhanh chóng được cải thiện với sự phát triển của những nguyên liệu làm cột vả

tiện ích phụ thêm của những detector trực tuyến Vào cuối những năm 1970, những phương pháp mới bao gồm sắc ký lỏng pha đảo được chap nhận cho sự phân tích cải tiền

giữa những hợp chat rat giống nhau

Cho đến thập niên 1980, HPLC thường được dùng dé phân tích những hợp chat hóahọc Những kỹ thuật mới cải tiễn sự phân tích, nhận dang, tinh lọc vả định lượng rất nhiều

so với những kỳ thuật trước dé Máy tính và kỹ thuật tự động góp phan vảo sự thuận tiện

của HPLC Những loại cột làm gia tăng khả năng tái sản xuất được giới thiệu vả nhữngthuật ngữ như cột vi mô, những cột ái lực và HPLC đã bắt đầu thâm nhập.

Thập kỷ qua đã chứng kiến một sự quyết tâm to lớn trong sự phát triển những cột vi

mô, và những cột chuyên biệt khác Kích thước của một cột HPLC tiêu biểu là: chiều dài

XXX mm với đường kính bên trong trong khoảng 3-5 mm Đường kính thông thường của

các cột vi mô, hay cột mao dẫn, ở vào khoảng 3 uum-200 ym.

HPLC sử dụng một cột ngắn hơn loại cột tiêu biểu, Một cột HPLC dài khoảng 3

mm và được đỗ day với những phân tử nhỏ hơn.

Hiện nay, một người có thể chọn nhiều loại cột để phân tích hợp chất, cũng như đa dạng

các loại detector dé giao tiếp với HPLC nhằm đạt được sự phân tích tối ưu các hợp chat

Dù HPLC được mở rộng như là một kỹ thuật chủ yếu dùng cho nghiên cửu công

nghệ sinh học, y sinh học, hóa sinh cũng như cho ngành dược phẩm, thật ra những ngànhnày hiện chỉ có 50% trong số những người sử dụng HPLC Hiện tại HPLC được sử dụng

trong rat nhiều lĩnh vực va ngành công nghiệp bao gồm mỹ phẩm, năng lượng, thực phẩm

và môi trường.

Các phương pháp phân tích HPLC:

+Normal phase chromatography (NP): phép sắc ký pha thuận +Reversed phase chromatography (RP): phép sắc ký pha đảo

+Size exclusion chromatography (SEC): phép sắc ky ray phan tử.

+lon exchange chromatography (IEX): phép sắc ký trao đổi ion

+Affinity chromatography: phép sắc ky ái lực

25

Trang 27

2.2.3 Ung dung

HPLC được dùng cho việc phan tích của các thành phan đã pha trộn các

phân tích định tính các phân tích định lượng điều chế các thành phần quan

Mobile phase: pha động

Solvent delivery: cung cấp dung môi

Pump: bơm

26

Trang 28

————————————————————

Injector: bộ phun

Sample injection: bơm mẫu

Column separation: cột phân tích

thị ở trục hoành còn tín hiệu detector biểu thị ở trục tung Quá trình tách xảy ra trên cột

dẫn dẫn đến một dai peak xuất hiện mọc lên từ đường nén Đó chính là dau hiệu thu được

từ mẫu hiện diện Nếu cường độ tin hiệu detector thu được là ty lệ tuyến tính với nồng độchất cỏ trong mẫu thi diện tích peak thu được trên sắc ky đồ là tương ứng với nồng độ

trong mẫu.

Các thành phân là được mô tả bởi thời gian lưu của nó tạ, được xác định khoảng thờigian từ khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện tín hiệu cực đại trên sắc ký đô

Trong mọi trường hợp thì thời gian lưu độc lập với lượng tiêm vào Thời gian ma pha động

di qua cột (không có sự tương tác với cộU) gọi là tụ „ gọi là thời gian chết.

Quá trình tách được xem như là hoàn tất khi số peak xuất hiện trên đường nên là ứng

với số thành phần các cấu tử trong mẫu Trong phân tích định lượng, chúng ta chi quantâm tách các thành phan cân thiết để xác định thành phan của chúng

27

Trang 29

Hinh 2.5 Mô ta thời gian lưu của peak Hình 2.6 Trạng thái của peak theo

chuẩn Gaussianian với p=20 và o=1

Hình 2.7 Peak chuẩn theo Gausisan

Xác định một thành phần nào đó mà chỉ dya vào thời gian lưu là không chắc chắn Tốt

nhất là phải thực hiện song song theo hai phương pháp là sắc ký và phương pháp khối phd

hay phô hồng ngoại dé xác định Những cặp phương pháp này gọi là phương pháp nối kết,

nó cho chúng ta có được những thông tin từ những nguồn khác nhau, độc lập với nhau Cúnhư vậy thì kết luận của chúng ta mới chính xác

Phương pháp sắc ký HPLC có thể xác định các thành phần tồn tại trong các hợp chất

mà nồng độ của chúng rat nhỏ ở vài nanogam hay nhỏ hơn

*Những yêu cầu kĩ thuật của một pha động trong HPLC

28

Trang 30

¢ Có khá năng hòa tan với mẫu can phần tích.

e Tinh khiết và không độc.

*Có 2 loại:

e Trộn dung môi với áp suất thường rồi bơm áp suất cao trước khi vao cột

e Chương trình dung môi hóa có thé thực hiện theo 2 cách:

kết ion (Trong thương mại, một số thiết bị chương trình hóa dung môi có

thể thực hiện được cả hai kỹ thuật trên.)

2.4 Tiêu chuẩn của sắc ký đồ và peak Gaussianian

Những điểm đặc trưng của sắc ký đồ lý tưởng là những hệ số liên quan tới sai số ngẫu

nhiên trong phương trình Gaussianian:

y= , sexp-(x- u} /20°]

ov2x

Trong đó:

jt: là thời gian lưu của peak các cấu tử

ø: là độ lệch chuẩn của peak.

o° : là bình phương độ lệch chuẩn.

Y : tiêu biểu cho tín hiệu nhận được từ detector tại điểm cuối của cột.

x: lả khoảng cách từ chiều cao của peak đến hai cánh bên của peak

Trong kỹ thuật sắc ký thường người ta xác định y theo công thức:

y= oof 2]

29

Trang 31

KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIẾU PHƯƠNG

Giá trị này đạt cực đại là 0.399 khi đó x = 0 Giá trị này cũng có hai điểm uốn tại x =+1 lúc đó đạt giá trị y = 0.242 đạt 60.6% so vơi giá trị cực đại Độ rộng của peak tại điểm

uốn là 2ø (ø =1) Trong sắc ký hiện dai, wy biểu thị cho độ rộng của peak tại vị trí chiều

cao peak đạt 1⁄2 (W)2 = 2.35 ø) Chiều rộng của peak tại đường nên được đo bằng 13.5%

chiều cao peak Tại điểm này thi theo phương trình Gaussianian W được xác định w = 4

2.5 Nguyên tắc của quá trình HPLC trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc

ký Nếu pha tĩnh là chất hap phụ thì ta có sắc ky hap phụ (pha thuận) Pha tĩnh là các chat

đã được liên kết với một nhóm chức khác ta có sắc ký pha liên kết (pha thuận, pha đảo,

trao đối ion) Nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký ray phân tử Cùng với phatinh, dé rửa giải các chat phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động

Như vậy, nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phản tích A, B, C vào cộttách, kết quả là các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết

định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác.

Chất phân tích

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được tạo thành bởi 3 lực thành phản: F), F;, F; Trong đó, F¿ F; là quyết định, còn F; là yếu tổ anh hưởng

30

Trang 32

không lớn Ở đây, F, là lực giữ chất phân tích trên cột, F; là lực kéo nó đi ra khỏi cột Như

vậy các chất khác nhau sẽ di chuyên trong cột với tốc độ khác nhau và tách hin nhau khi

ra khỏi cội.

[Vu = tu

2.6.2 Thể tích của pha tinh

Đây là thé tích được thiết kế va nó không có mặt trên sắc ky đồ, được ký hiệu là Vs Đại lượng này có thể xác định bằng cách lấy tổng thé tích bên trong của cột trừ đi thé tích

của pha động trong cột.

2.6.3 Thể tích phân giải Vp

Thẻ tích phân giải Vg của mỗi một cau tử trong mẫu phân tích biểu thị cho thé tích pha

động cần thiết để đi chuyển chúng xuyên qua cột Trên sắc ký đề thể tích phân giải phụ

thuộc vào thời gian lưu tạ của các cấu tử trong Nếu tốc độ dòng là hằng sé thi:

31

Trang 33

———È—_——ê

Dụng cụ tiêm và detector cùng tổn tại một thể tích chết và lượng này ảnh hưởng đến tổng thé tích phân giải Trong đó mẫu có thé bị nén, nên giá trị dòng đo được ở cuối cột cẩn phải được làm chính xác bởi hệ số nén Hệ số này muốn tính phải so với áp xuất ở đầu

cột.

2.6.4 Thời gian lưu tg (Retention time)

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần thiết để chất đó di chuyển từ nơi tiêm mẫu

qua cột sắc ký, tới detector và cho peak trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện

đỉnh của peak).

tụ = tụ.(1 + k’)

(tụ là thời gian chết, tức là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển của các phan tử dung môi k’ là hệ số dung lượng)

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu

sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện đã chọn Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng dé

phát hiện định tính các chất Thời gian lieu phụ thuộc các yếu tố: bản chất sắc ký của pha tinh; bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; cấu tạo và bản chất phân tử của

chất tan Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động

Trong một phép phân tích nếu t„ nhỏ quá thì sự tách kém, còn tạ quá lớn (ty > 20 phút)

thi peak bị dan và độ lập lại kém, thời gian phân tích dài Dé thay đổi thời gian lưu ta tìm

một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu tô phụ thuộc trên đây

2.6.5 Hệ số phân bố

Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và trong pha động tại thời điểm cân bằng:

K=C/C;

Khi nồng độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số, chỉ phụ thuộc vào bản chất

các pha, chất tan và nhiệt độ Đối với một chat, K càng lớn thì chất đó phân bố nhiều vào

pha tĩnh nên sẽ di chuyển chậm và ngược lại

2.6.6 Hệ số dung lượng k’ (Capacity factor)

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bế của chất đó trong hai pha và

được tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan m, trong pha tĩnh (hoặc

32

Trang 34

thể tích pha tĩnh V,) và lượng chat tan my trong pha động (hoặc thẻ tích pha động V„ ) ởtrong thời điểm cân bằng.

k=m, (mụ„ = KE, (W„

Nếu k’ nhỏ thi tạ cũng nhỏ và sự tách kém, k` lớn thi peak bj dan, độ nhạy kém.

Trong thực tế k’ từ | - 8 là tối ưu

Khi pha động đi chuyển có định hướng đọc theo cột vẻ phía cuối cột nó đem theo

khối lượng chất cẳn phân tích Trong quá trình đó chất cần phân tích sẽ phân bố giữa hai

pha tinh và động Hệ số dung lượng được tính thông qua thé tích phân bố Vạ và thé tích

Suy ra: tạ = ty( 1+ k`)

Vậy: k'=fa=tu „Ea

tụ tụ

2.6.7 Độ chọn lọc a (Selectivity - factor)

Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thong sắc ký, khi hai chất A, B có k'x và

k’, khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị 6 độ chọn lọc a:

Trang 35

Hình 2.9 Xác định độ chọn lọc œ

Các tác động qua lại giữa chất phân tích vả pha tĩnh có thể bao gồm tô hợp các tác

động qua lại của các nhóm phân cực đặc biệt vả không phân cực, chẳng hạn tác động qua

lại của các lưỡng cực và liên kết hydro Các thuật ngữ phân cực và không phân cực thường

được sử dung dé diễn tả độ chọn lọc của pha tĩnh Tuy nhiên sử dụng đông nghĩa độ phan

cực và độ chọn lọc là không đúng Độ phân cực chỉ đơn thuần là một khía cạnh của độ

chọn lọc gây ra tác động qua lại giữa pha tĩnh với các nửa phân cực của chất phân tích Độ

chọn lọc được diễn tả kết quả của các ảnh hưởng phức tạp qua lại lẫn nhau do các tác động

giữa chất phân tích và pha tĩnh

2.6.8 Số đĩa lý thuyết N (Theoreical plates) hay hiệu quả tách N

Hiệu quả tách là thước đo độ rộng của các nút chất phân tích khi nó chuyến dịch doc

theo chiều dai cột Hiệu quả cột được định nghĩa là bình phương tỷ số giữa thời gian lưu

tuyệt đối và độ lệch chuẩn của peak sắc ký

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu quả của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định, Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ky như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H tat nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và

trong pha động

34

Trang 36

Hình 2.10 Xác định độ lệch chuẩn ø của peak từ độ rộng của peak

Giá trị N có thé tính bằng 3 công thức sau:

Với w, là độ rộng của đáy peak tính theo đơn vị thời gian

wy là độ rộng tại một nửa chiều cao của peak tinh theo đơn vị thời gian

Chiều cao của một đĩa lý thuyết H được tính : Hf = —

Chiều cao H phụ thuộc nhiều yếu tố:

+ Đường kính va độ hap thụ của hạt pha tinh;

+ Tốc độ và độ nhớt của pha động:

+ Hệ số khuếch tán của các chất trong cột

Vi vậy, với một số điều kiện sắc ký xác định thi chiều cao H cũng hãng định đối với

một số chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.Trong thực tế N nằm

trong khoảng 2500- 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000.

35

Trang 37

2,6.9 Độ phân giải R (Resolution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện

sắc ký đã cho Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính theo một trong các công

thức:

Trong đó : — ta; va ta; là thời gian lưu của hai cấu tử j va i

Wy là độ rộng của đáy peak tính theo đơn vị thời gian

Trang 38

Hình 2.11 Sự phụ thuộc hệ số R vào chiêu đài của cột (phụ thuộc vào N - cột càng

dài thì số đĩa lý thuyết càng lớn).

Trong thực tế các peak cân đối (Gaussian) thì độ phân giải để 2 peak tách tối thiêu

là R = 1.0 Trong phép định lượng R = 1.5 là phù hợp.

+ Nếu R nhỏ thi các peak chưa tách han, việc tính điện tích peak sẽ không chính xác lúc

này phải làm tăng diện tích peak theo 3 cách sau đây:

- Làm thay đổi k’ bằng cách thay đối lực rứa giải của pha động (thay đổi độ phân cực

nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE - HPLC, )

- Lam tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dải hơn hoặc cột có kích

thước nhỏ hơn

- Lam tăng độ chọn lọc a bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trinh tách.

hoặc thay đôi thành phần pha động

+Nếu R lớn thì quá trình phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém, lúc nay

phải tim cách giảm R bằng cách: ứng dụng quá trình rửa giải Gradient dé cho chất thứ hai

ra nhanh hon, nêu thiết bị không có khả năng nay thì phải thay đổi thành phan hoặc tỷ lệ

pha động.

37

Trang 39

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP NGUYÊN HIỂU PHƯƠNG

Peak dạng đối xứng hình Gaussian trên thực tế khó đạt được, vì vậy phải quan tâm

đến hệ số không đối xứng f, khi f nằm trong khoảng 0.8 — 2.0 thì phép định lượng được

chấp nhận, nếu f >2.0 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy cần thay đổi các

điều kiện sắc ký để làm cho peak cân xứng hơn theo các cách sau:

giảm thé tích tiêm

2.6.11 Phương trình Van Deemter

Khi chúng ta đề cập đến những ảnh hưởng của các thông số đến quá trình tách.

chúng ta chưa đề cập đến tốc độ pha động trong cột Thực ra tốc độ của pha động có ảnh

hưởng đến quá trình phân tách các cấu tử trong mẫu trong quá trình sắc ký.

38

Trang 40

KHOA LUAN TOT NGHIỆP NGUYEN HIEU PHƯƠNG

m——-—_—_—_œầ=ềẰẽ —-—=——msnmmmm=mmmmmmm———————

Trong một điều kiện sắc ký đã được xác định, sự dân peak phụ thuộc vào nhiều quá

dong pha đông, tốc độ hữu hạn của sự thiết lập cân bằng phân bé chất tan vào hai pha (sự

chuyển khối) sự khuếch tán chất tan trong pha tĩnh, sự không đồng nhất của các dòng

chảy

Phương trình Van Deemter mô tả ánh hưởng của tốc độ dòng pha động và các thông

số động học khác đến hiệu lực của cột (đến chiều cao của đĩa lý thuyết H) :

Hinh 2.13 Mé ta phwong trinh Van Deemter Trong đó:

- _ A: mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy do các dòng chảy không đều của pha

động qua pha tĩnh làm cho tốc độ di chuyển của các chất tan cũng không đồng đều

dẫn đến sự dain peak A cảng lớn khi các hạt chất nhồi cảng lớn hoặc các hạt nay

không được nhỏi đồng đều.

- B/u: mô ta ảnh hưởng của sự khuếch tán doc (ngược vả xuôi) của các phân tử chat

tan theo phương dòng chảy của pha động (u là tốc độ dòng) làm cho chúng di

chuyển không đồng đều gây ra su dan peak B nhỏ khi hệ số khuếch tán của chat tan

trong pha động nhỏ, ngoài ra B còn phụ thuộc vào kích thước hạt và kỹ thuật nhoi

của cột giống như A,

39

Tiêu đề	Định Lượng Paracetamol Trong Thuốc Bằng Phương Pháp Trắc Quang Và Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao
Tác giả	Nguyễn Hiểu Phương
Người hướng dẫn	Thầy Lê Ngọc Tử
Trường học	Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Hóa Học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2009
Thành phố	Thành Phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	93
Dung lượng	23,64 MB