Nhóm 3 chiều thứ 4 báo cáo th sắc ký

Quá trình này giúp loại bỏ tạp chất, chỉ giữ lại các thành phần cần thiết, đồng thời tậndụng tối đa nguồn nguyên liệu bằng cách sử dụng dung môi phù hợp để hòa tan các hợpchất mong muốn.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC THỰC HÀNH KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC THỰC HÀNH KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS.TRỊNH THỊ PHI LY PHẠM NGUYỄN BẢO NHI – 21126445

HEN RÍCH - 21126488

VÕ LINH THƯ - 21126525NGUYỄN VĂN TOÀN - 21126539

THÍ NGHIỆM 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ

Bảng 1.1 Khối lượng cân để xác định hàm lượng chất chiết thô 6

Bảng 3.1 Quãng đường di chuyển của dung môi và các sắc tố 16

Bảng 3.2 Hệ số Rf của các sắc tố trong 2 pha động 16

Bảng 4.1 Nồng độ và diện tích chất protocatechuid acid 18

Bảng 4.2 Nồng độ và diện tích chất chlorogenic acid 18

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.2 Mẫu được cho vào erlen và bổ sung dung môi 10

Hình 2.3 Đặt bình mẫu vào bể siêu âm trong 10 phút 10

Hình 2.4 Thêm hỗn hợp silica gel vào pipet pasteur 11

Hình 2.6 Kết quả phân tách sắc tố bằng sắc ký cột 12

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI

1.1.Tổng quan

1.1.1 Mục đích ly trích chất chiết thô

Ly trích chất chiết thô từ nguyên liệu bằng các dung môi nhằm tách chiết các hợpchất hoạt tính sinh học như alkaloid, flavonoid, tanin, phenolic và các chất khác có giátrị Quá trình này giúp loại bỏ tạp chất, chỉ giữ lại các thành phần cần thiết, đồng thời tậndụng tối đa nguồn nguyên liệu bằng cách sử dụng dung môi phù hợp để hòa tan các hợpchất mong muốn Dịch chiết thô sau ly trích là cơ sở để thực hiện các bước tinh chế hoặcphân lập tiếp theo, phục vụ nghiên cứu hoặc sản xuất trong các lĩnh vực như dược phẩm,

mỹ phẩm, thực phẩm chức năng và nhiều ngành công nghiệp khác Việc lựa chọn dungmôi phù hợp dựa trên tính chất phân cực hay không phân cực của hợp chất, giúp tối ưuhiệu suất chiết xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng

Ly trích chất chiết thô bằng phương pháp sóng siêu âm là một kỹ thuật hiện đạinhằm tách chiết các hợp chất hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thô Sóng siêu âm tạo rahiệu ứng cơ học và nhiệt học thông qua hiện tượng xâm thực, giúp phá vỡ màng tế bào vàtăng cường sự tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu, từ đó nâng cao hiệu suất chiết xuất.Phương pháp này không chỉ giúp rút ngắn thời gian ly trích mà còn giảm lượng dung môi

sử dụng, đồng thời giữ được cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất nhạy cảm với nhiệt.Quá trình này thường được áp dụng trong các lĩnh vực như sản xuất dược phẩm, mỹphẩm, thực phẩm chức năng, nhờ khả năng chiết xuất hiệu quả các hợp chất nhưpolyphenol, flavonoid, hoặc alkaloid từ thực vật và các nguồn nguyên liệu khác

Ly trích lá bạch đàn bằng acetone và ethyl acetate mang lại nhiều ý nghĩa và giá trịkinh tế nhờ khả năng chiết xuất hiệu quả các hợp chất hoạt tính sinh học có giá trị caonhư flavonoid, tannin, terpenoid và phenolic Các hợp chất này có đặc tính kháng khuẩn,kháng viêm, chống oxy hóa và được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất dược phẩm, mỹphẩm và thực phẩm chức năng Lá bạch đàn là nguyên liệu tự nhiên dễ thu hoạch và cónguồn cung dồi dào, việc tận dụng để chiết xuất giúp tăng giá trị gia tăng và tối ưu hóa tàinguyên Sản phẩm từ dịch chiết có thể được sử dụng để phát triển thuốc, mỹ phẩm chămsóc da, tinh dầu hoặc chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm, mang lại lợi ích kinh tế

lớn Phương pháp này không chỉ đảm bảo hiệu quả chiết xuất mà còn mở rộng tiềm năngứng dụng của lá bạch đàn trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau.

Cây bạch đàn được biết đến với khả năng thích nghi tốt ở nhiều loại đất khácnhau, từ vùng khô cằn đến ngập nước Hiện nay, cây bạch đàn đã được du nhập và trồngrộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, bao gồm Đông Nam Á,Nam Mỹ và châu Phi

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Thân cây: Cao từ 10 – 25 m (một số loài có thể đạt 70 m), vỏ cây dễ bong tróc

Lá cây: Lá có hình mác hoặc lưỡi liềm, chứa nhiều tinh dầu thơm đặc trưng.Hoa: Nhỏ, mọc thành cụm, màu trắng hoặc vàng nhạt

Quả: Quả nang nhỏ, hình chén, chứa nhiều hạt nhỏ

1.1.2.2 Ứng dụng

Nhờ đặc tính sinh trưởng nhanh và giá trị kinh tế cao, cây được trồng tại nhiềuquốc gia trên thế giới Gỗ bạch đàn được sử dụng làm nguyên liệu xây dựng, sản xuấtgiấy và đồ nội thất Ngoài ra, lá bạch đàn chứa tinh dầu (đặc biệt là eucalyptol), đượcdùng trong y học, công nghiệp mỹ phẩm và sản xuất thuốc sát trùng

1.2 Vật liệu và phương pháp

1.2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ ngày 6 tháng 11 dến ngày 20 tháng 11 năm 2024

Hình 1.1 Bạch đàn.

Địa điểm: phòng 306 tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,Trường Đại học Nông Lâm Hồ Chí Minh.

1.2.2 Vật liệu và hóa chất

Nguyên liệu: Bột lá bạch đàn

Hình 1.2 Bột lá bạch đàn.

Hóa chất: Acetone, Ethyl acetate

Thiết bị: Cân điện tử; Bể siêu âm (J.P.SELECTA, s.a) công suất tiêu thụ điệnnăng của bể 465W, tần số 50/60 Hz; Tủ sấy (Memmert)

Dụng cụ: Bình tam giác, giấy lọc, pipet Pasteur, cốc thủy tinh, chén thủy tinh, bútviết tên mẫu,

Hình 1.3 Nguyên liệu sau khi được

thêm dung môi

Bước 2: Đem mẫu đi siêu âm trong 15 phút ( tần số 50/60 Hz và công suất 465W),sau 15 phút lọc dịch chiết qua giấy lọc.

Hình 1.4 Siêu âm dịch chiết lần 1 Hình 1.5 Lọc dịch chiết qua giấy lọc.

Bước 3: Thêm tiếp 15 mL dung môi vào bã và siêu âm (15 phút), lọc dịch chiếtqua giấy lọc lần 2

Bước 4: Lọc hết bã trong bình qua giấy lọc, sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy

Hình 1.6 Bã được bọc trong giấy lọc và đem đi sấy.

Bước 5: Sau khi sấy xong¸cân lại để biết khối lượng bã còn lại

1.3.2 Xác định độ ẩm của bột lá bạch đàn.

Bước 1: Lấy chén thủy tinh đã được sấy khô (105 oC) và làm nguội trong bình hút

ẩm, cân khối lượng chén

Bước 2: Cân 2 – 5 g bột lá bạch đàn trong chén thủy tinh Đem sấy chén và mẫu ởnhiệt độ 105 oC đến khi khối lượng không đổi.

Hình 1.7 Mẫu chuẩn bị đem đi sấy.

Bước 3: Để nguội trong bình hút ẩm và cân tổng khối lượng chén và mẫu

1.4 Kết quả và thảo luận

1.4.1 Kết quả

1.4.1.1 Ly trích chất chiết thô trong bột lá bạch đàn bằng dung môi acetone và ethyl acetate

Bảng 1.1 Khối lượng cân để xác định hàm lượng chất chiết thô

Hàm lượng chất chiết thô khi dùng dung môi acetone:

m1: Khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g)

Dung môi Khối lượng bột khô

ban đầu (g)

Khối lượng giấy lọc

(g)

Khối lượng bã vàgiấy sau khi sấy (g)

m2: Khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g).

1.4.1.2 Xác định độ ẩm của bột lá bạch đàn

Bảng 1.2 Khối lượng cân xác định độ ẩm

Khối lượng lần 1 (g) Khối lượng lần 2 (g)

Trong đó:

m0 là khối lượng của mẫu thử trước khi sấy (g)

m1 là khối lượng của chén và nắp trước khi sấy (g)

m2 là tổng khối lượng chén, nắp và mẫu sau khi sấy (g)

1.4.2 Thảo luận

1.4.2.1 Ly trích chất chiết thô trong bột lá bạch đàn bằng dung môi acetone và ethyl acetate

Khi so sánh kết quả chiết thô từ lá bạch đàn bằng dung môi acetone (18,1968 %)

và ethyl acetate (16,9622 %), có thể thấy một số khác biệt rõ rệt Acetone có hiệu suấtchiết xuất cao hơn (18,1968 %), giúp thu được lượng chất chiết thô lớn hơn và có khảnăng hòa tan nhiều hợp chất hữu cơ như terpenoid và flavonoid, đặc biệt là cineole, mộtthành phần chính trong lá bạch đàn Tuy nhiên, acetone cũng dễ bay hơi và có thể hòa tan

cả các hợp chất không mong muốn, đòi hỏi cần kiểm soát tốt quá trình chiết xuất để tránhtạp chất Ngược lại, ethyl acetate có hiệu suất thấp hơn (16,9622 %), nhưng nó ít hòa tancác hợp chất không mong muốn, giúp chất chiết thu được có độ tinh khiết cao hơn Chấtchiết từ ethyl acetate phù hợp hơn cho các ứng dụng yêu cầu độ tinh khiết, nhưng vớilượng chất chiết ít hơn

Cả hai dung môi đều có tính an toàn cao và dễ bay hơi, nhưng acetone có thể gâymất mát hợp chất nếu không được xử lý cẩn thận Vì vậy, lựa chọn dung môi phụ thuộcvào mục đích sử dụng: acetone phù hợp nếu cần thu được lượng lớn chất chiết, trong khiethyl acetate phù hợp hơn khi ưu tiên chất lượng và độ tinh khiết của chất chiết

1.4.2.2 Xác định độ ẩm của bột lá bạch đàn

Kết quả xác định độ ẩm của bột lá bạch đàn với hai giá trị 8,7217 % và 8,5643 %cho thấy sự chênh lệch nhỏ giữa các lần đo, điều này có thể xuất phát từ sai số trong quátrình thử nghiệm, điều kiện môi trường, hoặc sự không đồng đều trong mẫu Tuy nhiên,

sự khác biệt này không đáng kể và nằm trong phạm vi chấp nhận được Độ ẩm này tươngđối thấp, cho thấy mẫu bột lá đã được xử lý để giảm lượng nước, giúp bảo quản tốt hơn

và ngăn ngừa sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn

Mặc dù độ ẩm thấp giúp bảo quản lâu dài, nhưng độ ẩm quá thấp, các hợp chấthoạt tính có thể bị phá hủy Do đó, việc kiểm soát độ ẩm trong quá trình chiết xuất và bảo

quản là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm Kết quả này cho thấy bột lá bạchđàn có độ ổn định và khả năng bảo quản tốt.

THÍ NGHIỆM 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT

2.1 Tổng quan tài liệu

2.1.1 Kỹ thuật sắc ký cột

Phân tích sắc tố thực vật giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học của cây, từ đó cóthể đánh giá giá trị dinh dưỡng, ứng dụng trong y học, và khả năng chống chịu với điềukiện môi trường Việc phân tích này cũng có thể cung cấp thông tin về sự biến đổi sắc tốtrong các điều kiện khác nhau, chẳng hạn như ánh sáng, nhiệt độ, và độ ẩm

Sắc ký cột là một kỹ thuật phân tích được sử dụng trong hóa học và sinh học đểtách, xác định và phân tích các thành phần trong một hỗn hợp Trong trường hợp phântích sắc tố thực vật, kỹ thuật này thường được sử dụng để tách các sắc tố khác nhau nhưchlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid, flavonoid

Kỹ thuật sắc ký cột dựa trên sự phân tách các chất trong một hỗn hợp dựa vào sựtương tác khác nhau của các chất khác nhau với pha tĩnh và độ hòa tan trong pha động.Khi hỗn hợp được nạp lên cột, các thành phần khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khácnhau, dẫn đến sự phân tách các chất trong mẫu

Hình 2.1 Hoa ngũ sắc.

icterogenin, β-sitosterol Ở Ấn Độ, các bộ phận khác nhau của cây ngũ sắc có chứa hỗnhợp phenolic, flavonoid, alkaloid, triterpene, saponin, terpenoid

2.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây ngũ sắc là một dạng cây bụi thân nhỏ Chiều cao trung bình của cây khoảng 1

- 2 m hoặc có khi cao hơn Thân cây hình vuông, bề mặt có phủ nhiều lông nháp, kèmtheo đó còn có cả gai mọc quặp xuống dưới Toàn thân cây phát ra một mùi hăng đặcbiệt

Cây phát triển nhiều cảnh vươn dài Lá màu xanh, mọc đói, thường có hình tráixoăn hoặc hình trái tim Đầu lá nhọn, tròn ở dưới gốc, mép lá hình răng cưa đều nhau

Hoa ngũ sắc mọc thành cụm ở đầu cành hoặc đâm ra từ các kẽ lá Cùng một chùmhoa nhưng lại có nhiều màu sắc khác nhau như cam, vàng, hồng cánh sen, đỏ, trắng hoặchồng phấn Quả ra vào tháng 4 đến tháng 9 Nó có dạng quả bạch hình cầu Quả chín sẽ

có màu đen Bên trong chứa 1 hoặc 2 hạt có vỏ cứng, bên ngoài hình dáng xù xì

2.1.2.2 Phân bố

Cây ngũ sắc là loài bản địa của Trung Mỹ Cây mọc hoang nhiều ở các khu đấttrống, sườn đồi núi hay mọc ven theo các bờ biển Loại cây này có khả năng phát tán rấtmạnh nhờ chim mang hạt giống đi rải khắp nơi Ở Nouvelle Calédonie, Cây sinh sôinhiều đến nỗi chính phủ nước này phải ra lệnh tiêu diệt hết loài cây này vì nó ảnh hưởngnghiêm trọng đến môi trường sinh thái tự nhiên

Hiện nay, ở Việt Nam cây ngũ sắc cũng được trồng rộng rãi, chủ yếu là để làmcảnh vì cây có hoa đẹp, màu sắc sặc sỡ Loại cây này có mặt rộng rãi ở khắp các tỉnhthành trên cả nước nên có thể tìm thấy rất dễ dàng

2.1.2.3 Thành phần hóa học

Lá: Trong lá tươi của cây mới phát triển chứa 0,2 % tinh dầu Ở thời kỳ có hoa, lá

có thêm các chất lantaden và lantanin chiếm 0,31 - 0,68 %

Hoa khô: Chứa tinh dầu (0,07 %), terpen bicyclic (8 %), Laphelandren ( 10 12%)

-Vỏ cây: Lantanin ( một dạng alcaloid) 0,08 %

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ ngày 13 tháng 11 dến ngày 20 tháng 11 năm 2024

Địa điểm: phòng 306 tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,Trường Đại học Nông Lâm Hồ Chí Minh.

2.2.2 Vật liệu và hóa chất

Vật liệu: lá ngũ sắc khô xay nhuyễn

Hóa chất: n - hexan, acetone, sillica gel 60 (kích thước 0,015 - 0,040 mm).Dụng cụ: bông thủy tinh, giấy lọc, bình erlen, pipet pasteur thủy tinh, bóp cao su,micropipette, becher

Thiết bị: cân điện tử, bể siêu âm gia nhiệt

Bước 2: Đặt bình mẫu vào bể siêu âm để chiết bằng siêu âm trong 10 phút, sau đó

sử dụng giấy lọc chiết mẫu

Bước 3 Sử dụng pipet pasteur làm cột sắc ký, lấy một ít bông thủy tinh nhét vàođáy pipet, không nén quá chặt vì sẽ khiến sắc tố khó chảy xuống nhưng cũng không nénquá lỏng vì sẽ khiến sillica gel rơi khỏi cột

Bước 4: Cân 0,5 g sillica gel vào cốc thủy tinh, thêm vào 5 mL n - hexan và lắcnhẹ để sillica gel thấm đều dung môi

Bước 5: Nạp hỗn hợp vào pipet pasteur, dùng n - hexan tráng thành cột để toàn bộsillica gel dính trên thành rơi xuống

Bước 6: Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1 mm, dùng micropipette hút 1 mLdịch chiết sắc tố cho vào cột dọc theo thành một cách từ từ, không bơm thẳng xuống.Tiếp tục thêm n - hexan vào cột, tránh để cột khô

Bước 7: Nhóm carotenoid màu vàng không phân cực được rửa giải trước, thuvào ống nghiệm Nhóm chlorophyll màu xanh phân cực mạnh còn giữ lại trong cột đượcrửa giải sau dung môi phân cực hơn là n - hexan : acetone (7 : 3) vào ống nghiệm khác.

2.4 Thảo luận

Sự phân tách của các sắc tố dựa trên sự khác biệt về độ phân cực của chúng Sắc tốcarotenoid ít phân cực hơn chlorophyll, do đó chúng sẽ ít tương tác với pha tĩnh là silicagel có tính phân cực cao và bị rửa giải ra khỏi cột trước Ngược lại, chlorophyll sẽ tươngtác mạnh hơn với pha tĩnh và bị giữ lại trên cột lâu hơn

Trong thí nghiệm này, pha tĩnh sử dụng là sillica gel 60 có kích thước 0,015 0,040 mm (60 để chỉ ra rằng gel này có diện tích bề mặt khoảng 60 m2/g) và pha động là n

hexan Để cải tiến hiệu quả thí nghiệm, có thể thử thay đổi dần thành phần của dung môirửa giải từ n - hexan sang dung môi phân cực hơn (ví dụ: ethyl acetate), thay sillica gel 60sang silica gel có kích thước hạt nhỏ hơn (ví dụ: sillica gel 40) để tăng diện tích bề mặttiếp xúc hoặc sử dụng các loại pha tĩnh khác như alumina

Hình 2.6 Kết quả phân tách sắc tố

bằng sắc ký cột

Hình 2.5 Thêm hỗn

hợp sắc tố vào cột

THÍ NGHIỆM 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT TLC

3.1 Tổng quan

3.1.1 Kỹ thuật TLC

Pha động được sử dụng thí nghiệm là hệ dung môi aceton và hexan theo 2 tỉ lệkhác nhau để so sánh tỉ lệ nào tốt nhất để phân tách sắc tố thực vật Hexan là pha độngkhông phân cực dùng để rửa giải các chất không phân cực, còn acetone là pha động phâncực để rửa giải các chất phân cực hơn, sử dụng hệ dung môi này sẽ tạo ra một gradientphân cực tăng dần giúp phân tách các sắc tố có độ phân cực khác nhau một cách hiệu quả.Trong quá trình sử dụng cần phải chú ý an toàn vì 2 dung môi này rất dễ bay hơi và dễcháy, có hại khi hít phải hoặc tiếp xúc với da, gây buồn ngủ, chóng mặt Acetone gâykích ứng mắt Hexan nếu tiếp xúc trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến sức khoẻ, vì nó làchất độc đối với thần kinh và làm giảm khả năng sinh sản

Trong sắc ký bản mỏng khi đưa vào pha động thì quá trình rửa giải trên bản mỏngdiễn ra rất nhanh Hợp chất ít phân cực nhất sẽ di chuyển trên bản mỏng nhanh nhất, do

đó nó đạt giá trị Rf cao nhất Hợp chất phân cực nhất sẽ di chuyển chậm nhất và có giá trị

Rf thấp nhất Trong sắc ký bản mỏng để phân tách sắc tố thực vật, thì các sắc tố phân táchhiển thị trên bản mỏng (sắc ký đồ) theo thứ tự từ chậm nhất đến nhanh nhất là,xanthophyll (màu vàng), chlorophyll b (xanh lục), chlorophyll a (xanh lam-lục),pheophytin (xám) và β-carotene (vàng/cam)

Hệ số Rf được tính sau khi đo quãng đường đi của dung môi và sắc tố, ta sẽ sosánh với chất chuẩn được dùng kỹ thuật sắc ký cùng 1 loại pha động để nhận biết đó làchất gì Giúp so sánh độ phân cực của các sắc tố khác nhau, đánh giá tính hiệu quả vàtheo dõi quá trình sắc ký Hệ số Rf phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pha động, pha tĩnh,môi trường vì vậy chỉ có thể so sánh hệ số Rf trên cùng 1 điều kiện Rf và để có kết quảchuẩn xác nhất cần thực hiện song song với mẫu chuẩn

3.1.2 Các sắc tố thực vật

Các sắc tố chính là diệp lục, carotenoid; carotenoid gồm 2 lớp là caroten vàxanthophyll, trong đó caroten có 2 hợp chất chính là α-caroten và β-caroten cònxanthophyll gồm có 5 loại là lutein, neoxanthin, violaxanthin, antheraxanthin vàzeaxanthin Các sắc tố hấp thụ năng lượng từ ánh sáng quang phổ khả kiến, mỗi loại sắc