Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tối ưu hóa quy trình PCR (Polymerase Chain Reaction) phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh đen xơ trên mít

Hồ ChíMinh, xin cam đoan khóa luận “Tối ưu hóa quy trình PCR Polymerase Chain Reactionphát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh đen xơ trên mit” đây là khóa luận tốtnghiệp do bản thâ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO ©

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

—

TOI UU HÓA QUY TRÌNH PCR (Polymerase Chain Reaction)

PHAT HIEN VI KHUAN Pantoea stewartii

GAY BỆNH DEN XO TREN MÍT

Ngành học: CÔNG NGHE SINH HỌCSinh viên thực hiện: HONG MỸ XUYEN

Mã số sinh viên: 19126239Niên khóa: 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 04/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

TOI UU HÓA QUY TRÌNH PCR (Polymerase Chain Reaction)

PHAT HIEN VI KHUAN Pantoea stewartii

GAY BỆNH DEN XO TREN MÍT

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiệnPGS.TS NGUYÊN BẢO QUỐC HONG MỸ XUYEN

TP Thu Đức, 04/2024

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Khoa Học Sinh học cùng quý Thầy Cô đã giảngdạy và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập Những kiến thức mà chúng em nhậnđược sẽ là hành trang giúp chúng em vững bước trong tương lai.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc, người Thầy đã tậntình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt thời gian em nghiên cứu khóa luận Vàcũng là người đưa ra những ý tưởng, kiểm tra sự phù hợp của khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị luôn hỗ trợ giúp đỡ em giảiquyết những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Cảm ơn các bạn trongphòng Bệnh học và Chuan đoán phân tử đã luôn bên cạnh cùng nhau cô gắng hỗ trợnhau trong thời gian thực hiện khóa luận vừa qua.

Cuối cùng em xin dành cho gia đình, bạn bè, người thân những lời cảm ơn trântrọng và yêu thương nhất Cảm ơn vì đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ, động viên và lànguồn cô vũ lớn lao là động lực giúp em hoàn thành khóa luận này

Mặc dù đã cố gắng hoàn thành khóa luận trong phạm vi và khả năng có thé Tuynhiên sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự cảm thông và tậntình chỉ bảo của quý Thầy Cô và toàn thể bạn bè

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Hồng Mỹ Xuyên, MSSV: 19126239, lớp: DH19SHD thuộc ngành Côngnghệ Sinh học của khoa Khoa học Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ ChíMinh, xin cam đoan khóa luận “Tối ưu hóa quy trình PCR (Polymerase Chain Reaction)phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh đen xơ trên mit” đây là khóa luận tốtnghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu làhoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

vê những cam ket nay.

TP Thủ Đức, ngày 10 tháng 04 năm 2024

Người viết cam kết

TÓM TẮT

Mit (Artocarpus heferophyllus) là cây ăn quả nhiệt đới thương mại quan trọngđược trồng ở Việt Nam Trong những năm gan đây, Pantoea stewartii một loài vi khuangram âm, không hình thành bao tử, hiểu khí tùy nghỉ, đã được báo cáo là tác nhân gâybệnh đen xơ trên mít, đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của mít

ở Việt Nam Trước đây, việc phát hiện và xác định bệnh xơ đen trên mít được thực hiện

bằng phương pháp PCR sử dung primer CPSLI/CPSR2c và primer ES16/EIG2c.Phương pháp PCR cũng được áp dụng trong nghiên cứu này nhằm phát hiện và địnhdanh Pantoea stewartii trên cây mít ở Việt Nam Dựa trên việc tra cứu, thu thập và chọnlọc vùng gen chuyên biệt cho vi khuẩn P stewartii, các primer cụ thé đã được thiết kế

và đánh giá trên in silico PCR amplification, sau đó kiểm tra 47 chủng vi khuân phân

lập được từ các mẫu mít bị bệnh bằng phản ứng PCR Kết quả chỉ ra rằng 38 trong số

47 chủng vi khuẩn phân lập cho sản pham PCR với kích thước 214 bp tương tự như sản

phẩm PCR ở đối chứng Việc giải trình tự 16S rRNA của một chủng dương tính chứngminh rang đó là vi khuẩn P stewartii thông qua phân tích cây phát sinh loài Các kết

quả thu được trong nghiên cứu này hứa hẹn sự phát triển của các phương pháp phát hiện

nhanh vi khuẩn P stewartii tại vườn

Từ khóa: PCR, bệnh đen xơ trên mít, Pantoea stewartii, phát hiện, vi khuẩn

Jackfruit (Artocarpus heterophyllus lam.) is an important tropical commercial fruit

crop grown in Vietnam In recent years, Pantoea stewartii, an aerobic forming and gram-negative bacteria, has been reported as a causal agent of jackfruit bronzing disease that seriously affecting in the jack fruit industry in Vietnam Previously, detection and identification of bronzing disease of jackfruit were performed

non-spore-by PCR approach using CPSL1/CPSR2c primers and ES16/ESIG2c primers The PCR method was also applied in this study in order to detect and identify Pantoea stewartii

in jackfruit crop in Vietnam Based on searching, collecting and selecting specific gene

regions for P stewartii bacteria, specific primers were designed and evaluated on in silico PCR amplification, then followed by checking with 47 bacterial isolates collected from diseased jackfruit samples using PCR reactions The result indicated that 38 of 47 bacterial isolates showed amplicon of 214 bp as similar to that in the control 16S rRNA sequencing of a positive strain demonstrated that it was P stewartii through phylogenetic tree analysis The results obtained in this study hold promise for the development of methods for rapid detection of P stewartii in gardens.

Keywords: PCR, jackfruit bronzing disease, Pantoea stewartii, dectection, bacteria

MỤC LỤC

TrangLOI CẢM ƠN 2-2222 22221221221221221211211221211211211221211111121111112122111212 ve iXÁC NHÂN VA AM DOA IN sisescissssessasscanssscacansasupsanenannsannsianeannatacanamnaassarasiasaacoaaans iiTOM TAT oi = iii

ABSTRACT -52-2222212212221221121122121121127112112112112112112112121121121121121222 re iv

MUG DUG ccsecsrstusecutaemssssaigiassssenessesexuseasaianyaaapramaeamassaaadaaeaaesdeasaans SAGĐ33003388218g13838388x61 S304 VDANH SÁCH CHỮ VIET TẮTT -2-©22+22+2E2EE£EE£EEE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEerrrrrxee viiiDANH SÁCH BẢNG 2-55 S221 21221221221111111111111111111111111111 22c rreg ix(eee 915.1: et x

ee ce 10" |

Lá TÍNH Hết caenngneeeseeioeosioeatoribiosyeiterienoinsili08enei42ociiiEogfHGï453470xã050.k20402800020:250050-405085- 11-1 Em Tiền đố Tế s«cseeeccecdoaoiighiehhEccyisairtehiog0idi2.20160531.0505160510.5161-gkoc4Si14G308000)4g 5000461106 |1.3 NO1 dung thre W161 oe eee = ÔÖÖÖ.Ö 1IHƯƯNG #, TÔNG ATARI TẤT TE encinresrnnsercdcainnrinec nna 22.1 Tổng quan về bệnh đen xơ mít 2 essesseesseesesssessessssseesessieesesseesieeeteesees 22.1.1 Giới thiệu về bệnh đen xơ mÍt -2- 2 2+2S+SE£SE£EE£EE£EE£EEEEEEEEEEEEEE2E 22222 cre, 22.1.2 Tình hình bệnh đen xơ trên mít trong nước và ngoài nước - 4 2-¬5 ; Tint HỆNH bì ri Hồn tiến mÍL oi TIC ccceseesseernsrredtseooissarnpaensseretsi 4

2.1.2.2 Tình hình bệnh đen xơ trên mít ngoài nước -+++-++++sc+sc+scse+ >

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn Pantoed stewartii ccccccccccescsssessesessssesessesessssesessesesseeveeeseeees 52.2.1 Tổng quan, phân loại và đặc điểm hình thái -2- 22 2222z22z22+22xzzzzzzzzex 52.2.2 Phân bồ và đặc tính sinh hóa 2-2 2+2SE£EE2E£EEEEE2EEEEEEEEE712121E71 11212 re 695.9 Ege đIỂM: (GI O99 snnrenhanhh HE HH0 01830018340110008091G05430970/1%500)110020004/581401910601038/3 92.0 72.3 Nghiên cứu về loài P s/@w@rrfii -+ ¿-©2+22222+22222E322E22E122322212212211221 2212222 fi

2 Sedo IN SOLE CUU TONE HH ts scssneeneansanrornzimesmesneansees rex amnenasenennnenmcmmnanaeincaavennmmaRe 7 2.3.2 Nghiên COU hgöài THƯỚC s‹csecsszeebssrkdiinsisi66011030148455355355618316X8585001138800104343044810/66 8CHƯƠNG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP o.0 c.csscesseesesseessesseeseeseestesseeseesneenees 10

3.1 Thời gian va địa điểm thực hin o.oo cccecc ees eeseeseesseeseessessesseeseestesseseneesees 10

3.2 Vật liệu và thiết Bi ccccccccccccceecessececsecsesecsececssesecevesescecsucseseesessesecseseeesveseeeeeeeeees 103.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2-2 s+2s+21+2E£2E22E22E22122122121121212121221221221 2 xe, 103.2.2 Thiết bị và dung cụ nghiên cứu 2-2 522E+2E22E22E2E212121221221222222222222e2 10

3.2.3 Môi trường nuôi cấy và hóa chất 2-2-2 +s£SE+EE£EESEEEEEEEE717121 212122 re, 10

EENwi)i1589i1)80n)61iiì1 0 Ẻ.5 11

3.3.1 Đánh giá primer bằng công cụ tin sinh học -2¿2¿©2z+22++2z+z2z+zzz+zzszez 11

3.3.2 Thu mẫu và phân lập mẫu chứa tac nhân gây bệnh 2+ 2 s2 essences 12 13/2.1 Thu2nữu vũ xử TF TB enero cnnenronsensnsonsemnasenverensenncorsennsensconnnanenmenenesapeananyarences 12

3.3.2.2 Phân lập tác nhân gây bệnh - - 2+ ++++*£+*£+vvtrvrrerrerrrrrrrrrrrrrrerrke 13 3.3.2.3 Quan sát hình thái và phản ứng sinh hóa đặc trưng của P stewariii 133.3.2.4 Ly trích DNA vi khuẩn 2- 2-5225 2E22E22E212323212112112112112112121 2122 143.3.2.5 Kiểm tra chất lượng DNA -©2-2222222122122121121121121211211212121 21 xe 143.3.3 Tối ưu hóa quy trình PCR phát hiện vi khuẩn P s/ewarii - - 153.3.3.1 Khao sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR -22 225522222522 163.3.3.2 Khao sát nồng độ primer cho phản ứng PCR -2- 2 2225z22zz22z222z£2 163.3.3.3 Kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của primer - 2-2 s+2z2zz+s+zzzzzzzzzzez T73.3.4 Định danh vi khuẩn Pantoed sf€WAfFfÏi 5s- + 5<+s+E‡E+E£ESEE+EEEE2EEEEEEEEEErErrrees 183.3.5 So sánh cặp primer PstF - PstR với cặp primer tham khảo và thực hiện phản ứng PCR phát hiện P stewartii ở các giai đoạn khác nhau của mÍt eee 18 3.3.5.1 So sánh cặp primer PstF - PstR với cặp primer tham khảo - 18 3.3.5.2 Thực hiện phản ứng PCR phát hiện P stewartii ở các giai đoạn khác nhau của

Tt = 18CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -.-2 2©22 72 222E22222 22222222 2e re 20

ST 7 a 2204.1.1 Đánh giá primer chuyên biệt cho vi khuân Pantoea sfewarrtii -. - 204.1.1.1 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer trên công cụ in Silico 204.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Pantoed sf@Waffii -2:-22-©22©22252222222zz2s+zsscs2 224.1.2.1 Kết qua thu mẫu và phân lập 2-2 ©2++22++EE++EE++EE+2EE+2EE+zzxrersrees 234.1.2.2 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh h6a ccccccccccceecceecseeeessessesseesseesesseeseeseeens 234.1.2.3 Kết quả phan ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 244.1.3 Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR -2-©22+222+22++2E+2EE+2EEEzrErzrxrerrrer 25

4.1.3.1 Khảo sát các yếu tố nhằm tối ưu hóa phản ứng PCR phát hiện P stewartii 25

4.1.3.1.1 Kết quả khảo sát yêu tố nhiệt độ bắt cặp tối ưu của phản ứng PCR 254.1.3.1.2 Kết quả khảo sát nồng độ primer cho phản ứng PCR -2- 254.1.3.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy primer - - 2-22 s2z22sz2zz25+2 274.1.4 Kết quả định danh vi khuẩn Pantoea stewartii -©2+©s5s+2s++s+£s+zszzzzcsez 284.1.4.1 Kết quả phản ứng PCR với 47 chủng vi khuẩn đã phân lập - 28

4.1.4.2 Kết quả giải trình tự sản phẩm 16S rRNA của mẫu TG13 5- 294.1.5 Kết quả so sánh với cặp primer trên báo và thực hiện PCR với mẫu trực tiếp 304.1.5.1 Kết quả so sánh với cặp primer tham khảo -25csz5csc5cs5cs 80

4.1.5.2 Kết quả thực hiện phan ứng PCR phát hiện P sfewartii ở giai đoạn sớm của mit 31

NDE, TWN TVs ce crm ote navn gece indi ia ab bla oes isn nds psing dp nd pase wo Rad noe daCHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHI o.oo ceccccccccccccssssecsecseseceecsesecsvcsesseereseeneaneseeeees 34

OT TÌÌ EneseanasieetgsereatuiprtaokriegioypnndtntgirngtrtpntkillnAvie®oSuEciHN00x60898/0x600100020090i06050 34

5.2 Đề nghị 2-5-5 ST 23221271112212211111111111111111112111211121 2111 errreg 34TAT LIỆU THAM KHẢD 225-220 2202220.2211220.221.220722124212702e1exeee 35

DANH SACH CHU VIET TAT

: Polymerase Chain Reaction : Loop Mediated Isothermal Amplification : Tên primer

: Tên primer : Tên primer : Tên primer : Pantoea stewartii: Đồng Bằng Sông Cửu Long: King B Agar

DANH SÁCH BANG

TrangBảng 3.1 Thành phan phản ứng PCR khuếch dai vùng trình tự 16S rRNA 15Bang 3.2 Thông tin cặp primer ES16 - ESIG2c (Coplin va ctv, 2002) 18Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P stewartii từ mẫu mit có triệu chứng bệnh đen

XU TINH [ns25165-xt25555326122800-304055G5328198ã1806Di8i353:0fiL20281302Si6/2013⁄4i8133189EBEiSLtj;Ef-BE1EiGaE2SSCt2GiU2ĐE1Euuf9230838.200182GSu20 22Bang 4.2 Thanh phan phản ứng PCR phát hiện P stewartii -2 - 26

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Triệu chứng mít nhiễm bệnh đen xơ 2- 2 2 252522S522£z2zz+zzz5+2 3

Hình 2.2 Con đường vi khuẩn theo nước mưa xâm nhập vào bên trong mít 4

Hình 2.3 Hình thái tế bào của vi khuẩn P s/@Warrifii 2-©2-522222sc2cczszzxczsce 6 Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn P sfewartii trên môi trường KBA 7

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu -2 22 222222222z++2+z2z+zzzzex 11 Hình 3.2 Giao diện công cụ tin sinh hỌc + - 55 2-+++**++s+vsrrerreerrrrrrrrrrrrrrree 12 Hình 3.3 Mẫu mít có triệu chứng nhiễm bệnh đen xơ trên mít 2-52: 12 Hình 3.4 Chu trình nhiệt phan ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 15

Hình 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu 16

Hình 3.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn P stewartii 17

Hình 3.7 Mẫu bông mit và trái non trước và sau tăng sinh trong KB broth 19

Hình 4.1 Kết quả BLAST đoạn trình tự DNA dùng dé thiết kế primer 20

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu primer PstF - PstR trên in silico 21

Hình 4.3 Kết qua kiểm tra chéo cặp PstF - PstR trên in silico với chi Pseudomonas 21 Hình 4.4 Kết quả kiểm tra chéo cặp PstF - PstR trên in silico với chi Erwinia 21

Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường KBA 23

Hình 4.6 Kết quả nhuộm gram và kiểm tra một số đặc tính sinh hóa cơ bản 23

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16S rRNA của 47 mẫu - 24

Hình 4.8 Kết quả khảo sát yếu tố nhiệt độ bắt cặp tối ưu của primer PstF - PstR 25

Hình 4.9 Kết quả khảo sát nồng độ primer đối với primer PstF - PstR 26

Hình 4.10 Chu trình nhiệt PCR phát hiện P stewartii 2-5525 52<++++sc+sx+s 26 Hình 4.11 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer PstF - PstR 27

Hình 4.12 Kết quả kiểm tra độ nhạy của cặp primer PstF - PstR - 28

Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16S rRNA của 47 mẫu 29

Hình 4.14 Kết quả BLAST đoạn trình tự của mẫu TG13 trên CSDL của NCBI 30

Hình 4.15 Kết qua Cây phát sinh loài của mẫu TG13 (Pst - 1489R - TG13) 30

Hình 4.16 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer PstF - PstR 31

Hình 4.17 Kết quả phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn P stewartii ở giai đoạn sớm vớiCap Primer PSth = PSURs cmranesseronninittittiotgtG0SSE/0SSG2ISB010331.0NIGTGIDĐHSGIGSGSRSSIIGGGUGLGESUNHG2100301G0G1G03 32

phải một chứng bệnh làm cho các nhà vườn phải đau đầu đó là bệnh đen xơ mít làm cho

mít bị giảm độ ngọt, mắt thâm quan, ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cũng nhưnăng suất cây trồng Vi khuẩn Pantoea stewartii là một loài vi khuân gram âm, hình que

là tác nhân chính gây ra bệnh đen xơ trên mít (Gapasin va ctv, 2014; Zulperi, 2017).Tình hình diễn biến bệnh khó phát hiện, nhìn bề ngoài quả mít hầu như không có triệuchứng bệnh (Abidin và ctv,2020), vì vậy cần phải có một phương pháp cụ thé dé xácđịnh nhanh, chính xác bệnh trong giai đoạn sớm nhằm giảm thiểu những thiệt hại, rũi rocho nhà vườn và tránh anh hưởng đến nền kinh tế nước nhà

Xuất phát từ những thực tiên trên mà đề tài “Tối ưu hóa quy trình PCR (PolymeraseChain Reaction) phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen trên mit” đã đượcthực hiện.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá primer chuyên biệt cho vi khuẩn P stewartii

Nội dung 2: Thu mẫu và phân lập vi khuan P stewartii gây bệnh den xơ trên mít

Nội dung 3: Tối ưu hóa quy trình PCR nhằm phát hiện và định danh vi khuẩn P.stewartii gây bệnh xơ đen trên mít

Nội dung 4: Định danh vi khuân P stewartii gây bệnh đen xơ trên mít

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về bệnh den xơ mit

2.1.1 Giới thiệu về bệnh đen xơ mít

Cây mít có tên khoa học là Artocarpus heterophyllus lam., thuộc họ Dâu tam(Moraceae), chi Mit hay Chay (Artocarpus) có nguồn gốc phát sinh từ An Độ vaBangladesh là một cây ăn trái quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đặt biệt làvùng Nam và Đông Nam Á, đối với những nước canh tác câ lương thực và cây ăn quảmít nguồn cung cấp lương thực chính và sản phẩm thiết yếu đóng góp cho cuộc sốngngười nghèo Hiện nay cây mít được trồng phô biến ở các vùng nhiệt đới như: Án Độ,Bangladesh, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam, Camphuchia, Nepal, Srilanca,Indonesia, ngoài ra cây mít còn được tìm thấy ở Châu Phi, một số nước ở Trung Mỹ và

Nam Mỹ (Phạm Hùng Cương và Nguyễn Thị Ngọc Huệ, 2019) Theo chia sẻ TS Trương

Hồng Sơn mít có rất nhiều tác dụng cho sức khỏe như hỗ trợ làm đẹp, trong mít có chứa

nhiều vitamin C giúp tăng cường hệ miễn dịch, tốt cho hệ tiêu hóa, huyết áp, tim mạch,

xương và ngăn ngừa thiếu máu vì trong mít có chứa nhiều sắt kiểm soát việc lưu thôngmáu heo lương y Trần Gia Đạt việc bổ sung mít giúp phòng ngừa ung thư đo giàu nhiềuchất dinh dưỡng thực vật như ignans, isoflavones và saponis (Vũ Cường, 2023) Ngoàiđem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe mít còn có giá trị kinh tẾ cao

Tuy nhiên việc trồng mít cũng không dễ dàng các nhà vườn phải kiểm soát dịchbệnh, phải có kinh nghiệm và kỹ thuật canh tác tốt, đặt biệt vào mùa mưa sâu và dịchbệnh thường lan nhanh Hiện nay bệnh đen xơ trên mít đã gây ảnh hưởng đến chất lượng

và năng suất làm cho nhà vườn phải đau đầu Bệnh này được phát hiện lần đầu tiên ở

Philippines vào năm 2014 và lan sang Malaysia và Mexico vào năm 2017 (Ibrahim và

ctv, 2022).

Theo Võ Thị Ngọc Hà (2023) thông qua phỏng vấn trực tiếp nông dân tại tỉnh TiềnGiang cho thấy bệnh đen xơ trên mít thái gây hại với tỉ lệ bệnh trung bình xuất hiện vàomùa khô từ 5,29% đến 10,19% và vào mùa mưa tỉ lệ này lên đến 25,43% đến 33,05%

từ đây có thê thấy bệnh đen xơ trên mít thái xuất hiện nhiều vào mùa mưa hơn mùa khô

và đù trong giai đoạn phát triển nào của mít đều có thê bị bệnh đen xơ, từ thời kỳ đậutrái đến khi thu hoạch Thường thì không thé phân biệt là mít có nhiễm bệnh hay không

N

nếu như chỉ nhìn bên ngoài vì bệnh đen xo mít hau như không biéu hiện bên ngoài, nhàvườn chỉ vựa vào kinh nghiệm, cảm quan mà phân biệt, sau khi tìm hiểu từ các nhà vườntại Tiền Giang và Đồng Nai đề giảm bớt tình trạng xơ đen sẽ loại bỏ lứa mít đầu tiên vàcác lứa mít sau, dựa vào sự quan sát vào thời kỳ trái mít non nếu mít có hiện tượng gaikhông đều, đổi màu, trái bị méo mó sẽ loại bỏ vì nếu dé phát triển sẽ tốn nhiều chất dinhdưỡng nuôi mà còn không bán được giá Vào thời kỳ trái non có thê không phân biệtđược vì dù bên ngoài hay bên trong đều không có triệu chứng rõ ràng nhưng vào thời

kỳ trưởng thành thì biểu hiện bên trong lại rất rõ ràng nếu nhẹ chi có vài dém nâu vàng,đen nhỏ làm đổi màu một số chỗ ở phần xơ mít nhưng khi trái bị nặng sẽ lan tới phanmúi mít bên trong.

Những công bố gần đây, xác định bên trong trái mít có triệu chứng đốm nâu vàng,đen trên xơ hay múi mit là do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra Vào năm 2014 mộtnhóm nghiên cứu ở Philippines (Gapasin và ctv, 2014) đã phát hiện một loại vi khuẩn

Pantoea stewartii là tác nhân chính gây ra bệnh đen xơ trên mít và ba năm sau đó bệnh

này được báo cáo ở Malaysia và tác nhân gây bệnh được xác định có đặc điểm hình thái,

sinh hóa tương tự với miêu tả của nhóm nghiên cứu ở Philippines và việc thực hiện phản

ứng PCR khuếch đại vùng trình tự đặc hiệu cho loài cũng phát hiện vi khuẩn Pantoeastewartii là tác nhan chính gây bệnh đen xơ trên mít ở Malaysia (Zulperi và ctv, 2017).

Vi khuan P sfewartii có thé xâm nhập theo nước mưa vào bên trong trái mít thôngqua quá trình thụ phan xâm nhập qua vòi nhị đi vào bên trong trái hoặc qua khe hở giữacác múi lúc trái còn non hay các vết thương trên trái mít, hay ngay trên phần cuống nước

có thể thẩm thấu vào bên trong (Lê Văn Bé và ctv, 2017)

2.1.2 Tình hình bệnh đen xơ trên mít trong nước và ngoài nước

2.1.2.1 Tình hình bệnh đen xơ trên mít trong nước

Ở Việt Nam việc trồng mít đang ngày càng phát triển Theo số liệu của Tổng cụcThống kê, trong năm 2020 diện tích mít cả nước tăng thêm 16,881 ha nâng tổng diệntích cả nước lên 58,511 ha Riêng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã chiếm đến 30, 045 ha,tỉnh Tiền Giang có diện tích trồng mít lớn nhất cả nước với 13,141 ha, kế đến là HậuGiang với 6,966 ha và Đồng Tháp với 2,692 ha Trong những năm gan đây việc xuấtkhâu mít thái của nước ta sang Trung Quốc đã tăng trưởng cao: trong năm 2015 chi đạt

3 triệu USD nhưng vào năm 2020 đã lên tới 163 triệu USD và thậm chí năm 2017, kimngạch xuất khâu ngành mít thái của Việt Nam đã vượt qua Thái Lan (Lục Tùng, 2022)

Hiện nay thực trạng bệnh đen xơ trên mít rất phổ biến ở nước ta hầu hết các tỉnhtrồng mít ở nước ta đều phải như: Tiền Giang, Đồng Nai, Hậu Giang, Đồng Tháp, CầnThơ gây thiệt hại nặng nền đến năng suất, chất lượng và nền kinh kế nước nhà

Theo Lê Trí Nhân và ctv (2016), hiện tượng đen xơ trên mít xuất hiện chủ yếu vào

mùa mưa ở giai đoạn từ 30 - 90 ngày sau khi đậu trái, nghiên cứu này thực hiện trên 30

cây mít thái bốn năm tuôi tại phường Phú Thứ, quận Cái Răng, tỉnh Cần Thơ mẫu đượcthu thập vào hai mùa là mùa mưa (6 - 12/2014) và mùa nang (1 -7/2015), dé khảo sát

các đặc điểm nông học, phẩm chất trái và quan sát thời điểm xuất hiện hiện tượng đen

xơ trên mít, tiến hành đánh dau mam hoa từ khi nhú đến khi chấm dứt quá trình tungphan, đậu trái dé quan sát đặc điểm ra hoa và phát triển trái Trái được thu 10 ngay/ lầnthu liên tục 11 lần, mỗi lần 9 trái

2.1.2.2 Tình hình bệnh đen xơ trên mít ngoài nước

Những phát hiện đầu tiên về bệnh đen xơ trên mít được báo cáo tại Philippines

(Gapasin va ctv, 2014), Malaysia (Zulperi, 2017), Mexico (Hernadez - Morales va ctv,

2017) va Trung Quéc (Zhao, 2023)

Vào năm 2014 tại Philippines phát hiện một căn bệnh không được báo cáo ở mít

gây đổi màu từ hơi vàng đỏ đến đỏ, chấm nâu vàng trên xơ và không có triệu chứng bên

ngoài Khi bị nhiễm bệnh chất lượng trái cây bị tổn hại và vẫn chưa tim ra tác nhân chính

gây bệnh, từ thánh 4/2009 - tháng 3/2012 nhóm nghiên cứu tại Khoa quản lý dịch hạithuộc Đại học bang Visayas, Visca thành phố Baybay, đảo Leyte, tiến hành phân lập,

gây bệnh, đặc điểm và xác định nguyên nhân gây bệnh (Gapasin và ctv, 2014)

Tình hình trồng mít trong những năm 2016 tại Malaysia xuất hiện căn bệnh đen xơtrên mít có các triệu chứng đặc trưng như đổi màu từ vàng sang cam có đốm nâu trên xơ

mít (Gapasin và ctv, 2014) Vào tháng 4/2016 các mẫu mít có triệu chứng bệnh đen xơ

mít thu tại đồn điền Muadzam Shah thuộc bang Pahang nghiên cứu phân lập, thực hiệnphản ứng PCR với primer ES16 - ESIG2c (Coplin va ctv, 2002) nhằm phát hiện tác nhângây bệnh (Zulperi, 2017) Cũng cùng năm 2016 tại Mexico cụ thê ở khu vực Nayarit đãphát hiện căn bệnh có triệu chứng bệnh đen xơ mít giống với mô tả của Gapasin và ctvvào năm 2014.

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn Pantoea stewartii

2.2.1 Tông quan, phân loại và đặc điểm hình thái

Năm 1989 chi Pantoea xuất hiện Ban đầu chi Pantoea gồm một số loài thuộcErwinia herbicola va Enterobacter agglomerans cụ thé gồm các loài: Pantoeaagglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea citrea, Pantoea dispersa, Pantoea punctata,Pantoea stewartii, Pantoea terrea Năm 2009 có bốn loài được thêm vào chi Pantoeagồm Pantoea vagans, Pantoea eucalypti, Pantoea deleyi va Pantoea anthophila đượcphát hiện sau khi phân lập từ lá va chồi bạch đàn có dấu hiệu bi bạc lá Trong nhữngnăm gan đây chi Pantoea có thêm ba loài mới trong đó Pantoea gaviniae và Pantoeacalida được phát hiện trong môi trường sản xuất và sản phẩm sữa bột đành cho trẻ sơsinh và Pantoea allii được thu hồi từ hành tây và hạt hành tây (Cooney và ctv, 2014)

Trong năm năm gan đây ba loài Pantoea stewartii, Pantoea ananatis, Pantoeaagglomerans trong chỉ Pantoea được ghi nhận gây bệnh thực vật trên toàn thé giới gây

thiệt hại giá trị kinh tế, tôn hại đến cây trồng Vi khuẩn P stewartii được biết đến rộng

rãi là tác nhân gây bệnh đốm lá trên cỏ Sudan và bệnh héo rũ bạc lá trên ngô bản địa ởBắc Mỹ (Azad và ctv, 2000; Choi và ctv, 2013), trường hợp bệnh thực vật đầu tiên từngđược báo cáo trong chi Pantoea là bệnh héo ngô Trong những năm gan đây P stewartii

còn được xác định là tác nhân chính gây bệnh đen xơ mít trên mít gây ảnh hưởng nghiêm

trọng đến chất lượng và năng suất cây trồng

Trước đây vi khuẩn P stewartii có tên khác là Erwinia stewartii (Dye, 1963) là tácnhân gây bệnh héo ở ngô (Roper, 2011) vào năm 1989 dựa trên cơ sở phân loại hóa học

va phân tử một số loài thuộc chi Erwinia trong đó có Erwinia stewartii được xếp vàophức hợp Erwinia herbicola - Enterobacter agglomerans từ đây chỉ Pantoea xuất hiện

(Gavini và ctv, 1989) và được phân vào họ Enterobacteriaceae (Roper, 2011) Gần đây

chi Pantoea đã được phân lại vào họ Erwiniaceae (Adeolu va ctv, 2016).

P stewartii thuộc chi Pantoea với tên khoa học là Pantoea stewartii (Mergaert và ctv, 1993)

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Proteobacteria

Lớp (Class): Grammaproteobacteria

Bộ (Order): Enterobacteriales

Ho (Family): Erwiniaceae

Git (Gesusy Panis Hình 2.3 Hình thái tế bào của vi khuẩn

Loai(Species): Pantoea stewartii P stewartii

P stewartii là vi khuan gram âm, ky khí tùy nghi, hình que, không có khả nang diđộng, không sinh bào tử, không roi, chất nhày, có sắc tố màu vàng và có kích thướckhoảng 0,4 - 0,8 x 0,9 - 2,2 um (CABI, 2020).

2.2.2 Phân bố va đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn Pantoa stewartii phân bô rộng khắp thé giới có nguồn gốc từ hoa kỳ sau

đó lan rộng ra Châu Phi, Châu Au, Châu A (EPPO, 2023) Vi khuẩn P stewartii đượcbiết đến nhiều là tác nhân chính gây bệnh bạc lá trên ngô Hiện nay, bọ chét ngô(Chaetocnema pulicaria) là vật trung gian lây bệnh trên ngô, vi khuẩn P stewartii truyềnbệnh qua vết thương của thực vật (Ibrahim và ctv, 2022) Gần đây, một nghiên cứu ởMexico cho thấy bọ chét thuộc chi ChrysSA có liên quan đến bệnh den xơ ở mít, người

ta phát hiện ra rằng vi khuẩn được phân lập từ bọ chét được xác nhận là vi khuẩn P.

stewartii gay bệnh cho mít (Hernádez — Morales va ctv, 2021).

Vi khuẩn P stewartii có các đặc tính sinh hóa như không sinh indol và acetone, cóphản ứng dương tính với catalase, phản ứng âm tính với thuốc thử oxidase, không thủy

phân esculin, không phân giải nitrate, không sản sinh acid từ L - rhamnose, celloniose,

maltose, lactose, gentiobiose, a - merthy - D - gluoside, arbutin, salicin, amygdalin, glycerol, D - arabitol, dulcitol, meso - inositol, D - gluconate va 2 - keto - D - gluconat,

âm tính với phản ứng malonate (Bergey va John, 1994; CABI, 2020) Vi khuẩn P

stewartii sản xuất các polysaccharide ngoại bao là độc lực có kha năng gây bệnh

(Bradbury, 1967; Pepper, 1967), một số chủng vi khuẩn P stewartii phát triển ở 49C,một số ở 37°C (CABI, 2020)

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Có thé dùng nhiều môi trường khác nhau dé nuôi cấy vi khuẩn P s/ewerii như:

NA (Nutrient Agar), KBA (King B Agar), PSA (Peptone Sucrose Agar) Theo Ibrahim

va ctv (2022) hình thái khuẩn lac P stewartii có màu kem hoặc vàng chanh đến vàngcam, từ phẳng đến lồi, tròn với đường kính từ 1 - 4 mm và có ria nhẫn trên môi trườngKing B Agar Vi khuẩn phát triển trên môi trường KBA ở nhiệt độ 28°C, trong 24 - 48giờ Các khuẩn lạc trên môi trường có chiết xuất cao nam men - dextrose - canxicacbonat sẽ có màu vàng và lồi còn trên môi trường thạch dinh dưỡng có glucose sẽ cómàu vàng kem đến vàng cam (CABI, 2020)

2.3 Nghiên cứu về loài P stewartii

2.3.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2013, Dương Thị Thùy Tiên thông qua việc phân lập trên môi trường thạch

King B, sau đó ly trích DNA vi khuẩn Pantoea stewartii và tiễn hành thực hiện phản

ứng PCR với cặp primer ES16 - ESIIG2C (Colpin và ctv, 2002) Kết quả cho thấy trong

20 mẫu bắp tương đương với 20 lô bắp đều âm tính với vi khuẩn P sewarii, nghiêncứu nay cho thay việc giám định vi khuan P s/ewarfii gây bệnh héo rũ ngô rat ôn đỉnhvới cặp primer ES16 - ESHG2c.

Tháng 8/2020 - tháng 3/2021, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Thông tin vàỨng dụng KHCN (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Hậu Giang), thông qua việc thu mẫu

mít có dau hiệu bị bệnh đen xơ tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch King

B ủ trong 24 - 48 giờ ở 28°C và gửi mẫu giải tình tự vùng gen 16S rRNA và chỉ ra rằngtác nhân gây bệnh den xơ mít trên mit thái siêu sớm là vi khuẩn P s/ewarii (Ngô Văn

Thống, 2021)

Đầu năm 2022, Hoàng Đình Huy và ctv nghiên cứu khảo sát khả năng ức chế của

vi khuẩn Alcaligenes sp LH8 đối với vi khuẩn P stewartii tác nhân gây bệnh đen xơmít Thông qua kết quả của đường kính vòng kháng khuan vi khuẩn Alcaligenes sp LH8đối với vi khuẩn P stewartii thay rằng Alcaligenes sp LH8 gây ức chế vi khuẩn P.stewartii trên 16 mm Nghiên cứu này là bước tiến trong việc phát triển chế phẩm sinhhọc phòng ngừa bệnh xơ đen mít (Hà An, 2023).

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 2014, Gapasin va ctv trong nghiên cứu nay tác nhân gây bệnh den xơ mít được xác định dựa trên các đặc tính sinh hóa và hình thái thông qua nhuộm gram, phương

pháp được thực hiện trong nghiên cứu này là thu mẫu ở một số vườn mít tại đảo Leytethuộc Philippines và phân lập trên môi trường NA (Nutrient Agar), thực hiện các phảnứng sinh hóa và quan sát hình thái khi nhuộm gram, sau đó tiến hành thực hiện phảnứng PCR với hai cặp primer chuyên biệt cho vị khuẩn P stewartii là CPSL1 - CPSR2c

và ES16 - ESIG2c (Coplin và ctv, 2002) Nghiên cứu nay là bước tiến đầu tiên phát hiệntác nhân gây bệnh chính của bệnh den xơ mit là vi khuẩn P s/ewariii

Tháng 11 năm 2017, Hernández - Morales và ctv tiến hành phân lập một số mẫumit có dau hiệu den xo mít ở Mexico sau khi thực hiện phản ứng PCR với hai cặp primerCPSL1 - CPSR2c va HRP1d - HRP3c (Coplin và ctv, 2002) đã xác định được tác nhângay bệnh den xơ mit la do vi khuẩn Pantoea stewartii Day là một trong những nghiêncứu đầu tiên cho việc tìm ra tác nhân gây bệnh đen xơ mít ở Mexico

Năm 2020, Abidin và ctv đã thực hiện nghiên cứu về đa dạng di truyền CỦa VI

khuẩn P stewartii subspecies stewartii tác nhân gây bệnh xo đen trên mít dua vào kỹ

thuật MLST (Multilocus sequence typing) và dựa trên các gen gyrB, rpoB, atpD, infB.Nghiên cứu xác định đặc tính kiểu hình khuẩn lạc theo EPPO (2016) và xác định đặctính phân tử bằng phản ứng PCR với cặp primer ES16 - ESIG2c và đánh giá đạ đạng ditruyền của P s/ewartii subpsp stewartii, kết quả cho thay trong tong 28 mẫu ở Malaysiathì tat cả đều cho thấy sự tương đồng đến 99 - 100% với P stewartii Từ nghiên cứu nàyxác định được tác nhân gây bệnh xơ đen mít ở các khu vực lay mau tại Malaysia là vi

khuẩn P stewartii và thông qua việc đánh giá di truyền ở nghiên cứu nay cũng cho thay

không phát hiện biến thể di truyền giữa các chủng thu thập và có liên kết chặt chẽ với

P Stewartii.

Trong những năm gan đây, bệnh den xo trên mit ảnh hưởng rat lớn đến việc trồng

loài cây ăn trái này và trung bình có đến 80% cây trong vườn bị ảnh hưởng Bệnh cótriệu chứng gây đổi mau từ vàng sang đỏ, xuất hiện cham nâu trên xơ giống với mô tả

các nghiên cứu ở Philippines (Gapasin và ctv, 2014), Malaysia (Zulperi, 2017) và

Mexico (Hernádez - Morales và ctv, 2017) Các mẫu mít có triệu chứng đen xơ được

thu thập từ các đồn điền ở Trường Giang, Hà Nam, sau khi thu về tiến hành khử trùngmau, phân lập trên môi trường thạch chiết xuất cao nắm men - glucose, ủ qua đêm ở28°C, sau đó tiến hành phản ứng PCR với cặp primer ES16 - ESIG2c và CPSLI -CPSR2c (Coplin và ctv, 2002), mẫu sau đó được giải trình tự và cho ra kết quả tương tựđến 99,07% - 99,60% với loài P stewartii trên ngân hang gen Đây cũng là báo cáo đầu

tiên về bệnh đen xơ trên mít ở Trung Quốc thông qua nghiên cứu này giúp phòng ngừa

sự lây lan toàn câu của bệnh.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện: Tháng 7/2023 - 12/2023 tại phòng thí nghiệm bệnh học vàchuẩn đoán phân tử (RIBE 302 — 304) - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môitrường thuộc Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và thiết bị

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu mít có triệu chứng nhiễm bệnh đen xơ mít thu tại Cai Lậy - Tiền Giang

và Phú Thịnh - Đồng Nai được thu vào khoảng thời gian 06/2023 - 08/2023

Mau P stewartii (LA01, LĐ02) làm đối chứng dương được cung cấp khoa NôngHọc, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Các mẫu trái mít non và bông mít thu tại vườn Phú Thịnh - Đồng Nai vào khoảngtháng 11/2023.

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Các trang thiết bị: Máy PCR, máy ly tâm, tủ cấy vi sinh, tủ lạnh, tủ sấy, lò vi sóng,

nồi hấp vô trùng, cân điện tử, máy điện di, tủ chụp ảnh gel, máy voltex

Một số dụng cụ thí nghiệm: Micropipet, đầu tuýp, đĩa petri, ống nghiệm,eppendoft, cốc thủy tinh, bình thủy tinh, đèn cồn, que cấy trang, que cấy ria, lam kính

cối và chày xứ

3.2.3 Môi trường nuôi cấy và hóa chất

Môi trường nuôi cấy King B: Peptone 20 g/L, Glycerol 10 ml/L, KaHPO¿ 1,5 g/L,MgSO¿.7H›O 1,5 g/L, đối với môi trường rắn thêm 15 g/L Agar Hấp tiệt trùng ở 121°Ctrong 20 phút

Môi trường tang sinh Luria Bertani (LB): Peptone 10 g/l, Yeast Extract 5 g/l, NaCl

10 g/l Hap tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút

Hóa chat: PCI (Phenol: Chloroform: Isoamy ancohol với ti lệ 25:24:1), STE

(Sodium chloride/Tris/EDTA), TE buffer, Lysis buffer, chloroform, côn.

Định danh sinh học phân tử: GelRed, TBE buffer 0,5X (Tris - HCl/Borate/EDTA), agarose, ladder 1 kb, ladder 100 bp, TBE Buffer 5X, MyTaq DNA polymerase va các cap primer 63F - 1489R, PstF - PstR.

Tăng sinh, ly trích DNA từ các Đánh giá độ đặc hiệu primer bằng

chủng vi khuan đã phân lập công cụ tin sinh học

Kiểm tra chất lượng DNA đã ly Tối ưu quy trình PCR phát hiện P

trích từ các chủng vi khuân phân lập stewartii bằng cặp primer tự thiết kế

Primer là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình

tự nhất định theo nguyên tắc bổ sung Primer là điểm khởi đầu dé DNA polymerase cóthé thực hiện tổng hợp mạch bồ sung mới cũng như xác định đoạn DNA được khuếch

Sử dụng webside NCBI (National Center for Biotechnology Infotmation) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) tra cứu, thu thập và chon lọc vùng gen chuyên biệt cho

vi khuẩn P stewartii Cặp primer chuyên biệt cho vi khuẩn P stewartii được thiết kế

trên công cu primer 3Plus (https://www.primer3plus.com/index.html) trên vùng gen đặc hiệu đã được chọn lọc.

Cap primer chuyên biệt cho P stewartii sau khi đã thiết kế sẽ được kiểm tra trêncông cu in silico PCR amplification (https://insilico.ehu.es/PCR) và BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trên cơ sở dữ liệu của NCBI, dé đánh giá mức

độ bắt cặp cũng như độ đặc hiệu

In silico PCR amplification

NHÀ National Library of Medicine

Primer-BLAST A tool for finding specific primers Primer 1! s- { l cc

Primer 2! s- | ES E€

Finding primers specific to your PCR template (using Primer3 and BLAST).

Primers for target on one template Primers common for a group of sequences Migroorganism

PCR Template Retrieve recent results Publication Tips for finding specific primers CO Include plasmids (if available)

Allow [0 Ý Ì mismatches, but in/1_v] nucleotides in 3' end

Enter accession, gl, or FASTA sequence (A re‘seq record is prefered) @ Gs Range @ Coes)

from To Maximum length of bands

Forward primer 3000 nucleotides

>3'on minus strand) —_—_ W) Suggestions are welcome

Hình 3.2 Giao diện công cụ tin sinh hoc (a): giao điện BLAST của NCBI; (b): giao

điện in silico PCR amplification.

3.3.2 Thu mẫu và phân lập mẫu chứa tac nhân gây bệnh

3.3.2.1 Thu mẫu và xử lý mẫu

Thu thập các mẫu trái mít có triệu chứng của bệnh đen xơ Kết quả thu thập đượctổng 14 mẫu mít có triệu chứng bệnh tại các vườn trồng mít trong đó ở Cai Lậy - TiềnGiang (6 mẫu) và Phú Thịnh - Đồng Nai (8 mẫu) Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệmđược rửa lại với nước muối sinh lý và nước cất đề loại bỏ bụi ban và các sinh vật bênngoài Tiến hành phân lập trên môi trường King B agar

Hình 3.3 Mẫu mít có triệu chứng bệnh den xơ (a) Mẫu thu ở Tiền Giang; (b)

Mau thu ở Dong Nai.

3.3.2.2 Phan lập tác nhan gay bệnh

Mẫu được rửa lại với nước muối sinh lý và nước cất dé loại bỏ bụi ban và các sinhvật bên ngoài, sau đó tiến hành cắt nhỏ mẫu, dùng cối sứ và chày sứ nghiên nát, thêm 9

ml nước cất đã khử trùng vào cối Hút 1 ml phần dịch nghiền cho vào ống nghiệm, phaloãng thành dãy nồng độ từ 101 - 10° cấy trang trên đĩa petri có chứa môi trường chọnlọc KBA, ủ ở 28°C trong 36 - 48 giờ tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thai

vi khuẩn sau khi nhuộm gram, đồng thời kiểm tra đặc tính sinh hóa dé bắt khuẩn lạcnghi ngờ và tiến hành cấy ria nhiều lần đến khi có dòng thuần sau đó tăng sinh trên môitrường LB và bao quản ở -20°C với tỉ lệ (7 dich khuan tăng sinh: 3 glycerol 30%)

3.3.2.3 Quan sát hình thái và phản ứng sinh hóa đặc trưng của P stewartii

cất, phơi khô lam kính Quan sát hình thái vi khuân va gram bằng kính hiển vi với vật

kính 40X và 100X (đối với vật kính 100X phải có dầu soi kính)

Xem kết quả: quan sát hình thái vi khuân dưới kính hiển vi với vật kính 40X và100X (đối với vật kính 100X phải có dầu soi kính) Nếu vi khuẩn gram âm thì sẽ bắtmàu hồng, vi khuẩn gram dương thì bắt màu tím

Kiểm tra các phản ứng sinh hóa cơ bản:

và Oa gay hiện tượng sui bọt.

Kiểm tra sự phát huỳnh quang: Phương pháp này dé phân biết giữa vi khuẩn cóphát quang và vi khuẩn không phát quang trên tia UV trên môi trường KBA Khuân lạcPantoea sp Được cấy trên môi trường KBA không phát quang khi chiếu trên tia UV(Orio và ctv, 2012).

3.3.2.4 Ly trích DNA vi khuẩn

Tăng sinh các khuẩn lạc sau khi đã phân lập trên môi trường LB ở 28°C trong 24

-48h tiến hành ly trích thu DNA của vi khuẩn (Sambrook và Russell, 2001)

Bước 1: thu cặn khuẩn, hút Iml dich tăng sinh vi khuẩn vào tube 1,5ml ly tâm10.000 vòng/ phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nồi thu kết tủa (lặp lại 3 lần)

Bước 2: hút 400 pl dung dich STE buffer (Sodium chloride/Tris/EDTA) vào tube

va vortex dé rửa sinh khối khuẩn Sau đó dung dich được ly tâm 10,000 vong/ phút trong

3 phút, loại bỏ dich nổi (lặp lại 2 lần)

Bước 3: hút 400 ul lysis buffer vào phần kết tủa thu được, vortex hỗn hợp, ủ 65°C,trong | giờ.

Bước 4: hút thêm 300 pl PCI (phenol/chloroform/isoamy alcohol, 25:24:1), daođều va ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 10 phút

Bước 5: hút 300 ul dịch nỗi phía trên cho vào tube 1,5 ml sạch thêm 100 ul dungdich chloroform Ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 8 phút.

Bước 6: thu kết tủa DNA bang isopropanol: Hút 200 ul dịch nổi phía trên cho vào

tube 1,5 ml sạch mới Thêm 100 pl isopropanol, đảo đều, ủ lạnh -20°C trong 1 giờ, sau

đó ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 13 phút.

Bước 7: sau khi ly tâm và loại bỏ dịch nối, tủa DNA được rửa bằng ethanol 70°:Loại bỏ dich nồi, thêm 480 ul cồn 709, ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 10 phút (lặp lại

2 lần), Loại bỏ dich nổi và dé DNA khô tự nhiên

Bước 8: Tua DNA được hòa tan hoàn toan trong 50 pl TE buffer, Bao quản -20°C

3.3.2.5 Kiểm tra chất lượng DNA

Dé kiểm tra chất lượng sản pham DNA ly trích được từ dich tăng sinh vi khuẩn,đầu tiên do OD và điện di tổng số trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TBE 0,5X,DNA được nhuộm bằng GelRed và loading dye, điện di trong 25 phút với hiệu điện thế100V Quan sát kết quả với máy chụp UV Từ kết quả đo OD và điện di tổng số cho biếtnồng độ DNA và chất lượng DNA

Sau đó tiến hành pha loãng nồng độ DNA, thực hiện phản ứng PCR khuếch daivùng trình tự 16S rRNA với cặp primer 63F - 1489R thành phan phan ứng và chu trìnhnhiệt của phản ứng PCR được thé hiện trong Bang 3.1 và Hình 3.4 được phát triển từphòng thí nghiệm bệnh học và chan đoán phân tử (RIBE 302 — 304) — Viện Nghiên cứuCông nghệ Sinh học và Môi trường thuộc Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

Điện di sản phan PCR 16S rRNA được nhuộm với gelred va điện di trong gel

agarose 1% trong 25 phút với hiệu điện thé 100V Xem kết quả các mẫu có xuất hiện

band mục tiêu với kích thước khoảng 1500bp.

Bảng 3.1 Thành phan phan ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA

Thanh phan Nong độ géc Nông độ cudi Thể tích (ul)

30 giay

4°C

35 chu ki

œ

Hình 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA

3.3.3 Tối ưu hóa quy trình PCR phát hiện vi khuẩn P stewartii

Tối ưu hóa quy trình PCR nhằm phát hiện vi khuẩn P stewartii được thực hiệnbằng việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp và nồng độ primer Các phản ứng PCR được thựchiện với hóa chat là MyTaq DNA polymerase và cặp primer chuyên biệt cho vi khuan

P stewartii tự thiết kế (PstF - PstR) đã được đánh giá với sản phẩm PCR có kích thướcband mục tiêu khoảng 214 bp và thực hiện trên chủng chuẩn là vi khuẩn P stewartii