Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các loại mẫu vật của cây khôi nhung (ardisia silvestris pitard) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHỒI TỪ CÁC LOẠI MẪU VẬT CỦA CÂY KHÔI NHUNG Ardisia silvestris Pitard IN VI

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHỒI TỪ CÁC LOẠI

MẪU VẬT CỦA CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris

Pitard) IN VITRO

PHẠM TÀI DŨNG

Đà Nẵng, năm 2024

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHỒI TỪ CÁC LOẠI

MẪU VẬT CỦA CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris

Pitard) IN VITRO

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2020 - 2024

Sinh viên: Phạm Tài Dũng Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng, năm 2024

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực Đây là kết quả nghiên cứu của tôi và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu

vi phạm bất kỳ quy định nào về đạo đức khoa học

Xác nhận của người hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

Sinh viên thực hiện

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt ghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều

sự quan tâm và giúp đỡ từ cá nhân và tập thể trong suốt thời gian thực hiện Tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Võ Châu Tuấn – thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu, xây dựng thành công khóa luận Tôi xin cảm ơn các bạn lớp 20CNSH và các anh chị tại phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân đã lo lắng chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

TÓM TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống in vitro ở thực vật 3

1.1.1 Sự lựa chọn mẫu 3

1.1.2 Phương pháp vô trùng mẫu 3

1.1.3 Môi trường dinh dưỡng 3

1.1.3.1 Chất khoáng đa lượng và vi lượng 4

1.1.3.2 Carbon và nguồn năng lượng 4

1.1.3.3 Các vitamin 5

1.1.3.4 Chất kích thích sinh trưởng thực vật 5

1.1.3.5 Chất làm đông môi trường 6

1.2 Giới thiệu về cây khôi nhung 6

1.2.1 Phân loại 6

1.2.2 Đặc điểm hình thái 7

1.2.3 Vùng phân bố 7

1.2.4 Thành phần hóa học 8

1.2.5 Công dụng 8

1.3 Tình hình nghiên cứu cây khôi nhung 8

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới 8

1.3.2 Nghiên cứu trong nước 9

Chương 2 11

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 12

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.2.1 Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu thân của cây khôi nhung in vitro 12

2.3.2.2 Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu rễ của cây khôi nhung in vitro 12

2.3.2.3 Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu lá của cây khôi nhung in vitro 13

2.3.3 Xử lý thống kê 13

CHƯƠNG 3 14

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

3.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu đoạn thân cây khôi nhung in vitro 14

3.1.1 Ảnh hưởng của IBA 14

3.1.2 Ảnh hưởng của 2,4-D 15

3.1.3 Ảnh hưởng của BA 16

3.1.4 Ảnh hưởng của Kinetin 18

3.2 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu rễ cây khôi nhung in vitro 19

3.2.1 Ảnh hưởng của IBA 20

3.2.2 Ảnh hưởng của 2,4-D 21

3.2.3 Ảnh hưởng của BA 22

v

3.2.4 Ảnh hưởng của Kinetin 23

3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá cây khôi nhung in vitro 25

3.3.1 Ảnh hưởng của IBA 25

3.3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D 27

3.3.3 Ảnh hưởng của BA 29

3.3.4 Ảnh hưởng của Kinetin 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Cs: Cộng sự ĐHST: Điều hòa sinh trưởng 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA: Indol 3-butyric acid

BA: 6-benzyl adenine Kin: Kinetin N6-furfuryadenine MS: Murashige & Skoog (1962) mg: miligam

mg/L: miligam trên lít

%: phần trăm

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu đoạn

thân cây khôi nhung in vitro

14

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu

đoạn thân cây khôi nhung in vitro

16

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu đoạn

thân cây khôi nhung in vitro

17

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu

đoạn thân cây khôi nhung in vitro

18

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu rễ

cây khôi nhung in vitro

20

3.6 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu rễ

cây khôi nhung in vitro

21

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu rễ cây

khôi nhung in vitro

22

3.8 Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu rễ

cây khôi nhung in vitro

24

3.9 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá

cây khôi nhung in vitro

26

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá

cây khôi nhung in vitro

28

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá cây

khôi nhung in vitro

29

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá

cây khôi nhung in vitro

30

DANH MỤC HÌNH ẢNH

3.1 Mẫu đoạn thân cây khôi nhung in vitro tái sinh chồi trên môi trường

ix

TÓM TẮT

Khôi nhung hay khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) thuộc chi Ardisia, họ Đơn nem

(Myrsinaceae), có vùng phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền núi phí bắc và miền trung của Việt Nam Lá của cây khôi nhung được biết đến rộng rãi như một loại dược liệu có công dụng điều trị một số bệnh lý về tiêu hóa như viêm dạ dày tá tràng, ợ chua, nóng rát vùng thượng vị Hiện nay, nhu cầu khai thác cây khôi nhung để làm thuốc của con người ngày càng cao khiến loài cây này đang dần rơi vào tình trạng nguy cấp, nguy cơ tuyệt chủng và

đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996, 2007) Những nghiên cứu trong đề tài này được thực hiện nhằm cung cấp những dẫn liệu khoa học về nuôi cấy tái sinh chồi từ các

loại mẫu vật của cây khôi nhung in vitro, phục vụ cho công tác nhân nhanh cây khôi

nhung với hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt Vật liệu nghiên cứu được sử

dụng là 3 loại mẫu khác nhau của cây khôi nhung in vitro (đoạn thân, rễ, lá) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung riêng lẻ các auxin (IBA; 2,4-D) và cytokinin (BA;

Kinetin) ở các nồng độ khác nhau Kết quả cho thấy, môi trường MS + 0,5 mg/L BA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất ở mẫu đoạn thân với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 100% và

số chồi trung bình đạt 3,8 chồi/mẫu Môi trường MS + 1 mg/L BA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất ở mẫu rễ với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 50%, số chồi trung bình đạt 1,118 chồi/mẫu Môi trường MS + IBA (0,5; 0,75; 1 mg/L) cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 5%, số chồi trung bình đạt 0,2 chồi/mẫu

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Khôi nhung có tên khoa học là Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ

Myrsinaceae [8] Cây mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía bắc và một số tỉnh miền Trung như: Lào Cai (Sapa), Lạng Sơn (Hữu Lũng), Quảng Ninh, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Ba Vì), Ninh Bình (Cúc Phương), Hòa Bình, Thanh Hóa (Lang Chánh, Ngọc Lạc, Thạch Thành), Nghệ An (Quì Châu), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế (Phú Lộc), Quảng Nam – Đà Nẵng Ngoài ra, cây còn phân bố ở Trung Quốc (Hải Nam, Quảng Tây) [8] Lá của cây Khôi nhung được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác dụng trong việc điều trị

dạ dày tá tràng, làm giảm ợ chua, nóng rát vùng thượng vị, kích thích lên da non và làm làm lành dạ dày, tá tràng [10] Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lá cây khôi nhung còn

có tác dụng chống oxy hóa và chống tăng sinh tế bào in vitro, tác dụng kháng khuẩn và

gây độc tế bào ung thư [9]

Hiện nay, nhu cầu sử dụng cây khôi nhung làm thuốc ngày càng tăng, dẫn đến việc khai thác quá mức, làm cây trong tự nhiên suy giảm nhanh chóng Mặc dù cây khôi nhung phân bố rộng, nhưng số lượng cá thế ít do khả năng tái sinh từ hạt kém và cây trưởng thành bị khai thác làm dược liệu với số lượng lớn nên mất nguồn hạt để tái sinh Mặt khác, rừng tự nhiên ngày càng thu hẹp, làm mất các sinh cảnh sống thích hợp, cây khôi nhung đang bị rơi vào tình trạng nguy cấp, đe dọa tuyệt chủng và đã đưa vào Sách

Đỏ Việt Nam (1996, 2007) với cấp V, “sẽ nguy cấp” và được khuyến cáo “chỉ khai thác

có mức độ và giữ lại những cây con chưa đến tuổi thu hái Cấm khai thác loài này trong các vườn quốc gia, có thể tổ chức gây trồng để lấy nguyên liệu làm thuốc”

Đã nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây khôi nhung được thực hiện Tuy

nhiên nghiên cứu về khả năng tái sinh chồi từ các nguồn mẫu vật khác nhau của cây khôi

nhung in vitro vẫn chưa được ghi nhận

Nhằm tìm ra con đường nhân giống nhanh và hiệu quả, đáp ứng nhu cầu cây giống khôi nhung phục vụ sản xuất nguyên liệu dược trên quy mô lớn, chúng tôi thực hiện đề

tài “Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các loại mẫu vật của cây khôi nhung (Ardisia

silvestris Pitard) in vitro”

2

2 Mục tiêu đề tài

Xác định điều kiện môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi cây khôi nhung từ

nguồn nguyên liệu in vitro, góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây khôi

nhung với hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về nhân

giống in vitro cây khôi nhung, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nhân giống in vitro loài cây này

Là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong nghiên cứu và giảng dạy về nuôi cấy

mô tế bào thực vật sản xuất cây giống chất lượng cao, sạch bệnh

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp dữ liệu cơ sở trong công tác nhân nhanh

in vitro sản xuất cây giống khôi nhung, góp phần bảo tồn và phát triển bền vững nguồn

gen cây thuốc quý này ở nước ta

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống in vitro ở thực vật

1.1.2 Phương pháp vô trùng mẫu

Mẫu vật trước khi đưa vào nuôi cấy, được xử lý vô trùng bằng các loại hóa chất hoặc những tác động khác Hoạt tính của hormone nội sinh ở mẫu vật nuôi cấy, khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào, khả năng tái sinh,…của mẫu cấy

sẽ bị ảnh hưởng rõ rệt do các phương pháp xử lý vô trùng [17]

1.1.3 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường bao gồm các thành phần sau:

- Chất khoáng đa lượng (luôn được sử dụng)

- Chất khoáng vi lượng (gần như luôn được sử dụng nhưng đôi khi chỉ sử dụng nguyên tố sắt)

- Đường (gần như luôn luôn được thêm vào, nhưng bị loại bỏ đối với một số mục đích chuyên biệt)

- Chất kích thích sinh trưởng (gần như luôn được bổ sung)

- Vitamin (thường được bổ sung kết hợp)

- Chất làm đông đặc (agar hoặc gellan gum là những lựa chọn phổ biến nhất)

- Các acid amin và các chất bổ sung nitrogen khác (thường được lược bỏ) [16]

4

1.1.3.1 Chất khoáng đa lượng và vi lượng

Các mô và cơ quan thực vật được nuôi cấy in vitro trên môi trường nhân tạo, cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển Sự thành công của nuôi cấy mô thực vật như một phương tiện nhân giống cây trồng bị ảnh hưởng rất nhiều bởi bản chất của môi trường nuôi cấy được sử dụng Để cây phát triển khỏe mạnh và mạnh mẽ, cây còn nguyên vẹn cần phải hấp thụ từ đất:

- Nguyên tố đa lượng (được gọi là chất dinh dưỡng chính của thực vật): ion nitrogen (N), potassium (K), calcium (Ca), phosphorus (P), magnesium (Mg) và sulphur (S)

- Nguyên tố vi lượng: iron (Fe), nickel (Ni), chlorine (Cl), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu) và molybdenum (Mo)

Theo Epstein (1971), một nguyên tố có thể được coi là cần thiết cho sự phát triển của thực vật nếu:

- Thực vật không thể hoàn thành vòng đời của nó mà không có chất đó

- Chất đó có ảnh hưởng cụ thể đến thực vật và không thể thay thế hoàn toàn bởi bất kỳ yếu tố nào khác

- Chất đó ảnh hưởng trực tiếp tới thực vật, không gián tiếp qua môi trường

- Là thành phần của một phân tử thiết yếu trong thực vật

Các nguyên tố được liệt kê ở trên cùng với carbon (C), oxygen (O) và hydrogen (H) là 17 nguyên tố thiết yếu Một số chất khác như cobalt (Co), aluminium (Al), sodium (Na) và iodine (I) rất cần thiết hoặc có lợi cho một số loài nhưng tính cần thiết phổ biến của chúng vẫn chưa được thiết lập [16]

1.1.3.2 Carbon và nguồn năng lượng

Môi trường nuôi cấy mô thực vật không chỉ cung cấp các chất khoáng vô cơ mà còn cung cấp carbohydrate (phổ biến nhất là đường sucrose) để thay thế carbon mà cây thường cố định từ khí quyển nhờ quá trình quang hợp [16]

Sucrose được sử dụng với nồng độ thích hợp phổ biến là 2–3%, song tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) hoặc tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước) Glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi

cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơn Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ

ra kém hiệu quả và chỉ được dung trong những trường hợp đặc biệt [6]

1.1.3.3 Các vitamin

Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó phải bổ sung thêm vitamin vào môi trường, đặc biệt là vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 Các vitamin đặc biệt quan trọng như Myo-inositol đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào và được sử dụng với hàm lượng lớn từ 50-100 mg/L

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 -1000 lần dung dịch làm việc Dung dịch vitamin dễ hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy phải bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0oC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng [6]

1.1.3.4 Chất kích thích sinh trưởng thực vật

+ Auxin

Nhà thực vật học đầu tiên đề xuất sự tồn tại của hormone thực vật là Gottlieb Haberlandt (1854-1945), giáo sư Sinh lý Thực vật ở Berlin Auxin được xác định là indole-3-acetic acid (IAA) vào năm 1934 và giúp nuôi cấy mô thành công Hiện tại IAA

và một số chất tương tự của nó, ví dụ, auxin tổng hợp như 2,4- dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), naphthalene acetic acid (NAA) và indolebutyric acid (IBA), là không thể thiếu cho nuôi cấy mô [24]

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng [6]

Hầu hết các auxin không bị phá hủy bằng cách hấp ở 110–120°C trong 50–60 phút, đặc biệt nếu độ pH không có tính acid Tuy nhiên, hấp tiệt trùng ở pH thấp và có các yếu tố khác có thể phá hủy IAA Ánh sáng huỳnh quang trắng gây ra sự suy giảm cả

6

IAA và IBA trong cả môi trường lỏng và rắn Than có thể hấp thụ tới 97% IAA và IBA trong môi trường MS [18]

+ Cytokinin

Cytokinin được phát hiện trong những năm 1950 vì khả năng gây ra sự phân chia

tế bào thực vật Ngay sau khi phát hiện ra, Skoog và Miller đã đặt ra giả thuyết cytokinin về sự hình thành hình thái thực vật Giả thuyết dự đoán rằng cytokinin, cùng với auxin, đóng một vai trò thiết yếu trong quá trình hình thành thực vật, có ảnh hưởng sâu sắc đến sự hình thành rễ và chồi và sự phát triển tương đối của chúng

auxin-Nhiều báo cáo mô tả chức năng cytokinin trong các quá trình phát triển khác nhau của thực vật như tăng trưởng và phân nhánh rễ, kiểm soát ưu thế ngọn ở chồi, sự phát triển của lục lạp và sự già hóa của lá [23]

+ Gibberellin

Các gibberellin (GA) là sản phẩm trao đổi chất của nấm Gibberella fujikuroi Các tác động đặc trưng nhất của GA đối với sự phát triển của chồi là kéo dài các nút đoạn thân, tăng sự phát triển của lá và tăng cường ưu thế ngọn GA phá vỡ nhiều dạng ngủ đông, bao gồm ngủ đông của hạt, ngủ đông của củ khoai tây và ngủ đông của các long chồi và chồi GA tham gia điều khiển quá trình ra hoa [14]

1.1.3.5 Chất làm đông môi trường

Các chất làm đông môi trường được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô là agar, agarose và gellan gum Agar là một loại polysaccharide của tảo (chủ yếu tảo hồng Rodophyta) được chiết suất từ rong biển từ những năm 1650 đến 1660 bởi một người Nhật tên là Minoya Tarozaemon Agar khi ngâm nước ở 80oC sẽ chuyển sang dạng sol và

40oC thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của agar cao (6-12 g/L nước) Ở trạng thái gel nhưng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng Vì vậy, thuận lợi cho

sự hút dinh dưỡng của cây trong nuôi cấy mô [20]

1.2 Giới thiệu về cây khôi nhung

1.2.1 Phân loại

Cây khôi nhung, còn gọi là cây độc lực, đơn tướng quân [4], thuộc:

- Bộ: Ericales

- Họ: Primulaceae

- Chi: Ardisia

- Tên khoa học: Ardisia silvestris Pitard

Hình 1.1 Cây khôi nhung ngoài tự nhiên

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây khôi nhung là một loại cây nhỏ, mọc thẳng đứng, cao chừng 1,5 – 2 m, thân rỗng xốp, ít phân nhánh hay không phân nhánh, gần trên ngọn có nhiều lá [7]

Lá mọc so le, phiến lá nguyên, mép có răng cưa nhỏ và mịn, dài 25 – 40 cm, rộng

6 – 10 cm, mặt trên tím, gân nổi hình mạng lưới Hoa mọc thành chùm, dài 10 – 15 cm, hoa rất nhỏ, đường kính 2 – 3 mm, màu trắng pha hồng tím, 5 lá đài, 5 cánh hoa Quả mọng, khi chín màu đỏ Mùa hoa: tháng 5 - 7, mùa quả: tháng 7 – 9 [7]

1.2.3 Vùng phân bố

Chi Ardisia Sp có hơn 100 loài trên thế giới , Việt Nam có 94 loài, trong đó nhiều

loài được dùng làm thuốc Cây khôi nhung có vùng phân bố tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh miền núi của Việt Nam như Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng Ninh, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Yên Bái, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quãng Ngãi, Độ cao phân bố từ 400 đến 1000 m Trên thế giới, khôi nhung có ở Trung Quốc (Quảng Tây, Hải Nam) và Lào [2]

1.2.5 Công dụng

Theo tài liệu y học cổ truyền, trong lá khôi nhung có thành phần chủ yếu là tannin, các glycosid có tác dụng trung hòa, làm giảm sự gia tăng acid của dạ dày, chống viêm giảm đau, đặc biệt có tác dụng làm se vết loét, kích thích lên da non và làm lành vết thương trong đường tiêu hóa Khôi nhung được dùng để điều trị bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, làm giảm ợ hơi, ợ chua, nóng rát vùng thượng vị [1]

Ngoài việc sử dụng trong điều trị bệnh đau dạ dày, lá khôi nhung thường được dùng kết hợp với Bồ Công Anh, Khổ Sâm, Cam Thảo tạo thành những bài thuốc nam nhằm điều trị một số chứng bệnh như: kém ăn, trướng bụng, thể trạng yếu, mệt mỏi [10]

1.3 Tình hình nghiên cứu cây khôi nhung

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, các nghiên cứu về cây khôi nhung trên thế giới chưa nhiều, tập trung chủ yếu trong lĩnh vực hóa sinh, phân tích thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học của

loài Các nghiên cứu in vitro cũng được tìm thấy trong các loài thuộc chi Ardisia, họ Đơn

nem

Năm 2007, Ha và cs đã nghiên cứu về thành phần hóa học của hai loài thuộc chi

Ardisia đã phát hiện được trong lá của A.silvestris có các hợp chất

2-methyl-5-(Z-nonadec-14-enyl) và 5-(Z-2-methyl-5-(Z-nonadec-14-enyl), các diphenol cũng thu được từ rễ của

A.gigantifolia [12]

Năm 2012, Deng và cs đã nghiên cứu tạo callus in vitro loài A.crenata Sims từ 4

loại mẫu vật: thân, lá, trụ dưới lá mầm và mầm cây con vô trùng Kết quả cho thấy mẫu

mầm của A crenata nuôi cấy trên môi trường MS + 2,4-D cho tỷ lệ tạo callus cao nhất

Callus nuôi cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,01 mg/L KT bổ sung 5 mg/L AgNO3 cho hệ số tăng sinh gấp 8 lần Dựa vào hình thái đã thu được 5 loại callus, gồm callus trắng, ướt và mềm (I), callus gibraltar-like trắng (II), callus dạng hạt màu vàng ((III), callus màu vàng lục (IV) và callus màu xanh lục (V) Trong đó, callus (II) và (III)

có thể thiết lập thành công hệ thống tế bào huyền phù, và callus có thể được nuôi cấy duy trì tốt trên môi trường MS + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,01 mg/L KT bằng quá trình chuyển tiếp rắn-lỏng [15]

1.3.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 2016, Nguyễn Văn Việt và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây khôi

nhung thông qua nuôi cấy đoạn thân Môi trường tối ưu để cảm ứng tạo cụm chồi từ mắt ngủ là MS + TDZ 0,2 mg/L và NAA 0,5 mg/L Môi trường tối ưu để tái sinh cây từ cụm

chồi in vitro là MS + BAP 1,5 mg/L + NAA 0,5 mg/L Môi trường tối ưu cho ra rễ tạo

cây hoàn chỉnh là ½ MS + 1 mg/L IBA [11]

Đoàn Thị Thu Hương và cs (2019) đã nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây

khôi nhung có nguồn gốc ở Thái Nguyên Kết quả cho thấy, phương pháp tối ưu để khử trùng chồi được ngâm trong ethanol 70% trong 1 phút, bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong

8 phút và nuôi cấy trên môi trường MS với 0,2 mg/L BAP, tỷ lệ mẫu sống đạt được là 80,92%, MS bổ sung 1 mg/L BAP, 0,3 mg/L kinetin, 0,2 mg/L NAA, sucrose 30 g/L và agar 7 g/L, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi là 99,31%, chiều cao chồi 3,7 cm và nhân lên 9,13 lần/chu kỳ sau 4 tuần Môi trường MS chứa 0,5 mg/L NAA, sucrose 20 g/L và agar 7g/L phù hợp cho tạo rễ, 97,63% chồi tạo rễ Số lượng và chiều dài rễ tương ứng là 4,45 và 3,25 cm [4]

Huỳnh Văn Biết và cs (2020) đã thực hiện khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật, định lượng một số hợp chất và xác định khả năng kháng khuẩn, khả năng kháng oxy hóa

10

từ lá cây Khôi nhung (Ardisia silvestris) Kết quả cho thấy lá cây Khôi nhung có chứa các hợp chất như tinh dầu, chất béo, alkaloid, flavonoid, coumarin, tanin, anthocyanoid, carotenoid, các acid hữu cơ, chất khử, proanthocyanidin, saponin và anthraquinon Hàm lượng polyphenol có trong lá cây Khôi nhung là 0,26% chất khô Hàm lượng tanin của lá cây Khôi là 8,80% Hàm lượng Flavonoid của lá cây Khôi nhung là 1,442 mg/g Dịch chiết ethyl acetate và dịch chiết nước của lá cây Khôi nhung có khả năng kháng oxy hóa, nhưng thấp hơn so với acid ascorbic lần lượt là 4,2 và 4,4 lần Dịch chiết ethyl acetate của lá Khôi nhung có hoạt tính oxy hóa cao nhất Các dịch chiết ethyl acetate và dịch chiết ethanol thể hiện rõ tính kháng vi khuẩn thông qua đường kính vòng vô khuẩn, đối với vi khuẩn E coli lần lượt từ 9,67 mm đến 20,67 mm và Salmonella sp là 14,67 mm và 15,33 mm, tuy nhiên không thể hiện đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus [3]

Năm 2021, Thanh và cs đã tiến hành nghiên cứu tái sinh in vitro cây A silvestris

thông qua quá trình phát sinh cơ quan từ callus Các mẫu lá, đốt thân và cuống lá từ cây trưởng thành ngoài tự nhiên được sử dụng làm vật liệu ban đầu cho quá trình tạo callus và

tái sinh cây in vitro Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, các loại mẫu

đến sự hình thành callus và chồi bất định cũng đã được nghiên cứu Nghiên cứu đã chứng minh rằng môi trường tối ưu cho quá trình tạo callus từ ba loại mẫu cấy được xác định là

MS + 1,0 mg/L TDZ, 0,8% agar, môi trường này cho tỷ lệ mẫu tạo callus >80% Môi trường MS + 1,0 mg/L TDZ + 0,4 mg/L IAA có hiệu quả nhất trong việc tái sinh chồi, với tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi đạt cao nhất ở mẫu lá (tương ứng 85% và 14,6), Môi trường tạo rễ thích hợp nhất là MS + 1,5 mg/L IBA với tỷ lệ mẫu tạo rễ cao nhất (90%) [30]

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là cây khôi nhung (Ardisia silvestris Pitard) thuộc chi

Ardisia, họ Đơn nem (Myrsinaceae), bộ Ericales

- Nguyên liệu nghiên cứu: Sử dụng các loại mẫu vật như: thân, lá và rễ của cây

khôi nhung nuôi cấy in vitro (4 - 5 tháng tuổi) tại phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cấy

mô và tế bào thực vật thuộc khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học

- Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ 12/2023 đến 4/2024

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu đoạn

thân cây khôi nhung in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu rễ cây

khôi nhung in vitro

12

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá (phiến

lá và cuống lá) cây khôi nhung in vitro

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn mẫu ban đầu là các mẫu đoạn thân, rễ, lá (kích thước 0,5 – 1 cm) của cây

khôi nhung in vitro có sẵn tại Phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực

vật thuộc khoa Sinh – Môi trường, Trường đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu thân của cây khôi nhung in vitro

Các mẫu thân của cây khôi nhung in vitro (3 - 4 tháng tuổi) được sử dụng để nuôi

cây tạo chồi Mẫu thân sau khi bỏ lá, căt ra thành các đoạn mẫu thân dài 0,5 – 1 cm, cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung riêng rẽ IBA (0,5; 0,75; 1; 1,5 mg/L); 2,4-D (0,5; 0,75; 1; 1,5 mg/L); BAP (0,5; 1; 1,5; 2 mg/L); Kin (0,5; 1; 1,5; 2 mg/L) để đánh giá khả

năng tái sinh chồi in vitro

Sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro từ mẫu thân

thông qua tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu

2.3.2.2 Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu rễ của cây khôi nhung in vitro

Các mẫu rễ của cây khôi nhung in vitro (3 - 4 tháng tuổi) được sử dụng để nuôi

cây tạo chồi Mẫu rễ sau khi loại bỏ các rễ phụ, căt ra thành các đoạn mẫu rễ dài 0,5 – 1

cm, cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung riêng rẽ IBA (0,5; 0,75; 1,0; 1,5 mg/L); 2,4-D (0,5; 0,75; 1,0; 1,5 mg/L); BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L); Kin (0,5; 1,0; 1,5; 2,0

mg/L) để đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro

Sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro từ mẫu rễ

thông qua tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu