báo cáo tốt nghiệp phương pháp nuôi cấy mô cây hoa hồng

1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Nuôi cấy mô là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinhtrưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây.. Sự thành công của vi nhân giố

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 2

TỔNG QUAN 2

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY HOA HỒNG 2

Nguồn gốc và sự phân bố 2

Chương 2 12

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 12

Vật liệu 12

Chương 3 17

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

HIỆU QUẢ CỦA BA TRÊN SỰ TẠO CHỒI CỦA CÂY HỒNG TỶ MUỘI 17

Tỷ lệ sống 17

Chương 4 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

4.1 KẾT LUẬN 33

MỞ ĐẦU

Hoa hồng là một loài hoa đẹp được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới Nóđược trồng với nhều mục đích khác nhau như: trang trí làm đẹp cho không gian sống,làm nước hoa, mỹ phẩm và thuốc chữa bệnh Và còn một mục đích nữa là để làm quàtặng để chinh phục phái đẹp Riêng hoa hồng tỷ muội lại có vẻ đẹp thanh tú, màu sắc tươisáng và nở hoa quanh năm Công dụng của nó là để lảm cảnh trong sân vườn, lối đi,trang trí nội thức trong nhà Trong phong thủy, thì hoa hồng tỷ muội đổi vận “ khai vậnmạng phú quý”, gia đình êm ấm và thăng quan tiến chức Về kinh tế, hoa hồng là mộtloài hoa mang lại lợi nhuận cao Mặc dù đã có nhiều phương pháp nhân giống cổ truyềnnhưng vẫn không làm cây sạch bệnh, năng suất cao Đồng thời, nó còn tốn nhiều thờigian và công chăm sóc

Và thế là một phương pháp nhân giống mới được ra đời, đó là phương pháp nuôicấy mô Nó làm cho hoa hồng tăng thêm về số lượng lẫn chất lượng ( cây sạch bệnh).Điểm quan trọng, phương pháp này là sản xuất ra một số lượng trong thời gian ngắn, câysạch bệnh và trồng được quanh năm Đó cũng chính là lý do chúng em chọn đề tài này

Cây hoa hồng được Nobecourt và Kofler nuôi cấy mô thành công khi tạo ra môsẹo và rễ từ chồi vào năm 1945 Sau đó, đã có nhiều công trình nghiên cứu trong vàngoài nước về loài hoa này Phương pháp nuôi cấy mô được thực hiện nhằm tìm ra môitrường thích hợp cho sự nhân chồi và tạo rễ, làm cơ sở cho việc nghiên cứu, ứng dụngcác kỹ thuật công nghệ sinh học, đáp ứng nhu cầu về chất lượng giống ngày càng cao củangười tiêu dùng

Chương 1 TỔNG QUAN

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY HOA HỒNG

Nguồn gốc và sự phân bố

Cây hoa hồng có tên khoa học là Rosa sp, thuộc lớp song tử diệp, Bộ Rosales, HọRosaceae có nguồn gốc ôn đới và nhiệt đới vùng Bắc bán cầu Cách đây khoảng 5000năm, Trung Quốc là nơi đầu tiên thuần hóa hoa hồng nhưng mãi đến thế kỷ VIII thìnhững giống hồng từ Trung Quốc mới giới thiệu ở Châu Âu và hầu hết những giốnghồng ngày nay đều có nguồn gốc từ nó

Họ hoa hồng có khoảng có 115 chi và trên 3000 loài phân bố chủ yếu ở vùng ônđới và cận nhiệt đới bắc bán cầu Các nước sản xuất hoa hồng chính: Hà Lan, Mỹ,Nhật…Trong đó, Hà Lan là nước trồng và xuất khẩu hoa hồng lớn nhất thế giới Hiệnnay, các giống trồng ở Việt Nam hầu hết là giống nhập từ Hà Lan, Mỹ, Pháp, TrungQuốc và trồng phổ biến ở Đà Lạt rồi đổ xuống vùng Tiền Giang, Hậu Giang, nhất là tạiCái Mơn, Sa Đéc… hoa hồng được trồng đại trà với nhiều giống quí và mới lạ

Lá: lá hoa hồng là lá kép lông chim mọc cách, ở cuống có lá kèm nhẵn, mỗi lá có3-5 hay 7-9 lá chét, xung quanh lá chét có nhiều cưa nhỏ Tùy giống mà lá có màu xanhđậm hay xanh nhạt, răng cưa nông hay sâu hoặc có hình dạng lá khác.

Hoa: có nhiều màu sắc và kích thước khác nhau Cụm hoa chủ yếu có một hoahoặc tập hợp một ít hoa trên cuống dài, cứng, có gai Hoa lớn có cánh dài hợp thành chén

ở gốc, xếp thành một hay nhiều vòng, siết chặt hay lỏng tùy theo giống Hoa hồng thuộcloài hoa lưỡng tính Nhị đực và nhụy cái trên cùng một hoa, các nhị đực dính vào nhaubao quanh vòi nhụy Khi phấn chín rơi trên đầu nhụy nên có thể tự thụ phấn Đài hoamàu xanh

Quả: quả hình trái xoan có cánh đài còn lại

Hạt: hạt hồng nhỏ có lông, khả năng nảy mầm của hạt rất kém do có lớp vỏ dày

1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Nuôi cấy mô là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinhtrưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây Sự thành công của vi nhân giống phụ thuộcvào nhiều yếu tố: môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật,giống, nhiệt độ, ánh sáng, chọn mẫu vật và tất cả các giống nuôi cấy

Chọn nguyên liệu ban đầu cho nuôi cấy mô rất quan trọng, nó không những quyếtđịnh sự thành công ban đầu cho cả quá trình nhân tiếp theo Việc chọn vật liệu phụ thuộcvào phương pháp nuôi cấy nhưng phổ biến là chọn đoạn than có mang chồi nhũ, vì chọnvật liệu này sẽ có nhiều vật liệu để tiến hành nuôi cấy hơn chồi ngọn

1.2.1 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô thực vật được chia thành 4 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn cómôt chức năng riêng Giai đoạn 0 là giữ cây trong nhà lưới; giai đoạn 1 là khử trùng mẫucấy; giai đoạn 2 là nhân chồi nhanh; giai đoạn 3 là kéo dài, kích thích tạo rễ và tiền thuầndưỡng; giai đoạn 4 là thuần dưỡng.Trong đó, giai đoạn 2 là giai đoạn quyết định số lượngcây có thể tạo ra Sự thành công của giai đoạn này tùy thuộc vào sự kích thích chồi bất

định hay là sự phát triển của chồi bên và còn tùy thuộc vào số lần cấy truyền, hệ số nhângiống, môi trường chung quanh.

1.2.2 Tầm quan trong của phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô là một kỹ thuật nhân giống mang nhiều ưu điểm nổi bật như tạo cây sạchbệnh, hệ số nhân giống cao và thời gian sản xuất được rút ngắn Vì vậy, công nghệ nuôicấy mô có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối với những cây sinh sản chậm hoặc là đối vớinhững cây cần cung cấp số lượng giống lớn

Nuôi cấy mô là phương pháp làm giảm giá thành Đồng thời, tạo số lượng cây conlớn và đồng đều đáp ứng nhu cầu thị trường Phương pháp này có thể nhân được một sốlượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1m2 nền có thể để được 18.000 cây Thuậntiện và làm hạ giá thành vận chuyển (1 thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15 kg) Ngoài

ra, việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi

Bằng phương pháp nuôi cấy mô người ta có thể nhân giống rất nhiều loại cây từcác vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà nhân giống vô tính in vitro không thể thựchiện được Đồng thời, có thể duy trì được các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho cácphương pháp lai tạo giống

Bên cạnh đó, nuôi cấy mô còn bao gồm những ưu điểm nổi bật: có thể tạo đượcmột số loài thực vật mà không thể tiến hành in vitro do nhân giống in vitro có thể cảmứng được sự trẻ hóa của mô; Sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitrothường mạnh hơn những cây nhân giống in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa vàsạch bệnh; việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọccác đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy củacác cây mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy; Trong nuôi cấy in vitrochỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễdàng; Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống invivo; Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp nên có thể sảnxuất cây con quanh năm

1.2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình tháicủa tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phầnmôi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phậnnuôi cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loạimôi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng

vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng

Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (aminoacid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch tríchnấm men…

1.2.3.1Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trong nuôicấy thường là nước cất 1 lần Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất 2lần hoặc nước khử khoáng

1.2.3.2Các nguyên tố đa lượng

Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu các mô cấy

và không gây độc Nhu cầu khoáng đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều

so với cây trồng tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: Nitrogen (N),Photpho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), và Calcium (Ca)

1.2.3.3Các nguyên tố vi lượng

Đây là những nguyên tố mà cây trồng chỉ cần ít nhưng không thể thiếu cho sinhtrưởng và phát triển bình thường Hầu hết các nguyên tố khóang vi lượng cần thiết cho

cây đối với mô cấy đều được cung cấp vào trong môi trường nhân tạo Các vi lượngthường thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), kẽm (Zn), Đồng (Cu),Molybden (Mo), Cobalt (Co), sắt (Fe) Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấphơn 30 mg/l Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme.Nhiều nghiên cứu cho thấy sắt kết hợp với các chất chelat (EDTA- ethylendiamin-tetraacetic acid) làm tăng khả năng trao đổi chất của sắt.

1.2.3.4Nguồn cacbohydrate

Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp rấtthấp do thiếu clorophin, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác Vì vậy phải đưa thêm hợpchất carbonhydrate vào thành phần môi trường nuôi cấy và hợp chất carbonhydrate được

sử dụng phổ biến là đường sucrose Lý do nó được sử dụng phổ biến là nó ổn định tronghấp khử trùng và được cây sử dụng

Đường sucrose vừa là nguồn carbon cung cấp cho mẫu cấy, đồng thời còn thamgia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường Hàm lượng đường cao mô nuôicấy khó hút được nước Hàm lượng đường quá thấp là một trong những nguyên nhân gâyhiện tượng mọng nước ở mẫu cấy Đường còn có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bấtđịnh

1.2.3.5Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào

và mô được nuôi cấy thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn của chúng Cácvitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vit B1),nicotinic acid, pyridoxine (vit B6) và myo- inositol Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinhtrưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn carboncủa môi trường nuôi cấy

1.2.3.6Agra

Việc làm đông đặc môi trường thường dựa vào các hợp chất polysaccharide caophân tử, chúng giữ nước và môi trường khoáng cung cấp cho cây, có thể dùng làphytagell (gelrite) hay agar.

Agar thương được sử dụng hơn cả vì nó trơ không chịu tác dụng nhiều bởi cácphản ứng hóa học, tính ổn định cao và giá cũng tương đối rẻ

Agar được trích từ tảo và được dùng để chuẩn bị môi trường đặc hay môi trườngbán lỏng để nuôi cấy mô thực vật Agar tan ở 100oC và đông đặc ở 45oC Độ cứng củaagar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và độ pH của môi trường nuôi cấy Nồng độagar thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là 6-8 g Nồng độ agar được

sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môitrường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước vàhoạt động của cytokinin trong môi trường có agar

Độ tinh khiết cua agar trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng Người ta đãchứng minh được rằng trong agar có chứa Ca, Mg, K, Na và sự tha agar trong môi trườngnuôi cấy rất quan trọng

1.2.3.7Nước dừa

Trong nuôi cấy mô thực vật thường sử dụng nước dưa từ trái dừa bánh tẻ và tráidừa già Thành phần của nước dừa khá phong phú nhưng có chứa myo-inositol, các chấtthuộc nhóm cytokinin và một số amino acid khác Diphenylurea (DPU) có hoạt tính giốngnhư cytokinin là thành phần chính trong nước dừa Các thành phần này có hàm lượngthay đổi khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độtuổi

1.2.3.8Chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hìnhthái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng,mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó

Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lậptạo chồi và rễ thành lập tạo chồi và rễ Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợpcho sự tạo rễ, còn ở mức độ trung gian thích hợp cho tạo mô sẹo.

Auxin:

Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp Auxin tự nhiênđược tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-dichlorphenolxyacetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid(NAA).IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAAkhông ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4- D không bị biến tính trongquá trình hấp tiệt trùng

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằmthúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp vàtrao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính.Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin

là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo(callus) Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2,0 mg/l

vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp

Cytokinin:

Zeatin là cytokinin tự nhiên được trích từ hạt bắp nảy mầm Kinetin và 6-Benzyladenine được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây người ta đã chứng minh là được tạo ra ởmột vài loại cây Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởngcủa chồi nuôi cấy mô Đồng thời, nó ức chế sự tạo rễ và hình thành mô sẹo Nồng độ sửdụng là 0,1-2 mg/l Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hìnhthành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Tuy nhiên trong trường hợp không bổ sung cytokinin thì sau 10-12 ngày cũng cho

ra chồi nhưng tỷ lệ rất thấp

1.2.3.9Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc Than hoạttính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trườnghợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thayđổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sựhình thành và sinh trưởng của rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxyhóa tốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điềuhòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường.

1.2.3.10 pH

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môi trường là yếu

tố duy trì trao đổi chất trong tế bào Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một loạt các chấtphụ thuộc vào pH môi trường Đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibebrellin và cácvitamin Sự hấp thu các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH Để chỉnh pH của môitrường có thể dùng dung dịch 10% hoặc 1N NaOH và 1N HCl pH của đa số môi trườngđược điều chỉnh giữa 5,5- 6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agar khó chuyểnsang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng

1.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NUÔI CẤY MÔ CÂY HOA HỒNG ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

1.3.1 Các công trình trong nước

Nguyễn Thị Kim Thanh(2005), đã công bố kết quả nhân giống cây hoa hồng đỏ vàcây hoa hồng trắng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, sử dụng môi trường cơ bản MS+20 g/

l sucrose+ 5,6 g/l agar, với các kết quả cho từng công đoạn:

Tạo vật liệu khởi đầu: khử trùng mắt ngủ bằng HgCl2 0,5% trong 5 phút, hoặcdùng Haiter 10% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch trên 60% Mẫu này được cấy vào môitrường bổ sung BA hoặc Kinetin 1mg/l, mẫu sẽ bật chồi 100% sau 14 ngày nuôi cấy

Nhân chồi (sau 4 tuần nuôi cấy): sử dụng 2 mg/l BA đối với giống hồng đỏ cho hệ

số nhân cao nhất là 3,47 và 1,5 mg/l đối với giống hồng trắng cho hệ số nhân cao nhất là

5,94; sử dụng được cả môi trường đặc và lỏng cho nhân chồi hoa hồng đỏ, riêng hoahồng trắng thì chỉ nên sử dụng môi trường lỏng; pH=6 là thích hợp cho cả hai loại hoahồng.

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh: môi trường bổ sung 2 mg/l NAA hoặc 2 mg/l IBA chohiệu quả tạo rễ trên 60%

Theo Nguyễn Kim Hằng (2005), trên cây hoa hồng (Rosa chinensis) sử dụng 1,5mg/l BA cho hệ số nhân chồi cao nhất; sử dụng NAA riêng lẽ (1mg/l) hoặc NAA (2mg/l)kết hợp với than hoạt tính (2g/l) để tạo cây hoàn chỉnh là tốt nhất

Hồ Tân (2006), giai đoạn khởi đầu: môi trường bổ sung 3 mg/l BA cho tỷ lệ tạochồi từ mầm ngủ cao nhất; giai đoạn nhân chồi: môi trường bổ sung 1 mg/l BA cho sốchồi tăng cao nhất; giai đoạn tạo rễ: môi trường bổ sung 2 mg/l NAA tạo rễ là tốt nhất.Theo Lê Minh Lý (2007), trong giai đoạn nhân chồi của giống hoa hồng Rosa hybrid bổsung thêm 1-2 mg/l BA là thích hợp để nhân chồi

Nguyễn Hữu Tính (2008), đối với cây hoa hồng nhung ( Rosa chinensis L): sửdụng 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,15 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất; sử dụng 0,5mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l than hoạt tính để tạo cây hoàn chỉnh là tốt nhất

1.3.2 Các nghiên cứu ở ngoài nước

Theo kết quả nghiên cứu của Roy và cộng tác viên (2004), khi sử dụng 1mg/l và0.5 mg/l IAA để tạo rễ cho cây Rosa sp thì sau 4 tuần đã cho kết quả cao (85% rễ của câyRosa sp thành lập)

Kết quả nghiên cứu của Arif và cộng tác viên (1991), giai đoạn nhân chồi bổ sungthêm 3 mg/l BA và 0,05 mg/l NAA có tác dụng làm chồi cây hoa hồng mini tăng caonhất Al-Khalifah và cộng tác viên (2005), khi sử dụng 3,0 mg/l BA kết hợp với 0,2 mg/lkinetin thì cây thì cây Rosa hybrid L có tỷ lệ chồi tăng 71,1%

Theo Soomro và cộng tác viên (2003), để tạo rễ của cây Rosa indica đã sử dụng0,6 mg/l IBA và 0,1 mg/l NAA sau khoảng thời gian 12 tuần thì rễ sẽ tăng 50%; để tạo

chồi của cây Rosa indica đã sử dụng 2,0 mg/l IBA và 2,0 mg/l IAA sau khoảng 12 tuần

tỷ lệ chồi tăng 70%

Hamed và cộng tác viên (2006), để tạo chồi của cây Rosa indica L đã được sửdụng 1,5 mg/l BAP sau 7 ngày đã cho kết quả cao (100% chòi hình thành) Còn khi sửdung,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l kinetin thì sau 10 ngày có 98% chồi hình thành Theo kếtquả nghiên cứu của Khosravi và cộng tác viên (2007), trên cây Rosa hybrid sử dụng 4

µM BAP kết hợp với 0,5 µM NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thiết bị và hoá chất

Trang thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi thanh trùng(autoclave),máy đo pH, bếp khử trùng dụng cụ cấy, tủ sấy giấy, các dụng cụ thủy tinh dùng trong thínghiệm: ống đong, keo, ống nghiệm…

Hóa chất gồm có: Môi trường khoáng đa lượng – vi lượng MS( Murashige vàSkoog) Vitamin như thiamin, pyridoxine, nicotinic acid, myo – inositol Các chất điềuhòa sinh trưởngthực vật: 6 - Benzyl adenine (BA), 1 – naphthaleneacetic (NAA) Hóachất khử trùng mẫu vật: cồn 70o, xà phòng Sunligh, bột giặt, nước Javel và các chất khácnhư: đường sucrose, agar, nước dừa tươi, than hoạt tính

2.1.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, bộ phận sinh lý – Sinh hóa,khoa Nông nghiệp và SHUD, Trường Đại học Cần Thơ, đường 3/2 Tp Cần Thơ Thờigian thực hiện : từ tháng 12/2008 đến tháng 5/2009

2.1.3 Điều kiện thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng cấy mô (nhiệt độ 26 +2oC,cường độ chiếu sang 1500 lux, thời gian chiếu sang 16 giờ/ngày)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường cơ bản theo MS có bổ sung them 30g/l đường sucrose, 7g/lagar, 10% nước dừa tươi, vitamin theo Morel (1951) và 0,1g/l , myo – inositol Ngoài ra,tùy theo thí nghiệm có bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy 2g/l than hoạt tính và cácchất điều hòa sinh trưởng thực vật như: 6-Benzyl adenine (BA), 1 – naphthaleneacetic(NAA)

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 Tùy theo thí nghiệm mà sử dụnghay ống nghiệm(keo rót 40ml môi trường, ống nghiệm rót 12ml môi trường) và chuyểnvào nồi hấp khử trùng có nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm, trong thời gian 20 phút

cấy được lắc đều với dung dịch khử trùng Javel cộng thêm 2 giọt nước xà phòng Sunligh

17 phút, rồi rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng Tiếp đến, mẫu cấy lại được lắc đều vớidung dịch khử trùng Javel 15 phút nhưng không có thêm nước xà phòng Sunligh và rửalại 4 lần bằng nước cất vô trùng

2.2.3 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Hiệu quả của BA trên sự tạo chồi cây hồng tỷ muội

Mục đích: Tìm ra nồng độ BA thích hợp cho giai đoạn tạo chồi từ mầm ngủ.Mẫu cấy: Chọn những chồi thân với một mắt lá vừa được khử trùng để bố tríthí nghiệm

Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 4 nghiệmthức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 3 ống nghiệm đựng môi trường, mỗi ống nghiệm có

Các chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ sống: mẫu cấy có mầm ngủ vẫn còn xanh

 Số lá, chiều cao chồi

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 tuần sau khi cấy

Thí nghiệm 2: Hiệu quả của BAvà BAA trên sự nhân chồi cây hồng tỷ muội

Mục đích: Tìm ra nồng độ BA và NAA thích hợp kết hợp cho giai đoạn nhânchồi thích hợp cho giai đoạn tạo chồi từ mầm ngủ

Mẫu cấy: Chọn những chồi thân với một mắt lá ở vị trí thứ tư từ ngọn xuống

để bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 6 nghiệmthức, 6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo đựng môi trường, mỗi keo có 3 mẫu

Ký hiệu các nhiệm thức:

 Số lá, chiều cao chồi

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4, 5 tuần sau khi cấy

Thí nghiệm 3: Hiệu quả của NAA và than hoạt tính trên sự tạo rể cây hồng tỷ muội

Mục đích: Tìm ra nồng độ NAA thích hợp cho giai đoạn tạo rể

Mẫu cấy: Chọn những chồi cao từ 1- 2 cm để bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 7 nghiệmthức, 8 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo đựng môi trường, mỗi keo có 3 mẫu

NT5: 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l than hoạt tính

NT6: 1 mg/l NAA + 2 mg/l than hoạt tính

NT5: 2 mg/l NAA + 2 mg/l than hoạt tính

Các chỉ tiêu theo dõi:

 Số rễ, chiều cao rễ

 Chiều cao cây, số lá gia tăng

 Trọng lượng tươi gia tăng

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4, tuần sau khi cấy

2.2.4 Phân tích số liệu

Xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Excel và chạy thống kê thí nghiệm bằng chương trình Statgraphichc.

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

HIỆU QUẢ CỦA BA TRÊN SỰ TẠO CHỒI CỦA CÂY HỒNG TỶ

MUỘI

Tỷ lệ sống

Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.1 vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy thì nghiệm thức

BA 0,1 mg/l và nghiệm thức BA 2 mg/l cho số tỷ lệ sống (%) của mẫu cây hoa hồng tỷmuội cao nhất (100%) khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với các thí nghiệm thức đốichứng (66,7%) nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 1,5 mg/l

BA (88,9%)

Bảng 3.1: tỷ lệ sống (%) của mẫu cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có

BA khác nhau 1 tuần sau khi cấy.

Nghiệm thức 1 tuần sau khi cấyTỷ lệ sống (%)Đối chứng

0,1 mg/l BA1,5 mg/l BA

2 mg/l BA

66,7 b100,0 a88,9 a100,0 aF

CV (%) LSD

**

10,8118,10

3.1.1 Số lá

Kết quả trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy số lá giatăng cao nhất ở các nghiệm thức BA 0,1 mg/l là 2,6 lá khác biệt có ý nghĩa thống kê ởmức 5 % so với các nghiệm thức còn lại Số lá thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng là 0,9

lá Nghiệm thức 1,5 mg/l BA (1,6 lá) và nghiệm thức 2 mg/l BA (1,7 lá) khác biệt không

có ý nghĩa thống kê nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với đối chứng (0,9lá)

Bảng 3.2: số lá của cây hoa hồng tỷ muội trong môi trường có BA khác nhau

2 tuần sau khi cấy.

Nghiệm thức 1 tuần sau khi cấy Số lá 2 tuần sau khi cấy

2,6 d5,6 d3,6 c4,7 bF

CV (%)

LSD0,05

**

10,090,3151

**

10,020,7717

Kết quả tuần 2 sau khi cấy, nghiệm thức BA 0,1 mg/l vẫn cho số lá gia tăng caonhất (5,6 lá) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại Tạithời điểm này số lá gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức đồi chứng (2,6 lá)

3.1.2 Chiều cao chồi

Kết quả trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy nghiệm thức BA 0,1 mg/l cho chiều caochồi gia tăng cao và ổn định qua 2 tuần nuôi cấy Tuần đầu sau khi cấy, nghiệm thức BA0,1 mg/l cho chiều cao chồi gia tăng cao nhất (1 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức5% so với các nghiệm thức còn lại Chiều cao chồi gia tăng thấp nhất ở nghiệm thức đối