CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA docx

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓAtrường chọn lọc, môi trường phân biệt  thu được các khuẩn lạc đơn thuần khiết bằng các kỹ thuật phân lập.. CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓAViệc định danh: - Các đặc điểm

Trang 1

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA

trường chọn lọc, môi trường phân biệt  thu được các khuẩn lạc

đơn thuần khiết bằng các kỹ thuật phân lập

- Chủng thuần là yêu cầu cho việc định danh các vi sinh vật

Trang 2

Việc định danh:

- Các đặc điểm về hình thái

- Các phản ứng sinh hóa thực hiện bởi các chủng vi sinh vật

Trang 4

 Kết quả:

 Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím

 Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ.

Trang 6

Trang 7

 Các kết quả thử nghiệm sinh hóa của hàng

trăm loài vi sinh vật được tổng hợp thành những Bảng sinh hóa định danh vi sinh

vật.

 Bảng bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc

trưng nhất để phân biệt các loài vi sinh vật gây bệnh thường gặp Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thị một trị số là tỷ lệ phần

trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả

dương tính theo thống kê ở một loài vi

sinh vật.

Trang 8

 Các đặc điểm sinh hóa có trị số dao động ở mức

50% không có giá trị trong việc định danh.

 Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử

nghiệm sinh hóa biểu thị qui ước bằng các ký

hiệu như:

 (+) : dương tính

 (-) : âm tính

 (+/-) : khoảng trên 70% là dương tính

 (-/+) : khoảng trên 70% là âm tính.

 Trong các thử nghiệm này, để đảm bảo chính

xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng.

Trang 9

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.1.Nguyên tắc

- Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện

chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, có khả năng biến

dưỡng năng lượng theo phương thức hô

hấp với oxy tạo ra H2O2

ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao này trong tế bào

ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.

Trang 10

Trang 13

phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh

khối vi sinh vật trên phiến kính Ghi nhận sự sủi bọt nếu có Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh

khối của khuẩn lạc lên phiến kính, nhỏ một giọt H2O20,5% rồi đậy lại bằng một lá kính (lamelle) Ghi nhận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa phiến kính và lá kính.

Trang 15

1.2.Tiến hành

- Thử bằng ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau đó chấm đầu ống mao dẫn này vào tâm khuẩn lạc cần thử trên môi

trường Ghi nhận nếu có sự sủi bọt khí trong ống

mao dẫn Phương pháp này có ưu điểm là thử được trên từng khuẩn lạc nên có thể thực hiện trên các

khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần.

Trang 16

1.3.Đọc kết quả

- Dương tính (+) : khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O 2 được tạo ra.

- Âm tính (-) : khi không có hiện tượng sủi bọt khí.

Hình1: Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H 2 O 2 của vi khuẩn có

catalase dương tính.

Trang 17

2.Thử nghiệm bằng Urease

2.1.Nguyên tắc

- Xác định khả năng của vi sinh vật tổng

hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân

tăng pH của môi trường và có thể được

theo dõi qua sự thay đổi màu của chất chỉ thị pH.

- Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các loài Proteus spp Và thường được dùng để

phân biệt các dạng Proteus với các thành viên khác của Enterobacteriaceae.

Trang 21

- Ủ ở 370C trong 24 giờ.

Trang 22

* Môi trường urea lỏng

Rustigian-Stuart’s Urease Broth:

- Dương tính (+): Màu đỏ tím trong khắp

môi trường

- Âm tính (-) : Môi trường không có sự

đổi màu (màu vàng cam)

Trang 25

* Môi trường Christensen Urea:

- Dương tính (+): Màu đỏ tím trên bề mặt môi trường

thạch nghiêng + + + + : toàn bộ thạch đổi màu + + + : chỉ mặt thạch đổi màu + : mặt thạch ở đỉnh đổi màu, phần

môi trường còn lại không đổi màu (+) nhanh: màu đổi trong vòng 1-6 giờ

(+) chậm : màu đổi trong vòng 24 giờ đến 6 ngày ủ

hoặc lâu hơn

Trang 28

3.Thử nghiệm khả năng lên men đường hoặc rượu

Trang 29

3.1 Nguyên tắc

-Thử nghiệm khả năng lên men thường được dùng

để định danh các vi sinh vật đường ruột

(Enterobacteriaceae có khả năng lên men glucose,

E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men được

gluocose và lactose) và phân biệt một số giống vi sinh vật.

Trang 30

Môi trường Phenol Broth Base có pH 7,4.

Trang 31

theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày

- Lọc vô trùng môi trường qua màng lọc có kích thước lỗ

0,45µm hoặc 0,2µm.

- Tiến hành cấy chủng vào các ống môi trường bằng que cấy vòng.

trường hợp khẳng định kết quả âm tính, cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi thời gian ủ có thể kéo dài đến

trong 14-30 ngày.

Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) thì chất chỉ thị Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ

chuyển màu vàng lục.

Trang 38

4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrat

Xác định khả năng của một số vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pH môi trường Khi pH tăng, môi trường chuyển sang

kiềm, lượng acetate, formate tăng

pH trung tính: sản phẩm chủ yếu là CO2 và acetate

pH acid : sản phẩm chủ yếu là acetoin và lactate

Như vậy, sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

Trang 39

Môi trường Phenol Broth Base có pH 7,4.

Trang 40

Kiềm: màu xanh dương pH= 7,6

Trung tính (môi trường không nuôi cấy): màu xanh lục pH= 6,9

Cấy ria khuẩn lạc thuần từ môi trường KIA hoặc môi

trường thích hợp trên bề mặt môi trường SCA rắn trong ống thạch nghiêng Ủ ở 350C trong 24-48 giờ, khi cần có thể để đến 4 ngày.

Trang 41

pH 6,7 môi trường không nuôi cấy: từ màu kem đến nâu

Cách ủ giống như môi trường SCA.

Trang 42

Trang 43

5.Thử nghiệm khả năng sinh H2S

Xác định khả năng của vi sinh vật chuyển hóa các acid amin chứa lưu huỳnh trong điều kiện kỵ khí sinh H2S, tạo chất kết tủa màu đen Có nhiều cách phát hiện khả năng sinh H2S

nhưng phương pháp sử dụng acetate chì là nhạy nhất để

nhận ra một lượng H2S ở các vi khuẩn

Chuẩn bị môi trường

- Môi trường KIA (Kligler Iron Agar)

- Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar)

- Môi trường SIM (Sulfide Indol Motility Agar)

- Môi trường PIA (Peptone Iron Agar)

- Môi trường BSA (Bismuth Sulfide Agar)Tất cả các môi trường trên đều thanh trùng ở 1210C, 15 phút

Trang 44

- Môi trường BSA : cấy trên đĩa.

Có thể dùng giấy tẩm Pb(CH3COO)2 5% gắn lên thành ống môi trường lỏng Phương pháp này cho kết quả từ 30

phút dến 1-2 giờ.

Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng, ống thạch đứng hoặc trên mặt đĩa petri Ủ ở 370C trong 24–48 giờ, cần thiết có thể đến 7 ngày.

Trang 45

-Dương tính (+):

+ Xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường BSA

+ Môi trường KIA, TSI, SIM, PIA hóa đen

+ Màu nâu đen trên giấy thử tẩm Pb(CH3COO)2 5%.

- Âm tính (-) : Môi trường không có sự đổi màu.

Trang 47

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Xác định khả năng sinh indol từ tryptophan.

Trang 48

dùng các môi trường kết hợp:

- Môi trường MIU (Motility Indol Urea)

- Môi trường SIM (Sulfide Indol Motility)

Thuốc thử:

- Thuốc thử Erlic

- Thuốc thử Kovacs

Trang 49

Trang 50

- Sinh khối chủng thuần được cấy vào ống môi

trường lỏng, nhỏ 5 giọt thuốc thử

- Ủ ở 370C trong 24-48 giờ Trước khi bổ sung

thuốc thử có thể bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ.

- Kiểm tra bằng E.coli (indol (+)) và Klebsiella

(indol(-)).

Trang 51

Trang 52

Trang 53

Trang 54

Trang 55

Trang 56

Định dạng
Số trang	56
Dung lượng	2,16 MB