Nghiên cứu Đặc Điểm chủng nấm sợi sinh kháng sinh và Ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng

Khảo sắt ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối khang cia ching Asp.. - Nghiên cửu các điều kiện môi trường MT thích hợp cho sinh trưởng và sok KS eta c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM

KHOA SINH HOC

as

BAO CAO TONG KET

DE TAI NCKH CAP TRUONG

NGHIEN CUU DAC DIEM CHUNG NÁM SỢI SINH KHANG SINH VA UNG DUNG TRONG PHONG TRU BENH HAI CAY TRONG

Ma sb: CS.2012.19.44

CHU NHIEM DE TAI:

ThS TRAN TH] MINH ĐỊNH 'NHỮNG NGƯỜI THAM GIA

Th.S NGUYEN THIEN PHU 304- £510

1.2 Nắm sợi RNM và khả năng sinh CKS

1-3 Các yếu tổ ảnh hưởng lên khả năng sinh trường và sinh KS của NS

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1.4 Các NT nghiên cứu đã sử đựng ‹555555556seseo.15

-32.3 3 Định danh bằng sinh học phân tử

2.2.4 Phương pháp xác định sinh khối NS

3.3.5 Phương pháp khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

225.2 An Icing của độ mặn

2.25.3 Anh Ineéng của nguằn dinh dường carbon

-3.2 5.4 Ảnh hưởng của nguẫn dinh đường nÌ1 10

2.2.5.6, Anh Iuedng cia pH ban di —Ö 2.2.5.7 Xée dink dmg hoe qué trình lên men — 2.2.6 Khảo sắt các điều kiện ảnh hưởng lên độ bền CKS man ẨŸ -3.26.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

3.263 Ảnh hưởng của pH,

2.2.6.3 Ảnh hưởng của thời gian

2.2.1 Xée định nông độ ức chế tối thiểu MIC

2.2.8, Khảo sat khả năng làm giảm sinh khối nắm gây bệnh cây trồng của dich

229, Thương php thử thà tăng kháng nắm gây bệnh ở quy mỗ n vivo 3,1 Phân lập và tuyển chọn chủng NS có hoại tính đổi kháng mạnh 23 3.2 Đặc điểm sinh học và phân loại

3.3 Khảo sắt ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối khang cia ching Asp terreus DI

3.3.1, Anh Ineémg của MT môi cây

-3.3.3 Ảnh hưởng của nguẫn dinh dưỡng carbo) 32

3.3.4 Anh hưởng của nguồn đình đường niươ pa 3.3.5, Anh hướng của nhiệt độ

3.3.6, Anh hưởng của pH bạn đâu

3.3.7, Béng hoc qué trình lên men

3.4 Khảo sắt enzyme ngoại bảo

3.5 Khdo sit kha nang kháng nắm

3.6 Một số yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền CKS của chủng 4sp (erreus ĐI 42

ĐI làm giảm sinh khối nắm P, palmivora md

3/9 Thứ nghiệm khả, aig dts be PAeophahre pare ‘gly bệnh trên bip .49 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VẢ KIÊN NGHỊ, SI

Minimum Inhibitory Concentration (Nông độ ức chế tối thiểu) Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus khing methicillin) Mai twins

Chất kháng sinh

Rừng ngập mặn

Vi khuin Gram dương,

Vi khuẩn Gram âm

Ví sinh vật

DE TAI KHOA HQC VA CONG NGHE CAP TRUONG Tên đề tài: Nghiên cứu đặc điểm chủng nắm sợi sinh kháng sinh và ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng

Mã sổ: CS.2012.19.44

“Chủ nhiệm để ải: Trần Thị Minh Định Tel: 0936.176.594

Email dịnhtm/3hemp.edu vn

‘Co quan chi ti dB i: Khoa Sink hoe Trường Đại học Sự phạm TP HCM

‘Co quan va cd nhin phối hợp thực hiện: Nguyễn Thiện Phỏ, Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm TP HCM

“Thời gian thực hiện: 4/2012 -4/2013

Mục tiêu: Tuyển chọn, nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả | ching nim sợi vào phòng trừ bệnh hại cây trùng

Nội đụng chính

~ Phân lập và tuyển chọn chủng nắm sợi phản lập tử rừng ngập mặn (RNM)

Cần Giờ có hoạt tính kháng sinh mạnh,

- Khảo sắt hoạt tính kháng khuẩn, kháng nắm của chủng nắm sợi nghiên cứu

- Nghiên cửu các điều kiện môi trường (MT) thích hợp cho sinh trưởng và sok KS eta ching hayes phủ,

~ Khảo sắt các tính chất li hóa của chắt kháng sinh từ chủng NS nghiên cứu

- Bước đầu thử nghiệm khả năng ức chế nắm gây bệnh cây trồng của địch lên

men từ chủng nắm sợi nghiên cứu,

Kết quá chính đạt được (khoa học, ứng đụng, đào tạo, kinh tế-xã hộ)

- Từ 58 chủng nắm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, đã tuyển chọn được

em) vi đổi kháng yêu với Esherichia coli (D-d-1,10 em)

= Da nghién ciru đặc điểm sinh học và phân loại đến loài chủng ĐI, kết luận

chủng nay thude loai Aspergillus terreus

terreus B1 sinh kháng sinh mạnh nhất như sau: glucose 30 g, bột đậu tương 'CáC];2H,O 0.5 g FeCl,2H,O 2 mg, ZnSO, 7H,O 2 mụ, nước cắt lít ph

“$,5: nhiệt độ nuôi cấy 25C; 108 giờ

- Đã khảo khả năng kháng nắm của CKS tử chủng 4sp terreus Bl: khong kháng các loài

olani nhưng cỏ kha năng kháng mạnh Piyfaplihora pdlmisora

~ Đã xắc định một số đặc điểm của CKS trong dịch lên men chủng 4s?

terreus D1: bén nhigt (đến 100% trong 40 phút hoạt tính vẫn khỏng thay

446i), bén pH (thể hiện hoạt tính rất mạnh trong khoảng pH 4 - 7.5), bên thời sian (khi bảo quản ở 4°C, sau l6 tuần hoạt tỉnh vẫn không thay đổi) Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia

~ Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dung dich lên men của chung Asp terreus

ĐI trong việc làm gầm sinh khối P: palmfsore: cho thấy MT có 10% dich 9,57% sinh khi P palemivora sau 4 ngày nuôi cy

~ Đã khảo sit khả năng tiêu diệt P palmivora trén cây bắp, kết quả cho thấy

bảo tử của chủng Asp terreus im giảm 33.4% lệ cây bắp chết do bệnh,

Project Title: Optimizing of culture conditions for antibiotic production of a fungal strain isolated from Can Gio mangrove and applying it in plant diseases control

= Isolation of filamentous fungal strains from Can Gio mangrove soil

= Screening filamentous fungal isolates for antagonistic activity against bacteria and fungi

= Identification and classification of a fungal strain which has effectively antagonistic activity against fungal plant pathogens

- Optimizing of culture conditions for antibiotic production of this fungal strain

~ Studying on antibiotic properties derived from this strain,

- Basing on 285 rRNA gene sequence, DI isolate was class Aspergillus terreus,

KHUPO, | g, MgSO,.711,0 1 g, NaCl 1.5 g, CaCl.2H,0 0.5 g, FeCh,2H,0 2

mẹ, ZnSO,7H;O 2me, distilled water 1 litre: pH 5.5; culture temperature 25°C: 108 hours incubation

‘Antibiotic compounds derived from this strain showed effectively activity

‘against tested microorganisms when treated at 100°C in 40 minutes period, in

pH range from 4 to 7.5 and when stored at 4°C for 4 months

10 per cent of culture broth reduced 70.16 per cent biomass of Piytophthora palmivora; 20 per cent of culture broth reduced 79.57 per cent biomass of P palmivora after 4 days of incubation

A terreus DI spores reduced 33.4 per cent death rate of com caused by P palmivora,

Bệnh cây trồng là một trong những yếu tổ gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến năng suất trong nông nghiệp Trung bình mỗi năm, lượng nông sản bị mắt mát

22% (Khan, 2008) Theo thống kê khác, bệnh cây trồng gây thiệt hại khoảng 14.1%,

cổ dại khoảng 10.2% và côn trùng khoảng 12,2% (FAOSTAT, 2003; Agrios, 2005)

“Trong số các tác nhân gây bệnh cho cây trồng, nắm gây bệnh làm tổn thắt nông sản nhiều nhất, chiếm 42%, tiếp theo là vi khuẩn 27%, virus 18% và tuyến tring 13%

(Khan và Jairajpuri, 2010)

Để tiêu diệt bệnh cây trồng, bảo vệ mùa mang, con người đã sử dụng nhiều

loại hóa chất khác nhau, dẫn tối hậu quả: ö nhiễm môi trường (MT), mắt cân bằng

sinh thái, tỗn dư trong nông sản Sử dụng chất kháng sinh (CKS) và nắm sợi sinh kháng sinh trong soát bệnh cây trồng là một trong những giải pháp cho nền nông nghiệp an toàn và phát triển bền vững

Trong những năm gÌn đây, nhiều nhà khoa học trong nước cũng nhự trên thể

giới đặc biệt lưu ý đến việc tìm kiếm CKS từ nắm sợi RNM Bởi theo các nhà khoa 'Và thực tẻ, họ đã phát hiện nhiều hợp chất kháng khuẩn, kháng nắm, kháng virus

khẳng ung thư từ NS rừng ngấp mặn với hoại tính mạnh bơn rất nhiễu so với nắm

sợi từ đắt liễn, chứng tỏ đây là một hướng đi đúng đán

6 cửu về nắm sợi RNM sinh kháng sinh còn ít Đặc biệt, nắm sợi ở RNM Cần Giờ sinh kháng sinh vẫn còn nhiều vấn đẻ bỏ ngỏ

8 Mục tiêu: Tuyển chọn nghiên cứu và sử dụng có hiệu qua 1 chủng nắm sợi vào

~ Nghiên cứu các điều kiện môi trường (MT) thích hợp cho sinh trưởng và

sinh kháng sinh của chủng tuyển chọn

~ Khảo sắt các tính chất lí hóa của CKS tir ching nắm sợi nghiễn cứu

~ Bước đầu thử nghiệm khả năng ức chế nắm gây bệnh cây trồng của địch lên

men từ chủng nắm sợi nghiên cứu

.œs Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nắm sợi phản lập từ RNM Cần Giờ

Vai nét về nắm sợi

'NS là tắt cả các nắm không phải nắm men và cũng không sinh mũ nắm (thể

quả có kích thước lớn) như ở các nắm lớn Tuy nhiên ở tắt cả các giai đoạn chưa

xinh mũ nắm thì hệ sợi nắm của nắm lớn vẫn được gọi là NS và được nghiên cứu về:

nh hóa, di truyén như các NS khác [3]

các mặt sinh

“Thành phần hóa học của tế bào NS gdm carbon (40%), nito (7 - 8%), hydro (2

- 3%), côn lại là những nguyễn tổ lưu huỳnh, phospho, kali, mai, sắt, kẽm

mangan, đồng, canxi [6]

¡ nắm thường là một ống hình trụ đài không phân nhảnh hoặc phân nhảnh

có kích thước khác nhau Đường kính của các sợi nắm thưởng 3 - 5 ¡m, nhưng

cũng có thể tới 10 #m Các sợi nắm chỉ tăng trường ở ngọn, vừa dài ra vừa ngăn

vách (hoặc không ngăn vách), vừa tạo thành các nhánh Tốc độ tăng trưởng của sợi nắm thay đổi rắt lớn tùy theo loài từ 0.02 mum/giờ đến 6 mrm/giờ 6] Khuẩn lạc (KL) NS cỏ hình thải đặc trưng tùy loài Ở hầu hết các loài NS

hình thái KL thay đổi ít nhiễu tùy thuộc vào điều kiện nuối cấy, như thành phẩn

MT, nhiệt độ, pH, độ âm [6]

NS là những VSV hiểu khí, Hầu hết các NS sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25°C,

trừ những NS gây bệnh NS thích hợp với pH 5-6 [24]

"Nhiều nhà khoa học nhận định rằng NŠ là nguồn sinh các hợp chất có hoạt

tính sinh học có giá trị như enzyme, chất chống oxy hỏa, chất làm giảm cholesterol,

'CKS, chất điệt côn trùng Nhiễu loài NS được sử dụng trong sản xuất ở qui mô Aspergillus được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

* Chỉ Aspergilles

ä loài 4sp giaueus và loi nắm túi Eurotium hezbariorum phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô Fries (1832) chấp nhận chỉ nắm này của Meicheli Như

mang tén Aspergillus Meicheli ex Eries Trong số 18 loài thuộc chi Aspergillus 43

được phát hiện, có 8 loài cổ giai đoạn bảo tử túi, 10 loài không có hoặc chưa tìm thấy giai đoạn bảo tử túi [6]

Chi Aspergillus Meicheli ex Fries được đặc trưng bởi những đặc điểm sau:

Hệ sợi nắm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, miu nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hoặc sm khác nhau ở các vùng nhất định

của KI Bộ máy mang bào tử trằn phát triển một tể bảo có đường kính lớn hơn,

từ tế bảo chân, như là một nhánh của sợi nắm, gần thẳng góc với trục của tế bào chân và thường cỏ mặt ở trên mặt cơ chất Giá bảo tử trằn không có nhánh, không

có hoặc có rất L vách ngang có phần đỉnh phỉnh to ra thảnh bọng hình chủy, hình

clip, hinh nửa cầu hoặc hình cầu Bọng hữu thụ này (bong dinh giá) mang các thể

bình Các thể bình này hoặc song song và họp thành cụm ở phẩn đỉnh bọng hoặc

xếp thành hình tia sắt nhau trên toàn bộ b mặt bọng Thẻ bình hoặc chỉ cả một tằng thành chuỗi hướng gốc không phân nhánh Bảo tử trần không ngăn vách, thay đổi

về hình dạng và kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẫn, có gai, có nốt sằn) tủy từng loài Tắt cả các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của mot bong

các dạng hình cột, hình cầu hoặc hình tỉa tỏa tron (6), [42]

Nhiều loài thuộc chỉ 4spergiflus phân bổ rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên

trong các sản phẩm công nông nghiệp, ở nhiều vùng địa lí khác nhau trên thể giới lên men truyền thống để chế biển thực phẩm Hiện nay công nghệ sinh học sử dụng

cellulase), trong céng nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid CKS, nhu Asp fumigarus tạo thành fumagilin có tác dụng trên Entamoebae

tác dụng ức chế đổi với một số loài vi nim Asp candidus tạo thành cadidulin, 4s

‘oryzae, Asp famari và một số loài khác tạo thành acid kojic có tác dụng ức c với một số loài VK, Trong đó, chỉ có loài 4sp /iơmigarus đã thực sự được ding

trong công nghiệp để sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip Ở Việt Nam, Bùi

Xuân Đông và cộng sự (1978) nghiên cứu hệ vĩ nắm đổi kháng với các VK kháng

KS cho thấy có 14 loài thuộc chỉ 4spergifius có hoạt tính này [6|

Trong những năm gắn đây, hướng nghiên cửu mới vẻ NS của các nhà khoa

học trong nước cũng như trên thể giới là tìm ra các hoạt chất sinh học (trong đó có 'CKS) từ các loài NS chịu mặn, các loài NS có nguồn gốc từ biển, từ RNM

1.2 Nắm sợi RNM và khả năng sinh CKS

RNNM là một trong những MT sống giàu dinh dưỡng, là điều kiện sống lí tưởng cho VSV, trong đồ có NS (S0J Nắm bin là một nhóm nắm không đồng nhất

có khả năng sinh trưởng vả tạo bào tử trong MT nước biển hoặc cửa sông (Kohlmeyer, 1974) [39]

Nhiều nhà nghiên cứu đã cổ gắng đưa ra định nghĩa cho nắm biển (Kohlmeyer

vi Kohlmeyer, 1979; Jones, 1988) Bau tign, họ dựa vào nhu cầu sinh trưởng trong, nước biển hoặc trong một nằng độ muỗi NaCI nhất dinh (Meyers, 19

Jennings, 1964), Dinh nghĩa về nắm biển tốt nhất được đưa ra bởi Kohlmeyer và

Kohlmeyer (1970): “Nắm biển bắt buộc là những nắm chỉ có th sinh trưởng và sinh

biển" 29),

'Nắm biển cĩ khả năng sinh trường trên các cơ chat rat da dạng như gỗ, tảo, lá, cát và trong RNM [39] Trong số đĩ, NS sinh trưởng ở RNM thu hút được sự quan

tâm đặc biệt từ các nhà khoa học [39],

Cribb va Cribb (1955) tin du tién béo céo vé ndm biển phần lập từ thực vật RNM Kể từ đĩ, đã cĩ rắt nhiều nghiên cứu về nắm sợi RNM (Hyde va Lee, 1995; Jones và Alias, 1997) [50] Trong khoảng 2 (hấp kỹ qua kiến thức của con người về

NS rimg ngập mặn đã tăng lên nhanh chĩng (Jones, 2000) [39] Theo Jones và cộng

sự (2009) cĩ khoảng 530 loi nắm biển thuộc 321 chỉ, trong đĩ cĩ 424 lội nắm túi (251 chi), 94 lồi nắm sinh sản vơ tính (61 chi), 12 lồi nắm đảm (9 ch) Đa số các

lồi được mơ tả trong giai đoạn từ 1980 dén 1999, giai đoạn từ 2000 đến 2009 chỉ

mơ tả thêm $4 lồi Năm 2011, cĩ 549 lồi nắm biển với 19 lồi mới (thuộc l6 chỉ mới) so với năm 2009 [21], [40]

Các nghiên cứu cho thấy nắm biển cĩ hoạt tính KS kháng được phd rong các

VSV [21] Cuomo và cộng sự (1995) so sánh hoạt tính KS của 1500 chủng nắm

với 1450 mẫu phân lập tử đắt liền, kết luận rằng cĩ nhiều mẫu nắm phân lập từ biển cĩ hoạt tính KS hơn từ đất liên Newman và cộng sự (1998) nghiên

cu về CKS của các nắm biên sinh trưởng chậm, cho thấy hoạt tính KŠ phụ thuộc

trên 227 chủng NS phân lập từ biển (trong RNM và các đầm phá), kết quả cĩ 7

chủng cơ kh nang khing Vibrio parahaemolsticus, $5 ching khing S aureus {20}

(Strongman và cộng sự 1987), icrosphacropsin tir Microsphaeropsis sp (Holler cộng sự, 2000), mactanamide (Lorenz và cộng sự, 1998), 2 chất thuộc nhóm

nhóm lipodepsipeptide tác động lên quá trình tổng hợp thành tế bảo của nắm và có cộng sự (2010) báo cáo vẻ 36 chủng nắm biển phân lập tử bọt biển Psammocinia sp

ở Địa Trung Hải có hoạt tính khẳng nắm [21]

~ Chất chống ung thư: penochalasins A-C chống lại dòng tế bảo P3§8 leukemia (Numata va cing sy, 1996; Iwamoto va cng sự 1999) richdenones A-C

cộng sự, 1993, 1996), paeeiloxocin A chống lại dòng tế bio HepG2 (Wen vi cộng

'Vero (C50: 9.37, 5.42 g/ml) (Rukachaisirikul và cộng sự, 2010); Xylaria psiáii có hoại tính mạnh ở ICS0 4 ygiml va 1,5 ug/ml (Tarman và cộng sự, 201 1) [21]

© Vigt Nam, có một số công trình nghiên cứu về nắm sợi RNM:

~ "Tổng kết kết quả nghiên cứu về tính đa dang va vai trò của N§ phân lập từ

một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Binh” của Mai Thị Hằng (2002) [12]

~ "Khảo sắt hoạt ính đổi kháng và tiém năng ứng dụng của các chủng NS

phân lập từ một số khu RNM Nam Định và Thải Bình" của Mai Thị Hằng, Lê

‘Thanh Huyén (2002) [12]

học của nắm RNM Nam Định” của Mai Thị Hằng, Nguyễn Vĩnh Ha (2002) [12]

= Phan Thanh Phương (2007) nghiên cửu vẻ khả năng sinh KS của Asp foetidus, T viride, Asp twồingensis, P citrimam Tác giả đã khảo sát phổ tác động khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cây (ảnh hường của độ mặn, pH ban đầu

cấy) lên hoạt tính KS của các ching NS nay Tác giả đã

thử nghiệm tác dụng diệt tằm và diệt sâu tơ của các chủng NS nói trên [12]

trong MT và thời gian nụ

= Bai Thị Nha (2008), Phạm Thị Thủy Trinh (2008), Phạm Gia Cần (2009),

Phùng Vấn Phúc (2009), Khổng Thị Thu Ha (2010), Trương Mai Thanh Thanh

(2010) nghiên cứu về khả năng sinh KS của một số chủng NS sinh KS từ RNM Cần

Giữ

'Nhin chung các nghiên cứu về NS sinh KS ở RNM Cần Giờ cho thấy nắm sợi RNM có khả năng sinh nhiễu loại enzyme khác nhau, có thể sử dụng được nhiều

nguồn thức ăn carbon và nitơ khác nhau, thể hiện khả năng thích ứng rộng,

"Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh KS cua nắm sợi RNM Cần Giờ trong khoảng 25 - 35C pH thích hợp hơi acid, trong khoảng pI† 5 - 6.5 Chúng có này có khả năng chịu được độ mặn cao (10 - 20%) Đã phát hiện được nhiễu loài

NS có khả năng sinh KS ức chế VK, NS, nắm men [9] [12] [I4] [I5] [16],

: Những nghiên cửu về nắm sợi RNM sinh KS trên th giới và trong

y ce CKS tir nim sợi RNM có hoạt tính mạnh hơn nhiều so với CKS

từ các VSV có nguồn cốc từ đất liễn Điễu này chứng tỏ việc tìm kiểm các CKS

mới từ khu hệ V§V RNM là một hướng đi đúng đắn

tro

điều kiện nuôi cẤy bao gbm số lượng và chất lượng của các thành phẫn của MT cần phospho, vi lượng, vitamin và chất kích thích sinh trưởng) các yếu tổ vật lí và hóa

học (pH, thế oxy hỏa khử, nhiệt độ, độ thông khí

với nhau và từng yếu tổ riêng lẻ đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng của V§V

chất của VSV nói chung, đến sinh trường và nh KS của NŠ ni iệng Các

) Tat cả các yêu tổ này củng

và trong các chức năng sinh lí vả sinh hóa của chúng [36]

3 MT nuôi cấy: Sự lựa chọn MT thích hợp để nuôi cấy VSV rất quan trọng trong

chúng, Hau hét các V§V có thể phát

triển nhanh chóng trên MT tự nhiền vì chúng chứa tắt cả các thành phẫn chính cần

đều có thể được sử dụng để xác định các đặc điểm K§ của VSV, MT bản tổng hợp

phẩm thứ cấp khác có giá trị tử VSV [36]

việc làm sáng tỏ khả năng sản xuất KS

MT được chọn để lên men sản xuất K5 thy thuộc vào từng loại chủng sản xuất khác nhau Nhin chung một MT chất lượng tốt phải đắp ứng các yêu cầu sau: đảm, tiện cho việc tách chiết và tỉnh sạch CKS [10]

3 Nguồn đỉnh dưỡng carbon

'Nguôn dịnh dưỡng carbon khác nhau cổ ảnh hưởng khác nhau lên sự sinh trưởng cũng như sinh KS của NS [36]

Trong quá trình nuôi cấy P cirysogenum nêu chỉ sử đụng glucose làm nguồn đình đưỡng carbon, lượng penicillin tôi đa được tạo thành sau 50 giờ, và sản lượng

penicilin sẽ thấp hơn Nếu chi sir dung lactose sin lugng penicilin tăng lên, lượng

sinh trưởng của NS và sản lượng penicillin cao [2] (36)

* Nguồn dinh đưỡng nito

Nguồn dinh đưỡng nơ cỏ ảnh hưởng quan trọng đến sỉnh tổng hợp KS cia ANS, Người ta có thé sir dung mudi niưat hoặc mudi nitrit, madi amoni hữu cơ hoặc

muối amoni với kim loại, acid amin, protein vả các sản phẩm thủy phản của nó hóa (NO;, NO,) hoặc dạng khử (NH,`, NH;`)

Trong lên men penicillin, nguồn cung cẤp thức ăn nitơ có thể sử dụng bột đậu tương, bột hạt bông các loại dầu cảm Ngoài ra, cũng có thể cung cấp liên tục

(NH,);SO, nhưng duy trí ở nồng độ thấp, nếu dư thừa hiệu quả sinh tổng hợp penieillin sẽ giảm, nếu thiểu sẽ xảy ra hiện tượng tự phản của sợi nắm [2],

3 Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng

Cac hợp chất chứa các nguyên tổ khoáng như phospho, kali, canxi, magiẻ, lưu

huỳnh sắt, mangan, kẽm, đồng có ảnh hưởng rất lớn đến sự sống và hoạt tỉnh sinh học của VSV

Phospho là thành phần của những hợp chất quan trọng nhất trong tế bảo:

nucleoprotein, acid nucleic, polyphosphate va phospholipid Cac hợp chất chứa

phospho đóng vai trò quan trọng trong nhiễu phản dng hoa hoc, trong trao đổi

carbon va trong chuyển hóa năng lượng Sự khác biệt về hàm lượng phospho có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng của NS Khoảng 30 - $0% phospho được NS sử

dụng trong khoảng 24 giờ đầu tiên trong quá trình nuôi cấy [36]

Lưu huỳnh là thành phần của protein và một số enzyme vi coenzyme A

'Người ta thường sử dụng các muối sulphate thường làm nguồn lưu huỳnh cho MT Lưu huỳnh lả thành phẩn của một sổ CKS từ NS như penicillin, cephalosporin Dạng lưu huỳnh thích hợp nhất cho sinh tng bgp penicillin la natri thiosulphate

sợi nắm P cirysogenum và sản lượng penicilin [36]

Kali hoạt động như nhãn tổ kích hoạt một số enzyme (amylase, Ïnvertase) nó kích thích sự hydrate hóa trong tế bảo chất Thiếu hụt kali làm tăng quá trình đồng

hóa acid oxalic ở 4p øgez Hảm lượng kali trong MT rắt thắp sẽ làm giảm sự tiêu thụ đường của loài nắm này [36]

Canxi có ảnh hưởng quan ưọng lên sự chuyển hóa nơ, carbohydrate,

phospho lon Ca” có vai trò điều chỉnh pH trong MT Canxi hoạt hóa một số

enzyme như lipase, adenosine triphosphatase, Canxi côn là cofactor cũa œ-

amylase Tuy nhiên, nó có thể ức chế một số enzyme hoạt hóa bởi magiẻ [36] Sắt là thành phẩn của các enzyme oxy hóa-khử vả còn lả thành phần của một

số CKS [36]

Đồng cũng là một nguyên tố đóng vai wd cất quan trọng trong trao đổi chất của V$V Người ta đã chứng minh ring đồng và sắt hoạt động trái ngược nhau

trong quá trình sinh tổng hợp CKS Sắt cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp

penicillin Ngược lại khi thêm CuSO, vào MT sẽ ức chế sự tổng hợp CKS

penicilli

* Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, hoạt động của các hệ thống vận

và những chức năng sinh lí, sinh hóa quan trọng của tế bio, NS chi sinh

sản xuất penicilin, ở nhiệt độ 30°C, sự phân hủy penicillin diễn ra mạnh mẽ Do đó,

người ta thường nhân giống ở nhiệt độ 30°C, sang giai đoạn lên men người ta lại áp

khoảng 25 ~ 27°C Ché độ thứ hai, giai đoạn lên men ban đầu tiền hành & 30°C cho 28°C Trong sản xuit griseofulvin, ngudi tatiển hành lên men 6 25°C [2] 10]

pH môi trường đóng vai tro rit quan trọng đối với sinh trưởng đặc điểm trao đổi chất, và chính vì vậy đóng vai trò rit quan trong trong quả trình sinh tổng hợp

trực tiếp bằng cách làm thay đổi khả năng phân li của các chất trong MT [36] Hầu hết NS có thể sinh trường ở MT có pH từ 4.5 ~ 5 Khi nắm sinh trưởng,

pH của MT thay đổi phụ thuộc vào thành phần các chất có rong MT và đặc điểm

sinh li cla NS Khi MT bị acid hóa hoặc kiểm hỏa có thể ức chế sinh trưởng của

'VSV và làm đừng quá trình tổng hợp CKS Do đó, MT nuôi cấy VSV cần được [36} Tay timg chủng sản xuất KS mà giá tị pH thích hợp sẽ khác nhau pH thích griseofulvin la 6.8 ~ 7.2 [2] [10]

* Các phương pháp nuôi cấy NS

“Trong điều kiện hiện nay, ở mức độ sản xuất công nghiệp, phường pháp nuôi chy các chăng sinh KS cũng nhữ cđš chất cố hoạt tính sinh học khác thưởng được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy chỉm [10]

- Lên men (heo mế: Cá giá th phát biển của VSV tiễn Hà trong một dỗ lên men, sau khi giải phóng địch lên men của mẻ trước, rửa sạch cho MT lên men mới, sau khi thanh trùng lạ tiếp tục lên men mẻ mới [10]

tích dich lên men, sau một thời gian lên men nhất định bỗ sung thêm lượng MT mới cho đủ 100% thể tích MT lên men [I0]

~ Lên men nhiễu bình lên men: VSV được phát triển trong các bình lên men

liên tiếp Dịch nuôi cấy của một giai đoạn phát triển nhất định của VSV sẽ được

chuyển từ nôi lên men thứ nhất sang nồi thứ hai, sau đó từ nỗi thứ hai sang nỗi thứ: mới Với cách nuôi cấy VSV này có thể sử dụng dung tích nổi lên men hợp lý [10]

~ Lên men liên tục; VSV phát triển tong điều kiện dòng chấy của MT dinh đường và dich nuôi cấy liên tục vào và ra khỏi nỗi lên men, cho phép luôn giữ sự

sinh trưởng của VSV ở một giai đoạn nhất định - giai đoạn VSV sinh tổng hợp CKS

bằng cách các tế bảo của chủng sản xuất được cổ định trên các chất mang khác nhau trình lên men, tiết kiệm được nguyên liệu sản xuất và không đôi hỏi dung tích nỗi lên men lớn [I0]

(Windaus, My), Ta dm (Sanyo, Nhậ), Máy dập mẫu (Seward, Anh), Máy quang

phd (Amersham Biosciences, Thuy Dién)

MTI, (MT khảo sit khá năng sinh tông hợp CKS) glueose 30 g cao nằm men 2 peptone S g, MgSO4.7H120 0,5 ạ, KHSPO4 Ì ạ, nước cắt 1 it [46) 48) MI2 (MF khsio sit kha nang sinh tong hợp CKS) cao malt 2.1 g.glyeerol 4 peptone | g nue et | lit (45)

MT (MT khảo st khá năng sinh tổng CKS) Cao nằm men 9 g glucose 20 g KH2POM 1 g MgSO4.71120 0.5 g, peptone 1.8 g nue et | it [45} MT4, (MT khảo sắt khả nâng sinh tổng hợp CKS) NaNO3 3 g KCI 05 g MgSO47H2O 0.5 FeSO4 7H2O v

nước cất | líc [38]

MIS, Mỗi trường C/apek-dox (MT nuối cấy nằm sợi RNM): NaNOB 3.5 K2HPO4 1.5 g MgSO4.7H20 0.5 g KCI 0.5 g FeSO4.7H20 0.01 glucose 20 g agar 20 p.m bign lit

MT6, (MT kisio Sit khit ning sinh tng hop CRS): glucose 30 ¢ hot Ju nome

25 g cao nim men OS g KH2PO4 1 g MgSO47H2O Ig NaCl OS g

€a€ 12.2120 045 g, FeC13.2120 2 mg, 2080471120 2 mg, nude elt it [34

i RNM

HPOI lực cao nằm men Š g suerose 30

MT? Mỗi tring Glucose Yeast Extract Agar (MT nuôi cấy nấm YEA): cao mim men 4 g glucose 20 e agar 20 g nước biên 1 lit MT8, Mỗi trường Mai: Exraet Agar (MT nuổi cấy và giữ giỏng nằm sợi RNM MEA): a0 malt 20 g, peplone 1 g glucose 20 guar 20 g nude bién | it

MT, Moi trường MPA (MT nuối cấy VK kiểm định): cao thịt S g, peptone 5 NaC1S g agar 20 g, nước cất LúL

MTI0 Mỗi trường khoai tây (MT nuồi cấy N

g-3.2.1 Phương pháp xác định hoạt tỉnh KS

œ Nguyên tắc: CKS do các chủng NS sinh ra sẽ ức chế hoặc tiểu diệt các VSV

kiểm định, tạo thành vòng võ khuẩn Hoạt tính KS được sơ bộ xác định bằng kích

thước vòng vô khuẩn D-d (cm) Trong đó: D là đường kính vòng võ khuẩn (cm), d

là đường kinh khối thạch (cm)

Dũng kim mỗi mác lẫy các khối thạch chữa chủng nằm sợi RNM nghiền cứu đạt lên các đĩa thạch có V§V kiếm định

Đặt mẫu tong tủ lạnh tử 4 - giờ, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ (đổi

với VK), 4 - 72 giờ (đổi với nắm men và NS) Xác định hoạt tính KS bảng cách do

kích thước vòng vô khuẩn D-d (cm)

3.2.1.3 Phương pháp đục lỗ

‘Cy NS trong ống thạch nghiêng sau 3 ngày cho 5 ml nước cắt vỏ trùng vào ông

giống đùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử NS trong ống giống, sau đó lăn nhẹ

cho vào bình tam giác chứa SO ml MT6 dich thé Ù ở nhiệt độ phòng, sau 3 - 5 ngày, lọc, thụ dịch lên men

nút chai khoan một lỗ giữa đĩa VSV kiểm định Hút 0,1 ml địch lên men của chủng nắm sợi RNM nghiên cửu cho vào lỗ khoan

Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ, ù ở nhiệt độ phòng 24 giờ (đổi với VK), 48 -

72 giờ (đối với nằm men và NS), sau đó xác định hoạt tính KS bằng cách đo đường, kinh vông vô khuẩn D-d (em)

3.3.3 Phương pháp quan sắt hình thái và định danh nắm sợi 3.2.3.1 Quan sắt đại thể

LCấy NS vào ống thạch nghiềng, sou 3 ngày cho 5 ml nước cất về tring vio ống

giống dùng que cấy vô trùng gạt đều bảo tử NS trong ông giống, sau đó lăn nhẹ

trên tay để tạo thành địch huyền phủ Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vio dich đặc điểm sau:

Đặt một miếng thạch mỏng MTS có kích thước 0,5 x 0,5 em lên một miếng lam

võ trìng đặt ở giữa đĩa Peti cỏ một miếng giấy lọc được lâm ẩm bằng nước cắt vô trùng

‘Sau d6 cay NS vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamen lên, đậy nắp đĩa Petri

lại và ö 2 ngày LAy lam ra, nbs lactophenol hoặc xanh metbhylen Loffle vào git + _ Hình đáng sợi nắm: màu sắc, có vách ngắn hay không có vách ngăn, có phân nhánh hay không

+ Đặc điểm cơ quan sinh bào tử,

2.2.3.3 Định dank bằng sinh học phân tử

+ Thu nhận DNA

~ Phá mảng tế bảo và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải

phỏng các DNA, đỏng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

~ Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp

phenol và chiorofeem (hỗn hợp này có tác đụợg làn biển tỉnh proicin) để tách riêng pha cổ chứa DNA

~ Lâm kết tủa các acid nucleic bing ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được

các acid nucleic dang cô đặc, dễ bảo quản

* Chạy PCR (polymerase chain reaction)

Nguyên huyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cập mỗi chuyên biệt Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chủ kì rỗi tiếp nhau, mỗi chu ki gdm 3 bước:

~ Bước ! (biển tính): trong một dung địch đầy đủ thành phẳn cho sự sao ck

DNA duge biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phần tử thường khoảng là 94°C- 98°C trong vòng 30 giấy - 1 phiit

~ Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mỗi bit cặp với khuôn Nhiệt độ

nảy dao động khoảng từ 40" - 70°C và kéo dài trong vòng 30 giấy - phút,

~ Bước 3 (lổng hợp) nhiệt độ được tăng lên đến 72°C dé DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn nảy phụ thuộc vào độ dài của rnh tự DNA, thường kéo đài từ 30 gi i

* Giải tình tự DNA

"Nguyễn tắc hóa học (phương php Maxam va Gilbert: diza vào các phản ứng

thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có

Xích thước chênh lệch nhau một nucleotide,

"Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bỗ sung cho trình tự cần xác định nhữ DNA polymerase

đến út

Với việc sử dụng thêm các đideoxynueleotide cùng với các deoxynucleotide thong

kích thước chênh nhau một nucleotide

LỞ cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phản tách qua điện

di trên gel polyacrylamid Nếu sử đụng đánh dầu bằng đông vị phóng xạ thì kết quả

trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phỏng xạ tự ghỉ từ bản điện di Sau khi giải trình tự gen 288 FRNA, so sinh với ngân hàng gen NCBI để định cdanh đến loài chủng NS nghiên cứu

1.1.4 Phương pháp xác định sinh khối NS

Sinh khối NS được xác định dựa vào trọng lượng khỏ tuyệt đối Lọc địch lên

2.25.1 Lyra chon MT nudi céy thich hop

(c4 Nguyên tắc: Thành phẫn MT có ảnh hướng đến sự sinh trưởng và sinh KS ci

NS

c% Tiến hành: Nudi ching NS nghién edu trong các binh tam gide chita $0 ml cde MT1, MT2, MT3, MT4, MTS, MT6, MT7, MTR Sau 6 ngày, thụ địch lên men Kiểm tra sinh trưởng cia NS bing cách căn sinh khối khô Kiểm tra hoạt tính

'KS bằng phương pháp đục lỗ

2.2.5.2 Ảnh hưởng của độ mặm

.œ# Nguyên tắc: Độ mặn của MT có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng va sinh KS

của các chủng NS

.œ# Tiến hành: Nuôi các chủng N§ nghiên cửu trong các bình tam giác chứa 50 ml

MT6 bổ sung NaCI véi nỗng độ 0%; 0.5%; 1%; l,5%; 2%: 2,5%; 396; 3,5%; 4%; 4.5%; 5%; $,5%; 6% Sau 3 - 5 ngày thu dịch lên men

KS bảng phương pháp đục lỗ

3.3.5.3 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon

Nuôi NŠ trong các bình tam giác chứa 50 mÏ MT6 thay đường glucose bằng các đường: fructose, sucrose (saccharose), lactose, galactose, maltose, tỉnh bột, rỉ đường Sau 3 - S ngiy, thu djeh Ién men,

Kiểm tra sinh trưởng của NS bằng cách cân sinh khối khô Kiểm tra hoạt tính

KS bing phương pháp đục lỗ

2.2.5.4 Anh hưởng của nguần dinh dưỡng nite

Nuôi NS trong các bình tam giác chứa 50 ml MT6 thay đổi nguồn nitơ lần lượt

bằng cao thit, cao nắm men, bột đậu trong, peptone, NH,CI, NH4NOs, NaNO›, (0NH,);SO,, Sau 6 ngây, thụ dịch lên men

Kiểm tra sinh trường của NS bằng cách cản sinh khối khô Kiểm tra hoạt tính

KS bing phương pháp đục lỗ

3.3.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

"Nuôi NS trong các bình tam giác chứa S0 mÌ MT6 Ủ ở các nhiệt độ 20” 30°C, 35°C, 40°C, Sau 6 ngây, thủ địch lên men

Kiểm tra sinh trưởng của NS bằng cách cản sinh khối khô Kiểm tra hoạt tính

KS bằng phương pháp đục lỗ

2.25.6 Anh hung của pH ban đầu

"Nuôi NS trong các bình tam giác chứa 50 ml MT6 Chỉnh pH mỗi trường ở mức 4.0; 4,5: 5,0; 5.5; 6.0; 6.5: 7.0; 7.5

Kiểm tra sinh trưởng của NS bằng cách cân sinh khối khô Kiểm tra hoạt tính

KS bing phương pháp đục lỗ sau khi đã điều chỉnh pH địch lên men vẻ 7 -3.2.5.7 Xác định động học quả trình lên mem

S trong bình tam giác chứa 50 mÌ MT6 với các điểu kiện nuôi cấy thích

hợp đã xác định được Sau mỗi 12 giờ kiểm tra pH môi trường, thu dịch lên men đẻ xác định hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ, kiểm tra sinh trưởng của NS bing cách cân sinh khối khô

Nuôi

Nuôi NS trong các bình taim giác chứa 50 mÌ MT6 với các điều kiện nuôi cấy, thích hợp đã được xác định Sau 108 giờ lọc, tách riêng sinh khối, thu dịch lên men Sau đó, dịch lên men được lọc qua màng lọc Miniswt vô trùng để loại bảo tử, 2.261 Ảnh hưởng cáo nhiệt độ

Thi nghiệm: dịch lên men được xử lí nhiệt ở 40°C, 60°C, 80°C, 100°C trong I0

phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút 60 phút Kiểm tra hoạt tỉnh KS bing phương pháp đục lỗ

Đối chứng: dịch lên men để ở nhiệt độ phòng (30°C), kiém tra hoạt tính KS bằng

phương pháp đục lỗ

2.2.6.2 Anh hung của pH,

“Thí nghiệm: dịch lên men được điều chinh pH ở mức 4,0; 4,5; 5.0; 5,5; 6.0; 6,5;

340: 7.5 trong thai gian | gid Sau đó chỉnh vé pli = 7 Kiểm tra hogt tinh KS bằng phương pháp đục lỗ,

Đối chứng: dịch lên men không qua xử lí chỉnh về pH = 7 Kiểm tra hoạt tính K$

bằng phương pháp đục lỗ

2.26.3 Anh Iucding của thời gian

Dịch lên men được bảo quản ở 4°C Sau thời gian 1 tuẫn, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuản, kiểm tra hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ

Pha loãng CKS trong nước cất võ trùng thành các nông độ 100; 250; 500; 750; 1000; 1250 pg/ml

Chuẩn bị 9 mÌ MTI0, hấp vô tring 121°C trong 30 phút, để nguội đến 45- 50°C Ding pipet hat 1 ml CKS ở các nồng độ trên cho vào các ống nghiệm chứa vào với mật độ 10” tế bảo/ml Rót MT có chứa CKS và VK ra các dia Petri vo

trùng Ù trong tủ lạnh 4°C tử 4 - 8 gid, sau đó để ở nhiệt độ phòng 24 giờ Quan sát

'VK mọc ở các nông độ KS khác nhau Nông độ ức chế ổi thiểu được xác định lá

nồng độ CKS thắp nhất mà ở đó hoàn toản không có VK mọc

lên men

Nuôi cấy nắm gây bệnh cây trồng trong các ống thạch nghiêng chứa MTI2

‘Sau 3-5 ngày, cho Š mÌ nước cắt võ trùng vào mỗi ông giống, dùng que cấy vô trùng tam giác chứa MTI2 lông Bổ sung dịch lên men của chủng NS nghiễn cứu vào

theo Ú lệ 0%, 1%, 10%, 20% (trên tổng thể tích 50 ml) Theo dõi sự sinh trưởng của

nắm gây bệnh sau khoảng thời gian 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày bằng cách cân sinh khối khô

1.2.9 Phương pháp thử khả năng kháng nấm gây bện!

Lô đắt sạch: gồm 10 chậu, mỗi chậu trồng 3 cây bắp

Lô đổi chứng: gồm 10 chậu Tưới vào mỗi chậu Š ml dung dịch chita 10°

CFU/mL, bao tit nim Phytophthora palmivora, Sau 2 ngay, trồng vào mỗi chậu 3

cây bắp

Lô thí nghiệm: gồm 10 chậu Tưới vào mỗi chậu 5 ml dung dich chita 10° FU/ml bào tử nim Phytophthora palmivora Sau 2 ngày, tring vào mỗi chậu 3

cây bắp O nghiệm thức 1, tưới vào mỗi chậu 100 ml dung dịch lên men của chủng

iim Asp terreus & cée ning độ 10% Ở nghiệm thức 2, tưới vào mỗi chậu 100 mĩ

dung dich lên men của chủng nắm 4s 2erreus ở các nồng độ 20% Ở nghiệm thức

1, tưới vào mỗi chậu 100 mL dung dich chira 10" bảo tử chủng nim Asp terreus Sau 2 tun trdng bép, dém số lượng cây sống, chất

ty mo in vivo

BP

lập và tuyên chọn chúng NS có hoạt tính đối kháng mạnh Chúng tối ú nh phản lập các chúng NŠ từ các mẫu dắt thủ từ RNM Cần Giữ Kết quả thú được 5Ñ kiểu khuẩn lạc kháe nhau (lan \ lá chủng)

131L) bo po

bu Hình 3.1 Khuẩn lạc mot sé chung NS pl

lập được từ RNM Cần Giờ Chúng tôi tuyển chọn chung NS cỏ hoạt tỉnh đối kháng mạnh bằng cảnh thư hoạt tính đổi khủng của các chủng NS này với VK kiếm dinh fa 8 subis vi colí Kết quả được trình bày trong bảng 3Ì

Đăng 31 Hoạt tính đối kháng của các chúng NS phân lập tir RNM Cin Gir

oat tnt di khang Hat tinh da hing Kihiệu

+ 1/58 chủng đối kháng với cả B subtilis va E coli 19/58 chiing không có hoạt tính đổi kháng với cả B subtilis va E.coli

+ 3/58 chủng có hoạt tính đổi kháng với £ coli trong đó 1/58 chủng đổi

kháng ở mức trung bình, 2/58 chủng đối kháng ở mức yếu

* 37/58 chủng có hoạt tính đối kháng với B subtilis 1/58 chủng đối kháng với

B subtilis 6 mite rit mạnh 9/58 chủng đổi kháng với B subtilis & mite trung bình

26/58 chiing khang B subtilis ở mức yéu

A Czapek «25°C, quan sắt hình dạng mâu sắc,

hàn quan sat hinh dang, mau sắc sợi nắm,

Mình 3.3 Hoạt tính đối kháng với £:

coli của chủng ĐI

sơi DI bằng cách nuôi chúng DỊ mat KL

sắc tổ tiết vào

fae điểm cơ quan sinh sản,

Bang 3.2 Dặc điểm phân loại chủng nắm sợi DỊ

Giá báo tư tein không phân nhanh, có

phan dinh phinb ra thành bọng hình nua

Khối bảo tư trần đỉnh bên ngoài thank

dang hinh ta toa tron

Đặc diém phan loai chi Aypergillas The Bà Xuân Dồng (2080) A smson (1996)

= KL thimg phát trắng, vàng, vàng

- Qỗ hảo đề lần Không cỏ nhánh Không có hoặc ít có viet naa ngưng

hình

lắc dụng Hình cử, họ di hoệt inh tua tea tron

ĐI (x40)

Minh 3.8 Thể bình chủng ĐI (x400) Hình 3.9 Bảo tư chủng DI (x400) Chúng tôi gin ching “faggfføs DỊ đến công ty xét nghiệm Nam Khoa để định danh bằng cách giai trình tự gen 28S và so sảnh với ngắn hàng gen KẺI quả trình tự gen 288 rRNA cua chung

spergatlus ĐI như sau:

TTCGGCCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGG GGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGG ACGCTGGCATAATGGTTGTAAACGACCCGTCTTGAAAC

So sảnh với ngân hảng gen NCBI trình ty gen 28S rRNA cia ching

-4spergilius ĐI cổ độ tương đồng 100% với loài Aspergillus terreus Asp terreus Ws losi NS phổ biển trong đất và sinh nhiều hợp chất thử cắp có

tr [43] Theo Timothy G, Schimmal, Allen D Coffman, va Sarah J Parsons (1998) một số sin phim tra d&i chit 6 gid tri tr Asp terreus li aspullvinone, acid

asterric, asterriquinone, butyrolactone 1, citrinin, emodin, geodin, itaconate, lovastatin, questrin, sulochrin, va acid terrecyclic,

Masahira Nakagawa, Arika Hirota va Helichi Sakai (1982) nghiên cứu về

CKS cia ching Asp terreus phin lip tir mẫu đất lấy từ trại chăn nuôi của Trường

tông và có khả năng kháng khỏi u

3⁄3, Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối khang cia chiing Asp terreus DI

Che điu kiện nuôi cấy như thành phdn MT, ngubn carbon, nguta nita, pH, nhiệt

độ nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh KS

'NS, việc nghiên cứu tim ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS

là điều cẳn thiết

3.3.1 Anh hucéng của MT nuôi cấy

"Để tiến hành khảo sit ảnh hưởng của MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng cña chủng Asp terreus ĐI, chúng tôi nuôi chủng Asp terreus ĐI ngày thử hoạt tính đối kháng với 8 suðrii£ bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bảy trong hình 3.10

MT MI2 MI3 MI4 MIS MI6 M7 MTB

thiểu đồ anh hương của MT nuôi cấy lên hoạt tỉnh đổi kháng của

chung Asp terreus DI

Kửt quả cho thấy chúng đạp zreis ĐI có hoạt tính đổi kháng với 8 sưởi»

Hình 3.1

mạnh nhất khi nuôi cấy trong MT6 G MT4, ching Asp, terreus DI sinh trang

mạnh nhất nhưng lạt co hoạt tính đổi kháng với B subuliy yeu nhất (hình 3.9) Điều

nay cho thiy khá năng sinh trương và sinh KS cua chung sp terreus DI i khong,

đồng nhất với nhau So với ede MT khae, MI 64 thém các loại khoảng lã canxi Ugalde (1984), Clapham (1995), Rudd vat Franklin-Tong (1999), Sanders và cộng hông truyền tín hiệu của sinh vật nhẫn chuin Theo BD Shau HC Hoch (2007),

tim! có vài hich thich nấy mẫm củá bảo tư NS Theo N.§ Fgorox (1985) calcium

0 vải tổ diễu chính pH mỗi trường can cò ảnh hương quan trọng đến định

dưỡng nity, carbohydrate, vi dink dudmg phospho cua VSV Theo NS Egorov khoảng này có túc dụng tích cực đến quá trình sinh tông hop CKS cua chung Asp terreus DL

Heveht Sakat (1982) sự dụng khi nghiên edu vé CKS cua chung Asp, terreus phiin lắp từ mẫu đất lấy từ trại chân nuôi của Trưởng Đại học Osaka

1.1.2 Anh hướng của nẵng độ muối

(Chang sp terreus DI được phần lặp từ đất RNM, đỗ mặn của MĨ là một

trong những yêu tổ anh hương quan trọng đến khả năng sinh trương vả hoạt tỉnh đổi kháng Do đỏ, chúng tôi đã tiễn hành khao sát anh hong cua ning dé mudi NaCl

trong MT bằng cách nuôi chiing Asp terreus ĐI trên MT6 thay đổi nông độ muối

tử Ô 6%, sau 6 ngày khảo sắt hoạt tính đối khang vii B subwlis bằng phương pháp dục lỗ, kết qua được trình bày trong hình 3.12

Hình 3.13 Ảnh hướng của nồng độ NaCl

kháng của chung Asp terreus DY Kết qua cho thấy chủng yp terreus ĐI có hoại tính đối kháng mạnh trong khoảng nồng độ muối NaC từ 0 - 1% Khi dỗng độ muỗi cao hơn 1%, hoại (ính đội còn hoạt tính đổi kháng Diễu này có thể do hoạt tính của CKS bị kim hầm bởi

trong quá trình tông hợp CKS của chung Asp terreus BL

Trong khi kha năng sinh trường của chủng này tăng dẫn trong khoảng

Jing NS này vẫn cô khả năng

nông độ NaCI tir 0 - S.S%, và đến đỏ mặn MT 6%

sinh trường, vành trường mạnh hơn so với MT không cô muỗi Điễu này chứng tô

chang sp terreus D1 ta chung chịu mặn Theo định nghĩa cua Kohlmeyer va

Kohlmeyer (1979), chung sp terreus DI la chung nấm biển túy năng snh trường và sinh báo từ trên ca MT 60 và không cò muỗi Điều này cho

th

trường RNM và thích nghĩ với điều kiến sinh thái ở đây,

Đổ mặn trung bình của RNM Cin Gig khoang 1.8 ~ 2.0% Chúng Asp, terreus ching Asp, terreus DI 66 thé có nguồn gốc tử đất liễn du nhập vào môi

ĐI có khá năng sinh trường trong giới hạn độ mẫn rộng 0 - 66, vũ có thể sinh

trương ø đồ mặn cao hơn nhiều so với đồ mặn trung bình cua RNM Cần Giờ Tuy

phản lập từ RNM Cần Giớ

Khuu Phương Yến Anh (2007) nghiên cửu trên 4 chung NS yp guamensis

Võ Thị Bích Vấn (2010) nghiền cứu về khả năng sinh protease cua chung Asp,

orsde Kết quá cho thấy chúng NS này có khả năng sinh trường trên MT có độ mặn