Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long

Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS Nguyễn Đắc Khoa

Người hướng dẫn phụ: TS Nguyễn Đức Độ

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường

Họp tại: phòng bảo vệ luận án tiến sĩ (phòng họp 3, lầu 2), khu II, nhà điều hành, Trường Đại học Cần Thơ

Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …

Phản biện 1: ……… Phản biện 2: ………

Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Truong Van Xa, Tran Kim Thoa, Thai Tran Anh Thu, Nguyen Dac

Khoa (2023) Effects of seed soaking and foliar spraying of Kalanchoe

pinnata aqueous leaf extracts against rice bacterial leaf blight CTU Journal of Innovation and Sustainable Development, 15(3), 12-22 DOI:

10.22144/ctujoisd.2023.047

2 Truong Van Xa, Tran Kim Thoa, Nguyen Duc Do, Nguyen Dac

Khoa (2023) Seed soaking using methanol Kalanchoe pinnata leaf

extracts induces rice resistance against bacterial leaf blight

https://doi.org/10.3390/ijpb14040084

3 Truong Van Xa, Tran Kim Thoa, Nguyen Dac Khoa (2024)

Aqueous Chromolaena odorata leaf extracts induce rice resistance against bacterial leaf blight International Journal of Phytopathology

Accept 31.08.2024

4 Trương Văn Xạ, Nguyễn Đức Độ và Nguyễn Đắc Khoa 2024

Ngâm hạt lúa với cao phân đoạn lá sống đời (Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers.) để kích kháng bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv oryzae)

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số đặc biệt Bệnh hại

Thực vật (tháng 7/2024): 61-69

5 Nguyễn Thị Thúy Ngân, Trương Văn Xạ và Nguyễn Đắc Khoa

2024 Khảo sát cơ chế kích kháng bệnh bạc lá khi phun lên lá lúa dịch

trích lá cây hoa ngũ sắc Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

số đặc biệt Bệnh hại Thực vật (tháng 7/2024): 44-51

6 Phạm Thiết Trình, Lưu Minh Long, Trương Văn Xạ và Nguyễn Đắc

Khoa 2024 Khả năng kích kháng bệnh bạc lá khi phun lên lá lúa cao

chiết lá sống đời ly trích bằng dung môi nước Tạp chí Nông nghiệp và

Phát triển Nông thôn, số đặc biệt Bệnh hại Thực vật (tháng 7/2024):

52-60

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1 1 Đặt vấn đề

Bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Gram âm Xanthomonas oryzae pv

oryzae (Xoo) gây ra (Swings et al., 1990) Ở Việt Nam, bệnh phát triển

mạnh trên các vụ lúa hè thu, thu đông và có thể gây thiệt hại đến 65% năng suất lúa; ngoài ra bệnh còn gây thiệt hại nghiêm trọng đến chất lượng lúa

từ đó ảnh hưởng lớn đến ngành xuất khẩu lúa gạo chất lượng cao (Dinh et

al., 2008; Nguyễn Đắc Khoa, 2018; Son, 1993)

Các biện pháp phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa như sử dụng các loại thuốc hoá học, giống mang gen kháng, vi sinh vật đối kháng Một chiến lược khác để phòng trừ bệnh BB là kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn

(kích kháng) (Kloepper et al., 1992) Kích kháng là cách để quản lý bệnh

hại trên cây trồng một cách bền vững và thân thiện với môi trường (Khoa

et al., 2011, 2017; Lyon et al., 2007; Nguyễn Đắc Khoa, 2018; Pieterse et al., 2014; Walters et al., 2005) Đối với phương pháp phòng trị bệnh này

thì tác nhân kích kháng không tác động trực tiếp lên mầm bệnh mà chúng tạo ra các tín hiệu giúp kích thích cơ chế tự vệ có sẵn trong cây; trong đó

có sự tăng tích luỹ các hợp chất phenol, phytoalexin và protein liên quan đến quá trình phát sinh bệnh (PR-protein) như enzyme peroxidase (PO), catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonia lyase (PAL) nhằm ngăn chặn sự phát triển và lang rộng của mầm bệnh (Van

Loon et al., 1998; Vidhyasekaran et al., 1997)

Các tác nhân kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa được sử dụng như hóa chất, vi sinh vật và dịch trích thực vật Các tác nhân kích kháng bệnh cháy

bìa lá lúa đã được báo cáo như salicylic acid (Mohan Babu et al., 2003),

vitamin B1 (Ahn et al., 2005), vi khuẩn vùng rễ (Chithrashree et al., 2011),

Pseudomonas fluorescens (Lingaiah et al., 2013), dịch trích methanol Cà

độc dược (Datura metel) (Kagale et al., 2004), dịch trích nước và methanol Cang mai (Adhatoda vasica) (Govindappa et al., 2011), dịch trích lá cây Ngũ trảo (Vitex negundo) (Nisha et al., 2012), dịch trích nước Sống đời (Kalanchoe pinnata) (Khoa et al., 2017; Nguyễn Thị Thu Hương và ctv.,

2018) Các nghiên cứu đều ghi nhận, khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa của các tác nhân kích kháng là do hoạt tính của POX và CAT tăng lên

sau khi được xử lý dịch trích, đặc biệt là với sự hiện diện của Xoo, trong

khi hoạt tính PPO và PAL tăng ở giai đoạn đầu sau khi chủng mầm bệnh

(Kagale et al., 2004; Govindappa et al., 2011; Nisha et al., 2012; Khoa et

al., 2017) Các hợp chất hoạt tính sinh học có các đặc tính và độ phân cực

khác nhau nên hàm lượng và khả năng chống oxy hóa của chúng thay đổi khi quá trình chiết xuất được thực hiện bằng các dung môi khác nhau

(Jaiswal et al., 2012) Do đó các dung môi và/hoặc phương pháp chiết khác

nhau có thể chiết xuất được các hợp chất có khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa

Luận án này khảo sát khả năng giúp giảm bệnh và cơ chế kích kháng của các hợp chất có trong dịch trích một số loài thực vật bản địa tại Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), từ đó hình thành biện pháp phòng trị bệnh thân thiện với môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nâng cao năng suất

và chất lượng gạo thương phẩm

(1) Tuyển chọn được các dịch trích thực vật tại ĐBSCL có khả năng giúp

giảm bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xoo gây ra;

(2) Chứng minh được khả năng giúp giảm bệnh của dịch trích thực vật

được tuyển chọn có liên quan đến cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa;

(3) Khảo sát được khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa của nhóm hợp

chất có trong dịch trích thực vật được tuyển chọn;

(4) Xác định nhóm hợp chất có khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tuyển chọn dịch trích thực vật có khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa

Nội dung 2: Khảo sát khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa của nhóm hợp chất có trong lá Sống đời

Nội dung 3: Xác định các hợp chất trong Sống đời có khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa

1.4 Ý nghĩa của nghiên cứu

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án góp phần cung cấp dẫn liệu khoa học đầy đủ và có hệ thống về kích kháng bệnh trên cây lúa bằng tác nhân sinh học gồm: tuyển chọn, khảo sát khả năng giảm bệnh, chứng minh cơ chế và xác định hợp chất có khả năng kích kháng

Kết quả của luận án xác định được khả năng và cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích nước cỏ cứt heo, Cỏ hôi và Sống đời Điều chế và xác định các hợp chất trong lá Sống đời có khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng các loài thực vật có chứa các hợp chất tự nhiên giúp kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa là giải pháp có hiệu quả kinh tế và thân thiện với môi trường, không độc hại cho người, dễ sử dụng, có thể tận dụng nguồn nguyên liệu tại chỗ nên giúp giảm chi phí sản xuất;

Bên cạnh đó, biện pháp phòng trị bệnh bằng các loại dịch dịch trích thực vật hoàn toàn phù hợp với định hướng xây dựng nông nghiệp hữu cơ của Đảng và Nhà nước, nhằm mục đích phát triển nền sản xuất lúa gạo chất lượng cao phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu

1.5 Tính mới của luận án

Tuyển chọn, xác định được 3 loại dịch trích thực vật ở khu vực ĐBSCL

có khả giúp năng giảm giúp bệnh cháy bìa lá gồm cỏ cứt heo, cỏ hôi và sống đời;

Chứng minh được vai trò của 4 enzyme là POX, CAT, PPO và PAL liên quan đến cơ chế kích kháng cây lúa giúp giảm bệnh cháy bìa lá khi có

sự tác động của dịch trích chứa các hoạt chất sinh học;

Cao chiết lá sống đời [Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers.] ly trích bằng

phương pháp tách chiết lỏng-lỏng với dung môi methanol và cao phân đoạn điều chế bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với dung môi acetone

có khả năng giúp giảm bệnh cháy bìa lá bằng cơ chế kích kháng;

Xác định được tổng số 27 hợp chất sinh học từ cao chiết methanol và 34 hợp chất từ cao phân đoạn dung môi aceton Cung cấp dữ liệu thành phần hợp chất sinh học trong lá sống đời có khả năng kích kháng cây lúa giúp giảm bệnh cháy bìa lá

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa

2.2 Tính kháng bệnh của cây trồng

2.3 Các nghiên cứu về cơ chế kích kháng trên cây trồng

2.3.1 Cơ chế kích kháng của cây trồng thông qua các rào cản vật lý 2.3.2 Cơ chế kích kháng của cây trồng thông qua các phản ứng sinh hóa

Các phản ứng sinh hóa của cây trồng như tăng tổng hợp các hợp chất

phenol (Fan et al., 2017); phytoalexins (Cho et al., 2015; Roop Singh et

al., 2017); phản ứng siêu nhạy cảm (Hammerschmidt et al., 2000); hoặc

các PR-protein (Van Loon et al., 2006)

Trong phản ứng kháng bệnh của cây trồng thường xuất hiện các nhóm chất có hoạt tính oxy hóa cao (H2O2, O2-, OH-) trong cây góp phần giới hạn

sự phát triển của mầm bệnh (Apel et al., 2004; Shetty et al., 2008) Hoạt

động của nhóm chất có hoạt tính oxy hóa cao như là chất kháng khuẩn, tham gia vào một phần của sự lignin, suberrin và cấu thành khác của vách

tế bào, kích thích các gen có liên quan đến sự bảo vệ, kích thích tổng hợp

phytoalexin gây độc cho mầm bệnh (Nicholson et al., 1992; Apel et al., 2004; Edreva, 2005; Cho et al., 2015) Ngoài ra, nhóm chất có hoạt tính oxy hóa cao có vai trò giải độc cho tế bào (Rao et al., 1997; Govrin et al.,

2000) Do vậy, để giữ được trạng thái cân bằng trong tế bào thực vật nên

cơ chế giải độc được hoạt hóa cùng lúc với sự gia tăng các nhóm có tính oxy hóa cao, trong đó hai enzyme POX và CAT tham gia tích cực vào quá trình phân giải H2O2 trong tế bào (Apel et al., 2004)

2.3.2.1 Enzyme peroxidase

Enzyme peroxidase (POX) là glycoprotein có chứa nhóm heme (sắt), xúc tác phản ứng oxy hoá với cơ chất vô cơ và hữu cơ bằng H2O2 và có công thức cấu tạo C34H32O4N4Fe Ở cây trồng, POX thường hiện diện ở các dạng như lignin peroxidase, manganese peroxidase và peroxidase

(Hammerschmidt et al., 1982)

Trong cây trồng POX là nhóm enzyme được kích hoạt sớm trong quá trình kháng các mầm bệnh là nấm và vi khuẩn, sự gia tăng hoạt tính các POX gắn liền với sự suy giảm mức độ xâm nhập và lây lan của mầm bệnh

(Nicholson et al., 1992; Hammerschmidt et al., 2000) POX liên quan đến

một số quá trình sinh lý, sinh hóa trong cây như sự tăng trưởng và mở rộng

tế bào, điều hòa phản ứng tự vệ khi cây bị sốc bởi các tác nhân sinh học

hoặc phi sinh học (Hammerschmidt et al., 2000) Ngoài ra, POX vai trò

điều hòa các phản ứng oxy hóa và tăng tổng hợp H2O2, giúp cây trồng

chống lại sự tấn công của mầm bệnh (Hiraga et al., 2001; Shetty et al.,

2008) Tóm lại, hoạt tính của POX được gia tăng khi bị mầm bệnh tấn công

và được sinh ra cùng với hàm lượng của các chất có hoạt tính oxy hóa; là enzyme quan trọng cho quá trình hình thành cấu trúc tự vệ và các phản ứng

sinh hóa học chống lại sự phát triển của mầm bệnh (Hammerschmidt et al., 2000; Hiraga et al., 2001; Van Loon et al., 2006)

Kết quả nghiên cứu về phản ứng kích kháng lúa đối chống lại bệnh cháy

bìa lá do vi khuẩn Xoo gây ra cho thấy hoạt tính POX trong mô cây lúa

tăng khi có sự xâm nhiễm của mầm bệnh và càng tăng sớm và mạnh hơn

khi được xử lý bằng các tác nhân kích kháng (Song et al., 2001; Kagale et

al., 2004; Govindappa et al., 2011; Nisha et al., 2012; Khoa et al., 2017)

enzyme superoxyde dismutase hiện diện trong diệp lục tố sẽ tham gia phản ứng phóng thích H2O2 gây độc cho mầm bệnh (Loprasert et al., 1996)

Song song đó, enzyme POX trong mô cây cũng tham gia tăng tổng hợp

H2O2 (Hiraga et al., 2001; Shetty et al., 2008) Sau đó, CAT được tăng

tổng hợp ở tế bào chất nhằm xúc tác phân giải H2O2 cho ra H2O và phân tử

oxy, giúp cây giải độc cho cây (Apel et al., 2004; Yu et al., 2016)

Ngâm hạt lúa bằng dịch trích lá cây Húng quế (Ocimum sanctum) và cây Sả chanh (Cymbopogan citrus) có khả năng kích kháng chống lại bệnh Đốm vằn (Rhizoctonia solani) thông qua hoạt tính CAT tăng mạnh từ 0 đến 96 giờ sau khi cây lúa được chủng bệnh (Pal et al., 2011) Tương tự, ngâm hạt bằng dịch trích nước lá cây Sống đời (Kalanchoe pinnata) giúp

kích kháng cây lúa chống lại bệnh cháy bìa lá lúa thông qua tăng của

enzyme CAT từ 1 đến 6 ngày sau khi chủng bệnh (Khoa et al., 2017)

2.3.2.3 Enzyme polyphenol oxidase

Polyphenol oxidase (PPO) là một enzyme chứa đồng (Cu) Dưới sự hiện diện của oxy, enzyme này xúc tác sự hydroxyl hoá các hợp chất

monophenol thành các ortho-diphenol Các ortho-diphenol sinh ra lại tiếp tục bị oxy hoá thành các hợp chất ortho-diquinone tương ứng Các

diquinone có hoạt tính rất mạnh, có khả năng tham gia tạo liên kết chéo

hoặc ankyl hoá các protein, tạo thành các sắc tố có màu nâu (Yoruk et al., 2003; Constabel et al., 2008) PPO tham gia vào chức năng bảo vệ cây

trồng trước các tổn thương vật lý, sự tấn công từ mầm bệnh và côn trùng

gây hại (Constabel et al., 2008) Phản ứng tự vệ của cây trồng trước sự tấn

công của mầm bệnh là tăng sự biểu hiện enzyme PPO để tăng khả năng sản tổng hợp các hợp chất phenol và quinone; các hợp chất này có độc tính với

mầm bệnh là mầm và vi khuẩn (Li et al., 2002; Constabel et al., 2008) Bên

cạnh đó, PPO cũng còn có khả năng kích hoạt các gen mã hoá tử tín hiệu methyl jasmonate, oligogalacturonic acid trong cơ chế tự vệ của thực vật;

do đó PPO cũng có vai trò quan trọng trong cơ chế kích kháng giúp cây

trồng chống lại các bệnh từ vi sinh vật (Constabel et al., 2008)

Trong nghiên cứu của Pal et al (2011), dịch trích nước và ethanol lá cây Sả chanh (Cymbopogan citrus) và Húng quế (Ocimum sanctum) có tác dụng kích kháng lúa chống lại bệnh Đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani

gây ra, thể hiện qua việc tăng hoạt tính PPO lên gấp 3 lần so với những cây

lúa mà hạt của chúng không được xử lý kích kháng Theo Khoa et al.,

(2017) và Nguyễn Thị Thu Hương và ctv (2018), khả năng kích kháng của

dịch trích nước lá Sống đời chống lại bệnh cháy bìa lá lúa thông qua kích hoạt tăng hoạt tính PPO cao hơn so với nghiệm thức không xử lý dịch trích

2.3.2.4 Enzyme phenylalanine ammonia lyase

Phenylalanine ammonia lyase (PAL) tham gia quá trình ligin hóa vách

tế bào, sinh tổng hợp flavonoid, phenylpropanoid trong các phản ứng tự vệ

của cây trồng (Santiago et al., 2009) PAL xúc tác chuyển hóa phenylalanine thành trans-cinnamic acid trong quá trình tổng hợp

L-phenylpropanoid, dẫn đến sự tổng hợp các hợp chất liên quan đến quá trình

tự vệ cây trồng như lignin, isoflavonoids và coumarins (Solekha et al.,

al., 1995) Dịch trích methanol từ cây Cà độc dược (Datura metel) có khả

năng làm tăng hoạt tính enzyme PAL trong cây lúa, góp phần kháng lại

bệnh cháy bìa lá và bệnh đốm vằn trên lúa (Kagale et al., 2004) Dịch trích

lá Húng quế (Ocimum sanctum) và cây Sả (Cymbopogan citrus) có khả

năng làm tăng hoạt tính enzyme PAL trong cây lúa, góp phần kháng lại

bệnh Đốm vằn trên lúa (Pal et al., 2011) Dịch trích lá cây Cang mai (Adhatoda vasica) (Govindappa et al., 2011) Dịch trích nước lá Sống đời (Kalanchoe pinnata) có khả năng giúp cây lúa kháng bệnh cháy bìa lá lúa

do có sự gia tăng hoạt tính enzyme PAL (Khoa et al., 2017; Nguyễn Thị

Thu Hương và ctv, 2018)

2.4 Các hợp chất thực vật

2.5 Phương pháp chiết xuất các hợp chất thực vật

2.6 Các loại thực vật sử dụng trong nghiên cứu

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Tuyển chọn dịch trích thực vật

Tuyển chọn các dịch trích thực vật tuyển chọn từ nguồn thực vật tại

ĐBSCL dựa vào ba tiêu chí là: (1) cây cỏ phổ biến; (2) có chứa chất thực

vật có khả năng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng như mô tả của

Kuć (2006) và (3) thường là vật liệu cho các nghiên cứu kích thích tính

kháng trên các loại cây trồng khác nhau

3.2 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa khi ngâm hạt bằng các loại dịch trích thực vật

Thí nghiệm được thực hiện dựa trên phương pháp của Singh và Rao

(1997) và điều chỉnh theo Khoa et al (2017) Thí nghiệm được bố trí theo

thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại

Ghi nhận các chỉ tiêu gồm: (1) chiều dài chồi mầm (mm) và rễ mầm (mm) tại thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau đặt hạt (NSĐH), (2) tỷ lệ nảy mầm (%) ghi nhận 7 NSĐH, (3) chỉ số nảy mầm của hạt lúa (VI, Vigour index) được đánh giá theo mô tả của Arumugam et al (2008) và điều chỉnh theo Doni et al (2014) ở thời điểm 7 NSĐH

3.3 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại

Chủng bệnh nhân tạo: cây lúa ở giai đoạn 45 ngày sau khi gieo được sử dụng để chủng bệnh Chủng bệnh nhân tạo được thực hiện theo phương

pháp của Kauffman, (1973) và điều chỉnh của Khoa et al (2017)

Ghi nhận chỉ tiêu: chiều dài vết bệnh được đo ở thời điểm 7, 14 và 21

ngày sau chủng bệnh (NSCB) (Mew, 1993; Khoa et al., 2017)

3.4 Chứng minh cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp

lại, 4 nghiệm thức gồm: (1) hạt lúa giống được ngâm bằng nước cất và cây lúa không chủng bệnh (nước + không chủng bệnh), (2) hạt lúa giống được ngâm bằng nước cất và cây lúa có chủng bệnh (nước + có chủng bệnh), (3)

Hạt lúa giống được ngâm bằng cao phân đoạn F3 1,5% và cây lúa không

chủng bệnh (cao phân đoạn F3 + không chủng bệnh) và (4) Hạt lúa giống

được ngâm bằng cao phân đoạn F3 1,5% và cây lúa có chủng bệnh (cao phân đoạn F3 + có chủng bệnh)

Mẫu lá lúa được thu ở thời điểm từ 0 đến 7 NSCB; lá lúa thu được cho ngay vào nitơ lỏng Ly trích enzyme: Lấy 10 g mô lá lúa cắt nhỏ (1-2 cm)

và cho vào cối nghiềm có chứa bi sắt đã được thanh trùng Ngâm trong nitơ lỏng 10 phút Sau đó nghiền thành bột mịn bằng máy nghiền mẫu (MM200, Retsh) với tần số 20 lần/giây, 2 lần lặp lại Sau đó, cân 0,1 g mô

lá lúa cho vào tuýp eppendorf và đồng nhất trong 1,5 mL dung dịch đệm (đệm tương ứng mỗi enzyme) Tiếp theo, hỗn hợp được ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4○C (5430R, Eppendorf) Sau khi ly tâm, thu 1

mL phần dung dịch nổi bên trên và trữ ở -4oC để sử dụng cho khảo sát hoạt tính các enzyme trong vòng 7 ngày

3.4.1 Khảo sát hoạt tính enzyme POX

Hoạt tính POX được thể hiện thông qua sự thay đổi giá trị hấp thụ quang phổ bằng máy đo hấp thụ quang phổ (Spectro UV-2602, Labomed)

ở λ 470nm của nồng độ sản phẩm tetraguaiacol sinh ra từ phản ứng chuyển hóa H2O2 và guaiacol dưới sự xúc tác của enzyme POX theo phương pháp

của Hammerschmidt et al (1982) và điều chỉnh theo Khoa et al (2017)

Mẫu blank tại giá trị OD470nm được điều chỉnh về 0 gồm 1,6 mL H2O2 0,05 M; 0,15 mL guiacol 0,15 M và 0,15 mL dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M, pH 6,5 Mẫu khảo sát gồm hỗn hợp 1,6 mL H2O2 0,05 M; 0,15 mL guiacol 0,15 M và 0,15 mL dịch trích enzyme Giá trị OD470nm được ghi nhận từ lúc bắt đầu phản ứng đến 2 phút và mỗi 30 giây ghi nhận một lần