Đánh giá mức Độ biểu hiện của rna dài không mã hóa epb41l4a as1 Ở bệnh nhân sốt xuất huyết dengue

Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA với xét nghiệm sốt Dengue ở các nhóm bệnh nhân .... Mối liên quan giữa mức độ biểu của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các đặc điểm lâm sàng, cận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thùy Dịu

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA RNA DÀI KHÔNG MÃ HÓA EPB41L4A-AS1 Ở BỆNH NHÂN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2024

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thùy Dịu

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA RNA DÀI KHÔNG MÃ HÓA EPB41L4A-AS1 Ở BỆNH NHÂN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS HOÀNG VĂN TỔNG

PGS.TS NGUYỄN THỊ HỒNG LOAN

Hà Nội – 2024

người thầy đã trực tiếp giúp đỡ tận tình truyền đạt những ý tưởng, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập trong bốn năm qua cũng như trong thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Loan, người đã luôn đồng hành, chỉ bảo hướng dẫn, giúp đỡ và cho em những lời nhận xét, góp ý trong quá trình học tập và viết luận văn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS BS Nguyễn Minh Nam, khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Quân y 103 vì đã giúp đỡ, quan tâm, chỉ dẫn, góp ý và cung cấp mẫu trong quá trình thực hiện luận văn

Đồng thời em cũng đặc biệt cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, anh chị và sinh viên thuộc phòng An toàn Sinh học, Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân

y đã giúp đỡ và đào tạo điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm

Qua đây em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết để giảng dạy, trang bị kiến thức cho chúng em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè, những người

đã luôn ở bên cạnh, khích lệ động viên, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em học tập và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Học viên

Nguyễn Thị Thùy Dịu

Chữ viết tắt Tên đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

ALT Alanin transaminase Enzym Alanin transaminase AST Aspartate transaminase Enzym Aspartate transaminase AUC Area under the curve Diện tích dưới đường cong ROC

DWS Dengue with warning signs Sốt Dengue có dấu hiệu cảnh báo

HI Hemagglutination-inhibition Xét nghiệm ức chế ngưng kết

hồng cầu

ISG Interferon-stimulated gene Gen kích thích bởi interferon

NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease Bệnh gan nhiễm mỡ không do

rượu

LncRNA Long non-coding RNA RNA dài không mã hóa

ROC Receiver operating characteristic Đường cong ROC

RT-PCR Reverse transcription

polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen phiên

mã ngược

SLE Systemic lupus erythematosus Bệnh lupus ban đỏ hệ thống WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

Hình 1 Tình hình mắc sốt Dengue ở Đông Nam Á [86] 4

Hình 2: Các kiểu gen virus Dengue [31] 6

Hình 3 Cấu trúc virion DENV [65] 6

Hình 4 Cấu trúc bộ gen với trình tự polyprotein của DENV [66] 7

Hình 5 Chu trình nhân lên của DENV [66] 9

Hình 6 Các phương pháp chẩn đoán sốt Dengue liên quan đến thời gian mắc bệnh [66] 10

Hình 7 Biểu diễn giản đồ phân loại lncRNA [23] 14

Hình 8 Cấu trúc vector pJET-EPB41L4A-AS1 25

Hình 9 Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 10 Kết quả điện di vector pJET-EPB41L4A-AS1 khi cắt bằng enzyme giới hạn 35

Hình 11 Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa chu kỳ ngưỡng với số bản copies của mẫu chuẩn 36

Hình 12 Kết quả real-time PCR xác định khoảng định lượng của đường chuẩn 37

Hình 13 Kết quả real-time PCR định lượng tuyệt đối trên các mẫu nghiên cứu 39

Hình 14 Mức độ biểu hiện của EPB41L4A-AS1 ở các nhóm nghiên cứu 40

Hình 15 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 với tuổi theo hệ số tương quan Spearman (A) và giới theo Mann-Whitney U test (B) 42

Hình 16 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA với xét nghiệm sốt Dengue ở các nhóm bệnh nhân 44

Hình 17 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA và chỉ số huyết học ở các nhóm bệnh nhân theo hệ số tương quan Spearman (A, C) và theo Mann-Whitney U test (B, D) 46

Hình 18 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA và xét nghiệm chức năng gan ở các nhóm bệnh nhân theo hệ số tương quan Spearman (A, C) và theo Mann-Whitney U test (B, D) 49

Hình 19 Phân tích đường cong ROC về khả năng phân biệt giữa bệnh nhân DF và SD (A) và giữa bệnh nhân DF và DWS (B) của lncRNA EPB41L4A-AS1 51

Hình 21 Phân tích đường cong ROC về khả năng phân biệt giữa bệnh nhân sốt

Dengue không nặng và nặng của lncRNA EPB41L4A-AS1 53

Bảng 1 Các nghiên cứu về lncRNA EPB41L4A-AS1 19

Bảng 2 Trình tự mồi khuếch đại lncRNA EPB41L4A-AS1 30

Bảng 3 Thành phần tối ưu của phản ứng real-time PCR 30

Bảng 4 Chu trình nhiệt của phản ứng real-time PCR 31

Bảng 5 Nồng độ của lncRNA EPB41L4A-AS1 ở các đối tượng nghiên cứu 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về sốt Dengue 3

1.1.1 Dịch tễ học của bệnh sốt Dengue 3

1.1.2 Virus Dengue 5

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán sốt Dengue 9

1.2 Giới thiệu về RNA dài không mã hóa 13

1.2.1 Phân loại các lncRNA 14

1.2.2 Cơ chế hoạt động của các lncRNA 15

1.2.3 Vai trò của lncRNA trong nhiễm virus 16

1.2.4 Vai trò của lncRNA EPB41L4A-AS1 18

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất và trang thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.2 Xây dựng dải nồng độ chuẩn 26

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn 28

2.2.4 Tách chiết RNA tổng số 29

2.2.5 Tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA tổng số 29

2.2.7 Phân tích kết quả 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 32

3.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới tính của đối tượng nghiên cứu 32

3.1.2 Đặc điểm xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue 34

3.2 Thiết lập đường chuẩn của phản ứng real-time PCR để xác định mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 35

3.2.1 Tạo mẫu chuẩn mẫu mang gen đích mã hóa lncRNA EPB41L4A-AS1 35

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn của phản ứng real-time PCR 36

3.3 Đặc điểm biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 của các nhóm đối tượng nghiên cứu 38

3.4 Mối liên quan giữa mức độ biểu của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân sốt Dengue 42

3.4.1 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với tuổi và giới 42

3.4.2 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue 43

3.4.3 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với đặc điểm xét nghiệm huyết học 45

3.4.4 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các xét nghiệm chức năng gan 47

3.5 Giá trị tiên lượng của lncRNA EPB41L4A-AS1 trong bệnh sốt Dengue 50

3.5.1 Phân biệt nhóm bệnh nhân DF với DWS và SD 50

3.5.2 Phân biệt nhóm bệnh nhân DWS và SD 51

3.5.3 Phân biệt 2 nhóm bệnh nhân sốt Dengue không nặng và SD 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 68

MỞ ĐẦU

Sốt Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến, được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công nhận như một vấn đề nghiêm trọng với sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới Bệnh chủ yếu tập trung ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như ở Đông Nam Á và Thái Bình Dương, gần 1/3 dân số thế giới có nguy cơ bị nhiễm bệnh [13, 65] Những khu vực này chiếm khoảng 75% số ca mắc và tử vong do sốt Dengue trên toàn cầu, trong đó Việt Nam là một trong những quốc gia chịu hậu quả nặng nề của dịch bệnh này Tại Việt Nam, số ca mắc sốt Dengue trong năm 2022 đã lên đến 371.000 người với 144 trường hợp tử vong, tăng hơn 5 lần so với năm 2021

Căn bệnh truyền nhiễm này gây ra bởi một trong bốn týp huyết thanh của virus Dengue Phổ bệnh lâm sàng của bệnh khá đa dạng từ không có triệu chứng đến một loạt các hội chứng với các biểu hiện lâm sàng nghiêm trọng có thể gây tử vong [60] Do có bốn kiểu huyết thanh khác nhau và bộ gen RNA của virus liên tục biến đổi, nên việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả bệnh sốt Dengue vẫn đang là một thách thức lớn Các phương pháp điều trị hiện nay hoàn toàn dựa trên điều trị triệu chứng, đòi hỏi mức độ chăm sóc bệnh nhân cao và chưa có thuốc điều trị hiệu quả Bên cạnh đó, việc chẩn đoán sốt Dengue thường chỉ được thực hiện sau các biểu hiện nghiêm trọng

và các giai đoạn sau của nhiễm trùng, làm cho việc giám sát dịch tễ học sốt Dengue trở nên khó khăn hơn, đặc biệt là ở các quốc gia đang phát triển Tiên lượng kịp thời có thể ngăn ngừa tử vong liên quan đến sốt Dengue [41] Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các dấu ấn sinh học và sử dụng các dấu ấn sinh học trong chẩn đoán mức độ, tiên lượng và theo dõi đáp ứng điều trị sốt Dengue là hoàn toàn cần thiết

Trong những năm gần đây, liệu pháp dựa trên axit nucleic nổi lên như một phương pháp đầy hứa hẹn để chẩn đoán và điều trị sớm bệnh sốt Dengue Đáng chú ý trong đó, các RNA dài không mã hóa (lncRNA) đã thu hút được sự chú ý rộng rãi như

là một nhóm dấu ấn sinh học mới, đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch đáp ứng và bẩm sinh [55] Đặc biệt là trong phản ứng kháng virus của vật chủ, lncRNA tham gia điều hòa miễn dịch trong quá trình lây nhiễm virus Biểu hiện khác biệt của lncRNA

có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học đáng tin cậy về mức độ nghiêm trọng của bệnh trong các giai đoạn nhiễm trùng khác nhau cũng như trong quá trình tiến triển của bệnh LncRNA EPB41L4A-AS1 là một lncRNA có liên quan đến chuyển hóa tế bào và phản

ứng miễn dịch, mức biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 có liên quan trong nhiều bệnh ung thư, tuy nhiên ở những bệnh truyền nhiễm, cụ thể là bệnh sốt Dengue còn khá hạn chế Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá mức độ biểu hiện của RNA dài không mã hóa EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue” với hai mục tiêu:

1 Xác định được mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt Dengue với các mức độ bệnh khác nhau

2 Phân tích được mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA AS1 với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và giá trị tiên lượng ở bệnh nhân Dengue

EPB41L4A-CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về sốt Dengue

1.1.1 Dịch tễ học của bệnh sốt Dengue

1.1.1.1 Tình hình mắc sốt Dengue trên thế giới

Theo báo cáo của WHO, sốt Dengue hiện đang lưu hành ở 129 quốc gia; có 3,6

tỷ người sống trong các khu vực có nguy cơ truyền bệnh, ước tính có khoảng 390 triệu người mắc bệnh mỗi năm và 96 triệu trường hợp có triệu chứng lâm sàng Số ca mắc sốt Dengue đã tăng lên mạnh mẽ từ năm 1990 đến 2019, giữa ba thập kỷ đô thị hóa, khí hậu

ấm lên và nhu cầu du lịch trên toàn thế giới ngày càng gia tăng [88] Trong những năm này, tỷ lệ mắc sốt Dengue đã tăng từ 505.430 ca lên hơn 2,4 triệu ca với số ca tử vong tăng từ 28.152 người lên 36.055 người Số ca bệnh giảm nhẹ trong giai đoạn 2020-2022

do đại dịch COVID-19 Tuy nhiên, trong năm 2023, số ca sốt Dengue đã tăng đột biến trên toàn cầu, đặc trưng bởi sự gia tăng đáng kể về số lượng, quy mô và sự xuất hiện đồng thời của nhiều đợt bùng phát, lan sang các khu vực trước đây không bị sốt Dengue ảnh hưởng, dẫn đến mức cao kỷ lục là hơn 6,5 triệu ca và hơn 7300 ca tử vong [51] Theo báo cáo của Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh Châu Âu, kể từ đầu năm 2024, trên toàn thế giới đã có hơn 12 triệu ca mắc và hơn 8000 ca tử vong liên quan đến sốt Dengue đã được báo cáo [14]

Hiện nay, sốt Dengue lưu hành ở hầu hết các khu vực đông dân cư nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, trong đó chủ yếu là ở khu vực Đông Nam Á, châu Mỹ và Tây Thái Bình Dương và ít phổ biến hơn ở châu Phi và Đông Địa Trung Hải Khu vực châu Đại Dương là khu vực có tỷ lệ mắc bệnh sốt Dengue chuẩn hóa theo độ tuổi trên 100.000 dân cao nhất tiếp theo là khu vực Nam và Đông Nam Á Sốt Dengue đã gây ra gánh nặng kinh tế và bệnh tật to lớn ở các quốc gia lưu hành bệnh, trong đó khoảng 70% gánh nặng bệnh sốt Dengue toàn cầu xảy ra ở khu vực châu Á [76]

Ở châu Á, khu vực Đông Nam Á là được coi là tâm dịch sốt Dengue toàn cầu với

số ca mắc tăng 46% từ năm 2015 đến năm 2019, trong đó Indonesia, Myanmar và Thái Lan là một trong những quốc gia có tỷ lệ dịch bệnh cao nhất trên thế giới, đóng góp hơn

một nửa gánh nặng sốt Dengue toàn cầu (Hình 1) [82] Ước tính trong khu vực có

khoảng 2,9 triệu ca mắc và 5906 ca tử vong sốt Dengue xảy ra mỗi năm với tỷ lệ mắc

chuẩn hóa theo độ tuổi là 1153,57/100.000 người, và gánh nặng kinh tế hàng năm lên tới 950 triệu đô-la Mỹ [70]

Hình 1 Tình hình mắc sốt Dengue ở Đông Nam Á [82]

1.1.1.2 Tình hình mắc sốt Dengue ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia chịu hậu quả nặng nề của bệnh sốt Dengue Theo thống kê của WHO, tại Việt Nam, số ca mắc sốt Dengue đã tăng từ 105.370 ca năm 2009 lên 184.000 ca năm 2017 [49] Ước tính có khoảng hai triệu ca mắc bệnh hàng năm, mặc dù trung bình chỉ có 95.000 trường hợp được báo cáo hàng năm cho Bộ

Y tế trong giai đoạn 2002 đến 2020 Tuy nhiên, số ca mắc sốt Dengue trên thực tế cao hơn do việc giám sát sốt Dengue ở Việt Nam khá thụ động, chủ yếu dựa vào các trường hợp lâm sàng do bệnh nhân đến khám bệnh báo cáo; trong khi đó, có tới 80% trường hợp bệnh nhân không có triệu chứng hoặc triệu chứng nhẹ và có thể sẽ không đi khám Tác động kinh tế của sốt Dengue ở Việt Nam ước tính khoảng 30 đến 95 triệu đô-la Mỹ mỗi năm [13]

Ở Việt Nam, sốt Dengue được đặc trưng bởi tính thời vụ mạnh mẽ và sự thay đổi đáng kể giữa các năm và khu vực địa lý Bệnh xuất hiện với các mức độ khác nhau ở các vùng khác nhau của đất nước và có xu hướng bùng phát mạnh mẽ và phổ biến hơn ở các tỉnh phía Nam, với tỷ lệ mắc bệnh thường cao nhất vào khoảng tháng 6 đến tháng

10 [34] Ở miền Bắc, nơi có nhiệt độ thấp hơn so với cả nước, hầu hết các tỉnh đều có ít hoặc không có ca mắc Tuy nhiên, dịch lưu hành theo mùa đã được quan sát thấy ở Hà Nội từ sau năm 1997 với các vụ dịch quy mô lớn theo chu kỳ 3–5 năm, trung bình mỗi năm có khoảng 8.700 ca sốt Dengue trong hơn 10 năm qua [13, 73] Sự mở rộng lây

nhiễm DENV như vậy được coi là có liên quan đến điều kiện môi trường và khả năng

di chuyển của con người theo sự phát triển xã hội

Trong 10 năm trở lại đây, sốt Dengue xảy ra hàng năm ở hầu hết các tỉnh thành trong nước, không còn tuân thủ theo quy luật 4 - 5 năm như trước đây [1] Từ năm 2012 đến 2017, số ca mắc và tử vong do sốt Dengue trên cả nước thấp nhất trong năm 2014 với 3148 ca mắc, 20 ca tử vong sau đó liên tục tăng trong 5 năm gần đây Năm 2019, dịch sốt Dengue bùng phát, gia tăng mạnh tại một số tỉnh, thành phố trên cả nước với 335.056 ca mắc sốt Dengue, trong đó có 55 ca tử vong được ghi nhận Năm 2022, Việt Nam ghi nhận số ca mắc tăng gấp 5 lần, số ca tử vong gấp 5.3 lần so với năm 2021 Trong khi đó, năm 2023 đã ghi nhận số ca mắc cao bất thường lên tới 172.000 trường hợp Tuy không có phương pháp điều trị đặc hiệu cho bệnh sốt Dengue, nhưng việc phát hiện sớm và tiếp cận với dịch vụ chăm sóc y tế thích hợp sẽ làm giảm tỷ lệ tử vong xuống dưới 1%

1.1.2 Virus Dengue

Nhiễm virus Dengue (DENV) là nguyên nhân chính gây ra bệnh sốt Dengue, các

vectơ chính truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti và Aedes Albopictus [43, 73]

1.1.2.1 Phân loại virus Dengue

DENV được phân loại thành 4 týp huyết thanh DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4 dựa trên các đặc điểm di truyền và kháng nguyên với sự khác biệt về nucleotide giữa các nhóm là khoảng 30% Mỗi nhóm huyết thanh lại được chia nhỏ hơn về mặt di

truyền thành các kiểu gen (Hình 2) [30] Các kiểu gen khác nhau thể hiện khả năng thích

ứng khác nhau, đi kèm với những biến đổi di truyền và làm tăng khả năng lây lan của DENV ở các vùng địa lý khác nhau Trong số bốn huyết thanh nhóm, DENV-1 và DENV-2 là những loại phổ biến nhất liên quan đến các đợt dịch bùng phát trước đây, trong đó DENV-2 gây ra nhiễm trùng thứ phát nghiêm trọng hơn so với các huyết thanh nhóm khác [89]

Hình 2: Các kiểu gen virus Dengue [30]

1.1.2.2 Cấu trúc của virus Dengue

Virus Dengue (DENV) thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus và có 4 týp huyết

thanh khác nhau (DENV1-4) DENV có cấu trúc hình cầu, lớp kép lipid chứa nhiều lớp protein trên bề mặt tương đối nhẵn với vỏ bọc đối xứng, đường kính khoảng 50 nm và

lõi nucleocapsid bên trong (Hình 3) [63]

Hình 3 Cấu trúc virion DENV [62]

Cấu trúc bộ gen của DENV là một chuỗi đơn RNA (ssRNA) phân cực dương dài khoảng 11 kb, được chia thành ba phần: vùng 5′ UTR (vùng chưa được dịch mã), ORF

(khung đọc mở) và vùng 3′ UTR (Hình 4) [63] Cụ thể, vùng 5′UTR có kích thước

khoảng 95–101 nucleotide, trong khi độ dài của 3′UTR có thể thay đổi giữa các kiểu huyết thanh [48] Polyprotein được mã hóa bởi ORF đóng vai trò là khuôn mẫu để dịch

mã ba protein cấu trúc là capsid (C), màng (prM/M), vỏ (E) và bảy protein phi cấu trúc (NS), NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS2K, NS4B và NS5 Glycoprotein cấu trúc E

chịu trách nhiệm nhận dạng tế bào và thúc đẩy sự xâm nhập, trung gian bởi quá trình hợp nhất giữa vỏ virus và màng tế bào Trong đó, protein cấu trúc C giúp liên kết và ổn định RNA virus, protein M cấu tạo nên các kênh ion của virus, protein prM có chức năng như một lớp vỏ bảo vệ các peptide trên protein E trong khi các protein NS hỗ trợ sao chép bộ gen của virus Cụ thể, NS1 là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm virus giúp sao chép RNA của virus NS1 của DENV có khối lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới hai dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết (sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài NS2A tham gia sao chép và lắp ráp virus NS2B là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ Vùng trung tâm của NS2B là cofactor của protein NS3 NS3 có hoạt tính serin-protease và helicase, tham gia quá trình sao chép của virus và cảm ứng quá trình chết theo chương trình trong các tế bào bị nhiễm bệnh NS4A là protein liên kết màng gây ra sự thay đổi màng và autophagy để tăng cường sự nhân lên của virus NS4B ngăn chặn sự dẫn truyền tín hiệu do IFN -α / β gây ra và giúp virus thoát khỏi đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ Protein NS5 cấu tạo nên enzym RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) của virus và chứa các trình tự định vị hạt nhân (NLS) [53]

Hình 4 Cấu trúc bộ gen với trình tự polyprotein của DENV [63]

1.1.2.3 Vòng đời của virus Dengue

DENV có thể lây nhiễm nhiều loại tế bào, như tế bào đuôi gai, tế bào nội mô, nguyên bào sợi, đại thực bào, tế bào mast và bạch cầu đơn nhân [58] DENV xâm nhập vào tế bào bằng con đường dung hợp (fusion) Chu kỳ sao chép của DENV bắt đầu với

sự xâm nhập vào tế bào chủ bằng sự gắn kết của virus với các thụ thể của tế bào Sau khi lây nhiễm thành công, DENV chủ yếu tấn công và nhân lên trong các tế bào đuôi

gai và lây nhiễm các đại thực bào, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho Sự xâm nhập vào tế bào xảy ra thông qua quá trình nhập bào qua trung gian thụ thể bằng cách sử dụng các phân tử bề mặt tế bào như thụ thể Fc, glycosaminoglycans (GAG), các phân tử liên

kết với CD14 gắn kết lipopolysacarit, heparan sulfat (Hình 5)

DENV xâm nhập vào tế bào thông qua các túi được phủ clathrin Quá trình axit hóa của endosome dẫn đến sự hợp nhất của màng tế bào vật chủ và virus, sau đó giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất Tại đây, các vật liệu di truyền của virus được vận chuyển đến màng lưới nội chất bằng bộ máy vận chuyển khung tế bào RNA sợi dương của DENV đóng vai trò như một mRNA gắn vào ribosome của tế bào chủ mã hoá cho một phân tử polyprotein duy nhất Nhờ protease, phân tử polyprotein này bị phân cắt thành mười phân tử protein, trong đó có protein liên quan đến hoạt tính RNA-polymerase (đóng vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã) Sự sao chép của bộ gen RNA xảy ra ở màng lưới nội chất bằng cách sử dụng RNA sợi dương làm khuôn Protein DENV NS5, có khả năng methyl hóa RNA và RNA polymerase, cần thiết cho quá trình tổng hợp RNA của virus RNA virus mới được tổng hợp được bao bọc trong các protein

C, tạo thành nucleocapid đi vào trong màng lưới nội chất và được bao quanh bởi các protein M và E Các virus chưa trưởng thành di chuyển qua khu phức hợp bộ máy Golgi, nơi virus trưởng thành và chuyển đổi thành dạng lây nhiễm của chúng Các DENV trưởng thành sau đó được giải phóng khỏi tế bào và có thể tiếp tục lây nhiễm sang các

tế bào khác [62, 63]

Hình 5 Chu trình nhân lên của DENV [63]

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán sốt Dengue

Nhiễm bất kỳ loại nào trong số bốn loại virus Dengue đều dẫn đến một loạt các triệu chứng, từ sốt nhẹ đến các triệu chứng nặng đe dọa tính mạng Trong giai đoạn đầu của bệnh, sốt Dengue có thể biểu hiện dưới dạng sốt nhẹ “giống như cúm” với các triệu chứng tương tự như các bệnh khác như sởi, Zika, sốt vàng da và sốt rét Do đó, việc chẩn đoán sớm và chính xác là điều cần thiết để quản lý ca bệnh Chẩn đoán sốt Dengue

là một thách thức, phụ thuộc phần lớn vào giai đoạn nào trong quá trình lây nhiễm của

bệnh nhân (Hình 6)

1.1.3.1 Phân lập virus

Phân lập virus là phương pháp chẩn đoán truyền thống và được xem là tiêu chuẩn vàng để xác định nhiễm virus Dengue; thường được sử dụng trong các nghiên cứu cơ bản về virus, dịch tễ học và sinh bệnh học Tuy nhiên, việc phân lập có thể mất vài ngày đến vài tuần để thực hiện và làm tăng chi phí cho bệnh nhân Vì thế, phương pháp này

đã dần được thay thế bằng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) và gần đây hơn là bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme bắt giữ kháng nguyên NS1 để chẩn đoán nhanh hơn Để phân lập virus, các mẫu lâm sàng lấy từ bệnh nhân được nuôi cấy trong nhiều dòng tế bào của muỗi (AP-61, Tra-284, AP64, C6/36) hoặc động vật có vú (LLCMK2, Vero và BHK -21) Các mẫu máu lấy từ những bệnh nhân bị nhiễm bệnh bị sốt trong vòng năm ngày sau khi phát bệnh mang lại kết quả tốt nhất

Hình 6 Các phương pháp chẩn đoán sốt Dengue liên quan đến thời gian mắc bệnh

NS1 nhằm xác định có hay không có DENV trong máu người bệnh là phương pháp xác định nhanh chóng và chính xác ngay cả trong thời gian đầu nhiễm virus RT-PCR có thể cho kết quả sau 12h từ khi lấy bệnh phẩm và có thể thực hiện ngay lúc virus xâm nhập vào cơ thể mà chưa hề có dấu hiệu giảm số lượng tiểu cầu hay khi bệnh nhân bắt đầu sốt, chưa có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng, hoặc các xét nghiệm miễn dịch xác định kháng thể IgM vẫn còn âm tính [47]

So với phương pháp nuôi cấy, RT-PCR cho kết quả nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn từ 80% đến 100% Để tránh kết quả dương tính giả do khuếch đại không đặc hiệu trong phản ứng RT-PCR, cần chú ý đến vùng gen khuếch đại đặc hiệu cho DENV

Real-time RT-PCR

Các phương pháp phân tử chẩn đoán sốt Dengue đang dần thay thế phương pháp phân lập truyền thống để phát hiện virus Real-time RT-PCR dựa trên tín hiệu huỳnh quang để phát hiện sốt Dengue ngày càng được sử dụng nhiều do có tốc độ, độ nhạy và

độ đặc hiệu tốt hơn so với RT-PCR thông thường Trong đó, SYBR Green được sử dụng phổ biến do tiết kiệm chi phí hơn việc sử dụng các mẫu dò huỳnh quang [68]

1.1.3.3 Phát hiện kháng nguyên NS1

Việc phát hiện NS1 trong máu bệnh nhân bằng cách sử dụng phương pháp ELISA lần đầu tiên được mô tả vào năm 2000 Từ đó đến nay, phương pháp này đã được sử dụng hiệu quả, kháng nguyên NS1 xuất hiện trong máu người bệnh ngay sau khi có triệu chứng sốt và còn tồn tại trong máu cho đến ngày sốt thứ chín; kháng nguyên này được tìm thấy trước khi có kháng thể IgM NS1 có thể được phát hiện cùng lúc với RNA của virus và trước khi phản ứng kháng thể được hình thành Một hạn chế của việc phát hiện NS1 đối với bệnh nhân bị nhiễm trùng thứ cấp là sự gia tăng nhanh chóng các kháng thể phản ứng chéo NS1 trong giai đoạn cấp tính của bệnh, do đó việc phát hiện NS1 khá khó khăn [47]

1.1.3.4 Xét nghiệm huyết thanh học phát hiện kháng thể

Hiện có rất nhiều phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được sử dụng để chẩn đoán sốt Dengue, trong đó có năm phương pháp xét nghiệm huyết thanh học cơ bản và chính xác hơn là ức chế ngưng kết hồng cầu hemagglutination-inhibition (HI), cố định bổ thể (complement fixation), xét nghiệm trung hòa virus (neutralization test), phản ứng

MAC-ELISA (MAC-ELISA) và xét nghiệm ELISA IgG [63] Việc phát hiện nhiễm DENV bằng huyết thanh học rất phức tạp ở những khu vực trên thế giới có nhiều hơn một flavivirus đang lưu hành như virus viêm não Nhật Bản, virus Zika, do các epitope phản ứng chéo của các kháng thể

MAC-ELISA

Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme bắt giữ kháng thể ELISA (IgM antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Các kháng thể IgM chống lại DENV có thể được phát hiện bắt đầu từ 4-5 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng Hầu hết các kháng nguyên được sử dụng cho xét nghiệm này đều có nguồn gốc từ protein vỏ của bốn kiểu huyết thanh của DENV Trong các nghiên cứu được công bố trước đây, MAC-ELISA cho thấy độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 100% khi so sánh với xét nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu [9, 77]

MAC-IgG

Xét nghiệm kháng thể IgG bằng phương pháp ELISA được sử dụng để phát hiện các trường hợp mắc sốt Dengue gần đây hoặc trước đây dựa trên việc sử dụng các kháng nguyên giống như MAC-ELISA Phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi để phân loại các trường hợp dựa trên loại nhiễm trùng, nguyên phát hoặc thứ phát Trong sốt Dengue nguyên phát, kháng thể IgG chưa xuất hiện trong giai đoạn cấp tính và chỉ xuất hiện trong giai đoạn hồi phục Trong sốt Dengue thứ phát, kháng thể Dengue IgG xuất hiện ngay trong giai đoạn cấp tính và tăng trên bốn lần trong giai đoạn hồi phục (nếu các mẫu máu lấy cách nhau ít nhất bảy ngày) [9, 29]

Tỷ lệ IgM/IgG

Kháng thể IgM có thể xuất hiện sớm nhất vào khoảng ngày thứ 3-5 trong nhiễm DENV tiên phát, đạt đỉnh điểm vài tuần sau khi hồi phục và duy trì ở mức có thể phát hiện được trong vài tháng IgG thường không xuất hiện trong giai đoạn cấp tính của bệnh nguyên phát Do đó, khi được thực hiện song song, phát hiện IgM và IgG có thể đưa ra chỉ định chẩn đoán nhiễm trùng nguyên phát hoặc thứ phát dựa trên tỷ lệ IgM và IgG trong giai đoạn cấp tính của bệnh Tỷ lệ IgM/IgG cao hơn 1,78 được coi là dấu hiệu của nhiễm trùng nguyên phát và thấp hơn được coi là dấu hiệu của nhiễm trùng thứ phát [9, 29]

IgA

Kháng thể IgA được phát hiện vào ngày thứ 6 sau khi bắt đầu sốt cho đến ngày thứ 25 Nồng độ IgA cao nhất vào khoảng ngày thứ 8 sau khi bắt đầu sốt và giảm nhanh chóng cho đến khi không thể phát hiện được vào ngày thứ 40 Nhiều nghiên cứu chỉ ra

ra rằng không có sự khác biệt về nồng độ kháng thể IgA giữa bệnh nhân bị nhiễm trùng nguyên phát hoặc thứ phát [9, 29]

Xét nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu

Xét nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination-inhibition HI) dựa trên khả năng ngưng kết các tế bào hồng cầu của các kháng nguyên sốt Dengue DENV

có khả năng gây ngưng kết hồng cầu trong những điều kiện pH nhất định Trên cơ sở đó phản ứng ngưng kết hồng cầu được xây dựng để phát hiện và chuẩn độ virus trong hỗn dịch có chứa DENV HI được WHO khuyến nghị để phân biệt giữa nhiễm sốt Dengue nguyên phát và thứ phát và chúng đã được áp dụng phổ biến do chúng có những ưu điểm như không cần thiết bị nuôi cấy virus và có kỹ thuật đơn giản Tuy nhiên cũng có một

số nhược điểm: cần lấy hai mẫu trong khoảng thời gian thích hợp và phản ứng chéo với các kháng thể IgG đặc hiệu với flavivirus khác Trong trường hợp không có mẫu lần hai, không thể xác định tình trạng miễn dịch của bệnh nhân hoặc để biết liệu một số bệnh nhiễm trùng sơ cấp có bị phân loại nhầm thành nhiễm trùng thứ phát hay không vì chúng có lượng kháng thể rất cao ngay cả trong những ngày đầu tiên nhiễm bệnh [56]

1.2 Giới thiệu về RNA dài không mã hóa

Theo nghiên cứu về hệ gen ở người, có đến 70% hệ gene được phiên mã thành RNA nhưng chỉ khoảng 2% trong số đó dịch mã thành protein, phần còn lại được phiên

mã thành các RNA không mã hoá (non coding RNA - ncRNA) Long-non coding RNA (lncRNA) là các phân tử RNA không mã hóa cho protein, có kích thước khoảng hơn

200 nucleotide, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa gen Phần lớn các lncRNA được phiên mã bởi RNA polymerase II, một số ít được phiên mã bởi RNA polymerase III, như 7SK và 7SL Các lncRNA thường được gắn mũ 7-metyl guanosine ở đầu 5’, polyadenyl hóa ở đầu 3’ và có nhiều đặc điểm tương đồng với các mRNA [26, 92]

1.2.1 Phân loại các lncRNA

Các lncRNA có thể được chia thành nhiều nhóm khác nhau dựa trên sự phân bố

độ dài của chúng: lncRNA nhỏ (200-950 nucleotide), lncRNA trung bình (950-4.800 nucleotide), lncRNA lớn (>4.800 nucleotide) Theo vị trí phát sinh, các lncRNA được chia thành năm nhóm chính: intergenic lncRNAs (lincRNAs), intronic lncRNAs, antisense lncRNAs (aslncRNA/NATs), bidirectional lncRNAs và enhancer RNAs

(eRNAs) (Hình 7) [22]

Hình 7 Biểu diễn giản đồ phân loại lncRNA [22]

Cụ thể, các intronic lncRNA được phiên mã hoàn toàn từ những vùng intron của gen mã hóa protein Các intronic lncRNA được điều hoà qua quá cơ chế kích hoạt khác nhau nhưng chỉ mới khám phá được một phần nhỏ về chức năng của chúng Long intergenic non-protein coding RNAs (lincRNAs) là các lncRNA nằm giữa các gen mã hóa protein Các intergenic lncRNA và intronic lncRNA được điều chỉnh thông qua các

cơ chế hoạt hóa phiên mã khác nhau, có các biến đổi poly A khác nhau và biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào vị trí ở trong tế bào [15, 40] Các antisense lncRNA được phiên

mã từ chuỗi được sử dụng làm khuôn trong quá trình phiên mã của gen mã hóa protein Trong bộ gen người, antisense chiếm đến khoảng 32% trong số các lncRNA Ngày nay

có nhiều bằng chứng cho thấy antisense xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn biểu hiện gen theo hai phương thức cis hoặc trans Về mặt chức năng, các antisense lncRNA thúc đẩy hoặc ức chế sự tăng sinh, di cư, xâm lấn và nhạy cảm với hóa chất của tế bào ung thư Các bidirectional lncRNA được phiên mã theo hai chiều tại chuỗi được sử dụng làm khuôn trong quá trình phiên mã các gen mã hoá protein Chức năng của chúng liên quan

đến quá trình phát triển của các yếu tố phiên mã và điều hoà chu trình tế bào Tuy nhiên việc phát hiện các lncRNA tương đối khó do chúng không ổn định và trình tự mở đầu chưa được biết rõ Enhancer RNA (eRNA) được phiên mã từ trình tự DNA của vùng enhancer có chiều dài từ 500-2000bp, sự đa dạng của eRNA thấp hơn 19–34 lần

so với mRNA của các gen mã hóa protein lân cận, do đó chúng có thời gian tồn tại rất ngắn [67]

1.2.2 Cơ chế hoạt động của các lncRNA

Cơ chế hoạt động của các lncRNA được chia thành các nhóm chính bao gồm điều hòa phiên mã, điều hòa sau phiên mã, tái cấu trúc chất nhiễm sắc và các cơ chế hoạt động khác

Điều hòa phiên mã

Các lncRNA hoạt động như các co-factors để điều hòa hoạt động của các yếu

tố phiên mã và có một số lượng lớn lncRNA điều chỉnh quá trình phiên mã gen thông qua can thiệp phiên mã (ví dụ như các lncRNA: SRG1) Các lncRNA còn có thể làm thay đổi hoạt động của RNA polymerase II bằng cách tương tác với phức hợp khởi đầu phiên mã để điều khiển việc lựa chọn trình tự khởi đầu, ví dụ, ở người quá trình phiên

mã lncRNA từ vùng ngược chiều của locus dihydrofolate reductase (DHFR) để tạo thành bộ ba trong trình tự khởi đầu chính của DHFR ức chế sự gắn kết của đồng yếu tố phiên mã TFIID31 (transcription factor IID subunit 31) [6]

Điều hòa sau phiên mã

Có hai cơ chế điều hòa sau phiên mã phổ biến mà lncRNA tham gia, đó là cơ chế điều hòa cắt - nối và điều hòa dịch mã Các lncRNA ảnh hưởng đến quá trình cắt nối mRNA có thể hoạt động thông qua điều chỉnh hoặc liên kết với các yếu tố cắt nối, hoặc kết hợp trực tiếp với trình tự mRNA để ngăn chặn quá trình cắt nối Ngoài ra, có thể tồn tại các cơ chế điều chỉnh cắt-nối khác LncRNA LUST (phiên mã đặc hiệu LUCA-15) điều chỉnh sự biểu hiện của các biến thể mối nối RBM5 thông qua việc che dấu một trình tự điều hòa sợi sense [40]

Tái cấu trúc nhiễm sắc thể

Sự methyl hóa DNA và các biến đổi histone có thể làm thay đổi trạng thái của chất nhiễm sắc, dẫn đến hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã Trong quá trình này, lncRNA

tuyển mộ các thành phần tái cấu trúc chất nhiễm sắc đến các locus bộ gen cụ thể, điều chỉnh trạng thái của nhiễm sắc thể để ức chế hoặc kích hoạt phiên mã [40]

1.2.3 Vai trò của lncRNA trong nhiễm virus

Nhiễm virus vẫn là một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng đe dọa tính mạng của hàng trăm nghìn người mỗi năm Hiểu được cơ chế sao chép, đóng gói và lây nhiễm của virus vào các tế bào vật chủ có thể cung cấp các chiến lược mới để kiểm soát sự lây nhiễm của virus Là các phân tử điều hòa mạnh, lncRNA đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học khác nhau, bao gồm cả tương tác giữa virus và vật chủ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ra rằng lncRNA có vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm virus và phản ứng chống virus của vật chủ trong các phản ứng miễn dịch [36,

52, 90]

Các lncRNA tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus của bằng cách kích hoạt sản xuất inferferon (IFN) và cytokine, biểu hiện của gen kích thích IFN (ISG) và tín hiệu liên quan đến các thụ thể nhận biết mầm bệnh (Pattern recognition receptors-PRRs) như thụ thể TLR (Toll-like receptors) nhận biết các phân tử liên quan đến mầm bệnh (PAMP) khi bị nhiễm virus từ đó kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh Dựa trên giải trình từ RNA đã xác định được nhiều lncRNA có liên quan đến phản ứng miễn dịch kháng virus có liên quan đến TLR như lncRNA EGOT, lncRNA Cox2 LncRNA IFITM4P có liên quan đến khả năng miễn dịch chống virus bẩm sinh, giống với một số ISG, lncRNA IFITM4P hoạt động như một ceRNA để điều chỉnh một số thành viên trong họ IFITM và ức chế sự nhân lên của virus cúm A [83]

Bên cạnh việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc biểu hiện ISG, lncRNA cũng có thể làm cho các ISG giảm biểu hiện LncRNA LUCAT1 ức chế sự phiên mã của ISG bằng cách tương tác với STAT1 trong nhân và hạn chế phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong tế bào chủ [93] Sự không biểu hiện của lncRNA #32 làm giảm đáng kể mức độ biểu hiện của các ISG như IRF7 và OASL, dẫn đến dễ nhiễm virus gây viêm não và viêm cơ tim (EMCV) Ngược lại, sự biểu hiện quá mức của lncRNA #32 đã ức chế đáng

kể sự nhân lên của EMCV LncRNA #32 tương tác với hnRNPU và ATF2 để điều chỉnh biểu hiện ISG [50] Những kết quả này cho thấy rằng LncRNA #32 đã tham gia vào các phản ứng kháng virus bằng cách kiểm soát sự biểu hiện của ISG Ở bệnh nhân cúm A,

knockdown LINC02574 đã làm giảm biểu hiện của IFN loại I và loại III cũng như nhiều ISG khác [93]

Các cấu trúc RNA và DNA của virus kích hoạt và điều chỉnh sự biểu hiện của các lncRNA Ngược lại, các lncRNA này lại có có vai trò điều chỉnh phản ứng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ bao gồm tín hiệu liên quan đến thụ thể nhận dạng mầm bệnh PRR, việc sản xuất các IFN và cytokine [11] Ví dụ, trong trường hợp nhiễm virus viêm gan C, lncRNA-CMPK2 thúc đẩy sự sao chép của virus viêm gan C được tăng cường biểu hiện trong tế bào gan người sau khi điều trị bằng IFN-α, trong khi đó việc giảm biểu hiện của lncRNA nàyđ óng vai trò điều hòa âm trong đáp ứng với phản ứng của IFN cùng với sự tăng biểu hiện của một số ISG như Mx1, ISG15 và CXCL10 Carnero

và cộng sự (cs) phát hiện nhiễm HCV làm tăng sự biểu hiện của lncRNA EGOT, điều này được gây ra bởi gen cảm ứng axit retinoic kích hoạt NF- κB 1 (NF-κB activated retinoic acid-inducible gene 1 - RIG-I) và PKR kinase kích hoạt RNA Hơn nữa, biểu hiện của EGOT cũng tăng lên sau khi nhiễm cúm hoặc virus Semliki Forest [10]

Nhiễm virus gây ra những thay đổi trong hệ thống phiên mã của tế bào Trong số các RNA tham gia đáp ứng với virus có các lncRNA, nhiều nghiên cứu đã chứng minh các lncRNA của tế bào bị thay đổi về mức độ biểu hiện sau khi nhiễm virus [38, 71] Nhiều loại virus gây bệnh trên động vật như SARS-CoV, virus herpes simplex, HIV, HBV đã được chứng minh là làm rối loạn sự biểu hiện của lncRNA của vật chủ Các nghiên cứu sâu hơn đã chỉ ra rằng các gen virus điều chỉnh sự biểu hiện của gen mã hóa protein bằng cách điều chỉnh mức độ lncRNA của tế bào, cuối cùng thúc đẩy sự lây nhiễm virus Ví dụ, lncRNA PAN của Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) ức chế một

số chất điều hòa miễn dịch của vật chủ và điều chỉnh vòng đời của chính chúng Một số lncRNA của tế bào cũng có thể bị virus ức chế để tạo điều kiện cho quá trình sao chép

và biểu hiện gen của chúng Ví dụ, virus inducible lincRNA (VIN) có liên quan đến việc nhân lên và biểu hiện gen của virus đã bị các virus cúm A ức chế để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhận của chúng NEAT1 là một ncRNA cảm ứng virus (VINC), được báo cáo lần đầu tiên trong bệnh viêm não Nhật Bản và nhiễm virus dại ở chuột Sự biểu hiện của NEAT1 đã bị thay đổi sau khi nhiễm HIV-1, giảm biểu hiện của NEAT1 làm tăng khả năng nhân lên của virus thông qua việc tăng cường di chuyển từ nhân sang tế bào chất của Rev-phụ thuộc INS- có mang HIV-1 mRNAs [91]

LncRNA và virus Dengue

Trong quá trình lây nhiễm DENV, các ncRNA nói chung và lncRNA nói riêng cũng đóng vai trò quan trọng Các RNA không mã hóa này đóng vai trò như một antivirus, bảo vệ cơ thể dựa trên cơ chế miễn dịch bẩm sinh chống lại sự lây nhiễm DENV và điều hòa mức độ biểu hiện Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chúng có mức biểu hiện khác nhau trên những mức độ bệnh khác nhau, ví dụ nghiên cứu của Zhong và cs

đã phát hiện có 215 lncRNA có biểu hiện khác biệt ở bệnh nhân sốt Dengue mức độ nhẹ

và 225 lncRNA có mức biểu hiện khác nhau ở bệnh nhân sốt Dengue có dấu hiệu cảnh báo [95] LncRNA NEAT1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1) là một lncRNA

có liên quan tới mức độ bệnh của sốt Dengue, knockdown lncRNA NEAT1 ức chế sự nhân lên của DENV Trong một nghiên cứu khác, muỗi sau bị nhiễm DENV2, 72 loại lincRNA đã tăng mức độ biểu hiện để ức chế sự nhân lên của virus trong tế bào Quá trình làm ức chế lincRNA 1317 qua trung gian RNAi dẫn đến tăng cường khả năng sao chép của virus, điều này có thể cho thấy khả năng tham gia của nó trong quá trình bảo

vệ chống virus của vật chủ [58] Nghiên cứu của Long và cs phát hiện thấy sau khi nhiễm DENV-3, có 42 loại lncRNA có mức độ biểu hiện tăng lên, trong khi đó có 29 lncRNA giảm mức biểu hiện [39]

1.2.4 Vai trò của lncRNA EPB41L4A-AS1

LncRNA EPB41LAS1 (erythrocyte membrane protein band 4.1-like

4A-antisense 1) là một lncRNA nằm trong NST 5q22.2 Gen EPB41L4A-AS1 bao gồm 3 exon có tổng chiều dài DNA hơn 3,5 kb (ID gen 114915) và mã hóa cho một số protein

có kích thước nhỏ như outer mitochondrial membrane (OMM) protein, TIGA1

(transcript induced by growth arrest 1) [80, 98] LncRNA EPB41L4A-AS1 có vai trò tham gia điều hòa gen p53 và PGC-1alpha (peroxisome proliferator-activated receptor

và tăng sinh của các tế bào khối u và có liên quan chặt chẽ với quá trình chuyển hóa tế

bào (Bảng 1)

Bảng 1 Các nghiên cứu về lncRNA EPB41L4A-AS1

2023 Yan và cs

[84]

LncRNA EPB41L4A-AS1 có thể thúc đẩy sự tiến triển của ung thư xương và đóng vai trò như một dấu ấn sinh học chẩn đoán và tiên lượng bệnh

2022 Yang và

cs [85]

Biểu hiện EPB41L4A-AS1 ở các mô khối u thấp hơn đáng kể so với các mô không ung thư lân cận Sự biểu hiện quá mức của EPB41L4A-AS1 làm giảm đáng kể sự phát triển của các tế bào ung thư vú

2021 Bin và cs

[7]

EPB41L4A-AS1 đã ức chế sự tăng sinh, di cư, xâm lấn và chuyển tiếp biểu mô-trung mô của các tế bào ung thư đại trực tràng

2021 Wang và

cs [80]

Sự giảm biểu hiện của EPB41L4A-AS1 trong PBMC gây ra bởi tình trạng glucose cao có thể được sử dụng như một dấu hiệu cho thấy tình trạng viêm mãn tính ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2

Năm Tác giả Vai trò

2019 Zhu và cs

[98]

Sự biểu hiện quá mức EPB41L4A-AS1 ức chế quá trình đường phân nhưng làm tăng sự phụ thuộc vào quá trình oxy hóa axit béo trong quá trình chuyển hóa ty thể và ức chế hiệu ứng Warburg, cần thiết cho sự phát triển nhanh chóng của nhung mao nhau thai, dẫn đến sẩy thai

Trong các tế bào khối u, biểu hiện của EPB41L4A-AS1 có liên quan đến quá trình chuyển hóa khối u qua trung gian p53, đồng thời thúc đẩy quá trình đường phân

và chuyển hóa glutamine cũng như hiệu ứng Warburg LncRNA EPB41L4A-AS1 hoạt động như một gen gây ung thư bằng cách điều chỉnh con đường Rho/ROCK trong ung thư đại trực tràng [7] Ở bệnh ung thư vú, lncRNA này đóng vai trò như là một gen ức chế khối u thông qua sự điều chỉnh tăng sinh, di căn và quá trình chết theo chương trình của các tế bào [85] LncRNA EPB41L4A-AS1 còn có liên quan chặt chẽ với tình trạng viêm ở bệnh đái tháo đường type 2 và mức độ giảm biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 có thể được sử dụng như một yếu tố tiên lượng về tình trạng viêm mãn tính và các biến chứng mạch máu do tiểu đường có thể xảy ra ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 [80] LncRNA EPB41L4A-AS1 có tương quan với kích thước khối u, các giai đoạn lâm sàng của bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ và sự biểu hiện quá mức của lncRNA EPB41L4A-AS1 làm giảm sự tăng sinh tế bào [18]

Viêm nhiễm đóng vai trò rất quan trọng trong phản ứng miễn dịch khi cơ thể bị nhiễm virus, trong đó có virus Dengue Đây là một quá trình bảo vệ tự nhiên nhằm loại bỏ tác nhân gây bệnh và sửa chữa những tổn thương do virus LncRNA EPB41L4A-

AS1 điều chỉnh phản ứng viêm của các tế bào đơn nhân máu ngoại vi ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2 Biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 cho thấy mối tương quan nghịch có ý nghĩa với các yếu tố gây viêm Giảm biểu hiện EPB41L4A-AS1 sẽ làm tăng biểu hiện của các yếu tố gây viêm khi nồng độ glucose không đổi cũng như sau khi điều trị bằng lipopolysaccharide [80] LncRNA này còn có thể có liên quan đến tín hiệu cytokine và đáp ứng viêm quá mức trong viêm phổi nặng do SARS CoV-2 [46] Nghiên cứu của Mukherjee và cộng sự gợi ý rằng lncRNA có thể tương tác mạnh mẽ với các gen liên quan đến cytokine và các tương tác của chúng rất quan trọng để tạo ra các đáp ứng rối loạn miễn dịch Các tác giả cũng đưa ra giả thuyết rẳng sự giải phóng cytokine bất thường là yếu tố thúc đẩy sự điều chỉnh tăng của lncRNA này, điều này có thể ảnh hưởng tiêu cực đến các phản ứng chống virus từ đó dẫn đến rối loạn chức năng miễn dịch khi nhiễm COVID-19 nặng [46] Trong bối cảnh đại dịch COVID-19, quá trình viêm quá mức, đặc biệt là hiện tượng "bão cytokine" (cytokine storm), là yếu tố quan trọng gây nên các biến chứng nghiêm trọng ở bệnh nhân LncRNA EPB41L4A-AS1 được cho là có khả năng giảm mức độ viêm nhiễm bằng cách điều chỉnh biểu hiện của các cytokine và kiểm soát phản ứng miễn dịch, từ đó giúp giảm nguy cơ xảy ra các biến chứng nghiêm trọng Với vai trò điều hòa phản ứng viêm trong cả đái tháo đường type

2 và nhiễm SARS-CoV-2, lncRNA EPB41L4A-AS1 là một ứng viên đầy triển vọng cho các nghiên cứu tiếp theo Việc hiểu rõ hơn về cách lncRNA này điều chỉnh các quá trình miễn dịch có thể mở ra các phương pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến viêm mãn tính và các bệnh do virus gây ra Virus Dengue gây ra các phản ứng miễn dịch phức tạp, dẫn đến sự gia tăng cytokine và chemokine, tạo ra phản ứng viêm mạnh mẽ và đôi khi không được kiểm soát, gây ra các biến chứng nghiêm trọng như sốt xuất huyết Dengue hoặc hội chứng sốc Dengue Sự can thiệp của lncRNA EPB41L4A-AS1 có thể giúp điều chỉnh phản ứng viêm này, ngăn chặn tình trạng viêm quá mức và giúp duy trì phản ứng miễn dịch ở mức hợp lý, từ đó ngăn ngừa hoặc giảm thiểu các biến chứng nguy hiểm LncRNA EPB41L4A-AS1 có thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch, đặc biệt trong các bệnh lý liên quan đến viêm mãn tính và nhiễm virus Điều này cho thấy tiềm năng của nó trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới, nhằm kiểm soát tốt hơn phản ứng viêm và giảm thiểu các tác hại liên quan

Như vậy, lncRNA EPB41L4A-AS1 đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện p53, đồng thời thúc đẩy quá trình đường phân và chuyển hóa glutamine cũng như hiệu ứng Warburg [37] Trong khi đó, sốt Dengue có liên quan đến việc tăng cường tiêu thụ đường, và việc ức chế con đường phân giải glucose sẽ làm giảm quá trình tổng hợp RNA của virus Dengue, từ đó giảm giải phóng các virion [25] Do đó, nghiên cứu này bước đầu đánh giá mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 với sốt Dengue để giúp hiểu biết thêm về cơ chế cũng như phát hiện sớm nguy cơ tiến triển nặng ở bệnh nhân nhiễm DENV

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên nhóm bệnh bao gồm 200 bệnh nhân điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103, đã được chẩn đoán sốt Dengue theo hướng dẫn chẩn đoán sốt Dengue của Bộ Y tế Việt Nam 2023 và WHO 2009 [2, 16] và nhóm chứng gồm 100 người khỏe mạnh

Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được thu thập 4ml máu ở giai đoạn nguy hiểm của bệnh (từ ngày 4 đến ngày thứ 6 của bệnh sốt Dengue Trước tiên, các bệnh nhân được chẩn đoán sốt Dengue dựa trên các đặc điểm chính như sau: i) chẩn đoán sơ

bộ ca lâm sàng sốt Dengue: sống/đi đến vùng có dịch, đã bị sốt ≤ 7 ngày; ii) chẩn đoán lâm sàng có các triệu chứng: sốt cao đột ngột và liên tục, nhức đầu, chán ăn, buồn nôn, đau cơ, đau khớp, nhức hai hố mắt, da xung huyết, thường có chấm xuất huyết ở dưới

da, chảy máu chân răng hoặc chảy máu mũi; iii) cận lâm sàng có các đặc điểm như chỉ

số hematocrit (HCT) bình thường hoặc tăng, số lượng tiểu cầu có khuynh hướng giảm dần, số lượng bạch cầu thường giảm, chỉ số Aspartate aminotransferase (AST) và alanine aminotransferase (ALT) thường tăng Sau đó, các bệnh nhân được chia làm 3 mức độ [2, 16, 31] bao gồm 75 bệnh nhân mắc sốt Dengue mức độ nhẹ (DF), 75 bệnh nhân thuộc nhóm sốt Dengue có dấu hiệu cảnh báo (DWS) và 50 bệnh nhân mắc sốt Dengue nặng (SD) Cụ thể, ở nhóm DF, các bệnh nhân sốt Dengue có các biểu hiện lâm sàng như sốt cao đột ngột liên tục từ 2 - 7 ngày, có ít nhất 2 trong số các dấu hiệu sau: biểu hiện xuất huyết, nhức đầu, chán ăn, buồn nôn, da xung huyết, phát ban, đau cơ, đau khớp, nhức hai hốc mắt và có các dấu hiệu cận lâm sàng: HCT bình thường (không có biểu hiện cô máu) hoặc tăng, số lượng tiểu cầu bình thường hoặc giảm, số lượng bạch cầu thường giảm Các bệnh nhân DWS CÓ các triệu chứng lâm sàng của sốt Dengue, kèm theo các dấu hiệu cảnh báo: Vật vã, lừ đừ, li bì, đau bụng vùng gan hoặc ấn đau vùng gan, gan to > 2cm dưới bờ sườn, nôn nhiều, xuất huyết niêm mạc, tiểu ít, HCT tăng cao, tiểu cầu giảm nhanh chóng, AST/ALT ≥ 400 U/l, tràn dịch màng phổi, màng bụng trên siêu âm hoặc Xquang Khi bệnh nhân có một trong các biểu hiện sau: thoát huyết tương nặng dẫn đến sốc giảm thể tích (sốc sốt Dengue), ứ dịch ở khoang màng phổi và ổ bụng nhiều; xuất huyết nặng; suy tạng thì được phân loại vào nhóm SD

Nhóm chứng gồm 100 người khỏe mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu với các đặc điểm như sau: Người khỏe mạnh không mang thai đối với phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ, không có triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt Dengue, tiền sử không mắc bệnh: viêm gan, ung thư, các bệnh tự miễn, suy thận, các bệnh có thể gây xuất huyết (xuất huyết giảm tiểu cầu, bệnh Hemophilia, xơ gan…) và có xét nghiệm tổng phân tích máu, sinh hóa máu có giá trị bạch cầu, hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu, ure, creatinin, enzym gan AST, ALT trong giới hạn bình thường

Nghiên cứu đã nhận được sự đồng ý của các bệnh nhân và người hiến máu tham gia

2.1.2 Hóa chất và trang thiết bị

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm mẫu plasmid chứa trình tự gen mã hóa lncRNA EPB41L4A-AS1 (pJET-EPB41L4A-AS1) được cung cấp

bởi TS Ella Sklan (Hình 8); tế bào khả biến E coli DH5-T1 (one shot max efficiency

DH5-T1) (Invitrogen, Mỹ) được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng gen; Kit tách

plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit, enzyme giới hạn BglII, Kit chuyển cDNA

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, dung dịch master mix Applied Biosystems™ Fast SYBR™ Green Master Mix (Thermo Scientific, Mỹ); Kit tách chiết RNA tự động abGenix™ Viral DNA and RNA Extraction Kit (AITbiotech, Singapore), và một số hóa chất khác

Nghiên cứu sử dụng các thiết bị chính như máy tách RNA tự động abGenix của hãng AITbiotech, máy Real-time PCR Rotor-gene Q của hãng Quiagen, máy PCR hai block nhiệt Mastercycler nexus GX2 sản xuất bởi Eppendorf, máy đo quang phổ SpectraMax Quickdrop (Molecular Devices) (Mỹ) và các dụng cụ trang thiết bị cơ bản khác thuộc Phòng An toàn Sinh học, Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y

Hình 8 Cấu trúc vector pJET-EPB41L4A-AS1

Nguồn: TS Ella Sklan

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ được tóm tắt dưới đây:

Hình 9 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2 Xây dựng dải nồng độ chuẩn

Để phản ứng real-time PCR có thể xác định được chính xác số lượng bản copies đích ban đầu có trong mẫu thử thì cần phải tiến hành cùng lúc với các mẫu chuẩn đã được biết trước số lượng DNA đích ban đầu Trong nghiên cứu này, mẫu chuẩn đã được biết trước số lượng DNA đích ban đầu là các mẫu chuẩn được pha loãng theo hệ số pha loãng 10 lần từ DNA có nguồn gốc từ plasmid tái tổ hợp đã được chèn đoạn gen đặc hiệu mã hóa cho lncRNA EPB41L4A-AS1 Quá trình này gồm các bước cụ thể như sau:

Biến nạp vector vào tế bào khả biến E coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt

Các giọt thấm chứa plasmid trên giấy lọc Whatman được cắt theo từng khoanh, đặt vào ống eppendorf 1,5 ml 60 µl đệm AE buffer được bổ sung, tiến hành trộn nhẹ cho mẫu được ngấm đều dung dịch đệm, ly tâm nhanh, thu dịch nổi chứa plasmid 3 µl

dịch plasmid được bổ sung vào tế bào E coli khả biến, trộn nhẹ và để trên đá 30 phút

tạo điều kiện cho vector bám trên thành tế bào, sau đó được sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây và được chuyển ngay trên đá 2 phút 500 µl môi trường LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp, lắc 225 vòng/phút ở 37oC trong 60 phút Sử dụng 100 µl dung dịch biến nạp cấy trải trên môi trường LBA đặc có kháng sinh ampicilin (100 µg/ml) và nuôi trong tủ ấm, ủ đĩa ở 37oC qua đêm

Khuẩn lạc mọc trên môi trường LBA đặc được nuôi trong 5 ml dung dịch LB lỏng, có bổ sung ampicilin (100 µg/ml), lắc 200 vòng/phút, qua đêm Ly tâm lạnh 4oC,

8000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào

Tách chiết và định lượng plasmid

Một khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên môi trường LBA đặc được nuôi trong 5 ml dung dịch LB lỏng, có ampicilin (100 µg/ml), lắc 200 vòng/phút, qua đêm DNA plasmid trong tế bào được tách chiết bằng Kit GeneJET Plasmid Miniprep (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Cụ thể, 5 ml dịch tế bào nuôi cấy qua đêm được ly tâm trong 5 phút, tốc độ 8000 vòng/phút, 4°C để thu sinh khối tế bào và hoà tủa thu được trong 250

µl Buffer 1 Toàn bộ hỗn hợp sau đó được chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml và được bổ sung 250 µl đệm Buffer 2, trộn đều để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid Hỗn hợp (trong suốt) được trung hòa bằng cách thêm 350 µl đệm Buffer 3 đã được làm lạnh, đảo đều 3 đến4 lần Dịch nổi được thu bằng cách ly tâm trong 10 phút, tốc độ 13.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng Sau đó toàn bộ dịch nổi được hút và nạp lên binding column Cột được ly tâm trong 1 phút, ở 13.000 vòng/phút, nhiệt độ phòng, dịch chảy qua cột được loại bỏ Cột được rửa tiếp bằng cách thêm 500µl Wash soltuion và ly tâm trong thời gian 1 phút ở 13.000 vòng/phút, nhiệt độ phòng, dịch chảy qua cột được loại bỏ Cột được ly tâm tiếp trong 1 phút ở 13.000 vòng/phút, nhiệt độ phòng để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa và sau đó cột được chuyển sang ống eppendorf 1,5ml Cuối cùng 50

µl đệm rửa chiết Eltution Buffer (được cho bổ sung, cột được ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

và ly tâm trong thời gian 1 phút ở 12000 vòng/phút, nhiệt độ phòng để thu dung dịch plasmid

Sau khi tách chiết, DNA plasmid tái tổ hợp được cắt kiểm tra bằng enzyme giới

hạn BglII (Thermo Scientific, Mỹ) Thành phần phản ứng cắt bằng enzym BglII bao

gồm: ddH2O (6 l), buffer 10X (1 l), plasmid (2 l) và enzym giới hạn (1 l) Kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose 1,2%

DNA plasmid sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 260 nm (A260) Giá trị A260 =1 tương đương với hàm lượng DNA là 50 µg/ml DNA được xem là có độ sạch cao khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0

Thiết lập bộ mẫu chuẩn DNA

Nồng độ plasmid tái tổ hợp được xác định bằng hệ thống SpectraMax Quickdrop (Molecular Devices, Mỹ) Từ nồng độ (ng/µl) quy đổi thành (copies/µl) dựa trên kích thước của plasmid theo công thức sau:

Số bản sao= 6,022×10

23 (𝑏ả𝑛 𝑠𝑎𝑜𝑚𝑜𝑙 )×𝑙ượ𝑛𝑔 𝐷𝑁𝐴(𝑛𝑔) 𝑘í𝑐ℎ 𝑡ℎướ𝑐 đ𝑜ạ𝑛 𝐷𝑁𝐴 (𝑏𝑝)×660 (

𝑔 𝑚𝑜𝑙

𝑏𝑝 )×10 9Trong đó: 6,022*1023: Số Avogadro

660: Khối lượng trung bình của 1 bp

109: Chuyển đổi sang đơn vị ng

Từ dung dịch DNA plasmid ban đầu, 6 dải nồng độ được pha loãng với hệ số 10 (từ 106-101 copies/l) bằng cách pha loãng plasmid với nước khử ion, được sử dụng để xây dựng đường chuẩn cho phương pháp định lượng real-time PCR Các phản ứng được lặp lại 3 lần bằng máy real-time PCR Rotor-gene (Qiagen, Đức)

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn biểu diễn thể hiện mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn Đây là đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn và chu

kỳ ngưỡng tương ứng Từ điều kiện đã tối ưu trong phản ứng real-time PCR nghiên cứu tiến hành xây dượng đường chuẩn trên dải nồng độ 106-101 copies/l Quá trình phân tích đường chuẩn, cần xem xét các điều kiện sau:

- Hệ số tuyến tính R2 nằm trong khoảng 0,960-1,000, tốt nhất 0,99-1,00

- Hiệu suất nhân bản (PCR efficiency): phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 110%

95 Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng 95 3 đến 95 4, tốt nhất 95 3,3 đến 95 3,6 [19]

2.2.4 Tách chiết RNA tổng số

Từ các mẫu huyết tương thu thập được, nghiên cứu tiến hành tách chiết RNA bằng phương pháp từ tính sử dụng Kit abGenix™ Viral DNA and RNA Extraction Kit (AITbiotech, Singapore) trên hệ thống tách chiết tự động abGenix Nguyên lý của phương pháp này là dựa vào việc sử dụng hạt từ với bề mặt hạt được phủ một lớp sillica

có ái lực liên kết chọn lọc với nucleic axit Trong khi các tạp chất khác không thể liên kết với hạt từ sẽ nằm trong dung dịch và sau tiến trình rửa 3 lần qua dung dịch rửa sẽ giúp loại bỏ các tạp chất còn sót lại Quy trình tách chiết tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đầu tiên, các đĩa được lắc nhẹ để trộn đều các hạt từ Sau đó, 200 µl huyết tương được bổ sung vào giếng tương ứng trong cột thứ 1 và thứ 7 của đĩa Khi đã bổ sung 16 mẫu vào mỗi đĩa, đĩa được đặt trong hệ thống tách chiết tự động abGenix với quy trình tách chiết đã được thiết lập Các mẫu được ủ với 800 µl dung dịch đệm Lysis, rửa bằng 700 µl dung dịch Wash Buffer 1 và 800 µl dung dịch Wash Buffer 2, sau đó

80 µl Elution đã được sử dụng để thu được RNA ở cột thứ 6 và 12 của đĩa Với 200 uL mẫu huyết tương ban đầu, thu được 80 μl RNA Độ tinh khiết và nồng độ RNA được kiểm tra bởi Scandrop2 (Analytik Jena, Đức) sau đó bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng

2.2.5 Tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA tổng số

cDNA được tổng hợp từ khuôn RNA bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hỗn hợp thành phần phản ứng gồm 1 µl Random Hexamer primer (100μM), 1 µl ddH2O, 10 µl RNA template được trộn đều, ủ tại 65°C trong 5 phút Sau đó hỗn hợp tiếp tục được làm lạnh và bổ sung các thành phần gồm 4 µl 5X Reaction Buffer, 1 µl RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl), 2 µl dNTP mix (10 mM) và 1 µl RevertAid M-MuLV RT (200 U/µl) Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ tại 42°C trong 60 phút cho enzyme hoạt động tổng hợp cDNA và xử lý nhiệt tại 70°C trong 5 phút để bất hoạt eznyme Sản phẩm phản ứng có thể được dùng trực tiếp cho phản ứng real-time PCR hoặc được bảo quản tại -20°C cho đến khi sử dụng

2.2.6 Đánh giá mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 bằng phản ứng time PCR

Mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 được xác định bằng kĩ thuật

real-time PCR định lượng tuyệt đối sử dụng cặp mồi được thiết kế có trình tự trong Bảng 2

Bảng 2 Trình tự mồi khuếch đại lncRNA EPB41L4A-AS1

EPB41L4A-AS1_F GGGAGCTTCGTCGATTTGTG Nhóm nghiên cứu EPB41L4A-AS1_R CGGTAAGGCCTTTTCACTGAC Nhóm nghiên cứu Trong đó, nghiên cứu sử dụng master mix là Fast SYBR™ Green Master Mix Master mix này có ưu điểm tiết kiệm thời gian cho kết quả chỉ trong vòng 35 phút, có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được bổ sung UDG để giảm nhiễm trong phản ứng

real-time PCR Thành phần của phản ứng real-real-time PCR được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3 Thành phần tối ưu của phản ứng real-time PCR

Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối

Hỗn hợp của mỗi phản ứng được trộn đều và thực hiện trong chu trình nhiệt như

ở Bảng 4 Chu trình gồm giai đoạn kích hoạt ban đầu enzyme tại 95ºC trong 5s, tiếp

theo sau là 45 chu kỳ biến tính ở 95ºC trong 20 giây, gắn mồi ở 60ºC 30 giây và phân tích đường cong nóng chảy từ 65ºC đến 99ºC

Từ kết quả Ct ban đầu trong phản ứng real time RT-PCR, nghiên cứu tiến hành xác định nồng độ của lnc RNA trong huyết tương (copies/ml huyết tương) theo công

thức:

C=Q × 𝐕𝐜𝐃𝐍𝐀

𝐕𝐏𝐂𝐑 × 𝟏

𝐕𝐞𝐱𝐭 [72]