Đánh giá mức Độ biểu hiện của rna dài không mã hóa epb41l4a as1 Ở bệnh nhân sốt xuất huyết dengue (tt)

Biểu hiện khác biệt của lncRNA có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học đáng tin cậy về mức độ nghiêm trọng của bệnh trong các giai đoạn nhiễm trùng khác nhau cũng như trong quá trìn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thùy Dịu

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA RNA DÀI KHÔNG

MÃ HÓA EPB41L4A-AS1 Ở BỆNH NHÂN SỐT XUẤT

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

- ĐHQGHN

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Hoàng Văn Tổng, Học viện Quân y

2 PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Loan, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên – ĐHQGHN

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Hải Hà

Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

Phản biện 2: TS Trương Nhật Mỹ

Trung tâm nghiên cứu Việt Đức - Bệnh viện TW quân đội 108

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN

vào hồi 9 giờ, ngày 17 tháng 9 năm 2024

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Sốt Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến, được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công nhận như một vấn đề nghiêm trọng với sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới

Căn bệnh truyền nhiễm này gây ra bởi một trong bốn týp huyết thanh của virus Dengue Phổ bệnh lâm sàng của bệnh khá đa dạng từ không có triệu chứng đến một loạt các hội chứng với các biểu hiện lâm sàng nghiêm trọng có thể gây tử vong [10] Các phương pháp điều trị hiện nay hoàn toàn dựa trên điều trị triệu chứng, đòi hỏi mức độ chăm sóc bệnh nhân cao và chưa có thuốc điều trị hiệu quả Tiên lượng kịp thời có thể ngăn ngừa tử vong liên quan đến sốt Dengue [7] Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các dấu ấn sinh học và sử dụng các dấu ấn sinh học trong chẩn đoán mức độ, tiên lượng và theo dõi đáp ứng điều trị sốt Dengue là hoàn toàn cần thiết

Trong những năm gần đây, liệu pháp dựa trên axit nucleic nổi lên như một phương pháp đầy hứa hẹn để chẩn đoán và điều trị sớm bệnh sốt Dengue [9] Biểu hiện khác biệt của lncRNA có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học đáng tin cậy về mức độ nghiêm trọng của bệnh trong các giai đoạn nhiễm trùng khác nhau cũng như trong quá trình tiến triển của bệnh LncRNA EPB41L4A-AS1 là một lncRNA có liên quan đến chuyển hóa tế bào và phản ứng miễn dịch, mức biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 có liên quan trong nhiều bệnh ung thư, tuy nhiên ở những bệnh truyền nhiễm, cụ thể là bệnh sốt Dengue còn khá hạn chế Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá mức độ

biểu hiện của RNA dài không mã hóa EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue” với hai mục tiêu:

1 Xác định được mức độ biểu hiện của lncRNA AS1 ở bệnh nhân sốt Dengue với các mức độ bệnh khác nhau

EPB41L4A-2 Phân tích được mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với đặc điểm lâm sàng, cận lâm

sàng và giá trị tiên lượng ở bệnh nhân Dengue

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về sốt Dengue

1.1.1 Dịch tễ học của bệnh sốt Dengue

1.1.1.1 Tình hình mắc sốt Dengue trên thế giới

Theo báo cáo của WHO, sốt Dengue hiện đang lưu hành ở 129 quốc gia; có 3,6 tỷ người sống trong các khu vực có nguy cơ truyền bệnh, ước tính có khoảng 390 triệu người mắc bệnh mỗi năm và 96 triệu trường hợp có triệu chứng lâm sàng.[16] Hiện nay, sốt Dengue lưu hành ở hầu hết các khu vực đông dân cư nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, trong đó chủ yếu là ở khu vực Đông Nam Á, châu Mỹ và Tây Thái Bình Dương và ít phổ biến hơn ở châu Phi và Đông Địa Trung Hải [14]

1.1.1.2 Tình hình mắc sốt Dengue ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia chịu hậu quả nặng nề của bệnh sốt Dengue Năm 2022, Việt Nam ghi nhận số ca mắc tăng gấp 5 lần, số ca tử vong gấp 5.3 lần so với năm 2021 Trong khi đó,

năm 2023 đã ghi nhận số ca mắc cao bất thường lên tới 172.000 trường hợp

1.1.2 Virus Dengue

1.1.2.1 Phân loại virus Dengue

Nhiễm virus Dengue (DENV) là nguyên nhân chính gây ra

bệnh sốt Dengue, các vectơ chính truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti

và Aedes Albopictus [8, 13] DENV được phân loại thành 4 týp huyết

thanh DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4 dựa trên các đặc điểm

di truyền và kháng nguyên với sự khác biệt về nucleotide giữa các nhóm là khoảng 30%[5]

1.1.2.2 Cấu trúc của virus Dengue

Cấu trúc bộ gen của DENV là một chuỗi đơn RNA (ssRNA) phân cực dương dài khoảng 11 kb, được chia thành ba phần: vùng 5′ UTR (vùng chưa được dịch mã), ORF (khung đọc mở) và vùng 3′ UTR

1.1.2.3 Vòng đời của virus Dengue

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán sốt Dengue

Nhiễm bất kỳ loại nào trong số bốn loại virus Dengue đều dẫn đến một loạt các triệu chứng, từ sốt nhẹ đến các triệu chứng nặng đe dọa tính mạng Trong giai đoạn đầu của bệnh, sốt Dengue có thể biểu hiện dưới dạng sốt nhẹ “giống như cúm” với các triệu chứng tương tự như các bệnh khác như sởi, Zika, sốt vàng da và sốt rét Do đó, việc chẩn đoán sớm và chính xác là điều cần thiết để quản lý ca bệnh Chẩn đoán sốt

Dengue là một thách thức, phụ thuộc phần lớn vào giai đoạn nào trong quá trình lây nhiễm của bệnh nhân

1.2 Giới thiệu về RNA dài không mã hóa

1.2.1 Phân loại các lncRNA

Các lncRNA có thể được chia thành nhiều nhóm khác nhau dựa trên

sự phân bố độ dài của chúng

1.2.2 Cơ chế hoạt động của các lncRNA

Cơ chế hoạt động của các lncRNA được chia thành các nhóm chính bao gồm điều hòa phiên mã, điều hòa sau phiên mã, tái cấu trúc chất nhiễm sắc và các cơ chế hoạt động khác

1.2.3 Vai trò của lncRNA trong nhiễm virus

Nhiễm virus vẫn là một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng đe dọa tính mạng của hàng trăm nghìn người mỗi năm Hiểu được cơ chế sao chép, đóng gói và lây nhiễm của virus vào các tế bào vật chủ có thể cung cấp các chiến lược mới để kiểm soát sự lây nhiễm của virus Là các phân tử điều hòa mạnh, lncRNA đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học khác nhau, bao gồm cả tương tác giữa virus và vật chủ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ra rằng lncRNA có vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm virus và phản ứng chống virus của vật chủ trong các phản ứng miễn dịch [36, 52, 90]

1.2.4 Vai trò của lncRNA EPB41L4A-AS1

LncRNA EPB41L4A-AS1 (erythrocyte membrane protein band like 4A-antisense 1) là một lncRNA nằm trong NST 5q22.2 Gen

4.1-EPB41L4A-AS1 bao gồm 3 exon có tổng chiều dài DNA hơn 3,5 kb

(ID gen 114915) và mã hóa cho một số protein có kích thước nhỏ như

outer mitochondrial membrane (OMM) protein, TIGA1 (transcript

induced by growth arrest 1) [15, 18] LncRNA EPB41L4A-AS1 có vai trò tham gia điều hòa gen p53 và PGC-1alpha (peroxisome

proliferator-activated receptor gamma-coactivator 1-alpha)

LncRNA EPB41L4A-AS1 chủ yếu hoạt động như một lncRNA liên quan đến chuyển hóa tế bào và phản ứng miễn dịch, sự điều hòa giảm của lncRNA này trong các tế bào ung thư gây ra sự phụ thuộc vào glutamine và thúc đẩy quá trình đường phân Hiện nay đã có nghiên cứu chỉ ra rằng lncRNA EPB41L4A-AS1 có vai trò quan trọng trong nhiều loại ung thư ở người, lncRNA EPB41L4A-AS1 có thể ức chế

sự phát triển và tăng sinh của các tế bào khối u và có liên quan chặt chẽ với quá trình chuyển hóa tế bào

Như vậy, lncRNA EPB41L4A-AS1 đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện p53, đồng thời thúc đẩy quá trình đường phân

và chuyển hóa glutamine cũng như hiệu ứng Warburg [6] Trong khi đó, sốt Dengue có liên quan đến việc tăng cường tiêu thụ đường, và việc ức chế con đường phân giải glucose sẽ làm giảm quá trình tổng hợp RNA của virus Dengue, từ đó giảm giải phóng các virion [3] Do đó, nghiên cứu này bước đầu đánh giá mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 với sốt Dengue để giúp hiểu biết thêm

về cơ chế cũng như phát hiện sớm nguy cơ tiến triển nặng ở bệnh nhân nhiễm DENV

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên nhóm bệnh bao gồm 200 bệnh nhân điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103, đã được chẩn đoán sốt Dengue theo hướng dẫn chẩn đoán sốt Dengue của Bộ Y tế Việt Nam

2023 và WHO 2009 [1, 2] và nhóm chứng gồm 100 người khỏe mạnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ được tóm tắt dưới đây:

Hình 1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2 Xây dựng dải nồng độ chuẩn

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn

2.2.4 Tách chiết RNA tổng số

2.2.5 Tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA tổng số

2.2.6 Đánh giá mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 bằng phản ứng real-time PCR

2.2.7 Phân tích kết quả

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới tính của đối tượng nghiên cứu

Độ tuổi trung bình của các nhóm bệnh lần lượt là 37,8±15,73 (DF), 45,16±16,12 (DWS) và 50,78±19,63 (SD) Độ tuổi tăng dần theo từng mức độ bệnh, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về độ tuổi mắc bệnh giữa các nhóm DF và DWS, DF và SD (p<0,001) Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tuổi khi so sánh giữa nhóm DWS

và SD (p>0,05)

3.1.2 Đặc điểm xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue

Chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời đóng vai trò quan trọng để giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong nói chung liên quan đến sốt Dengue

Vì vậy, để hiểu rõ hơn về tình trạng này, nghiên cứu này tiến hành đánh giá các xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue Kết quả cho thấy tỷ lệ dương tính với NS1 cao nhất ở nhóm DWS (90,2%) so với nhóm DF (86,7%) và nhóm SD (84%) Ở kết quả xét nghiệm kháng thể đặc hiệu DENV, tỷ lệ dương tính với kháng thể IgM tăng dần từ nhóm DF

(26,7%) đến nhóm DWS (29,3%) và cao nhất ở nhóm SD với tỷ lệ 54%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05 Tỷ lệ dương tính với kháng thể IgG cũng tăng dần theo mức độ bệnh với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05

3.2 Thiết lập đường chuẩn của phản ứng real-time PCR để xác định mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1

3.2.1 Tạo mẫu chuẩn mẫu mang gen đích mã hóa lncRNA EPB41L4A-AS1

Sau khi biến nạp, tế bào E coli DH5α được nuôi cấy trên môi

trường LBA đặc Kết quả cho thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng (chứa plamid tái tổ hợp) mọc trên các đĩa LB chọn lọc có bổ sung ampicilin Plasmid từ khuẩn lạc đã được tinh sạch và cắt kiểm tra bằng

enzyme giới hạn BglII Dựa trên bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid tái tổ hợp pJET-EPB41L4A-AS1, enzyme BglII được lựa

chọn do không có vị trí cắt trên đoạn chèn mà chỉ có hai vị trí cắt trên vector pJET1.2, nằm ở hai đầu của vùng đa điểm cắt (vị trí nucleotide

12 và 2940 của vector pJET1.2) Vì vậy, khi plasmid tái tổ hợp được

cắt bằng enzyme BglII sẽ cho hai băng có kích thước khoảng 3 kb

(vector) và đoạn chèn 376 bp Do đó, bước đầu có thể khẳng định, những dòng tế bào này đã mang plasmid tái tổ hợp pJET-EPB41L4A-AS1

Nồng độ plasmid pJET-EPB41L4A-AS1 có chứa đoạn chèn kích thước 376 bp có giá trị 90 ng/µl Từ công thức tính ở trên có thể xác định được số phân tử của plasmid tái tổ hợp là: 2,4x1010 copies/µl

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn của phản ứng real-time PCR

Hình 2 Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa chu kỳ ngưỡng

với số bản copies của mẫu chuẩn

Dựa vào kết quả Ct trung bình sau 5 lần chạy ở nồng độ mẫu chuẩn 106-101 copies/µl, nghiên cứu đã tiến hành thiết lập phương trình được đường chuẩn Đường chuẩn được biểu thị bằng một hàm số thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa chu kỳ ngưỡng (Y = Ct) với log10 của số lượng lncRNA đích ban đầu có trong ống phản ứng (X = log10 Sq) là: y = -3,5075x + 36,934 Đường chuẩn xây dựng được có

hệ số tương quan R2 = 0,999; hiệu suất khuếch đại E = 94% và hệ số dốc S = -3,528 Bên cạnh đó, kết quả phân tích nhiệt độ tách chuỗi (melting curve) cho thấy, các nồng độ khác nhau của DNA chỉ có một đỉnh tín hiệu huỳnh quang Như vậy, điều kiện phản ứng RT-PCR đã cho phép khuếch đại đặc hiệu gen đích và đường chuẩn với dải nồng

độ 106-101 copies/µl là chính xác và đáng tin cậy

3.3 Đặc điểm biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 của các nhóm đối tượng nghiên cứu

Trên cơ sở điều kiện phản ứng real-time RT-PCR thiết lập được, nghiên cứu đã tiến hành định lượng mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 trong huyết tương của 300 người tham gia nghiên cứu dựa trên công thức của Singh và cs [12], nghiên cứu đã tính toán được công thức tính nồng độ của lncRNA EPB41L4A-AS1

trong huyết tương (copies/ml huyết tương) như sau:

Kiểm định thống kê sử dụng:Man-Whitney-U test

Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện của lncRNA AS1 tăng dần theo mức độ nặng của bệnh sốt Dengue Cụ thể, mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 cao nhất ở nhóm SD là 21,57

EPB41L4A-± 19,8 (105copies/ml), tiếp theo là nhóm DWS 4,55 ± 5,8 (105copies/ml), nhóm DF 1,58 ± 2,22 (105copies/ml) và thấp nhất là ở

nhóm chứng 0,59 ± 1,91 (105copies/ml) Sự khác biệt giữa các nhóm đều có ý nghĩa thống kê với p<0,001

3.4 Mối liên quan giữa mức độ biểu của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân sốt Dengue 3.4.1 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với tuổi và giới

Kết quả phân tích cho thấy mức độ biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 có mối tương quan thuận mức độ yếu với độ tuổi mắc bệnh của bệnh nhân sốt Dengue với hệ số tương quan Spearman rho=0,221 và p<0,05 Tuy nhiên, không có sự khác biệt giữa nồng độ lncRNA EPB41L4A-AS1 huyết tương giữa 2 giới nam và nữ với p>0,05 (Mann Whitney U test)

Hình 4 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA AS1 với tuổi theo hệ số tương quan Spearman (A) và giới theo

EPB41L4A-Mann-Whitney U test (B) 3.4.2 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue

Mức độ biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 tăng cao ở bệnh nhân sốt Dengue dương tính với IgG và IgM, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với nhóm không xuất hiện 2 kháng thể này (tương ứng p<0.05)

Hình 5 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA với xét

nghiệm sốt Dengue ở các nhóm bệnh nhân

Kiểm định thống kê sử dụng Mann Whitney U test

3.4.3 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với đặc điểm xét nghiệm huyết học

Hình 6 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA và chỉ số huyết học ở các nhóm bệnh nhân theo hệ số tương quan Spearman

(A, C) và theo Mann-Whitney U test (B, D)

Phân tích tương quan Spearman cho thấy chỉ số bạch cầu và mức độ biểu hiện của hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 có mối tương quan mạnh (rho=0,227, p<0,05); chỉ số tiểu cầu và mức độ biểu hiện của hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 có mối tương quan nghịch (rho=-0,499, p<0,001)

3.4.4 Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với các xét nghiệm chức năng gan

Ngoài đánh giá mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 với đặc điểm tuổi, giới tính hay đặc điểm huyết học, nghiên cứu còn đánh giá mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của lncRNA này với các xét nghiệm chức năng gan