BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y *************** TIỂU LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BỌ MẮM (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn) Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ HUYỀN Lớp : DH16DY Ngành : Thú y Niên khóa : 2016-2021 TP. Hồ Chí Minh, tháng 7/2021 BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y *************** TRẦN THỊ HUYỀN ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BỌ MẮM (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn) Tiểu luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y Giáo viên hướng dẫn ThS. ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP TP. Hồ Chí Minh, tháng 7/2021 XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ và tên sinh viên thực tập: Trần Thị Huyền. Tên tiểu luận: “Định tính thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây bọ mắm (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn)”. Đã hoàn thành tiểu luận theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các quy định của khoa Chăn Nuôi Thú Y. Ngày……tháng……năm 2021 Giáo viên hướng dẫn ThS. Đặng Thị Xuân Thiệp LỜI CẢM TẠ Trong suốt thời gian học tập và làm việc tại trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tôi đã được trang bị đầy đủ những kiến thức và kĩ năng cần thiết để trở thành một Bác sĩ Thú y. Nguồn động lực đã giúp tôi trưởng thành như ngày hôm nay chính là gia đình, thầy cô và bạn bè. Con mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của bố mẹ, là chỗ dựa tinh thần vững chắc, luôn luôn cho con hạnh phúc, niềm vui và tạo mọi điều kiện cho con học tập được như ngày hôm nay. Với lòng biết ơn vô vàn, con cầu mong bố mẹ luôn vui khỏe và sống đời với con. Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi – Thú y, Bộ môn Khoa học Sinh học Thú y cùng toàn thể thầy cô khoa Chăn nuôi – Thú y đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện cơ sở vật chất cho tôi thực hiện tiểu luận tốt nghiệp này. Bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Đặng Thị Xuân Thiệp đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện tiểu luận. Chân thành cảm ơn BSTY. Lâm Ánh Tuyết, ThS. Trần Thanh Tiến đã giúp đỡ, chia sẻ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm tiểu luận này. Cảm ơn tất cả người thân và bạn bè trong khoa, trong lớp DH16DY đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Trần Thị Huyền TÓM TẮT Đề tài: “Định tính thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây bọ mắm (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn)” đã được tiến hành từ 15/10/2020 đến 15/1/2021 tại phòng thí nghiệm PV201 - Bộ môn Khoa học Sinh học Thú y – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa khi chiết bọ mắm với dung môi nước, tạo cơ sở để sản xuất các sản phẩm bổ sung trong chăn nuôi. Các thành phần hóa học của bọ mắm được định tính bằng các phản ứng hóa học. Khả năng chống oxy hóa được đánh giá thông qua phương pháp thu gom gốc tự do DPPH (1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl), phương pháp ức chế NO (oxid nitric), phương pháp thử năng lực khử sắt (FRAP) và xác định tổng hoạt tính chống oxy hóa. Chỉ tiêu đánh giá khả năng chống oxi hóa là giá trị IC50 (inhibitory concentration), nồng độ ức chế 50% gốc tự do trong khoảng thời gian xác định hoặc mật độ quang (OD) hoặc tổng hoạt tính chống oxy hóa (TAC). TAC được biểu thị bằng số đương lượng của acid ascorbic (mg chất chuẩn/g cao chiết) thông qua mô hình phosphomolypden. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ cây bọ mắm có sự hiện diện của các hợp chất flavonoid, tannin, steroid - triterpenoid, saponin và các hợp chất đường khử. Cao chiết bọ mắm có tiềm năng chống oxy hóa đáng kể so với acid ascorbic và phụ thuộc vào nồng độ. Trong khảo sát thu dọn gốc DPPH, giá trị IC50 của cao chiết là 3639,84 μg/ml, trong khi giá trị IC50 đối với chất chuẩn acid ascorbic là 115,40 μg/ml. Với khả năng ức chế NO, giá trị IC50 của cao chiết là 718,80 μg/ml, trong khi giá trị IC50 đối với acid ascorbic là 37,67 μg/ml. TAC của bọ mắm dao động từ 34,70 ± 2,25 đến 46,39 ± 4,06 mg acid ascorbic/ 1g cao chiết. Hơn nữa, cao chiết cho thấy khả năng khử sắt đáng kể khi tăng dần nồng độ cao chiết, với OD0,5 = 1561,67 μg/ml. MỤC LỤC Xác nhận của giáo viên hướng dẫn i Lời cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng viii Danh sách các hình ix Danh sách các biểu đồ x Chương 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu đề tài 1 1.3 Yêu cầu 1 Chương 2 TỔNG QUAN 2 2.1 Tổng quan về cây bọ mắm 2 2.1.1 Vị trí phân loại 2 2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây bọ mắm Pouzolzia zeylanica (L.) Benn 2 2.1.3 Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng 3 2.1.4 Thành phần hóa học trong cây bọ mắm 3 2.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng 4 2.1.5.1 Tác dụng dược lý 4 2.1.5.2 Công dụng 6 2.2 Hoạt tính chống oxi hóa 6 2.2.1 Gốc tự do và sự oxy hóa 6 2.2.2 Chất chống oxy hóa 8 2.2.3 Cơ chế chống oxy hóa 8 2.2.4 Một số hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính chống oxy hóa 9 2.2.5 Hoạt tính chống oxy hóa của acid ascorbic 10 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 11 2.2.6.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 11 2.2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc NO 12 2.2.6.3 Phương pháp thử năng lực khử sắt (FRAP) 12 2.2.6.4 Phương pháp xác định tổng khả năng chống oxy hóa 13 2.3 Phương pháp chiết xuất và định tính các thành phần hóa học 13 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 15 3.2 Vật liệu thí nghiệm 15 3.2.1 Nguyên liệu 15 3.2.2 Hóa chất 15 3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Quy trình chiết xuất bọ mắm 16 3.3.2 Định tính chiết xuất nước từ cây bọ mắm 16 3.3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 17 3.3.3.1 Khảo sát khả năng thu gom gốc tự do DPPH 17 3.3.3.2 Khảo sát khả năng ức chế gốc NO 18 3.3.3.3 Khảo sát năng lực khử sắt (FRAP) 19 3.3.3.4 Xác định tổng khả năng chống oxy hóa 20 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong dịch chiết toàn phần bọ mắm 22 4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 23 4.2.1 Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH 23 4.2.2 Khả năng ức chế gốc NO 25 4.2.3 Năng lực khử sắt (FRAP) 27 4.2.4 Tổng khả năng chống oxi hóa 28 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 1: CÁCH PHA MẪU VÀ MỘT SỐ HÓA CHẤT 36 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ ĐO OD 38 PHỤ LỤC 3: CÁC BẢNG THỐNG KÊ ANOVA 42 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGTD : Bắt gốc tự do CAT : catalase DPPH : 1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH-H : 1,1 diphenyl-2-picrylhydrazine FRAP : Ferric reducing antioxidant power (năng lực khử sắt) GSH : glutathione IC50 : Inhibitory concentration (nồng ức chế 50%) NED : naphthylethylenediamine-dihydrochloride OD : optical density (mật độ quang) RNS : nitơ phản ứng ROS : oxy phản ứng SNP : natri nitroprusside SOD : superoxide dismutase TAC : total antioxidant capacity (tổng hoạt tính chống oxy hóa) DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong cây bọ mắm 4 Bảng 3.1 Quy trình định tính thành phần hóa học trong bọ mắm 17 Bảng 3.2 Quy trình thực hiện phương pháp DPPH 18 Bảng 3.3 Quy trình thực hiện phương pháp ức chế NO 19 Bảng 3.4 Quy trình thực hiện phương pháp FRAP 20 Bảng 3.5 Quy trình xác định tổng khả năng chống oxy hóa 21 Bảng 4.1 Kết quả định tính thành phần hóa học trong dịch chiết toàn phần bọ mắm 22 Bảng 4.2 Giá trị IC50 (μg/ml) bắt gốc DPPH của acid ascorbic và cao chiết bọ mắm 24 Bảng 4.3 Giá trị IC50 (μg/ml) ức chế NO của acid ascorbic và cao chiết bọ mắm 27 Bảng 4.4 Giá trị hấp thu quang phổ ở từng nồng độ cao chiết 28 Bảng 4.5 Giá trị OD0,5 của cao chiết bọ mắm và acid ascorbic 28 Bảng 4.6 Tổng hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương chất chuẩn của cao chiết bọ mắm 30 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình thái cây bọ mắm 3 Hình 2.2 Phản ứng dập tắt gốc tự do của acid ascorbic (Pehlivan, 2017). 11 Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH (Shalaby và ctv, 2013). 12 Hình 2.4 Phản ứng khử sắt của chất chống oxy hóa (Shalaby, 2013). 13 Hình 3.1 Cây bọ mắm tươi (a) và bọ mắm sau khi phơi khô (b) 15 Hình 4.1 Khả năng bắt gốc tự do của cao chiết bọ mắm (a) và acid ascorbic (b) 23 Hình 4.2 Khả năng ức chế NO của cao chiết bọ mắm (a) và acid ascorbic (b) 25 Hình 4.3 Khả năng khử sắt của cao chiết bọ mắm (a) và acid ascorbic (b) 27 Hình 4.4 Khả năng chống oxy hóa của cao chiết bọ mắm (a) và acid ascorbic (b) 29 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và phần trăm bắt gốc tự do DPPH của cao chiết bọ mắm (a) và acid ascorbic (b) (n=3) 24 Biểu đồ 4.2 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và phần trăm ức chế NO của cao chiết bọ mắm (a) và acid ascorbic (b) (n=3) 26 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Gốc tự do là những hợp chất có khả năng làm hỏng các lớp phân tử sinh học bao gồm acid nucleic, protein và lipid, là thủ phạm gây ra nhiều bệnh tật (Phaniendra và ctv, 2015). Tuy nhiên, các gốc tự do sẽ bị vô hoạt bởi các chất chống oxy hóa, đây là những hợp chất hóa học có thể làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa của các hợp chất khác thông qua một chuỗi các phản ứng (Dương Thanh Liêm, 2010). Do đó, đã có nhiều nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa ở lĩnh vực dinh dưỡng cho người và động vật (Nguyễn Thị Yến Phượng và Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, 2020; Nguyễn Xuân Duy và Hồ Bá Vương, 2013; Omar và ctv, 2020). Các chất có khả năng chống oxy hóa bao gồm hệ thống chất chống oxy hoá nội sinh (protein, enzyme) và chất chống oxy hóa ngoại sinh (Laguerre và ctv, 2007; Shalaby và ctv, 2013). Các chất oxy hóa ngoại sinh này có nhiều trong các nguồn từ thực vật như tỏi, hành tây, nho, trà xanh (Dương Thanh Liêm, 2010). Theo Omar và ctv (2020), việc sử dụng chiết xuất hành tây giàu phenolic làm phụ gia thức ăn trong khẩu phần ăn của gà thịt tăng cường hoạt động chống oxy hóa được thể hiện bằng việc tăng hoạt động của superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và mức glutathione (GSH). Sử dụng phụ phẩm nho tăng cường độ ổn định oxy hóa của thịt và giảm lượng chất phụ gia như vitamin E (Brenes và cs, 2016). Bọ mắm hay còn gọi là thuốc dòi, thuộc chi Pouzolzia, là một cây thuốc quen thuộc trong các bài thuốc cổ truyền của Việt Nam, dùng chữa các bệnh trên hệ hô hấp, tiêu hóa hoặc mụn nhọt (Đỗ Tất Lợi, 2004). Một vài nghiên cứu đã cho thấy bọ mắm chứa các hợp chất polyphenol, là thành phần chống oxy hóa tự nhiên phổ biến (Ghani, 2003; Lê Thanh Thủy, 2007) và đã ứng dụng trong các chế phẩm chăn nuôi. Khi bổ sung chế phẩm chứa thành phần bọ mắm giúp kích thích tăng trưởng trên heo (Lã Văn Kính và ctv, 2012), cải thiện tăng trọng, giảm tiêu tốn thức ăn, tăng tỉ lệ nuôi sống trên gà (Lã Văn Kính và Nguyễn Thị Lệ Hằng, 2012). Một số nghiên cứu trước đã cho thấy khả năng chống oxy hóa của bọ mắm. Tuy nhiên ở các nghiên cứu này, bọ mắm được tách chiết trên các dung môi methanol, ethanol hoặc trên các cao phân đoạn (Hossain và ctv 2017; Võ Thị Tú Anh và ctv, 2017; Wang và ctv, 2017). Việc này gây tốn thời gian, chi phí để tách chiết, loại bỏ dung môi. Do đó, việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cây bằng cách tách chiết các hoạt chất của bọ mắm với dung môi nước, một dung môi an toàn giá rẻ, có thể sử dụng ngay giai đoạn cao toàn phần mà không phải tách chiết phân đoạn để tạo ra những chế phẩm chăn nuôi an toàn, kinh tế là rất cần thiết. Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của ThS. Đặng Thị Xuân Thiệp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Định tính thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây bọ mắm (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn)”. 1.2 Mục đích Định tính thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá và thân cây bọ mắm khi chiết xuất với dung môi nước. 1.3 Yêu cầu Chiết xuất cao bằng dung môi nước từ cây bọ mắm. Định tính thành phần hóa học trong dịch chiết cây bọ mắm. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết bọ mắm. Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cây bọ mắm 2.1.1 Vị trí phân loại Cây bọ mắm hay còn được gọi là cây thuốc dòi, tên khoa học Pouzolzia zeylanica (L.) Benn. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), bọ mắm thuộc: Giới: Thực vật bậc cao (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Liên bộ: Bông (Malvanae) Bộ: Gai (Urticales) Họ: Gai (Urticaceae) Chi: Pouzolzia L. Loài: Pouzolzia zeylanica (L.) Benn 2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây bọ mắm Pouzolzia zeylanica (L.) Benn Cây bọ mắm (Hình 2.1) thuộc thân thảo, có cành mềm mọc trải ra, thân có lông, cao 40 - 90 cm. Lá mọc so le, đôi khi mọc đối, có lá kèm, phiến lá nhỏ hình mác hẹp, trên gân và 2 mặt lá đều có lông đặc biệt là mặt dưới, lá dài 4 - 9 cm, rộng 1,5 - 2,5 cm. Có 3 gân xuất phát từ cuống. Cuống dài 5 mm có lông trắng. Hoa nhỏ màu trắng. Cụm hoa đơn tính mọc thành xim co, ở kẽ lá có các hoa không cuống. Hoa đực có 4 nhị có chỉ nhị trong nụ hoa, hoa cái có vòi nhụy dài, trắng. Quả hình trứng, nhọn, có bao hoa có lông, màu hồng tím (Đỗ Tất Lợi, 2004).
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây bọ mắm
Cây bọ mắm hay còn đƣợc gọi là cây thuốc dòi, tên khoa học Pouzolzia zeylanica (L.) Benn Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), bọ mắm thuộc:
Giới: Thực vật bậc cao (Plantae)
2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây bọ mắm Pouzolzia zeylanica (L.) Benn
Cây bọ mắm (Hình 2.1) thuộc thân thảo, có cành mềm mọc trải ra, thân có lông, cao 40 – 90 cm Lá mọc so le, đôi khi mọc đối, có lá kèm, phiến lá nhỏ hình mác hẹp, trên gân và 2 mặt lá đều có lông đặc biệt là mặt dưới, lá dài 4 - 9 cm, rộng 1,5 - 2,5 cm Có 3 gân xuất phát từ cuống Cuống dài 5 mm có lông trắng Hoa nhỏ màu trắng Cụm hoa đơn tính mọc thành xim co, ở kẽ lá có các hoa không cuống Hoa đực có 4 nhị có chỉ nhị trong nụ hoa, hoa cái có vòi nhụy dài, trắng Quả hình trứng, nhọn, có bao hoa có lông, màu hồng tím (Đỗ Tất Lợi, 2004)
2.1.3 Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng
Trên thế giới bọ mắm phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thấy ở nhiều nước như Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Thái Lan,… Ở Việt Nam cây phân bố từ đồng bằng tới trung du và vùng núi
Bọ mắm là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, thường hay mọc lẫn trong các cây cỏ khác ở trong vườn, ven đường đi và vùng nương rẫy Cây con mọc từ hạt xuất hiện vào cuối mùa xuân, mọc nhanh vào mùa hè, sau khi có hoa quả là tàn lụi Bọ mắm có thể sử dụng toàn thân, cắt bỏ phần rễ, phơi hoặc sấy khô (Viện dƣợc liệu, 2006)
2.1.4 Thành phần hóa học trong cây bọ mắm
Hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học trong bọ mắm còn hạn chế ở nước ta Một vài nghiên cứu khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật đã chỉ ra bọ mắm có nhiều nhóm hoạt chất Bọ mắm là thực vật chứa flavone, flavonoid, tanin, carotene, carotenoid, ascorbic, tartaric, acid malic và pectic, khóang chất và muối của chúng (Ghani, 2003) Ngoài ra, theo Saha và Paul (2012), bọ mắm chứa alkaloid, glycoside, tanin và flavonoid Quá trình nghiên cứu đã tìm các hợp chất trong các nhóm hoạt chất, đƣợc trình bày trong Bảng 2.1
Hình 2.1 Hình thái cây bọ mắm
(Nguồn: https://www.thuocdantoc.org/duoc-lieu/cay-thuoc-doi)
Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong cây bọ mắm
Nhóm hoạt chất Tên hợp chất Tài liệu tham khảo
Quercetin Scutellarin-7-O-α-L-rhamnoside Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside
7B-hydroxy-3-oXo-28- dodecyl friedelan-28-oat Sarma và ctv (2013) Acid oleanolic α-amyrin 2α, 3α, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic
Friedelin Sarkar và các ctv, 2014
2.1.5 Tác dụng dƣợc lý và công dụng
Các nghiên cứu đã chỉ ra bọ mắm là thực vật có nhiều tác dụng dƣợc lý Nổi bật phải kể đến là các hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, chống oxy hóa và kháng ung thƣ
Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bọ mắm cho kết quả tốt Năm 2017, Võ Thị Tú Anh và ctv đã khảo sát khả năng kháng khuẩn trên các cao chiết từ thân và lá bọ mắm bằng dung môi methanol, hexane và ethyl acetate Kết quả cho thấy tất cả các cao đều có hoạt tính kháng E coli, P aeruginosa, S aureus tốt hơn kháng sinh amoxicillin ở tất cả nồng độ đƣợc khảo sỏt với 40 àg/ml Fl-0 + RH (với R là gốc tự do) Gốc flavonoid tự do (Fl-O) sau đó liên kết với một gốc tự do khác tạo thành hợp chất bền
Ngoài flavonoid, tanin cũng là một polyphenol phân bố rộng rãi trong thực vật chống lại các loại oxy phản ứng (Ilieva và ctv, 2019) Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện cho thấy các hợp chất polyphenol (tanin, flavonoid) là thành phần chống oxy hóa chiếm ƣu thế Trong nghiên cứu của He và ctv (2011), chiết xuất polyphenol táo, rất giàu tanin, làm giảm đáng kể quá trình peroxy hóa lipid và tăng khả năng hấp thụ gốc oxy trong tế bào lách Điều này cho thấy tiềm năng chống oxy hóa của tanin, là cơ sở của các hoạt động kháng vi rút, kháng khuẩn
2.2.5 Hoạt tính chống oxy hóa của acid ascorbic
Acid ascorbic đã đƣợc chứng minh là một chất chống oxy hóa mạnh Nó có thể hoạt động trực tiếp bằng cách dập tắt gốc tự do hoặc gián tiếp khôi phục các đặc tính chống oxy hóa của vitamin E (Pehlivan, 2017)
Phương pháp chiết xuất và định tính các thành phần hóa học
Quá trình chiết thông thường, các chất tan hòa tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên dịch chiết Nhƣng trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (mô tế bào động, thực vật), các chất nằm trong tế bào sau khi hòa tan thành dung dịch còn phải vƣợt qua vách tế bào ra khỏi các mô để đi vào dịch chiết Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học bằng các dung môi thích hợp nhƣ vậy đƣợc gọi là quá trình “chiết xuất” (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Hình 2.4 Phản ứng khử sắt của chất chống oxy hóa (Shalaby, 2013)
Fe(III)-TPTZ Fe(II)-TPTZ
Phương pháp chiết xuất hiện nay bao gồm phương pháp truyền thống và hiện đại, tùy vào mục đích nghiên cứu và điều kiện thí nghiệm để lựa chọn phương pháp phù hợp Một trong những phương pháp đơn giản, dễ thực hiện trong phòng thí nghiệm được biết là phương pháp ngâm nóng Phương pháp này tách các chất tan vào dung môi, được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn ở nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu đƣợc có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn Quá trình hãm trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày (hãm thuốc, hãm trà) chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước Chưng cũng có thể coi là một biến thể của phương pháp này (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Việc lựa chọn dung môi nước mang đến nhiều lợi ích, như giá thành rẻ, thuận tiện trong việc sản xuất các chế phẩm mà không cần đảm bảo loại bỏ hết dung môi
Thành phần hóa học của các dược liệu rất phức tạp và thường không thể biết tường tận Vì thế, thông thường ở mức độ đơn giản, việc nghiên cứu thành phần hóa thực vật thường được bắt đầu bằng việc xác định các nhóm hợp chất thường gặp bằng các phản ứng hóa học Sau khi tách chiết với nước thu được cao chiết bọ mắm toàn phần, tiến hành định tính nhanh với các thuốc thử chung Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính một hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện Chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng Dựa vào kết quả của các phản ứng đặc trưng (thường là phản ứng kết tủa và phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đã đƣợc thực hiện từ 15/10/2020 đến 15/1/2021 tại phòng Lab PV201
- Bộ môn Khoa học Sinh học Thú y – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Vật liệu thí nghiệm
Cây bọ mắm tím (Hình 3.1a) được cung cấp tại nhà vườn ở quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh, thu hoạch vào lúc cây bắt đầu ra hoa, đã cắt bỏ rễ, tiến hành loại bỏ các tạp chất (các loại rau cỏ khác) và phơi khô dưới ánh sáng mặt trời Sau đó cắt ngắn khoảng 1- 2 cm và bảo quản ở nhiệt độ phòng (Hình 3.1b)
Magnesium (Mg), hydrochloride đậm đặc (HCl đđ), nitrat bismuth Bi(NO 3 ) 3 , acid nitric (HNO 3 ) , kali iotua (KI), sắt (III) clorua (FeCl 3 ), anhydride acetic
Hình 3.1 Cây bọ mắm tươi (a) và bọ mắm sau khi phơi khô (b)
16 chloroform, acid sulfuric đậm đặc (H 2 SO 4 đđ), CuSO 4 , natri kali tartrat, natri hydroxit (NaOH), DPPH (1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl), ethanol (C 2 H 5 OH), kali dihydrophosphate (KH 2 PO 4 ), kali ferricyanide [K 3 Fe(CN) 6 ], acid trichloroacetic, natri nitroprusside (SNP), sulfanilamide, acid phosphoric (H 3 PO 4 ), naphthylethylenediamine-dihydrochloride (NED), natri photphat (Na 3 PO 4 ), amoni molybdate, acid ascorbic
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: tủ sấy, water bath, máy đo quang phổ, cuvet, máy ly tâm, máy vortex, micropipet 500 μL, 1000 μL và 5000 μL và các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Quy trình chiết xuất bọ mắm
Theo tham khảo từ quy trình của Nguyễn Duy Tân và ctv, 2017 chúng tôi tiến hành tách chiết bọ mắm bằng dung môi là nước ở nhiệt độ 80 o C Bọ mắm sau khi đƣợc phơi khô và cắt nhỏ, cho vào bình tam giác với tỉ lệ nguyên liệu khô/dung môi là 1/10 (kg/L) Cân chính xác 200 g bọ mắm khô đã đƣợc cắt nhỏ, thêm 2000 ml nước vào bình tam giác, ngâm trong waterbath 3h ở nhiệt độ 80 o C, lọc nóng , loại bỏ tạp chất bằng máy li tâm với tốc độ 3000 vòng, 10 phút thu đƣợc dịch chiết bọ mắm Thu hồi dung môi nước bằng cách đun cách thủy cho bay hơi trong waterbath ở nhiệt độ 80, thu đƣợc cao toàn phần Cao đƣợc bảo quản kín, ở nhiệt độ
2 - 8 o C Lặp lại thí nghiệm trên 3 lần
3.3.2 Định tính chiết xuất nước từ cây bọ mắm
Dịch chiết bọ mắm sau khi lọc, để nguội đƣợc sử dụng để định tính thành phần hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học đặc trưng tương ứng với từng nhóm hợp chất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007), quy trình đƣợc trình bày trong Bảng 3.1
Dịch chiết (5ml) đƣợc cho vào lần lƣợt 2 ống nghiệm (1) (2): ống (1) dịch chiết bọ mắm và ống (2) là dịch chiết có thêm thuốc thử Quan sát hiện tƣợng và so sánh sự thay đổi giữa ống (2) so với ống (1) để kết luận có hay không các hoạt chất định tính trong dịch chiết bọ mắm
Bảng 3.1 Quy trình định tính thành phần hóa học trong bọ mắm
Nhóm hợp chất Thuốc thử Thực hiện Kết quả phản ứng dương tính
Cho vài hạt Mg vào dịch chiết, lắc đều
Nhỏ 3 – 5 giọt HCl đđ Quan sát
Dung dịch có màu hồng đến đỏ
Tanin FeCl 3 1% Nhỏ 3 – 5 giọt FeCl 3 1% vào dịch chiết
Xanh rêu hay xanh đen
Cho 1ml Anhydrid acetic, 1ml cloroform vào dịch chiết , làm lạnh
Dung dịch đổi thành màu cam hoặc đỏ bền
Cho 3 – 5 giọt thuốc thử vào dịch chiết có chứa acid loãng
Saponin Tạo bọt Lắc mạnh dung dịch trong 1 phút theo chiều thẳng đứng
Cho 1ml Fehling A và 1 ml Fehling B vào dịch chiết Đun sôi cách thủy vài phút
Có kết tủa đỏ gạch
3.3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
3.3.3.1 Khảo sát khả năng thu gom gốc tự do DPPH
Các hoạt động thu gom gốc DPPH của cao chiết nước được đánh giá theo phương pháp mô tả bởi Braca và ctv (2001) Lấy 0,1 ml cao chiết bọ mắm ở mỗi nồng độ (100, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 μg/ ) Sau đó cho 3ml dung dịch DPPH 0,004% trong ethanol vào từng nồng độ, hỗn hợp đƣợc lắc đều, ủ trong tối ở nhiệt độ phòng sau 30 phút Đo mật độ quang bằng máy đo quang phổ ở bước sóng Q7 nm Thí nghiệm được lặp lại tương tự với acid ascorbic với dãy
18 nồng độ acid ascorbic cuối cùng trong phản ứng lần lƣợt là 10, 50, 100, 150 và 200 àg/ml Quy trỡnh thực hiện phương phỏp DPPH được trỡnh bày theo Bảng 3.2
Bảng 3.2 Quy trình thực hiện phương pháp DPPH
Thành phần Thể tích hút (ml)
Phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do (% BGTD) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó OD c là độ hấp thu của mẫu chứng (DPPH), OD t là độ hấp thụ của mẫu thử (cao chiết hoặc acid ascorbic) Khả năng chống oxy hóa đƣợc tính dựa vào giá trị IC50 Giá trị IC 50 được tính dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính của acid ascorbic và cao chiết Giá trị IC 50 càng thấp thì khả năng chống oxy hóa càng cao và ngƣợc lại
3.3.3.2 Khảo sát khả năng ức chế gốc NO
Hiệu quả ức chế NO thực hiện theo phương pháp của Alisi và Onyeze
(2008) Thêm nhanh 4 ml cao chiết ở các nồng độ khác nhau (100, 300, 500, 1000,
1500, 2000 và 3000 μg/ml) vào 1 ml dung dịch SNP 25 mM và các ống này đƣợc ủ ở 29 °C trong 2 giờ
Hút 2 ml dung dịch ủ đƣợc pha loãng với 1,2 ml thuốc thử Griess (1% sulfanilamide trong 5% H 3 PO 4 và 0,1% NED) Ngay lập tức quá trình diazo hóa nitrit bằng sulfanilamide đƣợc hình thành và sau đó kết hợp với NED tạo thành hỗn hợp mang màu đo ở bước sóng U0 nm Thí nghiệm được lặp lại tương tự với
19 acid ascorbic với dãy nồng độ cuối cùng trong phản ứng lần lƣợt là 10, 50, 100, 150 và 200 àg/ml Quy trỡnh thực hiện đƣợc mụ tả trong Bảng 3.3
Bảng 3.3 Quy trình thực hiện phương pháp ức chế NO
Thành phần Thể tích hút (ml)
Mẫu Nước cất SNP Thuốc thử Griess
Phần trăm ức chế NO đƣợc tính theo công thức:
% ức chế NO = [(OD c – OD t )/ OD c ] 100
Trong đó OD c là độ hấp thụ của mẫu chứng (SNP + thuốc thử), OD t là độ hấp thụ của mẫu thử (cao chiết/ acid ascorbic) Giá trị IC 50 đƣợc tính dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính của acid ascorbic và cao chiết
3.3.3.3 Khảo sát năng lực khử sắt (FRAP)
Khả năng chống oxy hóa khử sắt được xác định theo phương pháp được mô tả trước đó bởi Oyaizu, 1986 Theo đó, 1ml các nồng độ khác nhau của cao chiết
(100, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 μg/ml) đƣợc trộn với đệm phosphat (2,5 ml; 0,2M, pH 6,6) và 2,5 ml kali ferricyanide 1% Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50°C trong 20 phút
Mỗi ống nghiệm thêm 2,5 ml acid trichloroacetic (10%), sau đó đƣợc ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút Hút 2,5 ml phần nổi phía trên trộn với 2,5 ml nước cất và 0,5 ml FeCl 3 0,1% Độ hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng p0 nm Chất đối chứng acid ascorbic được lặp lại tương tự với dãy nồng độ lần lượt là
10, 50, 100, 150 và 200 μg/ Quy trình thực hiện đƣợc mô tả trong Bảng 3.4
Bảng 3.4 Quy trình thực hiện phương pháp FRAP
Mẫu Đệm phosphat kali ferricyanide acid trichloroacetic
Mẫu thử nghiệm (cao chiết bọ mắm)
Giá trị mật độ quang (OD) càng cao phản ánh khả năng khử của mẫu càng cao Hiệu quả chống oxy hóa của cao chiết đƣợc so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đú chất chuẩn hay cao chiết (àg/ml) cú giỏ trị OD=0,5 (OD 0,5 )
3.3.3.4 Xác định tổng khả năng chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa tổng của cao chiết được đánh giá bằng phương pháp phosphomolypden theo quy trình đƣợc mô tả bởi Prieto và ctv (1999) Cho 0,3 ml cao chiết ở các nồng độ (100, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 μg/ ) vào
3 ml dung dịch thuốc thử Các ống chứa dung dịch phản ứng đƣợc ủ ở 95 ° C trong
90 phút Làm nguội ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng i5 nm Lặp lại thí nghiệm trên với đối chứng acid ascorbic ở mỗi nồng độ (10,
50, 100, 150, 200 μg/ ).Quy trình thực hiện đƣợc mô tả qua Bảng 3.5
Bảng 3.5 Quy trình xác định tổng khả năng chống oxy hóa
Thành phần Thể tích hút (ml)
Mẫu Nước cất Thuốc thử
Khả năng chống oxy hóa đƣợc xác định thông qua giá trị mật độ quang, mật độ quang của mẫu càng lớn thì khả năng chống oxy hóa càng cao
Tổng hoạt tính chống oxy hóa tổng (TAC) được biểu thị bằng số đương lượng của acid ascorbic (mg chất chuẩn/g cao chiết) thông qua phương trình hồi quy tuyến tính của acid ascorbic (Umamaheswari và ctv, 2008).
Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, kết quả là trung bình cộng của thí nghiệm với độ lệch chuẩn (SD), số liệu đƣợc xử lí và so sánh sự khác biệt về mặt thống kê trên phần mềm Minitab 16
Các chỉ tiêu đánh giá, phương trình hồi quy biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ cao chiết và % BGTD DPPH, % ức chế NO, giá trị OD đƣợc tính toán và xây dựng bằng phần mềm Excel 2010 Theo đó, một số phương trình phổ biến như:
- Phương trình linear: Y = b0 + b1*X ; phương trình quadratic: Y = b0 + b1*X + b2*X 2 ; phương trình cubic: Y = b0 + b1*X + b2*X 2 + b3*X 3 ; phương trình power: Y = b0*X b1 , phương trình logarithmic: Y = b0 + b1*ln(X)
Trong đó, Y: tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH hoặc NO hoặc giá trị OD; X: nồng độ cao chiết hoặc acid ascorbic; b0 : hằng số; b1, b2, b3: các hệ số hồi quy Phương trình hồi quy được chọn là phương trình có hệ số tương quan cao (phản ánh sự biến thiên của hoạt tính chống oxy hóa đƣợc giải thích bởi nồng độ cao chiết) với độ tin cậy 95%
