CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “Ứng dụng chỉ thị phân tử trong cải thiện một số chỉ tiêu về năng suất sinh sản của gà Ác Gallus gallus domesticus Brisson”, do nghiên
GIỚI THIỆU
Trước đây, chọn giống chủ yếu dựa vào quan sát hình thái, tuy đơn giản nhưng kém chính xác và mất nhiều thời gian Kỹ thuật sinh học phân tử đã khắc phục hạn chế này, cho phép tạo giống nhanh chóng, chính xác hơn với những đặc điểm kết hợp Trong đó, chỉ thị DNA được xem là ưu việt vì dễ phát hiện, phổ biến trong bộ gene, độc lập với môi trường và có thể được sử dụng ở mọi giai đoạn phát triển của sinh vật Phân tích chỉ thị DNA gồm 3 nhóm: (i) dựa trên lai và sử dụng DNA đánh dấu như RFLP và in dấu vân tay đoạn DNA ngắn; (ii) dựa trên khuếch đại DNA in vitro như AFLP, SSR, RAPD; và (iii) giải trình tự DNA như SNP.
Gà Ác là giống gà bản địa được nuôi lâu đời ở ĐBSCL, được nuôi để lấy trứng và bán gà con làm giống Thịt gà Ác giàu dinh dưỡng, đặc biệt là Carnosine, cao hơn đáng kể so với gà trắng Carnosine là một protein có vai trò quan trọng trong các chức năng sinh lý như chống lão hóa, chống viêm, chống oxy hóa và dẫn truyền thần kinh Carnosine được ứng dụng trong y học để điều trị các bệnh như tiểu đường, Alzheimer và ung thư Hiện nay, các nhà sản xuất đang tìm cách tăng hàm lượng Carnosine trong thịt gà để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng về thực phẩm an toàn.
Trứng gà Ác được ưa chuộng bởi hương vị thơm ngon, không tanh, béo, giàu đạm lòng trắng và tỷ lệ lòng đỏ cao, màu sắc sậm đẹp mắt Gà Ác trưởng thành sớm, bắt đầu đẻ trứng từ 113-125 ngày tuổi, với khối lượng trứng trung bình 31,3-36,2 g/quả và tỷ lệ đẻ đạt 52,3-58,1% trong giai đoạn 23-37 tuần tuổi Hiện nay, gà Ác được nuôi theo hướng công nghiệp để sản xuất trứng ở quy mô lớn tại các tỉnh Tiền Giang và Long An Tuy nhiên, nguồn giống gà Ác hiện nay vẫn chưa đạt chất lượng tốt nhất, dẫn đến năng suất không ổn định và tỷ lệ đẻ chưa đạt tiềm năng tối đa Các nghiên cứu về di truyền của gà Ác còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào lĩnh vực dinh dưỡng.
Như vậy, vấn đề con giống gà Ác ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu sâu về di truyền ở mức độ phân tử và chưa có công bố nào về vai trò của một số gene ứng viên liên quan đến năng suất sinh sản của giống gà này Việc ứng dụng thành tựu công nghệ sinh học trong việc cải thiện năng suất trứng ở gà Ác là điều rất cần thiết và hoàn toàn khả thi Thành công của nghiên cứu sẽ mở ra hướng chọn giống mới một cách chính xác và nhanh chóng hơn, góp phần đẩy mạnh công tác lai tạo, chủ động trong vấn đề con giống và qua đó mang lại hiệu quả thiết thực hơn cho người chăn nuôi Đề tài “Ứng dụng chỉ thị phân tử trong cải thiện một số chỉ tiêu về năng suất sinh sản của gà Ác (Gallus gallus domesticus Brisson)” được thực hiện với mục tiêu:
(1) Xác định ít nhất 3 chỉ thị phân tử liên quan đến năng suất sinh sản của gà
(2) Đánh giá hiệu quả chọn lọc, cải tiến di truyền về mặt sinh sản ở đời con
(3) Tạo đàn gà Ác hạt nhân có năng suất sinh sản cao Ý nghĩa của luận án:
- Xác định được 6 đa hình gene (DRD2 Indel, PRL Indel, IGF1/PstI, INHA/PstI, NPY/DraI và VIPR1/HhaI) ở gà Ác nuôi tại ĐBSCL
Nghiên cứu đã xác định được mối liên hệ giữa 6 đa hình gene (DRD2 Indel, PRL Indel, IGF1/PstI, INHA/PstI, NPY/DraI và VIPR1/HhaI) với năng suất sinh sản của gà Ác nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long.
Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra đàn gà Ác xuất phát chọn lọc (đàn hạt nhân) đạt năng suất trứng ấn tượng 149,1 quả/gà mái/52 tuần đẻ, phục vụ cho công tác chọn lọc và nhân giống gà Ác tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.
Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin khoa học về đa hình gene liên quan đến năng suất sinh sản của gà Ác, góp phần phục vụ giảng dạy và sản xuất Điểm mới của luận án là nghiên cứu tập trung vào 3 điểm chính, tạo ra những đóng góp quan trọng cho lĩnh vực chăn nuôi gà Ác.
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Đồng bằng sông Cửu Long và Việt Nam xác định 6 đa hình gene (DRD2 Indel, PRL Indel, IGF1/PstI, INHA/PstI, NPY/DraI và VIPR1/HhaI) ở gà Ác, đóng góp quan trọng vào việc hiểu rõ hơn về di truyền và chọn giống gà Ác.
Ngoài ra, SNP T829C ở vùng exon 1 của đa hình INHA/PstI là kết quả đầu tiên trên gà ở Việt Nam
- Đề tài đã phân tích đánh giá ảnh hưởng của 6 đa hình này đến năng suất sinh sản của gà Ác, từ đó xác định được đa hình NPY/DraI có liên quan chặt chẽ đến năng suất sinh sản của gà Ác
- Đề tài đã chọn lọc, cải thiện năng suất trứng của gà Ác về mặt di truyền chọn giống thể hiện qua đàn gà thế hệ 1 có năng suất trứng cao hơn đàn gà thế hệ xuất phát là 4,4 quả/gà mái/24 tuần đẻ (tương đương tăng 6,2%) Bên cạnh đó, đàn gà thế hệ xuất phát chọn lọc (đàn hạt nhân) có năng suất trứng là 149,1 quả/gà mái/52 tuần đẻ.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: từ tháng 12/2021 đến 05/2023
+ Các phân tích sinh học phân tử được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ giống vật nuôi, Trường Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
+ Các chỉ tiêu về năng suất sinh sản của gà Ác được thực hiện và theo dõi tại trại gà ở huyện Phong Điền, Thành phố Cần Thơ
- Thế hệ xuất phát (G0): tiến hành trên 400 gà mái, 120 gà trống được chọn lọc ngoại hình từ 800 gà mái và 200 gà trống ở 9 tuần tuổi tại ĐBSCL
- Thế hệ xuất phát chọn lọc (SG0): tiến hành trên 130 gà mái và 26 gà trống ở 16 tuần tuổi được chọn lọc từ G0 có kiểu gene cho năng suất trứng cao
- Thế hệ 1 (G1): tiến hành trên 150 gà (1 ngày tuổi) được tạo ra từ đàn gà thế hệ xuất phát chọn lọc
3.1.3 Thiết bị và hóa chất
- Máy nhân gene PCR (TC 9639 BenchMark, Mỹ)
- Máy Nanodrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One, Mỹ)
- Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ)
- Máy chụp hình gel (Carestream Health, Mỹ)
- Máy ly tâm lạnh (Hermle Z323K, Đức)
- Máy ấp trứng công suất 2.000 trứng (Life, Việt Nam)
- Cân điện tử 300 g sai số 0,1 g (OEM, Việt Nam)
- Cân đồng hồ 2 kg sai số 10 g (NHS-2, Việt Nam)
- Thước kẹp điện tử 150 mm sai số 0,02 mm (Mitutoyo, Nhật Bản)
- Hóa chất thực hiện ly trích DNA: isopropanol, ethanol tuyệt đối, proteinase
K, phenol, chloroform, lysis buffer, SDS (Sodium dodecyl sulphate) 10%, NaCl 2M,
- Hóa chất thực hiện PCR, PCR-RFLP, điện di:
+ Primer (mồi) của Công ty Cổ phần Sinh hóa Phù Sa (Việt Nam)
+ MyTaq DNA polymerase (Bioline, Meridian Bioscience), 5x MyTaq buffer gồm 5 mM dNTPs, 15 mM MgCl2 (Bioline, Meridian Bioscience)
+ TAE 1x, SafeView TM DNA stain, loading buffer, loading dye, nước cất hai lần + Agarose (Thermo Fisher Scientific™)
+ PureLink™ PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific™)
+ Thang chuẩn 100-1.000 bp (Thermo Fisher Scientific™)
+ Enzyme cắt giới hạn PstI, HhaI và DraI (Thermo Fisher Scientific™)
3.1.4 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Qua nghiên cứu các công bố trước đây trên thế giới và trong nước trên những giống gà khác nhau về các gene liên quan đến năng suất sinh sản, đề tài đã sử dụng các cặp mồi chuyên biệt kế thừa từ 04 gene thực hiện gồm: DRD2, NPY, PRL và VIPR1 Bên cạnh đó, đề tài cũng tiến hành tự thiết kế các mồi cho 02 gene: IGF1 và INHA Trình tự các đoạn mồi và kích thước khuếch đại các đoạn gene tương ứng được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các mồi chuyên biệt của các đa hình gene nghiên cứu
Gene Trình tự mồi (5’-3’) Accession number
Nguồn tham khảo DRD2 F: TGCACTTCAATCCTTCCCAGCTT
Nghiên cứu hiện tại INHA F: ATCCCACAGCCCCAAGACCGT
Nghiên cứu hiện tại NPY F: TCTCAGAGCTCCAACGTATGA
Zhou et al., 2008 Chú thích: F: mồi xuôi; R: mồi ngược.
Phương pháp nghiên cứu
Đề tài sử dụng phương pháp tổ chức thí nghiệm để thu thập số liệu, xử lý, đánh giá và tổng kết số liệu để hoàn thành mục tiêu đề ra Đề tài bao gồm 3 nội dung chính, tổng quan nội dung thí nghiệm được minh họa ở Hình 3.1
Gà Ác nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long
Nội dung 1: Xác định các đa hình gene có liên quan đến năng suất sinh sản của gà Ác
- Chọn mua 800 gà mái và 200 gà trống lúc 9 tuần tuổi
- Nuôi các cá thể này đến 15 tuần tuổi
- Chọn lọc lại 400 gà mái và 120 gà trống đạt tiêu chuẩn gà đẻ hậu bị ở 15 tuần tuổi
- Ly trích DNA, xác định đa hình gene, SNP ở các gene ứng viên lúc gà 15 tuần tuổi
Nội dung 2: Đánh giá năng suất sinh sản và xác định mối liên kết giữa các gene ứng viên với năng suất sinh sản của gà Ác
- Nuôi lồng từng cá thể để ghi nhận năng suất sinh sản của 400 gà mái giai đoạn 16-40 tuần tuổi
- Phân tích mối liên kết giữa đa hình gene với năng suất sinh sản ở gà Ác
- Xác định 1 trong 3 chỉ thị có mối liên kết chặt chẽ đến năng suất trứng để tiến hành chọn lọc, nhân đàn gà Ác hạt nhân phục vụ Nội dung 3
Nội dung 3: Chọn tạo để cải thiện năng suất trứng của gà Ác ở thế hệ 1
* Tạo đàn gà Ác thế hệ 1 có năng suất trứng cao
- Ghép đôi gia đình theo tỷ lệ 1 trống : 5 mái có cùng kiểu gene (gene có năng suất trứng cao được chọn ở Nội dung 2) vào tuần tuổi 41 → cho gà trống giao phối trực tiếp với gà mái → thu trứng đem ấp để tạo đàn gà thế hệ 1
* Theo dõi: khối lượng và chỉ số hình dáng trứng, tuổi đẻ quả trứng đầu, khối lượng gà lúc đẻ quả trứng đầu, năng suất trứng, tỷ lệ đẻ, tỷ lệ sống, FCR, tiêu tốn thức ăn/10 trứng
- Thế hệ xuất phát (G0): theo dõi giai đoạn 16-67 tuần tuổi
- Thế hệ xuất phát chọn lọc (SG0): theo dõi giai đoạn 16-67 tuần tuổi
- Thế hệ 1 (G1): theo dõi giai đoạn 16-40 tuần tuổi
* Đánh giá hiệu quả chọn lọc
- Phân tích, đánh giá dựa vào năng suất trứng của thế hệ xuất phát, xuất phát chọn lọc và thế hệ 1
Hình 3.1: Sơ đồ tổng quan thể hiện các nội dung thí nghiệm
3.2.1 Nội dung 1: Xác định các đa hình gene có liên quan đến năng suất sinh sản của gà Ác
3.2.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Chọn mua 800 gà mái và 200 gà trống lúc 9 tuần tuổi có kiểu hình đạt tiêu chuẩn (gà có lông mảnh và thuần màu trắng, mỏ đen, chân đen hoặc xanh đen, không dị tật, khối lượng trung bình 480 g/gà trống và 400 g/gà mái) tại một cơ sở sản xuất giống có uy tín ở ĐBSCL Các cá thể này được nuôi ở chuồng lồng (kích thước: dài 50 cm, rộng 60 cm, cao 40 cm) giai đoạn 8-15 tuần tuổi, mật độ nuôi 4-5 con/ô lồng (13-
- Tiến hành chọn lọc lại 400 gà mái và 120 gà trống đạt tiêu chuẩn gà đẻ hậu bị ở
15 tuần tuổi để chuẩn bị vào giai đoạn đẻ trứng Ở giai đoạn 16-40 tuần tuổi, gà được nuôi lồng theo phương thức cá thể để ghi nhận một số chỉ tiêu năng suất sinh sản trong
24 tuần đẻ Mỗi cá thể gà Ác được đánh mã số bằng vòng dây nhựa cột ở chân (Hình 3.2) và được nuôi trong ô lồng có kích thước: dài 50 cm, rộng 20 cm, cao 40 cm
- Trại gà thí nghiệm có hàng rào lưới thép bao quanh, cách xa khu dân cư và sử dụng nguồn nước máy đã qua lọc cho gà uống Chuồng nuôi là dạng chuồng hở với hai mái tole (tôn) (kích thước: dài 24 m, ngang 9 m, cao 5m), có bạt che hai bên để tránh mưa và gió lùa
- Gà thí nghiệm được nuôi ở chuồng lồng, ô lồng cách mặt đất ít nhất 60 cm Máng ăn được làm bằng nhựa, đặt ở phía trước mỗi ô lồng và phía trên máng hứng trứng gà Gà uống nước tự do bằng núm uống tự động được gắn vào ống nhựa
- Gà được cho ăn 2 lần/ngày (7 giờ sáng và 14 giờ chiều) với khẩu phần theo độ tuổi và uống nước tự do
- Thức ăn được sử dụng cho gà Ác có thành phần dinh dưỡng tùy theo giai đoạn được trình bày ở Bảng 3.2 Lịch vaccine được tiến hành theo chương trình cho gà đẻ giống bố mẹ của Công ty TNHH MTV Giống Gia cầm Vietswan (Bảng 3.3)
- Giai đoạn 8-15 tuần tuổi: gà được nuôi ở chuồng lồng, mật độ 13-17 con/m 2 Chế độ chiếu sáng: ban ngày sử dụng ánh sáng tự nhiên
- Giai đoạn 16 tuần tuổi trở đi: gà được nuôi theo phương thức cá thể ở chuồng lồng Chế độ chiếu sáng: ban ngày sử dụng ánh sáng tự nhiên, ban đêm chiếu sáng đèn huỳnh quang đến 22 giờ (đảm bảo 16 giờ chiếu sáng/ngày)
Bảng 3.2: Thành phần của thức ăn cho gà Ác trong nghiên cứu
Thành phần Giai đoạn (tuần tuổi)
1-10 11-16 17-67 Độ ẩm (Max) (%) 13 13 13 Đạm thô (Min) (%) 19 17 17
Năng lượng (Min) (kcal/kg) 2.850 2.850 2.750
(Nguồn: Công ty Emivest Feedmill Việt Nam)
Bảng 3.3: Lịch vaccine cho gà Ác thí nghiệm
Ngày tuổi Vaccine Đường cấp
3 Gumboro lần 1 Nhỏ mũi, miệng
5 Newcastle lần 1 Nhỏ mắt, mũi, miệng
7 Vaccin bệnh đậu gà Chủng qua da cánh
28 Cúm gia cầm Tiêm dưới da cổ
35 Newcastle lần 3 Tiêm dưới da cổ
90 Newcastle lần 4 Tiêm dưới da cổ
105 Newcastle, viêm phế quản, hội chứng giảm đẻ, sưng phù đầu
Tiêm dưới da Định kỳ 3 tháng/lần Tái chủng Newcastle Tiêm dưới da cổ Định kỳ 6 tháng/lần Tái chủng cúm gia cầm Tiêm dưới da cổ
3.2.1.2 Ly trích DNA tổng số từ mẫu lông
- Thu mẫu: ở mỗi cá thể gà tiến hành thu 10 sợi lông non (khoảng 0,3 g lông có chứa mô thịt và máu ở gốc lông) Mẫu được cho vào túi nilon, sau đó mang về phòng thí nghiệm bảo quản lạnh ở -20 o C (Hình 3.3)
- Ly trích DNA tổng số được thực hiện theo phương pháp của Bello et al (2001) có bổ sung cải tiến như sau:
+ Lấy một đoạn 0,5 cm từ phần đầu gốc lông (nơi có phần thịt bám vào) băm nhuyễn, cho vào ống eppendorf vụ trựng (thể tớch 2 ml) cú chứa 500 àl lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA pH 8 và 2% SDS) và proteinase K 175 àg/ml (ở nồng độ cuối cùng) Ủ mẫu ở 37 o C trong 16 giờ và lắc nhẹ
+ Mẫu được lắc đều để đồng nhất hỗn hợp và sau đó ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút Phần nổi bên trên ống được chuyển sang ống eppendorf vô trùng khác (thể tớch 2 ml) và DNA được làm sạch bằng 300 àl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tớch 25:24:1) Sau đú, cho 50 àl NaCl 2 M và 2 phần thể tớch ethanol tuyệt đối để kết tủa DNA Tiếp theo, DNA được rửa sạch với ethanol 70 o và được trữ trong 500 àl TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8), bảo quản ở -20 o C
Hình 3.2: Đánh mã số gà theo từng cá thể Hình 3.3: Thu mẫu lông gà Ác
3.2.1.3 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số
- Mẫu DNA tổng số vừa ly trích được kiểm tra chất lượng thông qua kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2,0% điện di ở hiệu điện thế 80 V trong 30 phút và sử dụng máy Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA
Xử lý số liệu
- Tần số kiểu gene, tần số allele được tính bằng phần mềm POPGENE 1.32
- Sử dụng phương pháp thống kê ANOVA để xác định mối liên kết giữa các gene ứng viên với các tính trạng năng suất sinh sản; so sánh năng suất sinh sản của đàn gà thế hệ xuất phát, xuất phát chọn lọc và thế hệ 1 theo mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) của phần mềm Minitab 16.0 Độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình trong và giữa các nghiệm thức được xác định theo Tukey với alpha < 0,05 Mô hình thí nghiệm theo công thức sau: yij = à + Ai + ij
(yij: cỏc tớnh trạng quan sỏt, à: trung bỡnh chung, Ai: ảnh hưởng của kiểu gene, ij: sai số ngẫu nhiên)
- Phân tích mối tương quan giữa các tính trạng sinh sản bằng phần mềm Minitab 16.0
- Phân tích hiệu ứng tác động của kiểu gene đến các tính trạng khảo sát:
+ Hiệu ứng cộng tính (Additive effect):
(Kiểu hình AA - Kiểu hình aa)/2 + Hiệu ứng trội (Dominance effect):
Kiểu hình Aa - (Kiểu hình AA + Kiểu hình aa)/2
Số cá thể của thế hệ xuất phát chọn lọc
Số cá thể của thế hệ xuất phát i
