Nghiên cứu xác Định Đồng thời canxi và glucosamin bằng phương pháp ce c4d

Nghiên cứu xác Định Đồng thời canxi và glucosamin bằng phương pháp ce c4d Nghiên cứu xác Định Đồng thời canxi và glucosamin bằng phương pháp ce c4d

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

KIỀU THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CANXI VÀ GLUCOSAMIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-C4D

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

KIỀU THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CANXI VÀ GLUCOSAMIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-C4D

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Trần Cao Sơn PGS TS Nguyễn Thị Ánh Hường

Hà Nội - 2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS Trần Cao Sơn và PGS.TS

Nguyễn Thị Ánh Hường đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong quá trình nghiên

cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực

phẩm quốc gia và các Thầy, Cô giáo tại bộ môn Hóa Phân Tích và Khoa Hóa học, Trường

Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức,

kĩ năng để em hoàn thành các môn học trong khóa học này cũng như áp dụng vào thực tế

Em xin cảm ơn NCS Nguyễn Quang Huy cùng các anh chị em học viên và sinh

viên trong nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản CE-C4D của Bộ môn

Hóa Phân tích Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội đã hướng dẫn, giúp

đỡ và phối hợp với em trong quá trình nghiên cứu để em có kết quả như ngày hôm nay

Em xin cảm ơn công ty 3Sanalysis (http: //www 3sanalysis.vn/) đã cung cấp thiết

bị để em thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên giúp em hoàn

thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Học viên

Kiều Thị Lan Phương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về thực phẩm chức năng chữa bệnh cơ xương khớp 2

1.2 Tổng quan về canxi 3

1.3 Tổng quan về glucosamin và các chất có tác dụng điều trị bệnh thoái hóa khớp khác 5

1.3.1 Glucosamin 5

1.3.2 Một số chất khác có tác dụng trong điều trị thoái hóa khớp 7

1.4 Tổng quan các phương pháp phân tích canxi và glucosamin 8

1.4.1 Các phương pháp phân tích riêng rẽ canxi 9

1.4.2 Phương pháp phân tích riêng rẽ glucosamine 12

1.5 Tổng quan về phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc CE-C 4 D 18

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 21

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 21

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 21

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.2 Thiết bị và hóa chất 21

2.2.1 Thiết bị 21

2.2.2 Hóa chất 23

2.3 Khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị CE-C 4 D 24

2.4 Thông tin và quy trình xử lý mẫu phân tích 24

2.4.1 Thông tin mẫu 24

2.4.2 Quy trình xử lý mẫu phân tích 24

2.5 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 25

2.5.1 Độ đặc hiệu của phương pháp 25

2.5.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 25

2.5.3 Đường chuẩn của phương pháp 25

2.5.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Nghiên cứu xác định đồng thời canxi và glucosamin bằng phương pháp CE-C 4 D 28 3.1.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 28

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn các chất phân tích và đánh giá phương pháp 37

3.2 Phân tích đồng thời canxi và glucosamin trong mẫu thực phẩm chức năng 40 3.2.1 Kết quả phân tích canxi và glucosamin trong mẫu thực phẩm chức năng bằng phương pháp CE-C 4 D 40

3.2.2 Kết quả phân tích đối chứng canxi bằng phương pháp ICP-OES và glucosamin bằng phương pháp HPLC trong mẫu thực phẩm chức năng 43

KẾT LUẬN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Hàm lượng canxi tiêu thụ theo nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị (mg/ngày) 5

Bảng 1 2 Các dẫn xuất glucosamin thường gặp 6

Bảng 1 3 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định glucosamin bằng phương pháp sắc kí 14

Bảng 3 1 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của glucosamin và canxi 32

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của thế tách đến diện tích píc (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của glucosamin và canxi 33

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích píc (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của glucosamin và canxi 34

Bảng 3 4 Ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến diện tích píc (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của glucosamin và canxi 34

Bảng 3 5 Điều kiện thích hợp xác định đồng thời glucosamin và canxi bằng phương pháp CE-C4D 36

Bảng 3 6 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của canxi và glucosamin 37

Bảng 3 7 Phương trình đường chuẩn của canxi và glucosamin 38

Bảng 3 8 Giới hạn phát hiện canxi và glucosamin bằng phương pháp CE-C4D 39

Bảng 3 9 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp CE-C4D xác định canxi và glucosamin 40

Bảng 3 10 Kết quả phân tích hàm lượng canxi và glucosamin trong mẫu thực phẩm chức năng bằng phương pháp CE-C4D 41

Bảng 3 11 Kết quả phân tích hàm lượng canxi và glucosamin trong một số mẫu thực phẩm chức bằng phương pháp CE-C4D và phương pháp đối chứng 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu tạo của nguyên tử canxi 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của glucosamin 6

Hình 1 3 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị CE 19

Hình 1 4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của detector độ dẫn không tiếp xúc 20

Hình 1 5.Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector độ dẫn không tiếp xúc, với hai điện cực ngăn cách với dung dịch cần đo bởi thành mao quản 20

Hình 2 1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D sử dụng trong nghiên cứu 22

Hình 3 1 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau 29

Hình 3 2 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm His/Ace ở các pH khác nhau 29

Hình 3 3 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau 30

Hình 3 4 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm Tric/Lactic ở các pH khác nhau 30

Hình 3 5 So sánh khả năng phân tích glucosamin và canxi của các dung dịch điện ly khác nhau 31

Hình 3 6 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch điện ly đến thời gian di chuyển và sự phân tách của glucosamin và canxi 31

Hình 3 7.Ảnh hưởng của thế tách đến sự phân tách giữa glucosamin và canxi 32

Hình 3 8 Ảnh hưởng của thời gian và chiều cao bơm mẫu đến sự phân tách của glucosamin và canxi 34

Hình 3 9 Ảnh hưởng của cation K+, Na+, Zn2+ và Mg2+ đến sự phân tách glucosamin và canxi 35

Hình 3 10 Ảnh hưởng của MSM và chondroitin đến sự phân tách glucosamin và canxi 36

Hình 3 11 Độ đặc hiệu của canxi và glucosamin 37

Hình 3 12 Đường chuẩn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ canxi 38

Hình 3 13 Đường chuẩn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ glucosamin 39

Hình 3 14 Điện di đồ phân tích canxi và glucosamin trong mẫu thực phẩm chức năng 42 Hình 3 15 Đồ thị so sánh hàm lượng canxi trên nhãn và phân tích bằng phương pháp CE-C4D 42

Hình 3 16 Đồ thị so sánh hàm lượng glucosamin trên nhãn và phân tích bằng phương pháp CE-C4D 43

Hình 3 17 Đồ thị so sánh hàm lượng glucosamin giữa phương pháp CE-C4D và phương pháp HPLC 45

Hình 3 18 Sự tương quan hàm lượng glucosamin giữa phương pháp CE-C4D và phương

pháp HPLC 45 Hình 3 19 Đồ thị so sánh hàm lượng canxi giữa phương pháp CE-C4D và phương pháp

ICP-OES 46 Hình 3 20 Sự tương quan hàm lượng canxi giữa phương pháp CE-C4D và phương pháp

ICP-OES 46

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

AOAC Association of Official

Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CE Capillary Electrophoresis Phương pháp điện di mao quản CZE Capillary zone electrophoresis Phương pháp điện di mao quản vùng EOF Electroosmotic flow Dòng điện di thẩm thấu

EMS Electrospray mass spectrometry Khối phổ phun điện tử

ESI Electrospray ionization Ion hoá phun điện tử

FID Flame ionization detector Detector ion hoá ngọn lửa

His Histidine (2–Amino–3–(1H–

imidazol–4–yl) propanoic acid)

Histidin (acid 2–Amino–3–(1H–imidazol–4–yl) propanoic) HPLC High–performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

2–morpholin–4–yl-ethanesulfonic acid

Acid 2–morpholin–4–

ylethanesulfonic FLD Fluorescence detector Detector huỳnh quang

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

TCVN Vietnamese Standards Tiêu chuẩn Việt Nam

Tris 2–Amino–2–hydroxymethyl–

propan–1,3–diol

2–Amino–2–hydroxymethyl–

propan–1,3–diol UV- Vis Ultraviolet – visible Tử ngoại- khả kiến

ICP-OES Inductively coupled plasma-

optical emission spectrometry

Phương pháp quang phổ phát xạ plasma cảm ứng

ICP-MS Inductively coupled plasma

mass spectrometry

Phương pháp phổ khối lượng plasma cảm ứng

MỞ ĐẦU

Bệnh xương khớp là một trong những nhóm bệnh có khả năng để lại nhiều di chứng, tàn tật và ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống của con người Glucosamin là một nguyên liệu chính để tổng hợp proteoglycan, đã được Cơ quan đánh giá Dược phẩm Châu Âu xếp vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp [8] Bên cạnh đó, canxi

là một khoáng chất cần thiết trong sự hình thành và chuyển hóa của xương Canxi thường được kết hợp với vitamin D để hỗ trợ hấp thu canxi vào cơ thể Việc bổ sung canxi và glucosamin thường thông qua thực phẩm hằng ngày như tôm, cua, cá,… và còn thông qua dược phẩm, thực phẩm chức năng Hai hoạt chất glucosamin và canxi thường được phối hợp với nhau để tăng cường giúp cải thiện các triệu chứng của bệnh xương khớp Do đó, việc xác định hàm lượng glucosamin và canxi trong thực phẩm chức năng là quan trọng và cần thiết để kiểm soát chất lượng sản phẩm tương ứng và sức khỏe của người tiêu dùng Điều này đòi hỏi phải xây dựng và phát triển phương pháp phân tích các hoạt chất glucosamin và canxi trong thực phẩm chức năng

Thông thường, glucosamin và canxi thường được phân tích độc lập do tính chất của hai hoạt chất hoàn toàn khác nhau Hiện nay, các phương pháp định tính, định lượng trong thực phẩm chức năng như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3, 8-10, 23], phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) [12, 22, 44], phương pháp điện di mao quản (CE) [15-16, 26, 41], thường được áp dụng để phân tích glucosamine; còn phương pháp điện hóa [11, 19, 36], phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng [13, 27, 32], phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [33, 45], được áp dụng để phân tích canxi Tuy nhiên, hai hoạt chất thường được phối hợp với nhau trong cùng một sản phẩm thực phẩm chức năng, do đó việc nghiên cứu sử dụng một quy trình phân tích đồng thời hai chất

là điều cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả phân tích Phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) là phương pháp đơn giản, nhanh chóng với ưu điểm sử dụng ít lượng mẫu và hóa chất, thiết bị nhỏ gọn phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở nước ta Đồng thời, phương pháp có tiềm năng phân tích đồng thời hai chất canxi (một loại khoáng chất) và glucosamin (một chất hữu cơ) Trên cơ sở đó, đề tài

“Nghiên cứu xác định đồng thời canxi và glucosamin bằng phương pháp CE-C 4 D” đã

được lựa chọn nhằm tăng cường hiệu quả với một quy trình duy nhất phân tích đồng thời hai chất có tính chất hoàn toàn khác nhau

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thực phẩm chức năng chữa bệnh cơ xương khớp

Bệnh lý cơ xương khớp là bệnh thường gặp, là một trong nguyên nhân hàng đầu gây tàn phế Cùng với sự phát triển của nền y học, các bệnh cơ xương khớp ngày càng được quan tâm trong nghiên cứu và thực hành lâm sàng với mục đích chẩn đoán, điều trị kịp thời

và phòng bệnh hiệu quả để nâng cao chất lượng cuộc sống cho con người Hiện nay, các bệnh xương khớp thường gặp nhất là viêm khớp dạng thấp, loãng xương, thoái hóa khớp

và các bệnh xương khớp do chuyển hóa [5]

Thực phẩm chức năng chứa đồng thời glucosamin và canxi thường được chỉ định hiệu quả đối với các triệu chứng thoái hóa khớp và giảm khả năng xảy ra loãng xương trong cơ thể người Từ đó, việc sử dụng thực phẩm chức năng này làm giảm tình trạng tổn thương của toàn bộ khớp, bao gồm tổn thương sụn là chủ yếu, kèm theo tổn thương xương dưới sụn, dây chằng, các cơ cạnh khớp và màng hoạt dịch Đồng thời, thực phẩm chức năng tăng cường mật độ xương và chất lượng của xương Chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, chu chuyển xương, độ khoáng hoá, tổn thương tích luỹ, tính chất của các chất cơ bản của xương Trong các thông số này, chu chuyển xương đóng một vai trò quan trọng [5]

Bệnh thoái hóa khớp là bệnh lý của sụn khớp, định nghĩa là tổn thương của toàn bộ khớp, bao gồm tổn thương sụn là chủ yếu, kèm theo tổn thương xương dưới sụn, dây chằng, các cơ cạnh khớp và màng hoạt dịch Đó là một bệnh được đặc trưng bởi các rối loạn về cấu trúc và chức năng của một hoặc nhiều khớp (và cột sống) Tổn thương diễn biến chậm tại sụn kèm theo các biến đổi hình thái, biểu hiện bởi hiện tượng hẹp khe khớp, tân tạo xương (gai xương) và xơ xương dưới sụn Trong thoái hóa khớp có sự tham gia của các cytokin tiền viêm (yếu tố hoại tử u TNF-anpha) và các gốc tự do acid nitric tham gia vào quá trình dị hoá sụn khớp Các yếu tố này làm thay đổi sinh hoá và cơ học của sụn khớp,

mô xương dưới sụn khớp: chất cơ bản mất dần, thoái hoá lưới collagen, kích hoạt enzym tiêu protein và hậu quả làm bề mặt sụn khớp bị mỏng dần, xơ hoá và có biểu hiện lâm sàng

là đau và hạn chế vận động khớp

Bên cạnh đó, bệnh loãng xương được Albright định nghĩa là sự canxi hoá không đầy đủ ở khung xương vào năm 1930 Sau đó, nhờ sự tiến bộ trong kỹ thuật thăm dò hình thái và tổ chức học của xương, định nghĩa loãng xương chính thức được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thống nhất năm 1993 và sửa đổi năm 2001 Loãng xương là một bệnh lý của

xương, được đặc trưng bởi sự thay đổi sức mạnh của xương Sức mạnh này được đặc trưng bởi mật độ xương và chất lượng của xương Chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, chu chuyển xương, độ khoáng hoá, tổn thương tích luỹ, tính chất của các chất cơ bản của xương Trong các thông số này, chu chuyển xương đóng một vai trò quan trọng Theo nguyên nhân, loãng xương được chia làm hai loại là loãng xương nguyên phát và thứ phát Loãng xương nguyên phát lại được chia thành 2 loại: loãng xương sau mãn kinh và loãng xương tuổi già Loãng xương sau mãn kinh thường gặp ở phụ nữ sau mãn kinh hoặc phụ nữ sau cắt bỏ buồng trướng khoảng 5- 10 năm (liên quan đến sự thiếu hụt oestrogen) Loãng xương tuổi già xuất hiện cả ở nam và nữ trên 70 tuổi

Các dạng thực phẩm chức năng thường chứa đồng thời glucosamin và canxi đang được lưu hành rộng rãi trên thị trường là Viarthril-S, Thiên Giao Linh, Adcalub, Glucosamin, TM-Carebone, Joint Eum, Xjoint, Glucobone,

1.2 Tổng quan về canxi

Canxi là một khoáng chất quan trọng và cần thiết trong quá trình hình thành, cấu tạo khung xương Khoảng 98% lượng canxi trong cơ thể tập trung ở xương và răng và 2% phân bố trong máu để thực hiện các chức năng thần kinh cơ, đông máu Trong máu, canxi tồn tại dưới 3 dạng là khoảng 50% dưới dạng ion Ca2+, phần còn lại kết hợp với protein huyết tương (chủ yếu là albumin) và một phần nhỏ dưới dạng phức hợp với phosphat, citrat

và carbonat Canxi được hấp thu vào cơ thể thông qua thực phẩm hằng ngày bao gồm các sản pẩm từ sữa, cải xoăn, bông cải xanh, các loại hạt,…[14]

Canxi là kim loại kiềm thổ thuộc phân nhóm chính nhóm II của bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố hóa học có ký hiệu Ca, số nguyên tử bằng 20 và khối lượng nguyên tử

là 40,0784 g/mol Canxi là kim loại phổ biến thứ 5 trong vỏ Trái đất, cấu tạo nguyên tử của canxi được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1 1 Cấu tạo của nguyên tử canxi

Canxi là khoáng chất giữ vai trò quan trọng trong cơ thể con người Trong cơ thể người, canxi là thành phần cơ bản cấu tạo nên xương, răng và thường kết hợp với phospho làm cho xương, răng chắc khỏe Ngoài ra, canxi cần cho quá trình hoạt động của thần kinh

cơ, hoạt động của tim, chuyển hoá của tế bào và quá trình đông máu Canxi đi vào cơ thể qua ăn uống được hấp thu bởi ruột non, đại tràng và đào thải qua thận [28]

Tuy nhiên, con người thường không cung cấp đủ lượng canxi cần thiết cho cơ thể gây nên sự thiếu hụt canxi Đối với trẻ nhỏ, trẻ sẽ bị còi xương, chậm tăng chiều cao và một số trẻ thường bị giật mình, dễ nổi cáu Đối với người lớn, người cao tuổi, việc thiếu hụt canxi gây ra tình trạng thần kinh suy nhược, tinh thần không ổn định, mất ngủ hoặc ngủ li bì và

có thể dẫn tới bệnh loãng xương, xốp xương hay tăng huyết áp Đặc biệt, lượng canxi trong mãu thiếu sẽ gây hội chứng hạ canxi máu thường gặp ở mọi lứa tuổi Các dấu hiệu biểu hiện như tê ở một số bộ phận trong cơ thể (lưỡi, môi, các đầu ngón tay, đầu ngón chân) Trong trường hợp nặng, có hiện tượng co cơ xảy ra trên toàn bộ cơ thể (chân, tay đột nhiên

bị co rút, cứng lại, khó cử động, đau đớn, co giật khu trú) và có thể bị co thắt các cơ hô hấp gây khó thở

Trên thực tế, nhu cầu canxi của cơ thể được xác định vào mối tương quan của canxi với photpho Đối với mọi lứa tuổi, tỷ số Ca/P tối thiểu là > 0,8 và tỷ số này tốt nhất nằm trong khoảng từ 1 đến 1,5, đặc biệt đối với trẻ em [25] Lượng canxi nên tiêu thụ đối với từng độ tuổi khác nhau được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1 1 Hàm lượng canxi tiêu thụ theo nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị (mg/ngày)

Vị thành

niên

9- 13 tuổi 1300 mg 1300 mg 14- 18 tuổi 1300 mg 1300 mg 1300 mg

Người

trưởng thành

19- 50 tuổi 1000 mg 1000 mg 1000 mg 51- 70 tuổi 1000 mg 1200 mg

Ngoài ra, glucosamin cũng đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy tế bào sinh sụn,

kích thích sản sinh mô liên kết của xương, giảm mất canxi ở xương Glucosamin còn làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên giúp giảm ma sát giữa các khớp và giảm đau Vì vậy, glucosamin không chỉ làm giảm các triệu chứng của bệnh xương khớp (đau, cứng khớp, khó vận động) mà đồng thời ngăn ngừa bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn, giúp điều trị tận gốc chứ không chỉ là các triệu chứng

Liều dùng của glucosamin từ 1 đến 1,5 g/ngày và được hấp thụ vào cơ thể thông qua đường uống hoặc đường tiêm bắp Hoạt chất hiện được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và cho các kết quả khả quan

Công thức cấu tạo của glucosamin được thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của glucosamin

- Tên IUPAC: (3R, 4R, 5S)-3-Amino-6-(hydroxymethyl) oxane-2,4,5-triol

- Công thức phân tử: C6H13NO5

- pKa = 8 ± 0,2

- Khối lượng phân tử: 179,17 g.mol-1

- Glucosamin là chất rắn, màu trắng, không mùi, nhiệt độ nóng chảy: 88°C, tan tốt trong nước, hơi tan trong methanol sôi, ít hòa tan trong methanol hoặc ethanol lạnh, thực tế không hòa tan trong ete hoặc chloroform

Glucosamin trên thị trường được sử dụng trong hỗ trợ điều trị thoái hóa khớp gồm có bốn dạng chính glucosamin sulfat, glucosamin hydrochlorid, N-acetyl glucosamin và

glucosamin sulfat potassium chlorid Các dẫn xuất phổ biến này được trình bày trong bảng

1.2

Bảng 1 2 Các dẫn xuất glucosamin thường gặp

Tên thông thường Công thức phân tử

Khối lượng phân tử (g.mol-1)

Công thức cấu tạo

vệ khớp bằng ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholinase A2, N-acetylglucosamindase và kích thích tăng hoạt tính enzym có vai trò xúc tác phản ứng tổng hợp acid hyaluronic là chất giúp khớp hoạt động tốt Hiện nay, chondroitin được xem

là chế phẩm bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý tại khớp như viêm khớp,

viêm hoạt dịch, viêm gân, đau và sưng, bệnh Gout, thoái hóa cột sống, Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sử dụng kết hợp chondroitin và clucosamin sẽ có tác dụng tích cực hơn so với khi sử dụng từng chất riêng lẻ, đặc biệt hiệu quả hơn trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị thoái hóa khớp, giúp giảm sưng đau, cứng khớp và cải thiện chức năng vận động của khớp

Chondroitin có trong sụn khớp đảm bảo cho sụn mềm dẻo, xương dễ hoạt động và chịu đựng được các trọng lượng và sức ép Chondroitin giúp hạn chế sự thoái hóa các enzym (elastase, hyaluronidase), từ đó ức chế quá trình thoái hóa khớp, dịch khớp và ức chế thoái hóa chức năng của khớp, có tác dụng giảm đau do viêm khớp

1.3.2.2 Metyl sulfonyl methan (MSM)

Metyl sulfonyl methan là một sunfua đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính đàn hồi và linh hoạt của các cơ liên kết, ngoài ra nó còn góp phần chống viêm, giảm đau Metyl sulfonyl methane không chỉ có tác dụng trong viêm xương khớp và thoái hóa khớp

mà còn có tác dụng với bệnh thấp khớp và tăng khả năng tự miễn dịch của cơ thể MSM

có khả năng nuôi dưỡng và hồi phục sụn, những chất giống như gel để tạo lớp đệm cho khớp và là thành phần quan trọng của các mô liên kết Chất ngăn cản những liên kết chéo của colagen và protein, do đó làm giảm sự khô cứng của da và những tế bào kết nối Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng sunfua trong các khớp bị viêm thấp hơn trong các khớp khỏe mạnh MSM cung cấp lượng sunfua cần thiết cho vùng bị đau, các cơn đau phần lớn tập trung ở các tế bào cơ thịt Có nhiều loại cơn đau được quy là do áp lực xuống tê bào, khi tế bào chịu áp lực bên ngoài, từ đó sẽ trương phù và trở nên viêm Hiệu quả khả quan của MSM chính là sự duy trì sự lưu thông của tế bào, làm tan biến các chất không tốt đối với tế bào, khiến nguồn dinh dưỡng vào cơ thể dễ dàng, phòng tránh tế bào chịu áp lực,

từ đó cắt giảm các cơn đau Những bệnh nhân viêm khớp mỗi ngày sau khi bổ sung lượng MSM sẽ giảm và trị được các bệnh viêm khớp

1.4 Tổng quan các phương pháp phân tích canxi và glucosamin

Hiện nay, do canxi là một loại khoáng chất và glucosamin là một chất hữu cơ nên thông thường hai chất này được phân tích riêng rẽ bằng các phương pháp khác nhau như quang phổ hấp thụ nguyên tử [12, 22, 44], điện hóa [11, 19, 36], sắc kí lỏng (LC) [3, 8-10, 23], điện di mao quản [15-16, 26, 41],

1.4.1 Các phương pháp phân tích riêng rẽ canxi

1.4.1.1 Phương pháp điện hóa

Các cảm biến điện hóa được nghiên cứu và ứng dụng từ lâu và vẫn luôn thu hút được

sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các hãng sản xuất Các cảm biến điện hóa

có ưu điểm là phân tích nhanh, có độ chọn lọc, độ nhạy cao và thường có kích thước nhỏ gọn, có thể phân tích tại hiện trường

Một quy trình tổng hợp điện cực carbon biến tính dựa trên vòng diamide xác định chọn lọc canxi đã được tác giả Mojtaba và các cộng sự nghiên cứu thành công Điện cực carbon được biến tính bằng một ionophore là 1,4-diaza-2,3;8,9-dibenzo-7,10-dioxacyclododecane-5,12-dione Khoảng tuyến tính rộng từ 1,3.10-6 M đến 3,2.10-3 M Giới hạn phát hiện của phương pháp đạt được là 7,9.10-7 M Nghiên cứu đã áp dụng thành công xác định hàm lượng canxi trong các mẫu dược phẩm [36]

Tác giả Olayemi cùng cộng sự đã phát triển phương pháp phân tích điện hóa để xác định canxi trong nước khi có mặt acid humic và ion Cu (II) Phương pháp von-ampe vòng

sử dụng điện cực vàng Thế bắt đầu là -1,5 V với tốc độ quét 25 mV/s và thế kết thúc là 1,5 V Canxi có khoảng tuyến tính nằm trong khoảng 3,76- 5,4 mM với hệ số tương quan cao (R2 >0,999) và giới hạn phát hiện là 6,91.10-4 M Phương pháp được áp dụng trong các sản phẩm như nước khoáng, nước giải khát và rượu vang [19]

Canxi xác định trên điện cực Carbon thủy tinh bằng kỹ thuật đo sóng vuông được tác giả Joseany và cộng sự tiến hành nghiên cứu thử nghiệm Điều kiện tối ưu của nghiên cứu

là dung dịch đệm amoni 104 µM pH 9,4 và 400 µL EDTA 104 µM với thế quét nằm trong khoảng từ -0,6 V đến 0,6 V Giới hạn phát hiên của canxi là 1,6.10-3 µM Nghiên cứu tiến hành nghiên cứu trên mẫu dầu diesel sinh học với độ thu hồi khoảng 102% [11]

Tác giả Dilgin sử dụng điện cực than chì phân tích hàm lượng canxi dobesilate trong mẫu dược phẩm Nghiên cứu xây dựng khoảng tuyến tính từ 0,2 đến 100 µM với hệ số tương quan cao Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,065 µM và độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng 1,1- 2,0% Ảnh hưởng của các ion cản trở khác nhau trong nền mẫu không đáng kể được tiến hành khảo sát [18]

1.4.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là phương pháp phân tích dựa trên cơ sở mật

độ quang của dung dịch tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích (chất phân tích có tính chất quang học như tính hấp thụ quang, tính phát quang,…) Các phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử khá đơn giản, dễ tiến hành, được ứng dụng nhiều trong phân tích mẫu

Nhóm các nhà khoa học tại Syria đã xây dựng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tích canxi pitavastatin trong nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng dạng viên Phương pháp dựa trên sự hình thành phức hợp cặp ion màu vàng giữa pitavastatin canxi và bromocresol tím (BCP) trong môi trường chloroform Các thông số khác nhau ảnh hưởng đến phản ứng như: ảnh hưởng của dung môi, độ ổn định, nồng độ thuốc thử, tỷ lệ tương quan đã được tối ưu hóa Phức chất tạo thành được định lượng bằng quang phổ ở bước sóng 405 nm Khoảng tuyến tính được xây dựng trong khoảng 2,20 - 35,2 ppm Tiến hành phân tích hồi quy cho thấy hệ số tương quan tốt (R2> 0,99) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,37 ppm và 1,11 ppm Độ thu hồi của phương pháp cao khoảng 101% [12]

1.4.1.3 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp dựa trên nguyên lý hấp thụ của hơi nguyên tử, nếu chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào một đám hơi nguyên tử (ở trạng thái hơi, các nguyên tử tự do) thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ Quá trình đó gọi là quá trình hấp thụ ánh sáng (năng lượng) của nguyên tử Phổ phát sinh trong quá trình gọi là phổ hấp thụ nguyên tử [2]

Yebra cũng đã phát triển thành công phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử phân tích hàm lượng canxi và magie trong mẫu thực phẩm chức năng Tác giả đã đánh giá kết quả bằng các thiết kế thử nghiệm của Plackett-Burman Mẫu được hòa tan bằng nước cất hai lần sau đó tiến hành rung siêu âm trong 30s Phương pháp phân tích có giới hạn phát hiện của canxi và magie lần lượt là 2,8 mg/g và 9,5 mg/g Độ lệch chuẩn tương đối nằm trong khoảng 0,5 – 3,0% Phương pháp đã được áp dụng xác định hàm lượng các chất phân tích trong viên vitamin tổng hợp [45]

Tác giả Quigley áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử để phân tích canxi trong dược phẩm Phương pháp xây dựng đường tuyến tính trong khoảng 1 mg/L-

10 mg/L tại bước sóng 422,7 nm Nghiên cứu đã được ứng dụng xác định hàm lượng của canxi trong viên nén Bufferin là 12,02% [33]

1.4.1.4 Phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng (ICP)

Phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần là phương pháp xác định hàm lượng các nguyên tố trong nhiều lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp, thực phẩm, dược phẩm, môi trường, Nguyên tử hay ion nhận năng lượng kích thích từ plasma chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Tuy nhiên, trạng thái kích thích chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn (khoảng 10-12 – 10-8 s), sau đó nguyên tử hay ion phóng thích năng lượng hấp thụ dưới dạng bức xạ λ để trở về trạng thái bền nhất- trạng thái cơ bản

Bharathi avula và các cộng sự đã áp dụng phương pháp ICP-MS để xác định hàm lượng canxi trong thực vật và thực phẩm chức năng Mẫu thực phẩm chức năng sau khi cân, nghiền nhỏ sẽ được cân và phá mẫu bằng lò vi sóng Dung dịch mẫu được pha loãng 2-10 lần trước khi đưa vào hệ thống ICP-MS Phương pháp phân tích có giới hạn phát hiện của canxi là 1,09 µg/kg Độ lệch chuẩn tương đối nằm trong khoảng 0,12 - 4,9% Độ thu hồi đối với canxi trong khoảng 112,2 - 118,4 % Phương pháp đã được áp dụng để xác định hàm lượng nhiều nguyên tố trong mẫu thực vật và thực phẩm chức năng [13]

Bên cạnh đó, Siitonen cùng các cộng sự đã xác định canxi và chì trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử plasma cảm ứng cao tần Quy trình phân tích bao gồm tro hóa mẫu, sau đó thực hiện quy trình phân hủy ướt mẫu với (NH4)2HPO4 0,5 % và Ca2+ được đo tại vạch 393,37 nm Nghiên cứu có độ thu hồi cao trong khoảng 82,7- 105 %, độ lệch chuẩn tương đối trung bình là 8,0 % và ứng dụng phân tích thành công hàm lượng canxi trong 12 mẫu thực phẩm chức năng [38]

Anna Krejcova và các cộng sự đã xác định được nhiều nguyên tố gồm canxi trong các mẫu thực phẩm chức năng và mẫu bùn bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử plasma cảm ứng Mẫu thủy phân bằng acid nitric 65% trong lò vi sóng với chương trình công suất đạt 80 % trong 10 phút, và công suất đạt 100 % trong 10 phút Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5,13 mg/g Hàm lượng nguyên tố canxi trong năm mẫu thực phẩm chức năng dạng bột được xác đinh cho kết quả tương ứng so với nhãn trên bao bì [27] Hàm lượng 26 nguyên tố bao gồm canxi trong sữa dành cho trẻ sơ sinh được xác định bằng phương pháp phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử plasma cảm ứng bởi Abua Ikem và các cộng sự nghiên cứu ra Các mẫu sữa lỏng và sữa bột được phân hủy bằng thiết

bị vi sóng Milestone Ethos-PLUS Hàm lượng trung bình canxi phát hiện trong 11 sản phẩm sữa nằm trong khoảng 344 – 662 µg/g [24]

Nhóm tác giả Pereira cũng áp dụng phương pháp ICP-OES để xác định đồng thời canxi cùng các nguyên tố khác trong mẫu thực phẩm chức năng tại Brazil Các mẫu thực phẩm chức năng được đồng nhất sau đó để trong tủ sấy khoảng 3 giờ ở 60 ± 5°C Sau đó, mẫu được bảo quản trong bình polypropylene cho đến khi phân tích Phương pháp phân tích có giới hạn phát hiện là 1,98 µg/kg với hệ số tương quan R2 cao (0,9992) Độ thu hồi của c anxi trong mẫu nằm trong khoảng 96 – 101 % Phương pháp đã được áp dụng để xác định hàm lượng nhiều nguyên tố trong mẫu thực phẩm chức năng dùng trong thể thao [32]

1.4.1.5 Phương pháp điện di mao quản

Hiện nay, phương pháp điện di mao quản được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt

về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng phân tách và xác định canxi trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

Keiichi Fukushi và Kazuo Hiiro đã sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) cùng detector UV xác định được ion Ca2+ trong nước biển Nghiên cứu sử dụng mao quản silica phủ polyimide, 50 μm ID x 375 μm OD với tổng chiều dài mao quản là 72 cm

và chiều dài hiệu dụng là 25 cm Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic và chiều cao pic đối với ion đều nhỏ hơn 2,0% Các hệ số tương quan thu được từ đường chuẩn (R2) lớn hơn 0,999 Giới hạn phát hiện của canxi là 0,26 mg/L [21]

Susanne Nussbaumer và các cộng sự xác định hỗn hợp K+, Na+, Ca2+ và Mg2+ trong sản phẩm dinh dưỡng bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) trong thời gian chưa đầy 4 phút Nghiên cứu sử dụng mao quản silica (64,5 cm×50 μm ID) tại dung dịch điện ly là hỗn hợp Tris-acetate 100 mM (pH=4,5) và acetonitrile (80:20, v/v) với thế tách +30 kV Kết quả thu được là hiệu suất thu hồi đạt trong khoảng 98,6- 101,8% và độ lệch chuẩn tương đối dao động từ 0,4 đến 1,3% Phương pháp này đã được ứng dụng thành công xác định hỗn hợp K+, Na+, Ca2+ và Mg2+ góp phần kiểm soát chất lượng trong các sản phẩm dinh dưỡng hằng ngày tại bệnh viện đại học Geneva [31]

1.4.2 Phương pháp phân tích riêng rẽ glucosamine

1.4.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Priya Gaonkar và các cộng sự đã sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử UV-Vis xác định glucosamin sulfat trong thực phẩm chức năng dạng viên nén Trong nghiên cứu này, glucosamin được phản ứng với phenylisothiocyanate trong môi trường bazơ tạo ra dẫn xuất phenylthiourea, có bước sóng hấp thụ cực đại là 240nm Khoảng nồng

độ được xây dựng là 5- 25 µg/mL với hệ số tương quan lớn và độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,1% Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, phát hiện nhanh chóng, chính xác các sản phẩm thực phẩm chức năng chứa glucosamin được bán trên thị trường [22]

Yamaguchi và các cộng sự sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Vis xác định glucosamin dựa trên sự mất màu của phức hợp palladium (II)-o-hydroxyhydroquinonephthalein-hexadecyltrimethylammonium với bước sóng hấp thụ cực đại là 630 nm Khoảng đường chuẩn được xây dựng là 0,02- 0,18 µg/mL, độ lệch chuẩn tương đối thu được là 1,08% Phương pháp đã tiến hành áp dụng trên các mẫu thực phẩm chức năng dạng viên nén [44]

UV-1.4.2.2 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp dựa trên sự phân

bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [2] Khi pha động là chất lỏng, phương pháp được gọi là phương pháp sắc kí lỏng (LC), tương tự khi pha động là chất khí, phương pháp được gọi là phương pháp sắc kí khí (GC)

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký xác định glucosamin được tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1 3 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định glucosamin bằng phương pháp sắc kí

100-x 4,0 mm, 5µm)

UV

- RSD: 0,2- 1,4 %

- R2: 0,9994 LOD: 3,9 mg/mL

[30]

N-butyryl

glucosamin

Huyết tương chuột

Kênh A: Đệm phosphate

(pH = 7) Kênh B: Acetonitrile

Tỷ lệ A: B (80:20, v/v)

- Khoảng tuyến tính:

0,2 – 200 μg/mL LOQ: 1,0 µg/mL

[9]

Glucosamin Dược phẩm

Kênh A: Đệm amonium acetat (pH = 3,5) Kênh B: Acetonitrile

[34]

Glucosamin Dược phẩm

Kênh A: sodium perchlorat (50mM, pH=6,5)

Luna C8(250mm x 4,6

mm, 5µm)

UV

- R2: 0.9998

- LOD = 0,02 µg/ml RSD < 1%

[10]

Kênh B: Acetonitril

Tỷ lệ A: B (99: 1, v/v)

Glucosamin

Dược phẩm, thực phẩm chức năng

Đệm phosphat (pH 3):

Acetonitril (35:65, v/v)

Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm,

Shodex Asahipak NH2P-

50 (4.6 x250

mm, 5 µm)

Detector đo chỉ số khúc

Detector đo chỉ số khúc

1.4.2.3 Phương pháp điện di mao quản

Theo một nghiên cứu khác, Nicola Volpi ở đại học Modena và Reggio Emilia đã sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng kết hợp detector UV phân tích glucosamin trong các mẫu thực phẩm chức năng Nghiên cứu sử dụng dung dịch đệm hỗn hợp 150mM acid boric và 50mM NaH2PO4 tại pH= 7,0 với thế điện áp là 15kV Glucosamin được dẫn xuất bằng acid anthranilic (acid 2- aminobenzoic) trước khi phân tích trên thiết bị và xác định tại bước sóng 214 nm trong khoảng thời gian phân tích ngắn là 10 phút Khoảng tuyến tính nằm trong khoảng 240- 2400 pg (tương ứng với 40-400 µg/mL) với hệ số tương quan lớn hơn 0,980; giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 200 và 500pg Phương pháp đã áp dụng để xác định glucosamin và các dạng của glucosamin của một số thực phẩm chức năng cho kết quả phù hợp với công bố trên nhãn [41]

Jong Jyh Chen cùng nhóm cộng sự áp dụng phương pháp điện di mao quản phân tích glucosamin trong thực phẩm chức năng sử dụng kĩ thuật đánh dấu OPA Glucosamin được

gắn với ο-phthalaldehyde (OPA) bằng cách hòa tan glucosamin với hỗn hợp 4,5 mM OPA

và 4,5 mM 2-mercaptoethanol trong 20 mM đệm borat pH =9,3 Nghiên cứu sử dụng detector UV phát hiện tín hiệu tại 3 phút với bước sóng hấp thụ là 340nm Đường chuẩn được xây dựng trong khoảng từ 0,1 đến 30 mM Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,1 mM Nghiên cứu xác định thành công hàm lượng glucosamin trong 3 mẫu viên nén với

sự sai khác so với trên nhãn nhỏ hơn 10% [16]

Ngoài ra, theo nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Nga, E Václavíková tiến hành phân tích glucosamin và chondroitin sulphat trong thực phẩm chức năng sử dụng phương pháp điện di mao quản với dung dịch hỗn hợp đệm 10 mM NH4OH và 20 mM acid acetic (pH= 10) Glucosamin được phát hiện tại bước sóng 254 nm Khoảng tuyến tính của phương pháp là 10- 100 mg/L với hệ số tương quan lớn R2 > 0,999, giá trị độ lệch chuẩn tương đối tốt khoảng 1,82% Độ thu hồi của phương pháp nằm trong khoảng 98,8% và giới hạn phát hiện là 0,8 mg/L Nghiên cứu áp dụng phân tích thành công trên 35 mẫu thực phẩm chức năng được mau tại các cửa hàng thuốc [40]

Nhóm tác giả Patcharin Chaisuwan và cộng sự đã xác định thành công được glucosamin trong dược phẩm và huyết thanh bằng phương pháp điện di mao quản trong thời gian phân tích nhanh (dưới 3 phút) Theo nghiên cứu, chất phân tích được tối ưu hóa trong các điều kiện thí nghiệm: 20 mM đệm MES/His (pH = 6,0) với detector C4D; mao quản silica có đường kính ID = l00 µm, tổng chiều dài 35cm và chiều dài hiệu dụng là 24cm; điện áp +7 kV tại nhiệt độ 25°C Việc bơm mẫu được thực hiện theo phương pháp

thủy động lực học (5s dưới áp suất 0,5 psi) Độ lệch chuẩn tương đối RSD < 1,91% và độ thu hồi của phương pháp nằm trong khoảng 86,5- 104,78 % Khoảng tuyến tính được xây dựng trong khoảng 0,10 - 2,50 mg/mL với hệ số tương quan lớn [15]

Một nghiên cứu khác xác định glucosamin trong dược phẩm và thực phẩm chức năng

đã sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng kết hợp với detector độ dẫn điện không tiếp xúc Theo đó, Pavel Jác cùng cộng sự đã tối ưu được các điều kiện phân tích như: mao quản silica (chiều dài mao quản 75cm với chiều dài hiệu dụng 27cm, ID 50 µm), dung dịch điện ly là đệm acetate 30mM (pH=5,2), thế điện áp 30 kV với hệ bơm mẫu tự động Thời gian phân tách nhanh dưới 3 phút Khoảng tuyến tính xây dựng trong khoảng 100- 300 µg/mL với hệ số tương quan R² cao 0,997 Giới hạn phát hiện là 9,3 µg/mL Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương pháp khoảng 2,35 % (n= 15) và độ thu hồi tìm được trong khoảng 94,6- 103,3 % [26]

Như vậy, các nghiên cứu trước đây đã tiến hành phân tích định lượng riêng rẽ glucosamin và canxi trong thực phẩm chức năng và đều cho kết quả tốt Hiện nay, các sản phẩm hỗ trợ điều trị xương khớp đều bổ sung 2 chất này, tuy nhiên, chưa có báo cáo nào tiến hành phân tích đồng thời glucosamin và canxi Trong khi đó, phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc CE-C4D có tiềm năng xác định đồng thời các cation hoặc anion thậm chí có tính chất hoàn toàn khác nhau Vì vậy, trong nghiên cứu này, phương pháp CE-C4D đã được lựa chọn để đáp ứng các tiêu chí như yêu cầu thời gian phân tích nhanh, lượng mẫu sử dụng ít, chi phí vận hành thấp và giải quyết vấn đề phân tích đồng thời glucosamin và canxi trong các thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.5 Tổng quan về phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không

tiếp xúc CE-C 4 D

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có

chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E) nhất định được sinh ra do thế V [6]

Phương pháp điện di mao quản sử dụng điện trường sinh ra bởi một nguồn thế cao (hàng chục kV) áp vào mao quản (có đường kính trong 10- 150 µm) tại đầu bơm mẫu, làm cho các chất tích điện (trong nền dung dịch điện ly, có đệm pH thích hợp) di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6] Tương tự thời gian lưu trong sắc ký, trong phân tích bằng CE, thời gian di chuyển được dùng để định tính các ion, còn việc định lượng sẽ dựa trên tín hiệu diện tích píc thu được trong quá trình điện di

Trên cơ sở nguyên tắc của CE, một hệ thiết bị CE cơ bản mô tả như trong hình 1.3 [4]

Hình 1 3 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị CE

Mẫu được bơm vào mao quản theo một trong ba phương thức: Kỹ thuật thủy động lực học dùng áp suất, kỹ thuật thủy động lực học kiểu xi phông và kỹ thuật điện động học [6] Mao quản thường làm bằng vật liệu silic gọi là mao quản silica, phủ bên ngoài bởi một lớp polyme có độ dày từ 200- 350 µm, đường kính ngoài (OD) 365 μm, đường kính trong (ID) từ 10- 150 μm (phổ biến là 50 μm), chiều dài mao quản có thể từ 10- 100 cm (phổ biến là 60 cm) Hai đầu mao quản được đặt trong hai bình chứa dung dịch điện ly Một nguồn thế cao từ 5- 30 kV sẽ sinh ra điện trường (E) cho quá trình điện di xảy ra Các kết quả thực nghiệm cho thấy với mao quản silica, bề mặt mao quản thường tích điện âm, khi

đó sẽ xuất hiện một lớp điện kép làm cho thành mao quản có một điện thế nhất định (thế Zeta) [6]

Detector độ dẫn không tiếp xúc trực tiếp đo độ dẫn của dung dịch phân tích được đặt giữa hai điện cực Về cơ bản, độ dẫn đều do lớp điện kép của các phần tử mang điện thiết lập qua một lớp cách điện Độ nhạy của detector phụ thuộc nhiều vào nền dẫn điện vì vậy nên chọn dung dịch đệm phân tích phù hợp, có độ dẫn nhỏ nhất Detector độ dẫn được sử dụng nhiều với những chất phân tích không có khả năng hấp thụ UV- Vis nhưng có khả năng dẫn điện cao như các ion vô cơ, các acid amin… [39]

Detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục được giới thiệu lần đầu trên thế giới vào năm 1998 bởi Zemann cùng các cộng sự [46] và Da Silva,

Do Lago [20] thiết kế này vẫn được dùng cho tới tận ngày nay

Nguyên tắc hoạt động của C4D được mô tả như hình 1.4 và hình 1.5 dưới đây:

Hình 1 4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của detector độ dẫn không tiếp xúc

Hình 1 5 A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector độ dẫn không tiếp xúc, với hai điện

cực ngăn cách với dung dịch cần đo bởi thành mao quản

B) Mạch điện tương đương

Phương pháp điện di mảo quản (CE) sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D)

đã được ứng dụng rộng rãi để phân tích các chất hữu cơ và vô cơ trong các đối tượng mẫu khác nhau Đây là một trong số ít các phương pháp phân tích vừa có thể triển khai hiệu quả trong phòng thí nghiệm, vừa có thể phát triển thành công cụ phân tích có thể triển khai tại hiện trường Do đó, phương pháp điện di mao quản là sự lựa chọn phù hợp cho nghiên cứu phát triển và ứng dụng có tiềm năng phân tích đồng thời canxi và glucosamin, từ đó sẽ góp phần đảm bảo chất lượng của thực phẩm chức năng được lưu hành trên thị trường và nâng

cao sức khỏe cộng đồng

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài này là nghiên cứu quy trình xác định đồng thời canxi và glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp CE-C4D

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm:

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời chất phân tíchcanxi và glucosamin bằng phương pháp CE-C4D:

• Khảo sát dung dịch điện ly: thành phần, pH, nồng độ

• Khảo sát thế tách

• Khảo sát điều kiện bơm mẫu dựa trên phương pháp thủy động học kiểu

xiphong: thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu

• Khảo sát ảnh hưởng của các chất thường có trong nền mẫu thực phẩm chức

năng

- Đánh giá phương pháp phân tích:

• Độ đặc hiệu của phương pháp

• Xây dựng đường chuẩn

• Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

• Đánh giá độ chụm và độ đúng của phương pháp phân tích

- Áp dụng quy trình để phân tích đồng thời hàm lượng của canxi và glucsamin trong mẫu thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường

- Phân tích đối chứng bằng phương pháp truyền thống (canxi bằng phương pháp ICP-OES và glucosamin bằng phương pháp HPLC) nhằm đánh giá độ tin cậy của phương pháp CE-C4D

2.2 Thiết bị và hóa chất

2.2.1 Thiết bị

2.2.1.1 Thiết bị CE-C 4 D

Thiết bị CE sử dụng trong nghiên cứu (hình 2.1) được cung cấp bởi công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/)

Hình 2 1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C 4 D sử dụng trong nghiên cứu

(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống

- Cân phân tích của hãng Scientech (Mỹ), độ chính xác 0,1 mg

- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu (Việt Nam)

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSON 521 (Mỹ)

Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu gồm:

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc, ống nghiệm

- Micropipet các loại: 1000 µL; 200 µL; 20 µL

- Ống nhỏ: 2 µL để đựng mẫu phân tích

- Các lọ Falcon 15 mL; 50 mL để đựng dung dịch chuẩn và mẫu

- Bộ xylanh lọc mẫu có đường kính màng lọc là 0,45 µm

- Mao quản sử dụng là mao quản silica, đường kính trong (ID) là 50 µm

- Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm

2.2.2 Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh thiết phân tích và được pha chế bằng nước deion

2.2.2.1 Chất chuẩn

- Glucosamin hydroclorid (Merck, 99,8%)

- Dung dịch chuẩn canxi 1000 mg/L (Merck)

2.2.2.2 Hóa chất dung môi

- Arginin (Arg) (Fluka, ≥ 99,5%), L-histidin (his) (Fluka, ≥ 99,0%), tris(hydroxymethyl)aminomethan (tris) (Fluka, ≥ 99,0%), acid acetic (PA, Merck), acid lactic (Merck)

- Các dung môi khác: n-hexan, HCl, NaOH, acid trichloroacetic (TCA)

- Nước deion: là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,22 µm

2.2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

• Pha dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn glucosamin được pha từ chất chuẩn tương ứng (mục 2.2.1.1) trong nước deion: Cân chính xác 15,8 mg chuyển vào bình định mức 25,0 mL Thêm 10 mL nước deion và tiến hành rung siêu âm trong 30 phút để hòa tan hoàn toàn chất sau đó định mức tới vạch bằng nước deion thu được dung dịch gốc có nồng độ 500 mg/L Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng

• Pha dung dịch điện ly

Dung dịch điện ly Ace: Lấy chính xác 17,6 µL acetic axit băng bằng micropipet 100

µL vào bình định mức 25 mL Định mức bằng nước deion tới vạch thu được dung dịch điện ly có nồng độ 200 mM

Các dung dịch điện ly Tris, Arg, His được cân và pha trực tiếp vào bình định mức bằng nước deion Tất cả các dung dịch đều được rung siêu âm và chuẩn lại giá trị pH trước khi sử dụng Dung dịch đệm được pha mới hằng ngày

2.3 Khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị CE-C 4 D

Khảo sát một số điều kiện phân tách đồng thời canxi và glucosamin được thực hiện trên thiết bị điện di CE-C4D với hỗn hợp chất chuẩn tương ứng với nồng độ của canxi 20 mg/L và glucosamin 80 mg/L Khảo sát được thực hiện ở thế tách dương với cột mao quản

có chiều dài 50 cm, chiều dài hiệu dụng 35 cm, đường kính trong 50 µm Các điều kiện này được giữ cố định trong tất cả các thí nghiệm

Các số liệu thu được xử lý bằng phần mềm eDAQ PowerChrom và điện di đồ được

vẽ bằng phần mềm Igor Các số liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel

2.4 Thông tin và quy trình xử lý mẫu phân tích

2.4.1 Thông tin mẫu

Các mẫu thực phẩm chức năng được mua ngẫu nhiên tại các hiệu thuốc lưu hành trên thị trường Hà Nội bao gồm dạng viên nén, viên nang Thông tin của mẫu thực phẩm chức năng được nêu trong Phụ lục 1

2.4.2 Quy trình xử lý mẫu phân tích

Qua tham khảo Dược điển Việt Nam V [1] và nghiên cứu [13], quy trình xử lý mẫu được tiến hành như sau:

- Mẫu dạng viên nén: Lấy 20 viên mẫu và cân khối lượng để xác định khối lượng trung bình một viên Mẫu được nghiền mịn và trộn đều thành bột đồng nhất

- Mẫu dạng viên nang: Lấy 20 viên mẫu và cân khối lượng, tách vỏ, làm sạch phần vỏ và cân khối lượng vỏ Xác định khối lượng trung bình của ruột viên bằng cách lấy trung bình tổng khối lượng trừ đi trung bình khối lượng vỏ Mẫu được nghiền mịn và trộn đều thành bột đồng nhất

- Cân chính xác 12,5 mg mẫu đồng nhất tương ứng (độ chính xác 0,0001g) vào cốc thủy tinh Thêm 20 mL dung dịch acid trichloroacetic (TCA) 4% vào, rung siêu âm mẫu trong 30 phút và ly tâm mẫu trong 15 phút Chuyển dung dịch thu được vào bình định mức 25 mL, định mức tới vạch bằng TCA 4% Dung dịch thu được lọc qua màng lọc 0,45 µm và pha loãng (nếu cần) trước khi tiến hành phân tích trên thiết bị CE-C4D

2.5 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

2.5.1 Độ đặc hiệu của phương pháp

Độ chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh điện di đồ của hai chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và chất chuẩn tại nồng độ của canxi 20 mg/L và glucosamin 80 mg/L Phương pháp có độ chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng và tín hiệu chất phân tích không bị ảnh hưởng bởi các tín hiệu chất khác

2.5.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

- Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền Thông thường đối với các quá trình tách sắc kí, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [7]

- Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền Thông thường, giá trị LOQ được xác định theo tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [7]

2.5.3 Đường chuẩn của phương pháp

Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo 5 điểm chuẩn có nồng độ từ giá trị định lượng trong khoảng tuyến tính từ 0,5 mg/L – 100 mg/L đối với canxi và 2,0 mg/L – 100 mg/L đối với glucosamin Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau

đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ Các dung dịch chuẩn được pha trên dịch sau khi xử lý của mẫu trắng

2.5.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

- Độ lặp lại (độ chụm)