Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của Allopurinol sử sụng trong kiểm nghiệm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Trình tự nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt hình 2.1.
Hình 2 1 Trình tự các nội dung nghiên cứu
Mục tiêu 1: tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm bao gồm mục: 1.1; 1.2; 1.3.
Mục tiêu 2: xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia bao gồm mục: 2.1; 2.2.
Mục tiêu 3: xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời
6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS bao gồm mục:3.1; 3.2.
Đối tượng nghiên cứu
Gồm 6 tạp chất liên quan của allopurinol
Tạp A: 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxamid; 3-aminopyrazol-4-carboxamid Tạp B: 5-(Formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxamid
Tạp C: 5-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)-1H-pyrazol-4-carboxamid
Tạp D: Ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat.
Tạp E: Ethyl 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxylat
Tạp F: Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino-pyrazol-4-carboxylat
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 5/2017 đến tháng 5/2023. Địa điểm: Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh
Cỡ mẫu của nghiên cứu
- Tạp A, B, C, D, E, F được tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm tối thiểu 2 g
- Nguyên liệu hoạt chất allopurinol 2000 g được cung cấp từ Honor Bio – Pharm (Trung Quốc) và nguyên liệu hóa chất cơ bản trong tổng hợp và phân tích.
Xác định các biến số độc lập và biến phụ thuộc
Biến độc lập: nguyên liệu tổng hợp, điều kiện phản ứng, điều kiện sắc ký, điều kiện khối phổ.
Biến phụ thuộc: sản phẩm tổng hợp tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol đạt tiêu chuẩn quốc gia; quy trình định lượng đồng thời 6 tạp bằng phương pháp LC-MS/MS.
Phương pháp và công cụ đo lường thu thập số liệu
Luận án sử dụng các phương pháp tổng hợp và phân tích sau:
- Phương pháp tổng hợp hóa học bao gồm tổng hợp hoặc phân hủy từ nguyên liệu, khảo sát yếu tố ảnh hưởng hiệu suất phản: tỷ lệ mol, nhiệt độ và thời gian phản ứng.
- Phương pháp xác định độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng; DSC; nhiệt nóng chảy
- Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc bằng UV-Vis; IR; HRMS; NMR.
- Phương pháp phân tích xác định độ tinh khiết và định lượng bằng kỹ thuật hiện đại HPLC – DAD; LC-MS/MS.
2.6.2 Nguyên vật liệu thử nghiệm
Bảng 2 1 Một số nguyên liệu, chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
Chuẩn Nguồn gốc Số lô HL (%)
Allopurinol Viện KNT TP.HCM QT269 020520 99,7
Tạp chuẩn A EDQM - Hội đồng châu Âu No3 Code: A0350010 100
Tạp chuẩn B EDQM - Hội đồng châu Âu No4 Code: A0350020 100
Tạp chuẩn C EDQM - Hội đồng châu Âu No4 Code: A0350030 100
Tạp chuẩn D EDQM - Hội đồng châu Âu No4 Code: A0350040 100
Tạp chuẩn E EDQM - Hội đồng châu Âu No1 Code: A0350050 100
Bảng 2 2 Một số dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc/Quốc giá Hàm lượng
1 Acid acetic Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%
3 Acid hydrocloric Xilong/Trung Quốc 35 – 38%
5 Acid sulfuric Xilong/Trung Quốc 95 – 98%
7 Allopurinol Honor Bio/Trung Quốc 99,07%
11 Ethyl acetat Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%
14 Natri hydrocarbonat Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%
15 Natri hydroxyd Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%
Thiết bị phân tích đã được hiệu chuẩn đạt yêu cầu mục đích sử dụng và quản lý theo quy định GLP và ISO/IEC 17025.
Bảng 2 3 Một số trang thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT Thiết bị Hãng Nước sản xuất
1 Bộ dụng cụ đun hồi lưu Bomex Trung Quốc
2 Buồng soi UV Vilber Lourmat Pháp
3 Bình cầu 250 ml Bomex Trung Quốc
4 Cân phân tích 5 số KERN Đức
5 Hệ thống nhiệt vi sai DSC TA Instrument Mỹ
6 Hệ thống HPLC – LC – 20A Shimadzu Nhật
7 Hệ thống HPLC – DAD Hitachi Nhật
8 Máy cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz Bruker Thụy sĩ
9 Máy cộng hưởng từ hạt nhân 400 MHz Bruker Thụy sĩ
10 Máy đo điểm chảy Mettler Toledo Thụy sĩ
11 Máy đo pH CONSORT Bỉ
12 Máy cô quay R-200 Buchi Nhật
13 Máy khuấy từ gia nhiệt HEIDOLPH MR Hei - TEC
STT Thiết bị Hãng Nước sản xuất
14 Máy LC/MS IT-TOF Shimadzu Nhật
15 Máy lọc nước siêu sạch MERCK Đức
16 Máy quang phổ hồng ngoại Bruker Thụy sĩ
17 Máy quang phổ UV – Vis JASCO Nhật
18 Máy siêu âm POWERSONIC Hàn Quốc
19 Máy sắc ký lỏng UPLC – MS/MS Water Mỹ
Quy trình thu thập và cách phân tích số liệu
Trên cơ sở các tài liệu tham khảo8,9,40,64,66,69, khảo sát điều kiện ban đầu tổng hợp các tạp chất liên quan A, B, C, D, E, F của allopurinol
2.7.1 Tổng hợp tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol
2.7.1.1 Tổng hợp tạp A của allopurinol
Tiến hành khảo sát quá trình tổng hợp tạp chất A allopurinol thông qua phản ứng phân hủy allopurinol dưới tác động của nhiệt độ kết hợp với các tác nhân kiềm hóa khác nhau.
- Phân hủy allopurinol bằng dung dịch NaHCO3
Hòa tan 2,0 g allopurinol (14,7 mmol) vào 40 ml dung dịch NaHCO3 1 M (40 mmol) Đun hồi lưu dung dịch ở nhiệt độ 140 ℃ trong 3 giờ Để nguội, điều chỉnh pH của dung dịch đến giá trị pH = 6 bằng dung dịch H2SO4 10%, lọc lấy dịch Tiếp tục điều chỉnh pH dịch lọc thu được đến giá trị pH = 2 bằng dung dịch H2SO4 10%. Để dung dịch qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc cẩn thận để thu lấy tủa Rửa tủa bằng nước lạnh (3 ml/lần x 3 lần) Sấy ở 60 ℃ đến không đổi để thu lấy sản phẩm.
Sơ đồ 2 1 Phân hủy allopurinol bằng NaHCO3
- Phân hủy allopurinol bằng dung dịch NH 3
Hòa tan 2,0 g allopurinol (14,7 mmol) vào 40 ml dung dịch NH3 Đun hồi lưu dung dịch ở nhiệt độ 140 ℃ trong 3 giờ Để nguội, sau đó điều chỉnh pH của dung dịch đến giá trị pH = 6 bằng dung dịch H 2 SO4 10%, lọc lấy dịch Tiếp tục điều chỉnh pH dịch lọc thu được đến giá trị pH = 2 bằng dung dịch H2SO4 10% Để dung dịch qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc cẩn thận để thu lấy tủa Rửa tủa bằng nước lạnh
(3 ml/lần x 3 lần) Sấy ở 60 ℃ đến không đổi để thu lấy sản phẩm.
Sơ đồ 2 2 Phân hủy allopurinol bằng NH3
- Phân hủy allopurinol bằng dung dịch NaOH
Hòa tan 2 g allopurinol (14,7 mmol) vào 40 ml dung dịch NaOH 1 M (40 mmol) Đun hồi lưu dung dịch thu được ở nhiệt độ 140 ℃ trong 3 giờ Để nguội, sau đó điều chỉnh pH của dung dịch đến giá trị pH = 6 bằng dung dịch H2SO4 10%, lọc lấy dịch Tiếp tục điều chỉnh pH dịch lọc thu được đến giá trị pH = 2 bằng dung dịch acid sulfuric 10% Để qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc cẩn thận để thu lấy tủa. Rửa tủa bằng nước lạnh (3 ml/lần x 3 lần) Sấy ở 60 ℃ đến khối lượng không đổi.
Sơ đồ 2 3 Phân hủy allopurinol bằng NaOH
2.7.1.2 Tổng hợp tạp B của allopurinol
Tiến hành cân 0,5 g tạp A allopurinol dạng hemisulfat (2,85 mmol) cho vào 4 ml formamid, thờm tiếp vào 30 àl acid formic đun hỗn hợp trờn bếp cỏch thủy khoảng 95 o C trong 2 giờ, theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau khi kết thúc phản ứng, cho vào hỗn hợp 20 ml nước cất khuấy đều, lọc lấy tủa Rửa tủa với nước cất (10 ml x 3 lần), sấy ở 60 o C đến khối lượng không đổi, thu lấy sản phẩm.
Sơ đồ 2 4 Quy trình phản ứng tổng hợp tạp B
2.7.1.3 Tổng hợp tạp C của allopurinol
Phương pháp 1: tạp A allopurinol hemisulfat phản ứng với 1,2-diformylhydrazin
Cho 1,8 g tạp A allopurinol hemisulfat (0,01 mol) và 1,76 g 1,2- diformylhydrazin (0,02 mol) vào bình phản ứng Thêm vào bình dung dịch H2SO4
20% làm môi trường phản ứng Đun hỗn hợp trên hệ thống đun hồi lưu ở nhiệt độ
105 o C trong 5 giờ Cô cạn dịch sau phản ứng còn khoảng 20 - 30 ml Để nguội, khảo sát kết quả sản phẩm sau phản ứng.
Sơ đồ 2 5 Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân 1,2-diformylhydrazin
Phương pháp 2: tạp A allopurinol hemisulfat phản ứng với acid formic và hydrazin
Cho 1,8 g tạp A allopurinol hemisulfat (0,01 mol), 12 ml acid formic (0,3 mol) và 4,8 ml hydrazin hydrat 80% (0,1 mol) vào bình phản ứng Đun hỗn hợp trên hệ thống đun hồi lưu ở nhiệt độ khoảng 95 - 105 o C trong 5 giờ Cô cạn dịch sau phản ứng còn khoảng 20 - 30 ml Để nguội, sau đó cho methanol vào xuất hiện tủa là các tạp vô cơ, loại tủa Cô quay dịch lọc ở nhiệt độ thích làm xuất hiện tủa trắng là sản phẩm tạp C tổng hợp Lọc thu lấy sản phẩm, sấy ở 60 o C đến khối lượng không đổi.
Sơ đồ 2 6 Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân acid formic và hydrazin
2.7.1.4 Tổng hợp tạp D của allopurinol
Lấy 0,005 mol ethyl (ethoxymethylen)cyanoacetat, thêm vào 20 ml ethanol
96 o Lắc đều cho tan, thêm vào 0,5 ml hydrazin hydrat 80% Đun hồi lưu Cô quay dịch sau phản ứng đến hết dung môi, hòa tan sản phẩm thu được với 10 ml diethyl ether, lọc và cô quay áp suất giảm thu được sản phẩm, tiếp tục sấy ở 60 °C đến khối lượng không đổi, cân sản phẩm thu được. Đun hồi lưu
Sơ đồ 2 7 Sơ đồ tổng hợp tạp D allopurinol
2.7.1.5 Tổng hợp tạp E của allopurinol
Phương pháp 1: Tạp D allopurinol phản ứng với triethyl orthoformat
Hòa tan 1,8 g tạp D (0,01 mol) trong 36 ml triethyl orthoformat, đun hồi lưu khoảng 4 giờ ở nhiệt độ 95 độ C Sau đó, pha loãng dung dịch thu được với cồn 96 độ và nước, rồi tiến hành bốc hơi dung dịch đến khi tinh thể bắt đầu xuất hiện Lọc thu tinh thể và rửa với nước nhiều lần, cuối cùng sấy sản phẩm ở 60 độ C cho đến khi khối lượng không đổi.
Sơ đồ 2 8 Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và triethyl orthoformat
Phương pháp 2: Tạp D allopurinol phản ứng với acid formic
Hòa tan 1,8 g tạp D allopurinol (0,01 mol) trong lượng vừa đủ methanol Cho vào dung dịch 10 ml acid formic (0,265 mol) Đun hồi lưu trong bình cầu 2 cổ trong
3 giờ Lọc tủa, sấy tủa ở 60 o C đến khối lượng không đổi.
Sơ đồ 2 9 Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và acid formic
2.7.1.6 Tổng hợp tạp F của allopurinol
Phương pháp 1: hòa tan 0,2 g tạp D allopurinol (1,1 mmol) trong 2 ml triethyl orthoformat (1,75 mmol) và 0,2 ml ethyl 2-cyanoacetat (1,8 mmol) Đun hồi lưu hỗn hợp (khoảng 95 o C) trong 4 giờ, theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sau khi kết thúc phản ứng, pha loãng dung dịch thu được với 5 ml ethanol 96 o , lắc đều Thêm tiếp 5 ml nước Bốc hơi dung dịch trên bếp cách thủy (khoảng 60 o C) đến khi tinh thể bắt đầu xuất hiện Lọc thu tinh thể Rửa tinh thể thu được với 15 ml nước (3 x 5 ml) Sấy sản phẩm ở 60 o C đến khối lượng không đổi.
Sơ đồ 2 10 Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và triethylorthoformat
Phương pháp 2: cho 3,5 g nguyên liệu ethyl (ethoxymethylen)cyanoacetat vào
20 ml cồn tuyệt đối, hỗn hợp được khuấy từ gia nhiệt kết hợp gắn với sinh hàn Đợi đến khi nguyên liệu tan hoàn toàn thì cho hydrazin hydrat 50% vào Sau khoảng 10 phút thì thấy xuất hiện tủa trắng, lọc và rửa tủa với 10 ml nước cất Sấy sản phẩm ở
60 °C đến khối lượng không đổi và đem cân.
Sơ đồ 2 11 Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và hydrazin hydrat 50%
2.7.2 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp
Thử sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng: khảo sát và lựa chọn ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm Sản phẩm là tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng khi sắc ký đồ của ba hệ dung môi khác nhau cho một vết gọn duy nhất.
Sản phẩm sau khi đạt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng sẽ được thực hiện:
- Đo phổ UV-Vis để xác định cực đại hấp thu đặc trưng.
- Đo phổ IR để xác định sự có mặt của các đỉnh đặc trưng cho các nhóm chức trong phân tử (so sánh với phổ IR của tạp chuẩn).
Để xác định chính xác số khối của phân tử, phổ khối phân giải cao (HRMS) được sử dụng, cung cấp thông tin về khối lượng của các ion Giá trị khối lượng đo được từ HRMS sau đó được so sánh với giá trị khối lượng lý thuyết Độ lệch về khối lượng phải nhỏ hơn 5 phần triệu (ppm) để đảm bảo độ chính xác cao trong xác định số khối.
- Đo phổ 1 H NMR và 13 C NMR (so sánh với phổ NMR của tạp chuẩn hoặc phổ NMR của tài liệu tham khảo đã công bố) để xác định đúng cấu trúc phân tử của sản phẩm tổng hợp Trong trường hợp cần thiết có thể đo các phổ 2 chiều như DEPT; NOSEY…
2.7.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hướng đến nâng cao hiệu suất phản ứng
Khảo sát điều kiện tổng hợp
- Khảo sát tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng
- Khảo sát nhiệt độ phản ứng
- Khảo sát thời gian phản ứng
- Khảo sát quá trình tinh chế, loại tạp: có thế áp dụng các phương pháp tinh chế sau:
Quy trình 1: sử dụng ethanol 96 o – nước nóng Cho 1 g sản phẩm tổng hợp được vào cốc có mỏ 100 ml Đun hỗn hợp ethanol 96 o – nước (1:1) đến sôi Thêm từ từ hỗn hợp này vào cốc có mỏ đến khi sản phẩm tan hoàn toàn Để qua đêm, thu được tinh thể, tiến hành lọc thu lấy tinh thể, sấy ở 60 ℃ thu được sản phẩm tinh chế.
Quy trình 2: sử dụng ethanol 96 o nóng Cho 1 g sản phẩm tổng hợp vào cốc có mỏ 100 ml, thêm từ từ cồn đun sôi vào cốc có mỏ đến khi sản phẩm tan hoàn toàn Để ethanol bay hơi ở nhiệt độ phòng (khoảng 2 - 3 ngày), thu được tinh thể,tiến hành lọc thu lấy tinh thể, sấy ở 60 o C thu được sản phẩm tinh chế.
Phương pháp phân tích dữ liệu
Phần xử lý phân tích kết quả quy trình định lượng bằng HPLC-DAD sử dụng phần mềm Labsolution của Shimadzu và EZChrom Elite của Hitachi.
Phần xử lý kết quả định lượng tạp chất tổng hợp bằng phần mềm excel của microsoft office 2021.
Phần xử lý kết quả đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm bằng phần mềm SPSS 26.0.
Phần xử lý kết quả quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phần mềm Masslynx cho hệ thống UPLC-MS/MS của Water.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tổng hợp và tinh chế tạp chất liên quan của allopurinol
3.1.1 Tổng hợp và tinh chế tạp A allopurinol
3.1.1.1 Xác định sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp bằng sắc ký lớp mỏng
Phân hủy allopurinol bằng các tác nhân kiềm hóa khác nhau NaOH, NaHCO3, NH3 đều cho sản phẩm tính chất giống nhau.
Hệ dung môi (1) cho vết duy nhất có Rf = 0,71, hệ dung môi (2) cho vết duy nhất có Rf = 0,48 và hệ dung môi (3) cho vết duy nhất có Rf = 0,22.
3.1.1.2 Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp
Phổ UV-VIS (dung dịch NaOH 0,1 M): có 2 cực đại hấp thu 222,5 nm và 250 nm Phổ IR (KBr, cm -1 ): 3444,3 và 3399,9 (𝑣 𝑁−𝐻 ; 𝑎𝑚𝑖𝑛); 1665,6 (𝑣 𝐶=𝑂 ;
Phổ HRMS-ESI (+): m/z 127,06123 [M + H] + (tương ứng dạng base tạp A allopurinol) Phổ phân mảnh MS 1 của hệ thống máy khối phổ MS/MS cho tín hiệu [M + H] + 127,1 và [M + Na] + 149,1 (PL 1.1).
- Phổ 1H NMR, (DMSO-d 6; 500 MHz, ppm); 8,04 (s, 1H).
- Phổ 13C NMR, (DMSO-d 6; 125 MHz, ppm); 99,9 (C3); 150,3(C4); 133,9 (C5); 165,2 (C6) (PL 1.1).
Phản ứng hóa học gốc muối sulfat: có kết tủa trắng khi phản ứng BaCl2/H2SO4
Kết luận: các dữ liệu phổ UV-Vis, IR, HRMS, NMR, phản ứng hóa học của sản phẩm tổng hợp tương đồng và phù hợp với cấu trúc của tạp A allopurinol hemisulfat.
3.1.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp Ảnh hưởng tác nhân kiềm hóa: NH 3, NaHCO 3 và NaOH
Cố định nguyên liệu allopurinol 2,0 g (14,7 mmol), thay đổi tác nhân kiềm hóa là NH 3 , NaHCO3 và NaOH
Nhận xét: trong 3 tác nhân kiềm hóa NaOH; NaHCO3; NH3 cùng tỷ lệ mol tham gia tổng hợp tạp A allopurinol bằng phân hủy nguyên liệu allopurinol, NaOH tạo ra sản phẩm với hiệu suất cao vượt trội (PL 1.1) Lựa chọn NaOH là tác nhân kiềm hóa để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng, pH phản ứng và kết tinh. Ảnh hưởng tỷ lệ mol allopurinol và NaOH
Cố định khối lượng allopurinol 2,0 g (14,7 mmol), khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol allopurinol/NaOH đến hiệu suất phản ứng.
Hiệu suất phản ứng thay đổi đáng kể khi thay đổi tỷ lệ mol Trong đó tỷ lệ mol allopurinol : NaOH là 1 : 4,4 tương ứng với 50 ml NaOH 1M cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A cao nhất là 48,42% (PL 1.1). Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Cố định tỷ lệ mol allopurinol/NaOH là 1:4,4, khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ.
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất phản ứng Trong các giá trị khảo sát, nhiệt độ 180 o C cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A cao nhất là 49,68% (PL 1.1) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thời gian phản ứng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất Trong các khảo sát, thời gian phản ứng 5 giờ cho hiệu suất tổng hợp tạp A cao nhất là 50,33% (PL 1.1). Ảnh hưởng của pH loại tủa allopurinol chưa phản ứng pH 4 4,5 5 5,5 6
Giá trị pH dùng để kết tủa allopurinol còn lại sau phản ứng không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất phản ứng Trong các pH khảo sát, chọn giá trị pH = 5 loại tủa vì có hiệu suất tổng hợp sản phẩm cao nhất là 51,67% (PL 1.1). Ảnh hưởng của pH kết tinh tạp A allopurinol hemisulfat pH 1,40 1,45 1,50 1,55 1,60
Giá trị pH kết tinh tạp A allopurinol hemisulfat ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Trong đó giá trị pH = 1,5 cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A dạng muối hemisufat là cao nhất là 57,07% (PL 1.1).
3.1.1.4 Tinh chế sản phẩm tổng hợp
Khảo sát kết quả tinh chế trên khối lượng sản phẩm thô khoảng 1,3 g với 3 quy trình khác nhau được trình bày ở mục 2.7.3.
Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Trong 3 quy trình tinh chế, quy trình 3 sử dụng dung môi cồn ethanol 96 o – nước (4:1) đã làm lạnh cho hiệu suất tinh chế cao nhất khoảng 83% Tiến hành thí nghiệm như trên lặp lại 6 lần (n = 6), khối lượng sản phẩm tạp A allopurinol hemisuflat thu được trước và sau tinh chế.
Trước tinh chế (g) 1,3007 1,3126 1,3021 1,3162 1,3053 1,3001 Sau tinh chế (g) 1,0937 1,1366 1,1141 1,0857 1,0832 1,1117 Kết luận: Hiệu suất toàn bộ quy trình: 48,8%.
Quy trình tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat
Hòa tan 2,0 g allopurinol (14,7 mmol) vào 50 ml dung dịch NaOH 1 M (50 mmol) Đun hồi lưu dung dịch ở nhiệt độ 180 o C trong 5 giờ Để nguội, sau đó điều chỉnh pH của dung dịch đến giá trị pH = 5 bằng dung dịch H2SO4 10%, lọc lấy dịch. Tiếp tục điều chỉnh pH dịch lọc thu được đến giá trị pH = 1,5 bằng dung dịch
H2SO4 10% Để dung dịch qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc cẩn thận để thu lấy tủa. Rửa tủa bằng nước cất lạnh (3 ml/lần x 3 lần) Sấy ở 60 o C để thu lấy sản phẩm. Cho sản phẩm tổng hợp vào cốc có mỏ 100 ml, thêm khoảng 80 ml hỗn hợp cồn tuyệt đối – nước (4:1) đã làm lạnh, khuấy đều hỗn hợp khoảng 3 phút, sau đó lọc qua giấy lọc thu lấy sản phẩm Sấy sản phẩm ở 60 o C trong 4 giờ.
Sơ đồ 3 1 Quy trình tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat
3.1.2 Tổng hợp và tinh chế tạp B allopurinol
3.1.2.1 Xác định sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp bằng sắc ký lớp mỏng
Hòa tan sản phẩm tổng hợp trong methanol nồng độ 1 mg/ml triển khải trên
3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau (1): cloroform – acid acetic – methanol (9:1:1); (2): cloroform – ethyl acetat – methanol (5:2:3); (3): ethyl acetat – methanol (4:7) Chấm mẫu trên bản mỏng silicagel F254, khai triển đến khi dung môi di chuyển được 10 cm, lấy bản mỏng và để khô trong tủ hút, quan sát bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy sản phẩm tổng hợp cho 1 vết duy nhất trên SKLM với R f tương ứng với 3 hệ dung môi là 0,20; 0,51 và 0,79 chứng tỏ sản phẩm tổng hợp tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng (PL 1.2).
3.1.2.2 Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp
Phổ UV - Vis của dung dịch NaOH 0,1 M có một cực đại hấp thụ tại 245,8 nm Phổ IR của sản phẩm cho các mũi hấp thụ đặc trưng tại 3397,6 và 3204,7 cm-1 (vN-H), 1704,6 cm-1 (vC=O), 1595,2 cm-1 (vC=N) Các giá trị này phù hợp với cấu trúc của tạp chất B.
Phổ HRMS-ESI (+): m/z 177,0389 [M+Na] + phù hợp với khối lượng phân tử của tạp B allopurinol (PL 1.2).
- Phổ 1H NMR, (DMSO-d6; 400MHz, ppm); 13,05 (s, 1H); 12,76 (s,1H); 8,89 (d, 1H,J = 11.3, H); 8,20 (s, 1H) (PL 1.2).
- Phổ 13C NMR, (DMSO-d6; 100MHz, ppm); 165,2 (C6); 160,7 (C7); 147,4 (C5); 130,1 (C3); 102,6 (C4) (PL 1.2).
Kết luận: các dữ liệu phổ UV-Vis; IR, HRMS, NMR của sản phẩm tổng hợp tương đồng và phù hợp với cấu trúc của tạp B allopurinol.
3.1.2.3 Khảo sát các yếu tố quả ảnh hưởng hiệu suất tổng hợp Ảnh hưởng tỷ lệ mol xúc tác acid formic và formamid
Trong các khảo sát tỷ lệ mol xúc tác acid formic/formamid 1:100 cho hiệu suất tổng hợp cao nhất là 55,6% Lựa chọn tỷ lệ mol acid formic/formamid 1:100 khảo sát tiếp các yếu tố ảnh hưởng hiệu suất tổng hợp (PL 1.2). Ảnh hưởng của tỷ lệ mol tạp A allopurinol hemisulfat và formamid
Cố định nguyên liệu tạp A allopurinol hemisulfat 2,5 g (14,27 mmol), tăng dần lượng formamid theo tỷ lệ mol khảo sát.
Các kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ mol tạp A allopurinol hemisulfat và formamid là 1:35, tương ứng với 20 ml formamid (0,503 mol) cho hiệu suất phản ứng cao nhất là 65,07% (PL 1.2), đồng thời nhiệt độ phản ứng cũng có tác động đáng kể đến hiệu suất phản ứng.
Cố định nguyên liệu tạp A 2,5 g allopurinol hemisulfat (14,27 mmol) và 20 ml formamid (0,503 mol), thay đổi nhiệt độ phản ứng.
D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS
4.1.1 Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế tạp A allopurinol
Các công trình nghiên cứu của Roland K Robins (1956); Ronal M Cresswell (1972); Haruo Tanaka (1973) đều tổng hợp dạng base tạp A của allopurinol là 3- aminopyrazol-4-carboxamid; chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A allopurinol dạng muối hemisulfat theo chuẩn USP-NF 2023 Các công trình nghiên đều chưa công bố về độ tinh khiết cũng như quá trình rửa tạp hoặc tinh chế 11,57,60
Bàn về lựa chọn tác nhân tham gia phản ứng
Phản ứng phân hủy allopurinol được ưu tiên sử dụng chất kiềm hóa vì quá trình chỉ diễn ra trong một giai đoạn duy nhất, dẫn đến sản phẩm dễ tinh chế Điều này trái ngược với các phương pháp phân hủy khác cần nhiều giai đoạn và có nguy cơ nhiễm chéo cao Sau ba giờ phản ứng phân hủy, sản phẩm mới tạo thành được kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi cloroform – ethyl acetat – methanol.
– acid formic (50:40:40:1), quan sát vết sản phẩm bằng đèn UV 254 nm, kết quả cho thấy dung dịch sau phản ứng của allopurinol với NH3, NaHCO3 và NaOH đều hiển thị 2 vết trên sắc ký lớp mỏng, trong đó vết đậm có Rf = 0,48 trùng với Rf của vết allopurinol chuẩn và vết nhạt hình thành có Rf = 0,35 trùng với Rf của tạp A allopurinol chuẩn Sản phẩm mới tạo thành phân cực hơn nguyên liệu allopurinol trên sắc ký lớp mỏng, phù hợp với tính chất của tạp A allopurinol.
Thí nghiệm thủy phân allopurinol bằng các tác nhân kiềm khác nhau cùng nồng độ đương lượng OH- cho thấy hiệu suất sản phẩm tạo thành phụ thuộc vào loại tác nhân kiềm Trong số các tác nhân được sử dụng, NaOH mang lại hiệu suất cao nhất ban đầu, đạt khoảng 16,03% Tiếp theo là NaHCO3 với hiệu suất 5,50%, thấp hơn đáng kể so với NaOH.
NH3 cho hiệu suất tạo thành 4,15% (PL 1.1) Nguyên nhân do phản ứng thủy phân, NaOH là kiềm mạnh, quá trình phân ly trong nước xảy ra hoàn toàn, nồng độ OH - cao tấn công vào vị trí C(1) trên vòng pyrimidin của allopurinol để mở vòng tạo tạp
Theo cơ chế phản ứng được minh họa ở hình 4.1, NaHCO3 và NH3 đóng vai trò là các tác nhân kiềm yếu Trong nước, chúng phân ly tạo ra ion OH- yếu hơn so với NaOH.
BÀN LUẬN
Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế 6 tạp của allopurinol
4.1.1 Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế tạp A allopurinol
Các công trình nghiên cứu của Roland K Robins (1956); Ronal M Cresswell (1972); Haruo Tanaka (1973) đều tổng hợp dạng base tạp A của allopurinol là 3- aminopyrazol-4-carboxamid; chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A allopurinol dạng muối hemisulfat theo chuẩn USP-NF 2023 Các công trình nghiên đều chưa công bố về độ tinh khiết cũng như quá trình rửa tạp hoặc tinh chế 11,57,60
Bàn về lựa chọn tác nhân tham gia phản ứng
Tác nhân kiềm hóa được ưu tiên lựa chọn trong phản ứng phân hủy allopurinol vì phản ứng chỉ qua 1 giai đoạn và sản phẩm tạo thành dễ tinh chế so với các công trình nghiên cứu khác phải qua nhiều giai đoạn và nguy cơ nhiễm chéo cao 57-59 Thực hiện phản ứng phân hủy sau 3 giờ, tiến hành kiểm tra sơ bộ sự có mặt của sản phẩm mới tạo thành bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi cloroform – ethyl acetat – methanol
– acid formic (50:40:40:1), quan sát vết sản phẩm bằng đèn UV 254 nm, kết quả cho thấy dung dịch sau phản ứng của allopurinol với NH3, NaHCO3 và NaOH đều hiển thị 2 vết trên sắc ký lớp mỏng, trong đó vết đậm có Rf = 0,48 trùng với Rf của vết allopurinol chuẩn và vết nhạt hình thành có Rf = 0,35 trùng với Rf của tạp A allopurinol chuẩn Sản phẩm mới tạo thành phân cực hơn nguyên liệu allopurinol trên sắc ký lớp mỏng, phù hợp với tính chất của tạp A allopurinol.
Quá trình thủy phân allopurinol bằng các tác nhân kiềm OH- với nồng độ tương đương nhau cho thấy hiệu suất phản ứng chịu ảnh hưởng bởi loại tác nhân kiềm Sodium hydroxide (NaOH) mang lại hiệu suất cao nhất ban đầu (khoảng 16,03%), tiếp theo là sodium bicarbonate (NaHCO3) với hiệu suất đạt 5,50%.
NH3 cho hiệu suất tạo thành 4,15% (PL 1.1) Nguyên nhân do phản ứng thủy phân, NaOH là kiềm mạnh, quá trình phân ly trong nước xảy ra hoàn toàn, nồng độ OH - cao tấn công vào vị trí C(1) trên vòng pyrimidin của allopurinol để mở vòng tạo tạp
Quá trình thủy phân mở vòng allopurinol phụ thuộc vào nồng độ ion OH- NaOH là tác nhân kiềm mạnh, phân ly hoàn toàn trong nước tạo ra nồng độ ion OH- cao Trong khi đó, NaHCO3 và NH3 là tác nhân kiềm yếu, phân ly yếu trong nước nên nồng độ ion OH- thấp hơn đáng kể Sự chênh lệch này dẫn đến phản ứng thủy phân mở vòng diễn ra yếu hơn với NaHCO3 và NH3 so với NaOH, dẫn đến hiệu suất thấp hơn.
Hình 4 1 Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat
Bàn về xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp
So sánh phổ IR sản phẩm tổng hợp có các dãy hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức trong công thức cấu tạo và trùng với phổ chuẩn tạp A allopurinol hemisulfat, cho thấy sản phẩm tổng hợp sau tinh chế đúng là tạp A allopurinol hemisulfat theo USP-NF-2023.
Hình 4 2 Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn
Sơ đồ 4 1 Sự phân mảnh của tạp A allopurinol
Phổ MS 1 cho mảnh có số khối 127,1 phù hợp với khối lượng phân tử của tạp
A Các mảnh con thu được từ mảnh mẹ 127,1 là 42,9; 68,9; 81,9 và 110,0 phù hợp với các phân mảnh của tạp A (sơ đồ 4.1). Độ lệch giữa giá trị thực nghiệm và giá trị lý thuyết phổ HRMS: Độ lệch m/z = (m/z thực nghiệm – m/z H – m/z lý thuyết)/ m/z lý thuyết x 1000000
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Bảng 4 1 Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với phổ tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn
Sản phẩm tổng hợp (DMSO-d 6; 125/500 MHz)
Tạp A allopurinol hemisulat chuẩn (DMSO-d 6 ; 100/400 MHz)
Công thức cấu tạo tạp A allopurinol hemisulfat
- Phổ 13 C NMR của tạp A tổng hợp có 4 tín hiệu C có độ dời hóa học phù hợp với
4 nguyên tử C có trong cấu trúc tạp A.
- Phổ DEPT cho 3 tín hiệu C bậc 4, 1 tín hiệu C bậc 3 phù hợp với cấu trúc tạp A.
- Phổ 1 H NMR cho tín hiệu H trong –CH= (8,039 ppm) rõ Do tạp A tổng hợp được ở dạng muối nên tín hiệu của nước bị dịch chuyển đến khoảng 𝛿 = 7,5 ppm, lẫn với các tín hiệu của -NH và -NH 2 trong cấu trúc tạp A.
Phản ứng định tính nhóm hemisulfat
Nghiên cứu sử dụng H2SO4 10% trong quá trình kết tinh tạp A tại pH 1,5 tạo muối hemisulfat Cân chính xác khoảng 1 g tạp A hòa tan trong 100 ml nước (dung dịch tạp A) Lấy 5 ml dung dịch tạp A cho vào ống nghiệm, thêm vào 5 ml dung dịch BaCl2 0,1 N thì thấy có kết tủa trắng không tan trong dung dịch HCl (hình 4.3).
Phản ứng định lượng nhóm hemisulfat
Hút chính xác 20 ml dung dịch A cho vào bình nón 100 ml, thêm 2 – 3 giọt phenolphtalein Sau đó tiến hành chuẩn độ thể tích bằng dung dịch NaOH 0,1 M đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây Tiến hành chuẩn độ thể tích 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Ba2+ + SO4 2- → BaSO4 (kết tủa trắng)
V1 = 5,70 ml; V2 = 5,75 ml; V3 = 5,70 ml; VTB = 5,72 ml Nồng độ của dung dịch A:
Số mol của dung dịch A: 0,0572 x 0,1 = 0,00572 mol Khối lượng phân tử của tạp A: 1
0,00572= 174,8 ≈ 175 phù hợp với công thức tạp A dạng muối hemisulfat.
Hình 4 3 Kết tủa trắng BaSO4 trong phản ứng gốc muối hemisulfat của tạp A allopurinolNhư vậy tạp A tạo thành sau phản ứng có dạng muối hemisulfat C4H6N4O.1/2H2SO4.
Bàn về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat
Về ảnh hưởng của tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng: nồng độ NaOH 1
M; thể tích 50 ml (0,05 mol) cho hiệu suất cao nhất (tương đương tỷ lệ mol allopurinol: NaOH là 1: 4,4) khi lượng NaOH tăng hiệu suất tổng hợp giảm dần. Nguyên nhân là khi tỷ lệ NaOH ở các nồng độ cao cùng với phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao tạo nên độ nhớt lớn, thời gian kéo dài nên dung dịch sau phản ứng ở dạng gel, đồng thời tỷ lệ mol tăng làm gia tăng lượng tạp hình thành do lượng kiềm cao sẽ tiếp tục thủy phân nhóm amid (-CO-NH 2 ) tạo thành nhóm carboxyl (-COO-), sản phẩm tạo thành không kết tinh được hoặc sản phẩm tạo thành có màu vàng lẫn nhiều tạp hình 4.4.
Hình 4 4 Sản phẩm tạp A tạo thành khi dư NaOH
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A Khi nhiệt độ dưới 180°C, phản ứng sẽ diễn ra chậm do năng lượng cung cấp không đủ Ngược lại, nếu nhiệt độ vượt quá 180°C, tạp chất A hình thành trong dung dịch có thể bị phân hủy do phản ứng thủy phân nhóm amid (-CO-NH2-) thành acid (-COOH) Do đó, nhiệt độ 180°C được xác định là điều kiện tối ưu để tổng hợp thành công tạp A allopurinol (PL 1.1.).
Về ảnh hưởng của thời gian phản ứng: thời gian phản ứng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất Khi tăng thời gian phản ứng từ 3 giờ đến 5 giờ hiệu suất tăng khoảng
5 lần, hiệu suất bắt đầu giảm nhanh khi kéo dài phản ứng hơn 6 giờ Khi thời gian phản ứng kéo dài sản phẩm tạo thành bị phân hủy nên giảm hiệu suất tổng hợp. Thời gian 5 giờ là thời gian thích hợp để tổng hợp tạp A (PL 1.1).
Bàn luận về xây dựng và đánh giá tạp chất đối chiếu của allopurinol
4.2.1 Về xây dựng quy trình định lượng sản phẩm tổng hợp các tạp của allopurinol
Dược điển Việt Nam V; BP 2023 và USP-NF-2023 có các quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan A, B, C, D, E, F của allopurinol, tuy nhiên các quy trình chỉ dừng lại ở xác định phần trăm tạp chất so với nguyên liệu allopurinol 1,7,33 với diện tích pic các chất A, B, C, D, E, F thấp (không quá 0,2% so với allopurinol), dẫn đến quy trình chưa phù hợp để định lượng và xác định độ tinh khiết sản phẩm tổng hợp tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol Hiện chưa có công trình công bố về xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các tạp A, B, C, D, E, F bằng HPLC đầu dò dãi diod quang (DAD) theo hướng dẫn của ICH Q2(R1).
Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình định lượng các tạp tổng hợp allopurinol đều sử dụng pha động là các dung môi dễ bay hơi như acid formic hay acid phosphoric, acetonitril giúp quá trình vận hành và bảo quản hệ thống sắc ký lỏng không bị đóng muối so với DĐVN V; BP 2023; USP-NF 2023 và các tài liệu tham khảo đều sử dụng đệm phosphat tuy thuận lợi trong phân tích, tuy nhiên dễ làm tắt hệ thống, giảm tuổi thọ thiết bị và tăng thời gian rửa cột làm tăng chi phí. Pha tĩnh sử dụng cột Phenomenex Gemini NX có khả năng chịu được khoảng pH rộng (từ 1-12) trong các điều kiện pha động là acid pH thấp Riêng tạp C allopurinol sử dụng cột dài
Cột Phenomenex Synergi 4 µm MAX-RP 80R với pha đảo chịu được khoảng pH rộng cho khả năng phân ly tốt các chất có độ phân cực gần nhau Kích thước hạt nhỏ 4 µm kết hợp với chiều dài cột kéo dài 25 cm làm tăng số đĩa lý thuyết, giúp tăng hệ số phân giải và loại trừ tạp B gây nhiễu trong quá trình định lượng tạp C.
Về quy trình định lượng tạp A allopurinol
Kết quả khảo sát pha động cho thấy hệ acetonitril – dung dịch acid phosphoric có hiệu suất tốt nhất Độ rộng pic tạp A nhỏ hơn và chiều cao pic tăng lên nhờ khả năng chuyển về dạng phân tử hoàn toàn của chất phân tích Hệ số bất đối đạt yêu cầu theo Dược điển Việt Nam V và USP-NF 2023 (≤ 1,2), đảm bảo đặc hiệu của quy trình Ngoài ra, khảo sát pH dung dịch acid phosphoric từ 1,5 đến 3,0 trong vùng đệm acid phosphoric 128 giúp lựa chọn được pH tối ưu cho thông số sắc ký của tạp chất allopurinol.
≤ 2 cho thấy sự chuyển dạng chưa hoàn toàn và pic dung môi không tách khỏi pic tạp A Ở giá trị pH 2,5 (tương ứng nồng độ H3PO4 là 0,01 M) pic tạp A tách rời pic dung môi đồng thời hệ số bất đối As là 1,1 đạt yêu cầu Tốc độ dòng ảnh hưởng đến độ phân giải giữa pic tạp A và pic dung môi cũng như hệ số bất đối của pic tạp A. Tốc độ dòng 1 ml/phút pic tạp A được rửa giải nhanh trong khi thời gian lưu pic dung môi ít thay đổi dẫn đến pic tạp A bị trùng với pic dung môi Tốc độ dòng < 0,5 ml/phút làm cho thời gian phân tích kéo dài đồng thời làm tăng hệ số bất đối (As > 1,2) Tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho pic tạp A đạt hệ số bất đối và độ phân giải Nhiệt độ cột được khảo sát để tăng độ nhạy và hệ số bất đối của chất phân tích, tuy nhiên kết quả cho thấy, nhiệt độ cột ít ảnh hưởng Lựa chọn nhiệt độ 25 o C là nhiệt độ phòng thuận lợi cho quá trình phân tích.
Về quy trình xác định độ tinh khiết tạp B allopurinol
Hệ pha động acetonitril - acid phosphoric có độ phân cực trung bình và khả năng tạo thành hệ đệm ở pH thấp, giúp cân bằng các đỉnh sắc ký pH pha động 2,0 tương tự như quy trình định lượng tạp chất A để tăng khả năng phân tích Tốc độ dòng không ảnh hưởng nhiều đến độ phân giải đỉnh tạp chất B nhưng ảnh hưởng đến hình dạng đỉnh và thời gian phân tích Tốc độ dòng 1,0 ml/phút đáp ứng các thông số sắc ký cho đỉnh tạp chất B.
Về quy trình định lượng tạp C allopurinol
Quy trình định lượng tạp C allopurinol cần đạt độ đặc hiệu với pic tạp C tách hoàn toàn khỏi pic tạp A và B allopurinol, khắc phục được giới hạn hệ số phân giải trong Dược điển Việt Nam V, BP 2023 và USP-NF 2023 Tạp C được tổng hợp từ nguyên liệu là tạp A allopurinol hemisulfat Tuy nhiên với pha tĩnh là cột Gemini
NX kớch thước hạt 5 àm chiều dài 15 cm thỡ pic tạp B và C chưa tỏch ra hoàn toàn. Lựa chọn cột C12 Phenomenex Synergi 4 àm MAX-RP 80R pha đảo chịu được khoảng pH rộng đồng thời kớch thước hạt nhỏ hơn 4 àm và chiều dài cột tăng lờn 25 cm làm tăng số đĩa lý thuyết giúp tăng hệ số phân giải giữa các chất phân tích.Chọn bước sóng phân tích 200 nm vì cho tín hiệu tạp C là cao nhất làm tăng độ nhạy Khảo sát thành phần pha động ban đầu với hệ (1) acetonitril – methanol; (2) acetonitril – acid formic và (3) acetonitril – acid phosphoric với độ phân cực tăng dần làm cho các pic tạp A, B, C tách dần ra Độ phân cực pha động càng thấp, các chất phân tích sẽ bị rửa giải nhanh dẫn đến không tách ra được Hệ acetonitril – acid phosphoric tách được các pic nên tiếp tục được khảo sát tỷ lệ pha động và pH để các pic phân tích đạt các yêu cầu thông số sắc ký Tốc độ dòng 1,2 ml/phút pic tạp B và C chưa tách khỏi nhau do các pic rửa giải quá nhanh Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, các pic tạp A, B và C tách ra hoàn toàn và có As < 1,2 đạt yêu cầu theo quy định.
Về quy trình định lượng tạp D allopurinol
Thành phần pha động được khảo sát trong đó hệ acetonitril – methanol làm cho hình dạng pic bị kéo đuôi vì các chất phân tích không được chuyển dạng hoàn toàn trong quá trình rửa giải 128 Hệ acetonitril – dung dịch acid phosphoric cho hệ số kéo đuôi 1,3 nhỏ hơn 1,5 phù hợp do các phân tử tạp D allopurinol đã chuyển thành dạng ion có độ phân cực cao hơn nhiều so với nguyên liệu tổng hợp Khi tăng lượng acetonitril thì tạp D được rửa giải nhanh, thời gian lưu rút ngắn trong khi thời gian lưu pic dung môi thay đổi ít hơn dẫn đến pic tạp D có thể chồng lên pic dung môi. Khi giảm tỷ lệ acetonitril pic tạp D tách khỏi pic dung môi nhưng nguyên liệu sẽ bị lưu giữ lâu trên cột, làm tăng thời gian phân tích Tỷ lệ acetonitril – acid phosphoric là 30:70 phù hợp cho quá trình phân tích Khảo sát pH pha động từ 1,5 đến 3 cho thấy pH ảnh hưởng đến hệ số bất đối của pic và ổn định của đường nền; pH ≤ 1,5 đường nền dao động và có khả năng ảnh hưởng đến pha tĩnh làm tan chảy nhóm silinol của pha tĩnh pH > 3, sự chuyển dạng chưa hoàn toàn nên dẫn đến hệ số bất đối không lớn hơn 1,5 Kết quả cho thấy pH pha động thích hợp là 2,5 Nhiệt độ cột được chọn 40 °C vì hình dạng pic gọn và cao hơn ở nhiệt độ 25 °C Ở nhiệt độ 50 °C cho hình dạng pic tương tự ở nhiệt độ 40 °C Nhiệt độ cao giúp pha động di chuyển dễ dàng qua pha tĩnh làm tăng số đĩa lý thuyết, giúp tăng hệ số phân giải, pic cao và chiều rộng pic hẹp 128 Tuy nhiên nhiệt độ pha tĩnh cao trên 60 o C có thể làm bay hơi dung môi sôi lên trong hệ thống áp suất cao, tạo bọt khí và làm giảm tính ổn định của quy trình phân tích.
Về quy trình định lượng tạp E allopurinol
Tạp E được tổng hợp từ tạp D và acid formic, tạp E có độ phân cực cao hơn tạp D do hình thành liên kết amid (-NH-C=O-) khi tăng tỷ lệ acetonitril trên 10% có thể rút ngắn thời gian lưu của tạp E do được rửa giải nhanh hơn, tuy nhiên pic tạp E không tách hoàn toàn khỏi pic tạp D Khi giảm lượng acetonitril pic tạp E tách khỏi pic tạp D nhưng đồng thời làm tăng thời gian lưu tạp Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ phù hợp của acetonitril và acid phosphoric là 10:90 pic tạp E tách hoàn toàn Quy trình xác định độ tinh khiết tạp E sử dụng pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH = 3 với chương trình đẳng dòng đã rửa giải tốt tạp E đồng thời đảm bảo tuổi thọ cột được kéo dài hơn, thời gian phân tích ngắn, các thông số sắc ký đạt theo quy định Khi tiến hành sắc ký dung dịch tạp E với thời gian gấp 3 lần thời gian lưu của tạp E đều không thấy xuất hiện pic lạ và khi xem sắc ký đồ trong không gian 3 chiều với bước sóng từ 200 – 800 nm đều cho thấy chỉ có 1 pic là tạp
E Khi sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic tạp E bằng cách so sánh phổ UV-Vis tại thời gian lưu với phổ UV-Vis tại một điểm bất kỳ trên pic, đều cho thấy có sự tương hợp về phổ trên 99% Chứng tỏ pic tạp E không bị ảnh hưởng bởi các pic tạp ở cùng thời gian lưu, quy trình định lượng tạp E đạt yêu cầu theo hướng dẫn ICH Về quy trình định lượng tạp F allopurinol
Tạp F có quy trình tổng hợp từ nguyên liệu là ethyl (ethoxymethyl)cyanocacetat và hydrazin hydrat 50% có thành phần tông hợp giống tạp D allopurinol nhưng khác với tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng Tạp F có độ phân cực kém hơn tạp D và nguyên liệu ethyl (ethoxymethyl)cyanocacetat dẫn đến dễ lưu lại trên pha tĩnh, làm tăng thời gian rửa giải Kết quả khảo sát cho thấy pha động với lượng acetonitril dưới 30%, tạp F sẽ bị lưu giữ trên cột lâu hơn Khi tăng tỷ lệ acetonitril trên 40%, các chất bị rửa giải nhanh dẫn đến pic tạp F không tách rời khỏi pic nguyên liệu Tỷ lệ acetonitril – acid formic (35:65) là phù hợp vì đảm bảo được các thông số sắc ký và thời gian lưu không qua kéo dài So sánh với các quy trình DĐVN V; BP 2023; USP-NF 2023 và công trình nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy kết quả thời gian phân tích quy trình định lượng tạp F đã được rút ngắn trên 50% (khoảng 15 phút so với 25 phút trong Dược điển), giúp tiết kiệm dung môi làm tăng hiệu quả kinh tế.
4.2.2 Về đánh giá và thiết lập chất đối chiếu của allopurinol
Về quy trình thiết lập tạp chất chuẩn đối chiếu các tạp của allopurinol
Quy trình thiết lập chuẩn tạp A, B, C, D, E, F theo theo USP-NF 2023 được thực hiện theo đúng thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh cũng như quy trình thiết lập một chất chuẩn DĐVN V Các nguyên liệu thiết lập chuẩn được kiểm tra chất lượng và đều đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn Toàn bộ quá trình sản xuất chuẩn đã được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt, đóng chuẩn trong điều kiện khí nitơ (99,99%), độ ẩm ≤ 2%, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 2 -
8 °C để đảm bảo chất chuẩn ổn định trong một thời gian dài Sau khi đóng ống xong tiến hành kiểm tra sự đồng nhất của các lô sản xuất với chỉ tiêu hàm lượng, kết quả các giá trị RSD của các kết quả hàm lượng đều nhỏ hơn 2,0% do đó hàm lượng đồng nhất và quá trình đóng chuẩn ổn định Đánh giá liên phòng thí nghiệm được tiến hành độc lập tại 3 phòng kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO-IEC 17025 hoặc GLP của Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh là Khoa thiết lập chất chuẩn, chất đối chiếu; Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Khoa Nghiên cứu và phát triển Phân tích kết quả xử lý số liệu bằng SPSS tuân thủ đúng theo qui định về xử lý thống kê.
Do so sánh kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm nên lựa chọn phân tíchAnova một yếu tố phù hợp hơn so với sử dụng thống kê T-test vì T-test áp dụng phù hợp hơn trong trường hợp so sánh 2 PTN Để có thể áp dụng được phân tíchANOVA một yếu tố cần kiểm định Levene test bằng phần mềm SPSS 26.0 đánh giá phương sai của 3 phòng thí nghiệm, trường hợp đồng nhất thì mới áp dụng kiểm định F test dựa vào giá trị Ftn < Flt Trường hợp phương sai 3 phòng thí không đồng nhất thì sử dụng Robust test để so sánh giá trị trung bình Kiểm định Levene test chưa được hỗ trợ trong phần mềm excel, sử dụng SPSS 26.0 phù hợp để phân tích.
Bảng 4 7 Bảng so sánh Lenene - Test Mẫu phân tích Giá trị Lenene Test Sig Đánh giá Giá trị so sánh
Bàn luận về xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời
Phương pháp LC-MS/MS được đánh giá cao nhờ độ nhạy và đặc hiệu vượt trội Với khả năng định lượng tạp chất ở mức độ nanogam (ppb), phương pháp này vượt trội hơn nhiều so với LC-UV-Vis, vốn chỉ đạt độ nhạy ở mức microgam (ppm).
Quy định giới hạn nồng độ các tạp giữa USP-NF 2023 so với Dược điển Việt Nam V và BP 2023 có khác nhau Nghiên cứu lựa chọn nồng độ thấp nhất trong các quy định để xây dựng phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu các Dược điển, trong đó nồng độ tạp A, F là 0,2%, nồng độ tạp tạp B, C, D, E thấp nhất là 0,1% so với quy định giới hạn trong nguyên liệu và thành phẩm allopurinol.
4.3.1 Bàn về điều kiện khối phổ
Các thông số điện thế mao quản, thế cone, nhiệt độ dòng khí hóa hơi, dung môi pha động, tốc độ dòng khí hóa hơi, năng lượng va đập đóng vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật khối phổ ba tứ cực giúp tối ưu tín hiệu các chất phân tích (ion phân tử ban đầu và các ion phân mảnh đặc trưng), bên cạnh kiểu ion hóa (dương:positive hay âm: negative) Sử dụng chế độ Auto-tune của hệ thống LC-MS/MS giúp thuận lợi tìm điều kiện khối phổ tối ưu và các mảnh con của từng tạp Mảnh có tín hiệu lớn, ổn định, dùng để định lượng còn mảnh tín hiệu nhỏ hơn được sử dụng cho mục đích định tính Cấu trúc của allopurinol và các tạp hầu hết là các dị vòng chứa nitơ, có độ phân cực đến phân cực trung bình, cùng với các thông tin của các nghiên cứu đã công bố, kỹ thuật ion hóa điện ESI với chế độ bắn phá ion dương (positive) và kỹ thuật ghi phổ (MRM) được chọn dùng cho định lượng.
Hình 4 11 Phân mảnh ion định lượng của 6 tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol
Về các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu khối phổ
Dung môi pha mẫu: dung môi pha mẫu được lựa chọn là pha động vừa có khả năng hòa tan tốt chất phân tích, vừa làm tăng tín hiệu của mẫu trên đầu dò khối phổ vì làm tăng khả năng bay hơi pha động Dung môi pha động được chọn là acetonitril và acid formic vì cho khả năng ion hóa tốt và phù hợp với chương trình gradient do acid formic cung cấp nhiều proton giúp tăng quá trình ion hóa.
Thể tích phun: thể tích phun cũng ảnh hưởng lớn đến tín hiệu các pic Việc tăng thể tích phun làm tăng tín hiệu dễ dàng được nhận biết trên thực nghiệm, tuy nhiên khi thể tích phun quá cao, việc bay hơi dung môi để ion hóa không đáp ứng kịp thời sẽ làm giảm tín hiệu của các chất phân tích Kết quả nghiên cứu cho thấy thể tớch phun là 5 àl/phỳt Điều này vừa đỏp ứng việc thu nhận được tớn hiệu cao, vừa hạn chế làm bẩn hệ thống.
Thế mao quản (capilary voltage): thế mao quản ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình ion hóa các chất phân tích Sử dụng thế mao quản quá cao thì nhiệt độ cao từ thế mao quản làm tăng quá trình oxy hoá khử thành phần trong mẫu dẫn đến mao quản dễ bị ăn mòn và lão hoá Sử dụng thế mao quản quá thấp thì không ion hóa hết các chất phân tích dẫn đến tín hiệu thấp Vì vậy, kết quả thế mao quản trong nghiên cứu là 4 kV cho kết quả tối ưu về tín hiệu đồng thời kéo dài tuổi thọ thiết bị.
Nhiệt độ hóa hơi và tốc độ dòng khí hóa hơi: được khảo sát cùng lúc để tránh việc đọng lại dung môi do không hóa hơi kịp thời Luồng khí nitơ được đặt đồng trục với mao quản giúp hình thành những giọt nhỏ ở đầu mao quản và giúp những giọt này co lại dần trong giao diện ESI Do đó nhiệt độ hóa hơi và tốc độ dòng khí hóa hơi ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả ion hóa Về cơ bản, đối với một tốc độ rửa giải nhất định, tốc độ dòng khí phun phải được tối ưu hóa Việc lựa chọn giá trị của tốc độ dòng khí và nhiệt độ hóa hơi phải phù hợp dựa trên các thông số khác.
Thế cone là điện thế được sử dụng để hướng các ion phân tích vào tứ cực, đồng thời tách các ion khỏi vùng áp suất khí quyển của nguồn ion để đưa vào vùng chân không sâu Thế cone đóng vai trò quan trọng trong việc tối ưu tín hiệu ion, vì nó ảnh hưởng đến vận tốc ion và va chạm với các khí khác Tăng thế cone sẽ làm tăng vận tốc ion, dẫn đến va chạm với các khí khác và gây ra phân mảnh Việc xác định thế cone phù hợp rất quan trọng để tăng cường tín hiệu chất phân tích.
Năng lượng va chạm (collision energy): năng lượng buồng khí va chạm là thông số quan trọng trong phân tích MRM Kết quả nghiên cứu cho kết quả năng lượng buồng khí va chạm từ 12 – 25 V riêng biệt cho từng tạp, từng ion định tính,định lượng và thích hợp giúp tín hiệu ổn định Ion phân mảnh có m/z lớn cho tín hiệu ổn định hơn so với các ion có m/z nhỏ vì khi sử dụng năng lượng va chạm lớn,các ion mẹ dễ dàng vỡ ra thành các ion con Tuy nhiên khi năng lượng va chạm quá cao, các ion mẹ sẽ vỡ ra rất nhiều mảnh ion con có phân tử khối vô cùng nhỏ dẫn đến khó xác định cấu trúc của các phân mảnh ion con.
4.3.2 Bàn về điều kiện sắc ký
Quá trình phân tích bằng LC-MS/MS gồm hai giai đoạn: hệ thống LC tách các chất phân tích và xác định bằng đầu dò chọn lọc MS/MS Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo đã được sử dụng với pha tĩnh là cột Phenomenex Gemini NX C 18 (150 x 4,6 mm; 5 àm) cú khả năng chịu được pH rộng từ 1-12, cú thể khảo sát thành phần pha động có pH thấp Bên cạnh đó với kích thước hạt 5 àm được sử dụng vỡ khụng gõy hiện tưởng quỏ tải cột như so với cỏc pha tĩnh cú kích thước hạt nhỏ dẫn đến thuận lợi trong quá trình rửa giải và không làm tắt nghẽn cột cũng như tăng áp suất hệ thống phân tích, có thể ứg dụng cho các hệ thống khối phổ khác nhau Trong quá trình khảo sát pha động, hệ acetonitril hoặc hỗn hợp acetonitril – methanol – nước đều cho thấy các tạp allopurinol được rửa giải có hình dạng pic không đối xứng, đỉnh tù và pic kéo dài về phần đuôi, nguyên nhân có thể do quá trình phân bố trong pha tĩnh, các tạp chất allopurinol không chuyển hoàn toàn thành dạng muối hay dạng base dẫn đến hiện tượng chuyển khối trong sắc ký Dạng muối sẽ di chuyển nhanh hơn dạng base dẫn đến pic bị kéo đuôi Hệ pha động là acetonitril - acid formic với nồng độ acid formic thấp 0,05% (pH ≈ 3) cho tín hiệu 6 pic A, B, C, D, E, F trong mẫu phân tích đều gọn, không bị chẻ và hình dạng đối xứng Nguyên nhân do acid formic giúp quá trình ion hóa mẫu phân tích làm tăng tín hiệu pic trong đầu dò khối phổ, đồng thời môi trường có tính acid chuyển chất phân tích về dạng muối hạn chế hiện tượng kéo đuôi Tuy nhiên khi nồng độ acid formic cao sẽ làm tăng khả năng dung môi đi buồng ion khối phổ cạnh tranh với chất phân tích là giảm tín hiệu chất phân tích.
Tốc độ dòng: tốc độ dòng được lựa chọn phân tích là 0,8 ml/phút để rút ngắn thời gian phân tích, đồng thời làm pic xuất hiện gọn đẹp Nghiên cứu cho thấy trong phân tích bằng khối phổ, mỗi tạp khi được ion hoá, có thể tạo thành nhiều loại ion khác nhau tuỳ thuộc vào kỹ thuật và chế độ ion hóa Đề tài sử dụng kỹ thuật ion hoáESI, chế độ ion dương thông thường tạo được ion phân tử là [M+H] + và một số ion khác Mỗi ion phân tử khi đi qua tứ cực thứ hai lại được bắn phá để tạo thành các ion sản phẩm, hai ion được lựa chọn là hai ion có cường độ cao nhất và tỷ lệ giữa 2 ion này là đặc hiệu cho mỗi chất Do đó vấn đề liệu các chất có tách với nhau trên sắc ký lỏng hay không không còn quá quan trọng như khi sử dụng đầu dò là UV- Vis, DAD, điều này được chứng minh trong hướng dẫn mới nhất của ICH tại Q2(R2) (2024) 118 về độ đặc hiệu - chọn lọc các chất trong phân tích tạp 118 Đối với các phân tích thường quy, yêu cầu các chất phải tách khỏi nhau trên sắc ký đồ thì mới có thể phát triển phương pháp Còn đối với các thiết bị khối phổ, các chất có thể không tách trên LC nhưng khi qua MS đều đã tách hoàn toàn về tín hiệu dựa vào số khối, đây là một trong những điểm ưu việt của MS so với các phương pháp khác.
4.3.3 Bàn luận về thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E,
Bàn về tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu là ưu điểm nổi bậc của phương pháp LC-MS/MS được thực hiện theo hướng dẫn mới Q2(R2) của ICH trong quy trình định lượng tạp Sắc ký đồ khi phân tích từng tạp đều cho thấy không xuất hiện tín hiệu các chất còn lại (PL 5.1), chứng tỏ quy trình đạt độ đặc hiệu cao Nguyên nhân là do các chất được tách lần đầu qua hệ thống sắc ký lỏng và được chọn lọc ion đặc trưng của từng chất để phân tích trong hệ thống đầu dò khối phổ tứ cực Kết hợp với kỹ thuật ghi phổ MRM, các mãnh ion đặc trưng định lượng tiếp tục được chọn lọc phân tích củng cố thêm cho tính đặc hiệu của quy trình Do đó dù thời gian lưu các tạp không tách ra nhau hoàn toàn nhưng với hệ thống phân tích LC-MS/MS, vẫn đảm bảo tính đặc hiệu-chọn lọc cho phương pháp phân tích theo ICH Q2(R2) (2024) 118
Bàn về ảnh hưởng của nền mẫu
Khi phân tích bằng kỹ thuật LC-MS/MS, độ chọn lọc được cải thiện nhờ vào việc phát hiện ion mẹ và ion phân mảnh đặc hiệu Vì vậy, quá trình phân tích thường không bị ảnh hưởng nhiều bởi các tạp chất trong nền mẫu Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp có thể ảnh hưởng đến tín hiệu và sự ổn định của tín hiệu chất phân tích thông qua việc làm sụt giảm tín hiệu ion (ion suppression) hoặc làm tăng cường tín hiệu ion (ion enhancement) thì cần hạn chế tối đa hiện tượng này Nền mẫu phân tích trong nghiên cứu là tân dược với các tá dược đa phần là các chất trơ nên quá trình phân tích đơn giản hơn nhiều so với nền mẫu là huyết tương hay các dịch sinh học Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hưởng của tá dược cũng như các dung môi pha mẫu không ảnh hưởng đến các pic tạp allopurinol Đồng thời kết quả thực hiện khảo sát độ lặp lại tại nồng độ LOQ trong mẫu giả lập thành phẩm cho thấy độ ổn định của quy trình phân tích.
Bàn về giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Mục tiêu khi xây dựng phương pháp là tối ưu các điều kiện sắc ký và khối phổ sao cho giới hạn định lượng (LOQ) của các tạp nằm trong khoảng tuyến tính và phù hợp trong định lượng các tạp theo quy định trong DĐVN V; BP 2023; USP-NF
2023, kết quả thu được trong nghiên cứu đạt được LOQ là 10 - 20 ppm.
Bàn về khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Tất cả các chất đều thể hiện tính tuyến tính trong khoảng nồng độ 10 - 200 ng/ml với hệ số tương quan bình phương r2 ≥ 0,995 Khoảng tuyến tính này tương thích với phạm vi hàm lượng tạp trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc theo quy định, là từ 0,1% đến 0,2%.
Bàn về độ đúng và độ chính xác
