Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen, sự truyền plasmid mang blaNDM của các chủng vi khuẩn đường ruột kháng thuốc Gram âm lâm sàng tại TP.HCM 2010-2017

Gen blaxpm được đặcbiệt chú ý do chúng chủ yếu nằm trên plasmid nên có khả năng lan truyền giữa cácplasmid trong cùng loài hay khác loài; đồng thời chủng mang blaypm thường da khángnhiều

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HA TAM DƯƠNG

LUAN AN TIEN SI SINH HOC

TP Hồ Chí Minh — Năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LE HA TAM DƯƠNG

Nganh: Di truyén hoc

Mã số ngành: 62420121

Phản biện 1: PGS.TS Ngô Thị Hoa

Phản biện 2: TS Nguyễn Thị Thu Hoài

Phản biện 3: TS Nguyễn Thị Lệ Thủy

Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Thị Thu Hoài

Phản biện độc lập 2: TS Vũ Thanh Thảo

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CAO THỊ BẢO VÂN

TP Hồ Chí Minh — Năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài luận án tiến sĩ ngành di truyền “Phân tích đa dang và biến đôi

di truyền vùng gen blanpm quy định tính kháng kháng sinh nhóm carbapenem của các

chủng vi khuân Gram âm lâm sàng tại TP HCM 2013-2019” là công trình khoa học do

tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Cao Thị Bảo Vân.

Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và không

trùng lặp với các công trình đã công bô trong và ngoai nước.

Nghiên cứu sinh

(Ký tên, ghi họ tên)

Lê Hà Tam Dương

LỜI CÁM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đành cho PGS.TS Cao Thị Bảo Vân đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian nghiên cứu

tại Viện Pasteur TP HCM.

Xin cám ơn chị Nguyễn Thị Hạnh Lan, bạn Nguyễn Thị Yến Nhi, em Lê Thị Liên,

em Hoàng Ngọc Khánh Quỳnh và chị Trần Thị Minh Thảo, những đồng nghiệp ở Phòng

thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur TP HCM đã hỗ trợ

và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Xin cảm ơn chị Trần Khánh Linh, em Thi Nguyễn Hải Ngọc, Võ Trần Ngọc Trinh, Nguyên Thảo, Trần Văn Đức, Diệu Thuận và Thái Ngọc đã luôn nhiệt tình hỗ trợ và sát

cánh cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.

Xin cảm ơn Cô Nguyễn Thụy Vy, các Thầy Cô Bộ môn Di truyền và Cô Trần Thị

Phuong Giang - Phòng dao tạo sau Đại học, ĐH KHTN đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện

thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng gửi lời cám ơn đến:

- Ban Giám đốc và tập thể cán bộ Khoa xét nghiệm Bệnh viện Nhi Đồng 1, Bệnh

viện Nhi Đồng 2, Bệnh viện Bình Dân và Bệnh viện Nhân Dân Gia Định đã hỗ trợ nguồn

chủng quý giá cho nghiên cứu.

- Viện nghiên cứu khoa hoc y khoa Quân đội Hoa Kỳ (AFRIMS) đã tài trợ kinh phí

thực hiện nghiên cứu.

- Viện nghiên cứu các bệnh do vi sinh (RIMD), Dai học Osaka, Nhật Ban đã hợp

tác giải trình tự gen vi khuẩn.

Cuối cùng, con xin tri ân Ba Mẹ và các anh chị em trong gia đình đã luôn yêu thương

và ủng hộ, cắm ơn Anh đã luôn bên cạnh và khích lệ em trong công việc và cuộc song, cam

ơn hai con đã chịu nhiêu thiệt thoi khi phải san sẻ thời gian với công việc của me.

CHUONG 1 TONG QUAN u.eeecescescesssssesssssesessessessessessessessessesatsnssatsnssnesussussessnsaneseesvess 4

1.1 Họ vi khuẩn đường ruột Gram âm lâm sang phổ biến và đặc điểm kháng kháng

sinh ở vi khuân họ đường ruột Gram âm ¿2522222 +E+E+EvEvEvrerrrtrtrtrtrrsrsrrreree 4

1.1.1 Họ vi khuân đường ruột Gram âm lâm sàng phổ biến -. - 4 1.1.2 Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn họ đường ruột Gram âm 6 1.2 Kháng sinh nhóm carbapenem và cơ chế kháng carbapenem - 9

1.2.1 Khang sinh nhóm carbapenem + + +++k++t£+x£+sk+sEEEeEeeksekrrkerkereereie 9

1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem ở họ vi khuan họ đường ruột Gram âm 11

1.2.3 Carbapenemase, NDM va các biến thé ecccccccccscscsscscssesescsscsesvssesesvseseavsvesees 12

1.3 Đặc điểm di truyền gen kháng carbapenem DIANDM sssssssssssssesssssssesesssssseeessessseees 16 1.3.1 Đặc điểm gen bÏZNDM :-©522SE SE 2E EEEEEE2E1E212112117121111 11T tre 16 1.3.2 Đặc điểm các plasmid mang bÏ#NDM -: -2-©52-55222+22++2£xt2zxzrxrzrxerree 19 1.3.3 Cấu trúc di truyền vùng mang gen blanpm và các yếu tố chuyền vị 21

1.4 Đặc trưng hóa chủng mang gen blanpm bằng phân tích tô hợp trình tự da allele

(Multi-locus sequence tYDIT) - - thành x22 1111111111111 1 1111111111111 H.gkrkg 24

1.4.1 Định nghĩa dòng sequence type (dòng ST) và phương pháp phân tích tổ hợp

trình tự đa allele (MLST- Multi-Locus Sequence Typing) - «+ s«<+<<<sse2 24

1.4.2 Các dòng ST phổ biến ở các chủng mang gen DIANDM -. ‹ :©52- 2552 26 1.5 Chuyên gen bằng tiếp hợp và chuyên vị gen 222¿222E+2+ettEEExeerrrrrrvee 27

1.5.1 Chuyén gen bằng tiếp hợp -¿¿++++x2Ext2ExtEExetrxrrrkrrrrerrrerreee 27 1.5.2 na 43344) 33

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về họ vì khuân đường ruột Gram

Am khang carbapenem 0T ÚƠỞs¿ý›ýŸý“3 37

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -:cc22cceccccerrrrerree 39

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22¿+++22EEEEE++2+++22222221122222222221111222221221112 te 39

2.2 Vat Gtr NGHISN CUU oo 40

2.2.1 Dụng cụ - thiết bị -©5c- 5c k2 1 21211121211 21121111211 11 111g 40

2.2.2 Các hóa chất, sinh phẩm dùng trong nghiên cứu -22- sz+sz sec: 42 2.3 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu 2:++2222EE2+22+++2222221111221222222111122 221211112 re 48

2.4 Các phương pháp thực hiỆn tt TH H11 111gr rrey 49

2.4.1 Sang lọc chủng vi khuân mang gen ĐÏ4NDM - -. :-©225¿225+2cx2cx>zxeszez 49 2.4.2 Phương pháp định danh vi khuẩn - 2-2 2 2++£+E++E++EEzEkerxerxerrxeei 50 2.4.3 Phương pháp kiểm tra kiểu hình nhạy cảm kháng sinh -: 50

2.4.4 Phuong pháp giải trình tự Ø€n - - 55 + + +EEiEseEsrrrirrirrresrerrre 54

2.4.5 Phương pháp ráp nối, chú giải, và phân tích trình tự gen - 57 2.4.6 Xử lý và phân tích số liệu ¿- 2+ 2++2+++E+++EE++EE+SEEerkvsrkrrrrrrrkrrree 58

2.4.7 Phương pháp MLSÏÌT - Ăn TH TH TH HH trệt 59

2.4.8 Phương pháp tiếp hợp - ¿se sex E2 EEE2112112711211211 112111111 62

3 CHƯƠNG 3 KET QUA NGHIÊN CỨU VA BAN LUẬN - -2se+s+se¿ 64

3.1 Phân loại chủng theo thời gian và bệnh viện - - ¿55+ +c+x+t+sererereeevsee 64

3.2 Kiéu hình kháng kháng sinh của chủng nghiên cứu -cc+¿ 65

3.3 Chung mang blanpm và kiểu hình kháng kháng sinh của chủng mang blanpo 69

3.4.4 Đặc điểm cấu trúc di truyền xung quanh gen blanpm ở 17 chủng nghiên cứu 84 3.4.5 Đặc điểm dòng ST mang blanpm trong nghiên cứu . : : s - 97 3.5.5.1 Kết quả phân tích dong ST E coli trong nghiên cứu .: : - 98 3.5.5.2 Kết quả phân tích dòng ST ở vi khuẩn K pneumoniae trong nghiên cứu 102 3.6 Khả năng chuyền gen ngang qua plasmid tiếp hợp ở chủng nghiên cứu 107 3.6.1 Kha năng tiếp hợp của 17 chủng nghiên cứu 2- 2 s+sz+s+zxzss 107

3.6.2 Tần suất tiếp hợp của các chủng mang plasmid có Đ4NDM - 115

4 CHƯƠNG 4 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ -cccccccctEvvverrrrrrrrrerrrrree 122

il

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CUA TÁC GIÁ ĐÃ XUAT BẢN CÓ LIÊN

QUAN DEN LUẬN ÁN 2-5252 2 E12E12112112112112112111111111 111111111111 1111 11.0 124

)00809/94/.100I2000121275 134 Phụ lục 1 Danh sách 155 chủng vi khuẩn Gram âm và đặc điểm kháng kháng sinh PLI

Phụ lục 1.1 Danh sách 155 chủng vi khuẩn Gram âm trong nghiên cứu PLI Phụ lục 1.2 Kiểu hình kháng kháng sinh theo kháng sinh đồ -:- PL6

Phụ lục 1.3 Kiéu hình kháng kháng sinh của 155 chủng vi khuẩn Gram âm

theo MIC .Ô PLII

Phụ lục 1.4 Tong hop két qua phan tich kiéu hinh nhạy cam kháng sinh cua 155

chung vi khuân Gram âm trong nghiên CỨU -¿- 5-5 +s+£+E+EeEeEereretexexexeree PLI7

Phụ lục 2 Phiếu thu thập thông tin -2- 2 2£ ©5£+SE£2E£2E££EE£EESEEEEEEEEEvEkerkerrxerkeres PL18

Phụ lục 3 Danh sách 64 chủng mang gen ĐÏNDM - - 5 55 5+ 3+ +EEsEEseseeseeeeesee PL20

Phụ lục 4 Dữ liệu thô trình tự gen - Ă 1111 319v HH HH kg ngư PL22

Phụ lục 5 Tiêu chuẩn đọc kết quả kiểu hình kháng kháng sinh 2-5-5 PL25

Phụ lục 5.1 Tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vòng kháng khuẩn ức chế đối với các loại vi khuẩn Gram âm và khoảng chấp nhận về đường kính của chủng

chuẩn E coli ATCC® 259221 222.1211211 nH.nHHrreiirrriie PL25

Phụ lục 5.2 Giá trị tiêu chuân nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh đối với các vi khuẩn thử nghiệm dựa trên CLS] 2019 c¿z+22scccz+e PL26

11

DANH MỤC TU VIET TAT VÀ DỊCH THUẬT

Tiếng Việt

Viết tắt Viết day di

BN Bénh nhan

BV Bénh vién

BV NDGD | Bệnh viện Nhân Dân Gia Dinh

BV NDI Bệnh viện Nhi đồng 1

Viết tắt Viết đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

aa Amino acid Axit amin

AMC Amoxicillin/Clavulanic acid (Tén khang sinh)

ATCC American Type Culture Collection Bộ sưu tập giống chuân Hoa

Kỳ

ATM Aztreonam (Tén khang sinh)

BHI Brain Heart Infusion Môi trường BHI lỏng

BHIA Brain Heart Infusion Agar Môi trường BHI rắn

BLAST Basic local alignment search tool Công cụ tim kiếm trình tự

tương đồng

bp Base pairs Cap base

CAZ Ceftazidime (Tén khang sinh)

CFU Colony forming unit Don vi tạo khúm

iv

CIP Ciprofloxacin (Tén khang sinh)

CLSI Clinical Laboratory Standards Viện Tiêu chuân Lâm sang

Institute và Xét nghiệm

CRE Carbapenem Resistance Họ vi khuẩn đường ruột

Enterobacteriacae khang carbapenem CRO Ceftriaxone (Tén khang sinh)

CTX Cefotaxime (Tén khang sinh)

CS Colistin (Tén khang sinh)

CXM Cefuroxime (Tén khang sinh)

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dNTP

ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate ddNTP

DNA Deoxyribonucleic acid DNA

E coli Escherichia coli Tén vi khuan

ECDC European Centers for Disease Trung tâm kiêm soát và

Control and Prevention phòng chống bệnh Châu Âu

E-test Epsilometer test E-test

EUCAST European Committee of Ủy ban Châu Âu về thử

Antimicrobial Susceptibility Testing | nghiệm tính nhạy cam

khang sinh

ESBL Extended Spectrum B-Lactamase B-lactamase phô rộng

ETP Ertapenem (Tén khang sinh)

FOX Cefoxitin (Tén khang sinh)

GM Gentamicin (Tén khang sinh)

I Intermediate Trung gian

ICU Intensive care unit Don vi săn sóc tích cực

IMP Imipenem (Tén khang sinh)

INFORM International Network for Optimal Mang lưới quốc tế về giám

Resistance Monitoring sát tính kháng tối ưu

IS Insertion sequence Trình tự gắn chèn

K Kanamycin (Tén khang sinh)

KPC Klebsiella pneumoniae (Tén enzyme)

carbapenemase

kb Kilo-base (Don vi do kích thước

DNA) MEM Meropenem (Tén khang sinh)

MH Mueller Hinton Thach Mueller Hinton

MHA Mueller — Hinton Agar Môi trường thạch Mueller —

Hinton

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nông độ ức chế tôi thiêu

NA Not available Không có thông tin

NCBI National Centre of Biotechnology Trung tâm Thông tin Công

Information nghệ Sinh học Quốc gia

NDM New Delhi metallo-B-lactamase (Tén enzyme)

NGS Next-Generation Sequencing Giải trình tự thé hệ mới

NTA NasoTracheal Aspiration Hút dich khí quản qua mũi

OD Optical Density Mật độ quang

OMV(s) Outer membrane visicle(s) Tui mang ngoai

ORF Open reading frame Khung doc mo

OXA Oxacillinase (Tén enzyme)

PBP Penicillin Binding Protein Protein gan penicillin

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại tổng

hợp chuỗi

PDR Pandrug resistant Toàn kháng/kháng toàn bộ

R Resistant Khang

rRNA Ribosomal ribonucleic acid RNA ribosom

rpm Revolutions per minute Vong/phtt

S Susceptible Nhạy

SMART The Study for Monitoring Chương trình giám sát xu

Antimicrobial Resistance Trends hướng kháng khang sinh

SXT Trimethoprim-Sulfamethoxazole (Tén khang sinh)

vi

UV Ultra violet Tia UV

Taq Thermus aquaticus DNA polymerase | Men chịu nhiệt

TAE Tris Acetate Dung dich dém TAE

Ethylenediaminetetraacetate

TBE Tris-borate-EDTA Dung dich dém TBE

TM Tobramycin (Tên kháng sinh)

Tn Transposon Nhân tô chuyên vi

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thê giới

VI

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của penicillin, cephalosporin, carbapenem - 10

Hình 1.2 Các cơ chế chính kháng carbapenem ở vi khuẩn Gram âm -. - 12

Hình 1.3 Minh họa kiểu hình kháng carbapenem của các biến thể NDM - 18

Hình 1.4 Trình tự axít amin NDM-I va các biến thể NDM ccccccccrrree 19 Hình 1.5 Sự phân bố blaxpm theo nhóm plasmid ở Enwerobacteridcede -: s:: 20 Hình 1.6 Ví dụ về các cấu trúc di truyền và cơ chế chuyền vị của bÏ2NpM - 23

Hình 1.7 Các thành phần chính tham gia quá trình truyền plasmid -s- 30 Hình 1.8 Mô hình hóa cơ chế thu nhận và lan truyền blaNDM theo 3 cấp độ 37

Hình 2.1 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu 2-2 ©£ +++E£+EE£EE+EE£EEEEEEEEEEEErrkerkerrrerkee 48 Hình 2.2 Sơ đồ thực hiện phương pháp khuếch tán trên thạch Kirby-Bauer 51

Hình 2.3 Các bước xử lý và phân tích dữ liệu dé thu trình tự plasmid mang blanp 59

Hình 3.1 Ty lệ kháng/trung gian của chung nghiên cứu giữa các bệnh viện (Thực hiện bang phương pháp khuếch tán trên thạch (K.$Ð))) 2-2 2£ £+E£2E++EE£EE£+EEEEEEEEeEkerrerrkees 67 Hình 3.2 Tỷ lệ kháng/trung gian của chung nghiên cứu giữa các bệnh viện (Thực hiện bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)) - ¿2 2+ +£+£+£E£+E++£xzxsrxee 68 Hình 3.3 Ảnh đại diện kết quả PCR sàng lọc gen DIGNDM cscsssessesssessesssessesssessesseessessecssesees 69 Hình 3.4 So sánh kiêu hình kháng/trung gian giữa nhóm chủng kháng carbapenem mang blanpw va không mang blanpm theo phương pháp KSĐ Scssssekrsirrrrrrrrrres 71 Hình 3.5 So sánh kiểu hình kháng/trung gian giữa nhóm chủng kháng carbapenem mang blaupw và không mang blanpm theo phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 71

Hình 3.9 Đặc điểm cấu trúc di truyền vùng gen blanpm trên plasmid nhóm IncFIA 91

Hình 3.10 Dac điểm cấu trúc di truyền vùng gen blanp trên plasmid nhóm IncHI2 92

Hình 3.11 Đặc điểm cấu trúc di truyền vùng gen blanpm trên plasmid nhóm IncFII(Yp) 93 Hình 3.12 Kết qua PCR các đoạn trình tự thuộc 8 gen giữ nhà ở vi khuẩn E coli 99

Hình 3.13 Cây phân loại kiểu gen các chủng E coli phân tích trong nghiên cứu 101

Hình 3.14 Anh dai diện kết quả khuếch dai 7 locus gen giữ nha chủng K pneumoniae ReSISNDI-1 103

Hình 3.15 Cây phân loại kiểu gen các chủng K pneumoniae trong nghiên cứu 106

Hình 3.16 Ảnh chụp đại diện kết quả tiếp hợp chủng ResI4ND2-1 - 108

Hình 3.17 Đánh giá độ nhạy/kháng kháng sinh của chủng tiếp hợp -. 111

Hình 3.18 Kết quả điện di kiểm tra sự hiện diện gen blanpm ở các chủng tiếp hop 113

Vill

DANH MỤC BANG VÀ BIEU DO

Bang 1.1 Tóm tắt đặc điểm một số phân nhóm plasmid chính [23] -2- 2 2©s2+5£2zsz>sz 6

Bảng 1.2 Các phép đo về mức độ tiếp hợp được báo cáo trong y văn [109] -c5 -: 32

Bảng 2.1 KS đĩa sử dung trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch 2: 5z ©cs+cse+rssrxez 42

Bảng 2.2 Danh sách KS bột được sử dụng trong thử nghiệm MIC - 5 5c c+xssessee+ 43

Bang 2.3 Danh sách 8 locus gen và trình tự mỗi tương ứng ở chủng E coli -5e¿ 46 Bang 2.4 Danh sách 7 locus gen và trình tự mỗi ở chủng K pneuaoHiđe : -:©cczcc5c-c: 47 Bang 2.5 Nồng độ kháng sinh khảo sát MIC 2-22 ©S2+SE+2EE£EESEEEEE221211221211 2121 crxe 53 Bang 3.1 Phân loại nguồn chủng theo thời gia c.ccceccsccesssessesssesssessesssesseessecsssssesssessecssecssesseesseeses 65 Bang 3.2 Phân loại nguồn chủng theo bệnh Vi6M cesccessesssessessesssessecssesseessecssessecssessecssecssesseesseeses 65 Bang 3.3 Phân loại nguồn chủng theo thời gian và bệnh viện + 5 5z+c+e+zz+zxczzxersee 65 Bảng 3.4 Phân loại chủng vi khuẩn mang bÏ#wpụ -

Bảng 3.5 Chung mang blanpm phân theo bệnh viện

Bang 3.6 Phân loại chủng mang Dlanpm theo thời Ø14T -ó- 5< 123131 E +31 91 ESEEkEskrekkskkrree 70

Bảng 3.7 Danh sách chủng chọn giải trình tự DNA - -c 5 112 9v HH ngư 72

Bang 3.8 Biến thé NDM và loại plasmid mang blaypm ở chủng nghiên cứu -¿ 74 Bảng 3.9 Phân tích kiểu hình kháng carbapenem các chủng nghiên cứu theo phân nhóm

biến thé NDM bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu -2¿©¿+£+2zEe2zxevrxzervzeee 75 Bảng 3.10 Phân tích kiểu hình kháng carbapenem các chủng nghiên cứu theo phân nhóm

biến thé NDM bằng phương pháp K.SĐ 22-52 2222 E221 271127112211211121112111 111111211 eyee 76 Bảng 3.11 Tóm tắt kết quả phân tích đặc điểm 17 chủng mang ĐÏ2Npạ -5° 5525525555552 79 Bảng 3.12 Đặc điểm gen kháng kháng sinh ở chủng mang bÏ2wpM -5- ©2255 ©5<+cx+2zs+cse2 80 Bảng 3.13 Danh sách plasmid dùng dé vẽ cấu trúc di truyền vùng gen bÏ4Npụ -: 85 Bảng 3.14 Danh sách chủng được chọn giải trình tự DNA các gen giữ nhà dé phân tích

li 0ì000fWNEr-ỤẦỤŨẰỤŨẰỤẰẶA 98 Bảng 3.15 Kết quả xác định kiểu trình tự các chủng E COUi c.cceccesscsssesssssssessessesseessesssessessseseesseess 100 Bang 3.16 Kết quả xác định kiêu trình tự các chủng K pneumoniae 25-55cccccccccccces 105 Bảng 3.17 Kết quả tiếp hợp của chủng nghiên cứu

Bang 3.18 Đặc điểm chung của chủng va plasmid mang blawpw tiếp hop trong nghiên cứu 110 Bang 3.19 Kết qua định danh chủng tiếp hợpp 2-2-5 2< 22EE£EEEEEE2EEEEE2EEEEEExEEcrkcree 111 Bang 3.20 Các trình tự chức năng liên quan khả năng tiếp hợp của các chủng nghiên cứu 114 Bảng 3.21 Kết quả tính tần suất tiếp hợp ở chủng nghiên cứu . ¿¿+c5z+czx+czxsrvz 115

ĐẶT VAN ĐÈ

Vi khuẩn kháng kháng sinh là một trong những vấn đề nghiêm trọng toàn cầu,

đe dọa sức khỏe con người Là một quốc gia đang phát triển, Việt Nam phải đối mặt

với gánh nặng kinh tế xã hội và áp lực trong quản lý lâm sàng do vi khuan kháng

kháng sinh, đặc biệt vi khuẩn đa kháng gây nhiễm trùng bệnh viện ngày một gia

tăng Trung bình, có 1/10 bệnh nhân bị nhiễm trùng khi được chăm sóc sức khỏe, tỷ

lệ này còn cao hơn ở các đơn vi chăm sóc đặc biệt tại các bệnh viện [1].

Carbapenem là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng nhất thuộc họ

B-lactam, đến nay vẫn được xem là “kháng sinh lựa chọn” trong điều trị nhiễm đa kháng

khuẩn [2] Tuy nhiên, sự xuất hiện và không ngừng gia tăng các nhóm carbapenemase

có khả năng thủy phân carbapenem đã và đang là thách thức lớn đối với công tác bảo

vệ sức khỏe cộng đồng [3]

New Delhi metallo B-lactamase (NDM) là một carbapenemase (metallo-B

lactamase) được phát hiện gần đây nhất (năm 2008) va hiện là một trong những

enzyme được quan tâm hang dau [4] NDM do gen blanpm mã hóa, có kha năng thủyphân gan như tất cả kháng sinh họ B-lactam, kế cả carbapenem Gen blaxpm được đặcbiệt chú ý do chúng chủ yếu nằm trên plasmid nên có khả năng lan truyền giữa cácplasmid trong cùng loài hay khác loài; đồng thời chủng mang blaypm thường da khángnhiều loại kháng sinh hoặc toàn kháng do chúng có khả năng tiếp nhận các gen kháng

kháng sinh khác thông qua các yếu tố di truyền động như các trình tự chèn

(IS-Insertion Sequence), transposon (Tn) hay các integron Các gen kháng kháng sinh này

thường bao gồm gen mã hóa ESBL (Extended Spectrum f-Lactamase), AmpCcephalosporinase, các carbapenemase khác (loại OXA) và những hợp chất có khả

năng kháng aminoglycoside (16S RNA methylase), quinolon (qnr), rifampicin,

sulfamethoxazole va chloramphenicol [5] Do đồng mang nhiều gen kháng, việc điềutrị kháng sinh đối với phần lớn các chủng sinh NDM đang chỉ giới hạn ở ba loại thuốc

hiện có là colistin, tigecycline và fosfomycin [6] Tuy nhiên, colistin gây tac dung

phụ như độc cho thận và thần kinh, tigecycline cần một lượng lớn nhưng lại cho hiệuquả thấp vì nồng độ của chúng kém được duy trì trong máu, đường tiết niệu và phối

Ngoài ra, fosfomycin, một loại kháng sinh lâu đời, chỉ được sử dụng trong điều trị

nhiễm trùng đường tiết niệu và không được sử dụng rộng rãi do thiếu các thử nghiệm

đối chứng ngẫu nhiên Vi khuẩn đề kháng với các kháng sinh này cũng đã được báo

cáo ở vi khuẩn sinh NDM [7-9] Các hợp chất có khả năng ức chế NDM đã được tìm

thấy nhưng hiện chưa có chất nào được ứng dụng thành công trong lâm sàng Các đợtbùng phát do vi khuân mang NDM đã được báo cáo trên toàn thế giới [10, 11] Đã cócác hướng dẫn về phòng ngừa và kiểm soát vi khuân Gram âm kháng carbapenem

nhưng vẫn chưa có hướng dẫn riêng nào dành cho vi khuẩn sinh NDM [12]

Kể từ khi được phát hiện đến nay, vi khuân mang gen blanpm đã nhanh chónglan rộng trên toàn thé giới Hiện đã có ít nhất 24 biến thé gen blanpm được xác địnhtrong 60 loài, thuộc 11 họ vi khuẩn; một số biến thể được chứng minh tăng cường

hoạt động của carbapenemase [12] Vi khuẩn mang blanpm chủ yếu thuộc họ

Enterobacteriacae, Acinetobacter hay Pseudomonas với các dong ST (Sequence

Type - ST) khác nhau Có ít nhất 40 dòng ST Klebsiella pneumoniae va Escherichia

coli mỗi loại được xác định mang gen bløwpM Tuy nhiên, chỉ có một số ít dòng STnổi trội được được xem như là dòng ST “quốc tế” nhất định ở mỗi loài như ST11,

ST14, ST15 hoặc ST147 ở K pneumoniae và ST167, ST410 ở E coli [12] Ngoài ra,

có khoảng 200 loại plasmid khác nhau mang gen blanpm đã được ghi nhận (theo số

liệu từ ngân hàng GenBank-NCBI, 2019), phổ biến là nhóm IncFII, IncC, IncX3

Các yếu tố di truyền động như IS, Tn hay các integron là các yếu tô giúp lan

truyền gen kháng giữa các chủng trong cùng ST hay khác ST, cùng loài hay khác loài.Tất cả chúng đã góp phần tạo nên các bối cảnh di truyền đa dạng của vùng trình tựmang gen blanpm, giải thích cho khả năng đa kháng của vi khuẩn mang blanpm va sựlan truyền nhanh chóng của gen blanp Sự phân bồ vi khuẩn mang b/anpw khác nhaugiữa các nước phụ thuộc vào tình hình dịch té, điều kiện kinh tế xã hội, mối quan hệgiao thương và chính sách quản lý lâm sàng ở mỗi quốc gia

Mặc dù vi khuẩn sinh NDM đã tôn tại phổ biến tại nước ta và gây hậu quảnghiêm trọng trong lâm sàng nhưng chúng ta biết rất ít về cơ chế lan truyền và khả

năng kiêm soát chúng Hiện tại, các nghiên cứu ở Việt Nam vân còn thiêu nhiêu dữ

liệu phân tích di truyền có hệ thống trên số lượng lớn chủng theo thời gian dé có thé

đánh giá toàn diện, xác định các yếu tố nguy cơ làm cơ sở cảnh báo trong quản lý lâm

sàng.

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

- Dac điểm vùng trình tự di truyền quanh gen blanpm va vai trò trong việc

lan truyền gen kháng?

- Chung mang blzNpw có biến động theo thời gian và có ảnh hưởng đến khả

năng lan truyền không?

- Dong chủng phổ biến ở mỗi loài VK mang blanpm ? Khả năng lan truyền

blanbw có dé dàng giữa các loài khác nhau?

MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen, sự truyền plasmid mang genblaxpw của các chủng vi khuẩn họ đường ruột Gram âm lâm sàng tại TP.HCM 2010-

2017 nhằm tìm hiểu cơ chế lan truyền gen kháng blanpm và các yêu tố góp phần vào

sự lan truyền này, làm cơ sở khoa học dé dự báo trong điêu tri và quản lý lâm sang.

NỘI DUNG THỰC HIỆN

1 _ Phân lập, xác định kiểu hình đa kháng thuốc của các chủng vi khuẩn họ đường

ruột Gram âm kháng carbapenem mang gen blanpm Chọn đại diện chung mang

blanpm để giải và phân tích trình tự DNA plasmid

2 Nghiên cứu các đặc trưng di truyền của các chủng đại diện gồm: (i) Xác định

các dạng biến thể NDM; (ii) Xác định nhóm plasmid mang gen blanpw; (iii)

Phân tích đặc điểm cấu trúc, thành phan của vùng gen blanpm:; (iv) Xác định

dong ST của các chung.

3 Phân tích khả năng chuyền gen blanpm của các chủng bằng tiếp hợp

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Ho vi khuẩn đường ruột Gram âm lâm sang phố biến và đặc điểm

kháng kháng sinh ở vi khuẩn họ đường ruột Gram âm1.1.1 Họ vi khuẩn đường ruột Gram âm lâm sàng phố biến

Vi khuẩn họ đường ruột Gram âm là nhóm vi khuẩn (VK) có màng kép, trongcùng là màng sinh chất, tiếp theo là lớp peptidoglycan mỏng nằm trong khoang chuchất và màng ngoài Màng ngoài là phức hợp gồm lipoprotein và lipopolysaccharide,

có cấu trúc gần giống màng tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớptrong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm ba thành phần:

Lipid A, polysaccharide lõi và kháng nguyên O [13] Màng ngoài còn có thêm các

protein cơ chất (porin) còn gọi là protein lỗ xuyên màng cho phép một số loại phân tử

đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ , các protein vận chuyền quamàng một số phân tử riêng biệt như: nucleotide, vitamin B12 , các lipoprotein liên

kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

Mặt ngoài một số vi khuẩn ho đường ruột Gram âm có những sợi nhỏ và ngắn

gọi là pili, được chia thành hai loại là pili chung va pili giới tính Pili chung giúp vi

khuan bám lên các bề mặt qua đó quyết định tính chất ngưng kết hồng cầu của vikhuẩn Pili giới tính có vai trò quan trọng hơn, là cầu nối truyền DNA từ tế bào vikhuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận trong quá trình tiếp hợp [13]

Nhóm vi khuẩn họ đường ruột Gram âm gây bệnh thường gặp trong lâm sàng

gồm có họ Enterobacteriacae (phố biển nhất là Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae va Enterobacter cloacae), Acinetobacter baumannii, Pseudomonas

aeruginosa

Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tap trung vào ba tác nhân

chính: K pneumoniae, E coli và E cloacae Day cũng chính là các vật chủ phô biếnnhất mang bl2wpw được ghi nhận cho đến nay [14-16]

K pneumoniae là VK gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp ở người, đứngdau là viêm đường hô hap dưới [17] Ngoài ra, K pneumoniae cũng có thé gây nhiễm

trùng ở đường tiết niệu, đường mật dưới, vết thương phẫu thuật, viêm phối, nhiễm

trùng hô hấp trên, viêm màng não, nhiễm trùng máu, K pneumoniae đứng thứ haisau E coli về nhiễm trùng đường tiết niệu ở người lớn tuổi Trình tự gen K

pneumoniae gồm 1 phân tử DNA mạch vòng khoảng 5,4 triệu bp, chứa 4.962 gen mã

hóa protein, 80 RNA vận chuyên (tRNA) và 25 RNA ribosome (rRNA)

E coli có bộ gen gồm một phân tử DNA mach vòng khoảng 4,6 triệu bp, chứa4.288 gen mã hóa protein (được tô chức thành 2.584 operon), bảy operon RNAribosome (rRNA) va 86 RNA vận chuyén (tRNA) [18] Bén canh nhiém tring tiétniệu, E coli còn có thé gây gây viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương,

nhiễm trùng máu [19].

E cloacae cũng là một trong những tác nhân đa kháng thuốc, gây nhiễm trùngbệnh viện hàng đầu trong vài thập ky qua [20, 21] E cloacace kháng carbapenem đãđược tìm thấy ở nhiều quốc gia trên thế giới, cơ chế kháng chủ yếu do carbapenemasenhóm A hoặc B nằm trên cả NST hoặc plasmid [22] Bộ gen E cloacace gồm một

phân tử DNA mạch vòng khoảng 4,9 triệu bp, chứa 4.496 gen mã hóa protein, 77

RNA vận chuyên (tRNA) và 25 RNA ribosome (rRNA)

Như da số sinh vật, bộ gen vi khuân mang các gen tông hợp nhiều sản phẩm

khác nhau cho quá trình sống, sinh trưởng và phát trién của chúng Tuy nhiên, nhiều

gen quan trọng của vi khuẩn lại định vị trên những DNA tách biệt, nằm rải rác trongnguyên sinh chat của vi khuẩn gọi là plasmid

Plasmid là một phân tử DNA cấu trúc vòng tròn, có khả năng sao chép độc lập

với nhiễm sắc thé của tế bào chủ Giữa DNA plasmid và DNA nhiễm sắc thé của tế

bào vật chủ có sự tương tác cộng sinh và chi phối lẫn nhau [23].

Thông thường, mỗi loại plasmid sẽ thích nghi với một số loại vi khuẩn nhất định.Dựa trên khả năng thích nghi với tế bào vat chủ, plasmid được xếp thành nhóm có phổ

vật chủ rộng và hẹp Tương tự, vi khuẩn thường chỉ tiếp nhận những plasmid mà chúng

là tế bào chủ của các loại plasmid đó (Bảng 1.1) [13]

Bang 1.1 Tóm tắt đặc điểm một số phân nhóm plasmid chính [23]

IncK, IncB/O và IncZ 80-150 thấp tiếp hợp hẹp

IncA/C 18-230 thap — tiếp hop hẹp

IncH 75-400 thap — tiếp hợp rộng

IncP 70-275 thap — tiếp hop rong

IncT ~217 thap tiép hop hep

IncU 29-60 thap tiép hop rong

1.1.2 Co chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn ho đường ruột Gram âm

Cho đến nay biện pháp chủ yếu điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn họ

đường ruột Gram âm gây ra là sử dụng kháng sinh Kháng sinh là những chất kháng

khuân do các chung vi sinh vật sản sinh ra hoặc được tông hợp nhân tạo, có tác dụng

ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn ngay ở nồng độ thấp Có thé phân loạikháng sinh theo cấu trúc phân tử hoặc hóa học (ví dụ: betalactam, macrolide,

tetracycline, quinolone, aminoglycoside, sulphonamide ), theo cơ chế tác dụng (vi

dụ: ức chế tông hợp thành tế bào, ức chế tổng hợp protein ) hoặc theo phô tác dụng

(ví dụ: kháng sinh phô hẹp, phô rộng) [6]

Vi khuẩn kháng thuốc đầu tiên được phát hiện trong bệnh viện, nơi sử dụng rấtnhiều kháng sinh Các chủng đa kháng (kháng lại nhiều loại kháng sinh) được phát

hiện vào cuối những năm 1950 đến đầu những năm 1960 [24] Từ đó, tình trạng kháng

kháng sinh nhanh chóng lan rộng ra khắp các quốc gia trên thế giới, de doa nghiêmtrong sức khỏe cộng đồng với nhiều ca tử vong do điều trị thất bại và những tồn thất

về mặt kinh tế và xã hội [25]

Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn có thé là đề kháng tự nhiên hoặc đề khángthu được Đề kháng tự nhiên là đặc điểm sinh học của một loải, thường có được do

yếu tố di truyền với mục đích bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động của kháng sinh Đặc

điểm này xuất hiện ở tất cả các cá thể của loài một cách tự nhiên thay vì là kết quảcủa áp lực chọn lọc từ môi trường hoặc hiện tượng truyền gen ngang (horizontal genetranfer) Mặt khác, đề kháng thu được là đề kháng có được nhờ đột biến gen, nhận

được gen đề kháng từ bên ngoài thông qua truyền gen ngang hoặc kết hợp cả 2 cơ chế

này Thông thường, các đột biến xảy ra do lỗi trong quá trình sao chép DNA có tần

suất rất thấp Các đột biến này có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm khác nhau

trên gen cấu trúc hoặc gen điều hòa Cơ chế truyền ngang các vật liệu di truyền từmột vi khuẩn này sang một vi khuẩn khác có thể theo bốn phương thức: tiếp hợp, biếnnạp, tải nạp và thông qua các yếu tổ truyền gen Các gen kháng kháng sinh có thê đivào tế bào vi khuân ở dạng cả plasmid mang gen kháng kháng sinh hoặc chỉ có đoạngen kháng kháng sinh để rồi sau đó tồn tại như một plasmid độc lập hoặc tích hợp

vào plasmid/ nhiễm sắc thé của tế bào vi khuẩn nhận [26]

Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn có thé bắt nguồn từ hai yếu tố: yêu tố ditruyền sẵn có/thu được và hoạt tính của kháng sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy vàchọn lọc những vi khuân khang Tinh dé kháng sẽ phát triển khi có mặt đồng thời hai

yếu t6 này trong môi trường hoặc vật chủ Các gen quy định đặc tính kháng và tế bào

vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới áp lực chọn lọc của kháng sinh có trong

môi trường [27].

Có ba nhóm cơ chế kháng kháng sinh chính: giảm hấp thụ kháng sinh, thay

đổi đích tác động của kháng sinh và sinh enzyme ức ché/bién đôi kháng sinh [28] Cụthể, vi khuân Gram âm có thể làm giảm sự hấp thụ kháng sinh bằng cách hạn chếkháng sinh đi vào bên trong tế bào, tăng cường việc bơm đầy kháng sinh ra ngoài tế

bào hoặc kết hợp cả hai phương thức này So với vi khuân Gram dương, lớp màng

ngoài của vi khuẩn Gram âm tạo nên một lớp hang rào bảo vệ cho tế bào vi khuẩn

Vì vậy, đa số các nhóm kháng sinh ky nước như aminoglycoside, rifamycin vàmacrolide sẽ khuếch tán qua màng lipid kép của tế bào vi khuẩn, còn nhóm B-lactam

sẽ đi vào bên trong qua protein lỗ màng năm trên màng ngoài tế bào [29] Bằng việcthay đổi cấu trúc của lỗ màng hoặc loại bỏ lỗ màng, vi khuẩn Gram âm sẽ hạn chế

được kháng sinh đi vào bên trong tế bào Cơ chế chủ động bơm đây kháng sinh giúp

vi khuân Gram âm đề kháng với hầu hết các loại kháng sinh (trừ polymyxin) Một sốloại bơm đây đặc hiệu với một nhóm kháng sinh (ví dụ bơm Tet đặc hiệu vớitetracycline), nhưng đa số các loại bơm đây có tác dụng với nhiều nhóm kháng sinh

(bơm đây đa kháng) khác nhau như bơm AcrB-TolC ở E coli có thé day

fluoroquinolone, ÿ-lactam, tetracycline, chloramphenicol, acriflavine va

trimethoprim ra ngoai tế bao vi khuẩn [26] Mac dù ban đầu các gen mã hóa bơm đây

đa kháng đều nằm trên nhiễm sắc thé của vi khuẩn nhưng gan đây đã có bang chứngkhoa học cho thay các gen này di chuyền sang plasmid, qua đó có thé lan truyền sangcác cá thể cùng loài hay thậm chí khác loài [30]

Ở cơ chế thay đôi dich tác động của kháng sinh, do thành tế bào vi khuẩn đóng

vai trò quan trọng trong sự tồn tại và sinh trưởng của chúng nên các enzyme tham gia

vào quá trình tông hợp thành tế bào trở thành một trong những mục tiêu tác động của

nhiều loại kháng sinh Phổ biến nhất trong kiểu kháng nay là đột biến ở protein gắn

penicillin (Penicillin-Binding Protein - PBP), làm giảm ái lực với kháng sinh

ÿ-lactam Ngoài ra, đê hạn chê nhóm kháng sinh polymyxin gan vào mang, vi khuân có

thé thay đổi cấu trúc lipid A của màng ngoài tế bao vi khuẩn [31] Ngoài ra, đột biến

ở gen mã hóa rRNA 16S giúp vi khuẩn kháng lại aminoglycoside trong khi các đột

biến ở gen gyrA và parC (mã hóa DNA 19 gyrase và topoisomerase IV) giúp ngăncản kháng sinh nhóm quinolone/fluoroquinolone không thé gắn vào các vi trí này

[32].

Trong ba cơ chế kháng chính kể trên, cơ chế sinh tong hop enzyme có kha năng

ức chế hoặc biến đổi kháng sinh là cơ chế được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn hết

do chúng giúp vi khuân kháng lại các kháng sinh mạnh nhất hiện nay, ké cả kháng

sinh thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng Có ba hình thức giúp enzyme ức chế hoặc biếnđổi kháng sinh là chuyên nhóm, oxy-hóa khử và đặc biệt là thủy phân

Loại enzyme thủy phân phổ biến nhất là B-lactamase, có khả năng cắt liên kết

amide trong vòng j-lactam của kháng sinh nhóm ÿ-lactam, ngăn không cho kháng

sinh tiếp cận PBP Enzyme B-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum j-lactamases

- ESBL) có khả năng thủy phân tat cả các kháng sinh penicillin, cephalosporin va

aztreonam nhưng vẫn nhạy với carbapenem Có thể nói carbapenem là kháng sinhcứu cánh hiện nay, đặc biệt dùng trong điều trị nhóm vi khuẩn Gram âm đa kháng và

tiết ra, là carbapenem đầu tiên và cũng hợp chất gốc dùng để tạo ra các kháng sinh

thuộc nhóm carbapenem về sau Do thienamycin không bền và dễ bị thủy phân, cácdẫn xuất của nó lần lượt ra đời Năm 1985, 1mipenem (ban đầu được gọi là MK0787)

là carbapenem lần đầu được dùng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn phức tạp Imipenemtuy bền hơn và có ái lực cao với PBP nhưng vẫn dễ bị thủy phân bởi dehydropeptidase

I (DHP-I) có 6 ria thận [33] Trong hai thập kỷ tiếp theo, nhiều kháng sinh khác thuộc

nhóm này lần lượt được cải tiến bang việc bổ sung một nhóm methyl vào vị trí I-P,

giúp bảo vệ chúng khỏi sự thủy phân, như meropenem (1996), ertapenem (2001),

doripenem (2016), [34, 35].

Về phổ hoạt động, là một phân lớp của kháng sinh -lactam song carbapenem

có phô kháng khuẩn rộng hơn hắn so với các phân lớp khác như penicillin, các thế hệ

cephalosporin cũng như các B-lactam hoặc/và chất ức chế B-lactamase hiện có khác[36] Đặc tính này có được một phần nhờ cấu trúc đặc biệt của chúng

Carbapenem có cau trúc khá giống penicillin, gồm một vòng B-lactam hình

vuông nối với một vòng năm cạnh Khác với penicillin, ở carbapenem, nguyên tố lưu

huỳnh được thay bằng gốc methylen và có thêm một nối đôi Cau trúc đặc biệt nàytạo ra ba đặc tính giúp carbapenem có phổ tác dụng rộng: (1) Phân tử rất nhỏ và cókhả năng sử dụng những lỗ nhỏ ở màng ngoài vi khuân Gram âm dé tiếp xúc với PBP;(2) Khó bị B-lactamase của nhiều loại vi khuân thủy phân vòng B-lactam; (3) Có áilực với nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn (Hình 1.1)

H H Penicillin R? H Cephalosporin Carbapenem R2

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của penicillin, cephalosporin, carbapenem [2]

Về cơ chế hoạt động, đặc điểm nào khiến carbapenem có hiệu quả cao?

La một lớp của B-lactam, carbapenem không dễ khuếch tán qua thành tế bào

vi khuẩn [37], chúng xâm nhập vào vi khuẩn Gram âm qua protein màng ngoài, cònđược gọi là porin Sau khi vượt qua chu chất, carbapenem dễ dàng acyl hóa PBP,enzyme xúc tác tông hợp peptidoglycan trong thành tế bào vi khuẩn đồng thời có thể

ức chế liên kết chéo peptide cũng như các phản ứng peptidase khác Điều đặc biệt

quan trọng quyết định hiệu quả hoạt động của carbapenem là chúng có khả năng liênkết đồng thời với nhiều PBP khác nhau [38] Sự hình thành thành tế bao là một quá

trình năng động với sự hình thành và tự phân hủy xảy ra cùng một lúc; khi PBP bị ức

10

chế, quá trình tự phân hủy vẫn tiếp diễn [39] Hậu quả là peptidoglycan dần suy yếu

và tế bào vỡ ra do áp suất thầm thấu

Về hiệu quả hoạt động, imipenem, panipenem và doripenem là những kháng

sinh mạnh với VK Gram dương [36] Trong khi đó, meropenem, biapenem,

ertapenem va doripenem hiệu qua hơn với VK Gram âm [36] Ngoài ra, ertapenem

có phô hạn chế hơn đối với P aeruginosa [40]; meropenem không mạnh băngimipenem hay doripenem trong điều trị Acinetobacter baumannii [40]; với P

aeruginosa và A baumannii, doripenem có nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum

Inhibitory Concentration - MIC) thấp hơn imipenem va meropenem [41] Ngoài ra,doripenem là carbapenem ít bị thủy phân nhất bởi carbapenemase; doripenem bị thủyphân chậm hơn từ 2 đến 150 lần so với imipenem [42]; khi kết hợp với axit clavulanic,

meropenem có khả năng tiêu diệt Mycobacterium tuberculosis đa kháng [43].

Carbapenem cũng có thể được kết hợp với các khang sinh khác dé điều trịnhiễm khuẩn nghiêm trọng Một số sự kết hợp cho tác động tích cực, như mở rộngphố hoặc hiệp đồng (ví du imipenem kết hợp colistin trong điều trị K pneumoniaekháng metallo-B-lactamase (MBL) [44], song một số kết hợp cho tác dụng khôngmong muốn như tăng đề kháng với một trong những loại kháng sinh được sử dụng(như imipenem kết hợp tigecycline và gentamycin trong điều trị K pneumoniae và E

coli kháng ESBL) [45].

1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem ở họ vi khuẩn họ đường ruột Gram âm

Trong một thập kỷ trở lại đây, sự đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem đã tăngnhanh ở họ vi khuẩn đường ruột Gram âm trên toàn cầu Có ba cơ chế đề khángcarbapenem phô biến ở nhóm vi khuẩn này, đó là:

(i) Tạo các đột biến làm giảm tính thắm của màng tế bào với kháng sinh;

(ii) Sử dụng bơm đây dé bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn;

(iii) Sản xuất vượt mức một loại B-lactamase không phải carbapenemase kết hợp

giảm tính thắm màng ngoài do mắt hoặc thay thế kênh porin Cơ chế này được

ghi nhận ở E cloacae, Enterobacter aerogenes, Proteus rettgeri, Citrobacter

11

freundii, E coli và K pneumoniae; hoặc sản xuat enzyme carbapenemase (một

nhóm ÿ-lactamase) có khả năng thủy phân carbapenem (Hình 1.2) [46].

Giảm tính thắm

_ màng ngoài

Hình 1.2 Các cơ chế chính kháng carbapenem ở vi khuẩn Gram âm [46]

Trong các cơ chế này, sinh tong hợp enzyme carbapenemase là cơ chế hiện được

nghiên cứu sâu rộng nhất, đặc biệt đây là cơ chế giúp vi khuân kháng lại các loại

kháng sinh mạnh nhất hiện nay Đồng thời, các gen mã hóa carbapenemase của vi

khuẩn chủ yếu năm trên plasmid, tạo điều kiện cho sự lan truyền nhanh chóng gen

kháng giữa các sinh vật cùng loài, thậm chí khác loài.

1.2.3 Carbapenemase, NDM và các biến thể

Enzyme carpapenemase

Carbapenemase là lớp ÿ-lactamase đặc biệt có kha năng thủy phân

carbapenem Các enzyme carbapenemase được chia thành hai họ dựa trên sự khác

biệt trong cơ chế thuỷ phân kháng sinh carbapenem: một họ là các enzyme sử dụng

12

serine ở vị trí hoạt động, gồm lớp A (KPC, GES, ); lớp D (23, 48,

OXA-51, OXA-58, OXA-181, ) và họ còn lại gồm các enzyme sử dụng kẽm ở vị trí hoạt

động dé xúc tác quá trình thuỷ phân, có lớp B metallo-B-lactamase (VIM, IMP và

NDM) [47].

Carbapenemase lớp A có thé thuỷ phân nhiều loại khang sinh chứa vòng lactam như carbapenem, cephalosporin, penicillin và aztreonam nhưng vẫn bị ức chếbởi axit clavulanic Carbapenemase lớp A gồm có một số enzyme như SME (Serratia

B-marcescens enzyme), IMI (imipenemase), NMC-A (non-metallocarbapenemase-A)

(NMC-A), SFC (Serratia fonticola carbapenemase), SHV-38, GES (Guiana extended

spectrum) va KPC (K pneumoniae carbapenemase) Enzyme lớp A có thé do gen trênnhiễm sắc thé mã hóa (như IMI-1, NCM-A, SME, SHV-38, SFC-1) hoặc do gen trên

plasmid mã hóa (như KPC, GES và IMI-2) [48].

Trong nhóm carbapenemase lớp A, KPC là enzyme phổ biến nhất, chỉ sau một

vai năm ké từ khi được phát hiện tại Mỹ (1966), KPC đã lan rộng trên toàn thế giới

và gây ra sự bùng phát dịch ở nhiều quốc gia thuộc Châu Á, Bắc Mỹ, Châu Âu vàChâu Phi Mặc dù KPC chủ yếu được phát hiện trong các chủng K pneumoniae phân

lập từ các trường hợp nhiễm trùng bệnh viện nhưng nó cũng được ghi nhận ở các

chủng vi khuẩn họ đường ruột khác như E coli, Citrobacter, Enterobacter spp vagan đây là Acinobacter spp [49, 50] Tỷ lệ tử vong do nhiễm vi khuan sinh KPC dao

động từ 25% đến 69% [51] Có ít nhất 24 biến thé blaxec đã được ghi nhận trên thé

giới theo dữ liệu ghi nhận từ NCBI Một số dòng ST K pneumoniae mang KPC phổbiến được tìm thấy ở nhiều quốc gia trên thế giới như ST512, một biến thể đơn locus

từ ST258, ST15, ST11 Bên cạnh đó, gen blaxpc được phi nhận trên rất nhiều nhóm

plasmid khác nhau như IncF, InclI2, IncX, IncA/C, IncR, IncL/M, ColE1 [41], trong

đó phổ biến nhất là nhóm IncF/FIIK [52] Plasmid nhóm IncF thường mang thêm một

số gen kháng các loại kháng sinh khác như aminoglycoside, tetracycline, quinolone,

trimethoprim, và sulfonamide [52] Tuy có sự đa dạng trong đặc điểm di truyền nhưng

có một điểm khá đồng nhất ở các dong nỗi trội là bizpc năm trên transposon Tn4407

13

có kích thước khoảng 10kb cùng với gen mã hóa tranposase Tn3 (tnpA), resolvase

Tn3 (tnpR) và hai trình tự chèn ISKpn6 và ISKpn7.

Carbapenemase lớp D là các serine-B-lactamase ít bị ức chế bởi axit

Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) hoặc axit clavulanic, có hoạt tính kháng

carbapenem yếu Carbapenemase lớp D có enzyme OXA (phân lập từA.baumannii đa kháng thuốc vào năm 1985) [53] OXA được quan tâm do có khả năngbiến đôi nhanh và mở rộng phô hoạt động Chúng vốn tồn tại trong các sinh vật không

lên men như A baumannii và P aeruginosa [54], gần đây được phát hiện thường

xuyên ở các tác nhân đa kháng va gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến như E coli,

K pneumoniae và A baumannii [55].

Có hơn 200 biến thé OXA được xác định trong đó 9 biến thé là B-lactamase phé

mở rộng và nhiều biến thể carbapenemase (như OXA-23, OXA-24/40, OXA-48,

51, 58, 134, 143, 211, 213, 214,

OXA-229 va OXA-235) [46].

OXA-23 là enzyme OXA đầu tiên được phân lập từ A baumannii Scotlandvào năm 1985 và gây ra các đợt dịch bùng phát trên thé gidi[56] Các gen bloxa.23

năm trên nhiễm sắc thê hoặc trên plasmid và được liên kết với bốn cấu trúc di truyền

khác nhau, phô biến nhất là transposon Tn2006 [56]

OXA-58 lan dau duoc phát hiện tại Pháp năm 2003 Tai khu vực Dia Trung Hai,

kế từ năm 2009, OXA-58 đã dan thay thế OXA-23 Việc thay thé này có thé được

giải thích bởi lợi thế chọn lọc liên quan đến hoạt động carbapenemase cao hơn củaOXA-23 [57, 58] và/hoặc thu nhận được tính kháng carbapenem thông qua chuyển

gen ngang [58].

Trên thế giới, hiện OXA-48 vẫn là enzyme OXA phổ biến nhất Gen blaoxa-agphát hiện lần đầu ở K pneumoniae tại Thổ Nhĩ Kỳ vào năm 2001, sau đó nhanh chónglan rộng ra toàn thé giới [48] Các enzyme thuộc họ OXA-48 cũng mang các đặctrưng carbapenemase nhóm D là khả năng phân giải carbapenem yếu và không phângiải cephalosporin nhưng khi kết hợp với các cơ chế dé kháng khác lại tăng đáng kéhiệu quả ly giải 2 nhóm kháng sinh này Ví dụ khi một chủng vi khuẩn mang gen

14

blaoxA-as đồng thời với các gen mã hóa ESBL (thường là CTX-M-15 hoặc SHV-12)hoặc những thay đổi về tính thấm của mang sẽ giúp chủng vi khuẩn có kiểu hình

kháng carbapenem rất rõ ràng [59] Gen blaoxa-4s không thuộc một dòng nhất định

mà thường liên kết với transposon Tn/999 hoặc transposon Tn/999.2 [60]

Phần lớn gen blaoxa nằm trên plasmid Các gen thuộc họ blaoxa-23, blaoxa-24/40

và blaoxa-sg có thé nằm trên nhiều loại plasmid khác nhau song gen blaoxa-as lại đượctìm thấy chủ yếu trên một nhóm plasmid có khả năng tự lan truyền (IncL/M), kích

thước khoảng 62kb [59] dù cũng có ghi nhận một vài trường hợp nằm trên plasmid

nhóm IncA/C, IncF [61].

Cabapenemase lớp B chứa một hoặc hai ion kẽm tai vi trí hoạt động nên được

gọi là metallo-B-lactamase (MBL) MBL được chia thành ba phân lớp (BI, B2 và B3)

dựa trên đặc điểm chuỗi axít amin [62]

Các enzyme phân lớp BI và B3 có hai ion kẽm ở vị trí hoạt động và có phô rộng

(penicillin, cephalosporin và carbapenem) Ngược lại, các enzyme phân lớp B2 có

một ion kẽm hoạt động, trong khi liên kết của ion kẽm thứ hai ức chế hoạt động xúctác của chúng [63] Cac enzyme phân lớp B2 có phổ hẹp, bao gồm các carbapenem

ngoại trừ penicillin và cephalosporin.

Carbapenemase lớp B sở hữu khả năng thủy phân tất cả các kháng sinh B-lactam

ngoại trừ monobactam và thường tạo khả năng đề kháng ở mức cao khi kết hợp với

các cơ chế kháng khác như thay đổi tính thấm của màng hay sinh các enzyme ESBL

[52] Sở di có được khả năng này là do carbapenemase nhóm B sử dụng ion Zn?* dé

hoạt hoa và phá vỡ vòng ÿ-lactam Khác với các carbapenemase chứa serine ở vị tri

hoạt động, enzyme nhóm này không tạo thành sản phẩm trung gian enzyme-acyl, màtấn công trực tiếp vào phân tử nước nhờ ion kẽm qua đó phá vỡ liên kết amide củavòng j-lactam Cũng vì lý do này, enzyme nhóm B bị ức chế bởi các chất tác độngđến liên kết giữa ion kim loại và các phân tử khác như axit ethylenediaminetetraacetic(EDTA) và axit dipicolinic [52] Gen mã hóa các enzyme này thường được tìm thấytrên plasmid có thể lan truyền rộng rãi ở P aeruginosa, A baumannii và họ

Enterobacteriaceae [64].

15

Phan lớn các MBL được xác định đến nay thuộc phân lớp BI, phổ biến nhất

trong lâm sàng là IMP (imipenemase) (1990), VIM (Verona Integron-encoded MBL)

(1997) và NDM (New Delhi metallo B-lactamase) (2008) Trong đó, NDM là một

trong số các enzyme carbapenemase phổ biến nhất ở họ Enterobacteriaceae va A

baumannii., được quan tâm hơn hết, dù mới được phát hiện gần đây nhất nhưng đãnhanh chóng lan rộng khắp thế giới với tốc độ không ngừng gia tăng [65]

NDM - carbapenemase lớp B

Lần đầu tiên được xác định ở chủng K pneumoniae phan lập từ một bệnh nhân

Thụy Điển nhập viện ở New Delhi, Ấn Độ, năm 2008 [4], NDM đã nhanh chóng lantruyền đến các lục địa trên thế giới ở hơn 40 quốc gia vào năm 2013 Bên cạnh j-lactam, các chủng mang NDM thường kháng với hầu hết các kháng sinh khác do có

Sự cùng tồn tại của các cơ chế kháng thuốc khác nhau [66]

Về cơ chế hoạt động, NDM tương tác với cơ chất thông qua các ion kẽm liên kết

trong vi trí hoạt động [67] Các ion kẽm cũng kích hoạt một phân tử nước cho đi một

proton dé tạo nhóm hydroxide thủy phân vòng B-lactam bang cách lấy đi nguyên tửcarbon của nhóm carbonyl B-lactam Dang chú ý, sự định vị trong tế bào của NDMkhác với tất cả các MBL khác: NDM là một lipoprotein neo vào màng ngoài ở vikhuẩn Gram âm, giúp lipid hóa chuỗi axít amin ở cuối peptide tín hiệu của NDM,ngược lại, tất cả các MBL khác bản chất lại là các protein periplasmic hòa tan [67]

Việc neo trên màng giúp tăng cường đáng ké sự 6n định của NDM trong điều kiện

thiếu kẽm, thường xảy ra tại vị trí nhiễm trùng khi một lượng lớn calprotectin protein

chelating kim loại được giải phóng như là một phản ứng miễn dich của vật chủ Việc

neo màng cũng tạo điều kiện cho việc tiết enzyme này trong các túi màng ngoài (Outermembrane visicle-OMV) OMV chứa NDM có thé bảo vệ các quan thé vi khuẩn lâncận khỏi tác động của B-lactam và OMV có thé mang cả NDM và gen mã hóa cho

NDM là blanp [68].

1.3 Đặc điểm di truyền gen kháng carbapenem blaypm

1.3.1 Đặc điểm gen blaxpm

16

Gen blaxpm mã hóa enzyme NDM, gồm 270 axit amin, chứa hai ion kẽm tại

vị trí hoạt động, nơi diễn ra quá trình thủy phân B-lactam Cấu trúc thứ cấp của enzymeNDM mang 9 ơ-helix, 17 B-strand và 3 turn Sự thay thé axít amin đã được ghi nhận

tại 17 trong số 270 axít amin, tạo ra 28 biến thể NDM khác nhau Sự thay thế M154L

là phô biến nhất và được quan sát thay ở 12 trong số 28 biến the NDM khác nhau

[69].

Các biến thể NDMĐến nay có ít nhất 24 biến thể gen blanpm đã được xác định, một số biến thé

được chứng minh tăng cường hoạt động của carbapenemase [12] Các biến the NDMđược ghi nhận khi có từ 1 đột biến axít amin trở lên Một trong những đột biến đượcnghiên cứu nhiều gần đây là đột biến M154L ở NDM-4 Đột biến thay thế M154Lđược xác định làm tăng tính ôn định của các biến thé NDM thông qua tối ưu hóa đónggói chuỗi bên ky nước [70] Đột biến này có thể đóng vai trò ức chế sơ cấp từ đó đưa

vào các đột biến khác, dẫn đến mắt ôn định cấu trúc của phân tử Cấu trúc của các

biến thé NDM bị xáo trộn tại tâm hoạt động có thé thay đổi ái lực của kẽm dẫn đếnviệc gia tăng tinh kháng Tắt cả các biến thé từ NDM-2 đến NDM-17 (ngoại trừ NDM-1) đã được chứng minh tăng ái lực với kẽm Tuy sự thay thế axít amin chưa được ghinhận ở vị trí hoạt động của các biến thể NDM nhưng một số biến thể đã được ghinhận thay đồi hoạt tính với B—lactam Các biến thé này không thay đổi hoạt tính khi

được thử nghiệm trong điều kiện đồi dào kẽm [71] Tuy nhiên, dưới điều kiện thiếu

kẽm, NDM-4 (M154L), NDM-6 (A233V) và NDM-9 (E152K) được ghi nhận tang

đề kháng với cefotaxime nhờ tăng ái lực với kim loại (M154L) hoặc tăng độ ôn định

của enzym NDM (A233V và E152K) NDM-3 (D95N) và NDM-14 (D130G) cũng

được ghi nhận tăng đề kháng cefotaxime trong điều kiện thiếu kẽm, nhưng cơ chếchưa rõ Hoạt tính của các biến thé NDM 16 (R264H), NDM-11 (M154V) và NDM-

2 (P28A) không thay đồi trong điều kiện thiếu kẽm NDM-1 được cho là đã biến đổithành các biến thể khác nhau trong điều kiện thiếu kẽm [68]

Ngoài ra, các biến thé NDM-5, -17, -20, -21 và -24 có chứa đột biến thay théV88L cũng đã được ghi nhận gia tăng hoạt tính carbapenemase Nong độ ức chế tối

17

thiểu (MIC) đối với ertapenem ở chủng mang NDM-5 và NDM-20 được ghi nhậngap 4-8 lần so với NDM-1 Hoạt tính carbapenemase của NDM-17 và NDM-21 tương

tự như NDM-5 [72-74] Điều này cho thấy đột biến tại vị trí không hoạt động cũng

có thể có tác động đến hoạt tính của enzym Mặc dù biến thé NDM-4 (M154L) và

NDM-14 (D130G) có hoạt tính carbapenemase tăng nhưng M154L và D130G được

tìm thấy trong NDM-8 không ghi nhận thay đổi hoạt tính carbapenemase [75]

Đề tìm hiểu vai trò của một số đột biến, các đột biến nhân tạo đã được các

nhóm nghiên cứu tạo ra: đột biến thay thế S191A/E152A tại vòng linh hoạt (flexibleloop) ở NDM-7 cho thấy các đột biến này đóng vai trò quan trọng trong việc khángB-lactam và thủy phân kháng sinh Đột biến kép của NDM-7 (E152A và S191A) cho

thấy tính nhạy cảm được tăng lên so với đột biến đơn (E152A/S191A), xác nhận vai

trò hiệp đồng của cả hai axít amin này trong hoạt động của enzym Đột biến E152A

ở vòng omega (omega loop) ở NDM-5 làm vi khuẩn mẫn cảm hơn với penicillin,cephalosporin và carbapenem Qua đó xác nhận E152 đóng vai trò quan trọng đề

kháng ÿlactam [76] Nhìn chung, trong điều kiện thiếu kẽm, các biến the NDM5,

-7, -12, -13,-15, -16 cho kiểu hình kháng carbapenem mạnh nhất, tiếp đến là các biến

Hình 1.3 Minh hoa kiểu hình kháng carbapenem của các biến thể NDM [69]

Các biến thể NDM thường chứa từ một đến năm đột biến thay thế axít amin

so với NDM-1 NDM-18 là một ngoại lệ ở chỗ nó giống hệt với NDM-1, ngoại trừ

18

lặp lại 5 axít amin (QRFGD) tại vị trí 44 đến 48 trên NDM-1 (Hình 1.4) Tuy không

có đột biến thay thế axít amin nào được tìm thấy tại vị trí hoạt động của enzyme

nhưng một số biến thé đã được báo cáo thay đổi hoạt tính kháng B-lactam

Signal peptide Lipidation box BI B2 ao

Hình 1.4 Trinh tự axit amin NDM-1 và các biến thé NDMCác biến thé NDM được ghi chú trong dấu ngoặc đơn tại các vi trí thay thé axit

amin Chuỗi peptide tín hiệu của NDM-1 được đóng khung đỏ; a-helix, B-strand va các turn được chú thích lần lượt bởi các đường xoắn ốc màu đen, xanh và cam Các

axit amin tại các vi trí hoạt động của NDM-1 được tô đậm và các axít amin liên kết

kẽm được tô màu vàng Hộp được tô màu xanh lá cây là vi trí lipid hóa [12].

1.3.2 Đặc điểm các plasmid mang blaxpm

Mặc dù blaxpm được tim thay trên nhiễm sắc thé vi khuẩn nhưng phần lớn vẫn

năm trên plasmid, có vai trò quan trọng trong việc lan truyền [77-79] Gen blanpm đã

được tìm thấy trên nhiều loại plasmid khác nhau Có tổng số 355 plasmid mang

blanpw với trình tự hoàn chỉnh hiện có trên GenBank (tháng 1/2018) [80] Tuy nhiên,

19

theo số liệu ghi nhận trên Genbank tháng 8/2022, số lượng trình tự plasmid hoàn

chỉnh mang blanpm đã là 14.112.

Có ít nhất 20 loại plasmid mang blanpm ở Enterobacteriaceae, bao gồm IncC,

IncB/O/K/Z, IncFIA, IncFIB, IncFIC, IncFTIII, IncHI1, IncHI2, IncHI3, IncN3, IncHI,

Inc , IncT, IncX1, IncX3, IncX4, IncY va ColE10 (33, 82 va 85-104) Diéu nay chothay nhiều loại plasmid khác nhau có thé thu nhận blanpm Sự phân bố toàn cầu củacác loại plasmid mang blanpm được thé hiện trong hình 1.5

Af

oF

si

IncC, IncUM, IncX 4

— Ấy, NCC INCFIA, Incfl8,

` IneFlL IneR, IncX: >

IncC,IncFIA, ncf l8, ⁄ bịDcDK-HIÏ EeR, 2m ince, incri

chức: IncFIA, lacFI8, IncF II, Inc g s IncfA, IncF I8, IncFIl

‡ 3

IncflA, IncF I8, IncFII va

tá IncFl8, IncFlB, IncHI18, IncFlI, IncX3 3

IncX3, IncƯM,

Hình 1.5 Sự phan bố blaypm theo nhóm plasmid 6 Enterobacteriaceae [12]

Sự lưu hành các nhóm plasmid mang blanpm khác nhau tùy Châu luc Tại

Đông A, IncX3 được ghi nhận là loại plasmid mang blanpm phố biến nhất, chiếm

khoảng 1/3 plasmid mang có trên GenBank (2019) Cac plasmid IncX3 là các plasmid

có phố vật chủ hẹp và đến nay chỉ tìm được thay ở Enterobacteriaceae Hầu hết các

plasmid IncX3 trong GenBank (67/117; 57,3%) tìm thay ở E coli, tiếp theo là K.

pneumoniae (20/117; 17,1%) Plasmid IncX3 mang blanpw tuy cũng được tìm thay ởchâu Au và Bắc Mỹ, nhưng hau hết (80/117; 68,4%) được phân lập ở Trung Quốc và

các nước láng giéng, nhu Han Quéc (n=7), Việt Nam (n=2) và Myanmar (n=3) Do

ty lệ lưu hành cao, plasmid IncX3 được nghi van là phương tiện chính trong việc lantruyền blanp ở Đông A, đặc biệt là ở Trung Quốc Các biến thé của blanpm, bao gồm

20

blaxpm-1, blanpm-4, blanpm-s, blanpm-6, ĐÍANDM-7, blanpm-13, blanpM-17, blanpM-19,

blaxpm-19, blanpm-19 cũng đều đã được tìm thay trên các plasmid IncX3 Điều này

nhấn mạnh rang plasmid IncX3 có thé đóng vai trò là một khuôn từ đó b/anpw tiễn

hóa tạo ra các biến thể NDM mới

Một loại plasmid mang blanpm phổ biến khác là IncC (còn gọi là IncA/C2).Các plasmid IncC mang blanpm phân bố trên toàn thé giới và được tìm thấy trên tat

cả các châu lục ngoại trừ Nam Cực IncA/C có phô vật chủ rộng và các plasmid IncCmang bizwpw đã được tìm thấy ở Morganellaceae và Vibrionaceae cùng vớiEnterobacteriaceae Hầu như tất cả các plasmid IncC mang biznpw đều thuộc về ST1(39/53) hoặc ST3 Bên cạnh đó, IncF cũng là nhóm plasmid được ghi nhận nhiều ởChau A Ngoài ra, Incl được ghi nhận nhiều ở Châu Au [23]

1.3.3 Cấu trúc di truyền vùng mang gen blanpm và các yếu tố chuyền vị

Các yêu tô chuyên vị hay yếu tố di truyền di động như trình tự chèn IS,

transposon, integron và dao kháng kháng sinh có thé dịch chuyên các gen kháng

kháng sinh Sự dịch chuyên này có thé là giữa các plasmid khác nhau hay giữa cácplasmid và nhiễm sắc thé Gen blaxpm đã được tìm thấy trong một loạt các bối cảnh

di truyền, điều này cho thấy rằng nhiều cơ chế đã được tham gia vào việc dịch chuyền

phosphoribosylanthranilate isomerase), dsbC (còn được gọi là tat, mã hóa protein

chuỗi tín hiệu dẫn truyền chuyền vi twin-arginine), cutA/ (còn được gọi là dct, ma

hóa protein dung nap cation hóa tri hai periplasmic) va groes-groEL (ma hóa

chaperonin) va trình tự chèn ISCR27 ISAba125 chứa ving trình tự -35 của promoter

biểu hiện blanp-1 [81] Bên cạnh đó, được ghi nhận từ rat sớm ở Acinetobacter, mộttrình tự ISAbz125 thứ 2 cũng đã được tìm thấy năm sau ISCR27; hai phan tửISAba125 này tạo thành một transposon tổng hợp mang blanpm-1 kinh điển, được gọi

21

là Tn/25 (Hình 1.5A) Các thành phan di truyền trong Tn/25 có nguồn gốc khác nhau

và vùng groES-groEL-ISCR27 được cho là bắt nguồn từ Xanthomonas spp [82]

Nhìn chung, ở hầu hết các plasmid mang biznpw, gen blanpm thường có hai

ban sao của trình tự chèn (ví dụ: ISAba725, IS26 và IS3000, ) tạo ra các transposon

tong hợp mang blanp [80] Các integron lớp 1 được tìm thấy có liên kết với ISCR/(vùng chung trình tự chèn 1 - Insertion sequence common region 1) bao gồm một bảnsao của ISCR/, một vùng biến đổi (VR-Variable region) mang các gen kháng thuốc

và bản sao của đầu 3’ bảo tồn (CS-Conserved Sequence) của integron lớp 1 dé tạo ra

các yếu tô di truyền lớn hay còn được gọi là phức hợp integron lớp 1" [83] Một sốbáo cáo cho thấy blanpm-1 cũng được chèn vào vùng biến đổi của integron lớp 1 đượcliên kết với ISCRI [84] [85], cho thay sự lan truyền blanpw-1 rất có thé liên quan đếnISCR! cũng như các transposon tông hợp

Nguồn gốc chính xác của blanpm-1 vẫn chưa được biết rõ Việc nghiên cứu can

thận bối cảnh di truyền và trình tự của blanpm-1 cho thấy blanpm-1 là một gen khảm

(chimeric) Trình tự 19 bp đầu tiên của chuỗi nucleotide (mã hóa 6 axít amin đầu tiêncủa NDM-1) có nguồn gốc từ một gen aphA6 kháng aminoglycoside Trinh tựnucleotide còn lại bắt nguồn từ gen mbl đến nay chưa được xác định Vì ISAba1T25

và aphA6 phô biến rộng rãi ở Acinetobacter spp., rat có khả năng sự hợp nhất các gen

tạo thành blanp-1 Xảy ra ở Acinetobacter.

Các yếu tố ISCR có khả năng thu nhận và tích lũy các thành phần di truyền

thông qua cơ chế rolling-circle [86] Là một yếu tố di truyền động, ISCR27 ban đầu

có thé đã thu được gen tiền thân của blanpm-1 và chuyển vị gen cùng với bleusz, frpF,

dsbC, cutAl và groes-groEL vào aphA6 (vùng phía dưới của một bản sao ISAba125),

cho phép hợp nhất và hình thành blanpm-1 [82] Bản sao thứ hai của ISAba125 sau đóđược chèn xuống phía dưới của ISCR27 dé tạo thành transposon tổng hợp Tn/25 dựa

trên ISAba125 [82].

22

B

IS26-formed composite transposon

e.g PNDM4_WCHEC, accession.

IS3000-formed composite transposon

e.g pEh1A, accession KR822246

Hình 1.6 Ví dụ về các cầu trúc di truyền và cơ chê chuyên vi của blanpm

(A) Tn725 được hình thành bởi hai bản sao ISAba725 (B) Transposon tổnghợp được hình thành bởi hai bản sao IS26 (C) Transposon tông hợp được hình thành

bởi hai bản sao I§S903 (D) Yếu tố được hình thành bởi hai bản sao TIME (E)

Transposon tổng hợp được hình thành bởi hai ban sao IS3000 (F) Bối cảnh di truyền

có chứa ISCR! Yếu tố này cũng được kẹp giữa bởi hai bản sao IS26 Các tên plasmid

và số đăng ký GenBank được hiển thi A biéu thị các gen hoặc các yếu tố di động bịcắt ngắn Do bản tính di động cao, blanpm cũng có thé bị mắt bởi các tế bào vi khuẩn.Việc biến mat có thé là do mat các đoạn DNA do trình tự chèn va chuyển VỊ, chănghạn như tái tổ hợp hoặc mất hoàn toàn các plasmid mang blanpm [80]

Acinetobacter spp dong vai trò là vật trung gian đưa blanpm vao

Enterobacteriaceae [82] Yếu tô mang blanpm.1 Tn/25 đã bị gián đoạn hoặc cắt ngắntrong Emterobacteriaceae để tao ra một loạt các cấu trúc di truyền đa dạng của ĐÌ2NDM

23

Sự gián đoạn này phan lớn là do chèn nhiều yếu tố di truyền khác như IS7, IS5, IS26,1S903, ISEc33, ISKpn14, và tái tổ hợp.

Các trình tự nằm ở 2 đầu (flanking) của các trình tự Tn725 cũng đã hình thành

các cơ chế liên quan đến việc di chuyển blanpm.1 Các cơ chế này bao gồm một số

transposon tổng hợp được hình thành bởi hai bản sao của cùng một trình tự chèn,chăng hạn như IS26, IS90 và IS3000 (còn được gọi là Tn3000) Sự sao chép cuablaxp trên cùng một plasmid là do hoạt động của một transposon tông hợp tạo bởiIS26 Ngoài ra, việc di chuyển bawpw có thé nhờ liên kết với một yếu tố ISCR khác

như ISCR7 (Hình 1.6).

1.4 Đặc trưng hóa chủng mang gen bizxpw bang phân tích tổ hợp trình tự đa

allele (Multi-locus sequence typing)

1.4.1 Dinh nghĩa dòng sequence type (dòng ST) và phương pháp phân tích tổ

hợp trình tự đa allele (MLST- Multi-Locus Sequence Typing)

Quy trình chung dé xác định một dòng vi khuan (đôi khi còn được gọi là định

danh) là phân tích trình tự DNA đặc trưng của một tập hợp các gen giữ nhà Tùy loài

vi khuẩn, có 6-8 gen giữ nhà được chọn dé phân tích Mỗi trình tự gen giữ nha sẽđược giải mã, so sánh và xác định bằng các chữ số tương ứng với các allele đã biết

Tập hợp các allele khác nhau được quy định bằng các kiểu trình tự khác nhau

(sequence type — ST) Tap hợp các chủng có cùng ST được gọi là dòng ST [87].

Phương pháp phân tích tô hợp trình tự đa allele (MLST) là phương pháp xácđịnh dòng ST của vi khuẩn dựa trên việc giải trình tự các gen giữ nhà và phân loạichúng theo tổ hop các allele tương ứng dựa trên cơ sở dit liệu đã biết [87]

Ưu điểm của kỹ thuật MLST là dễ thực hiện, kiểu trình tự của allele được biểu

diễn bang con số nên dé dang so sánh kết quả Ngoài ra, MLST còn cho biết trình tự

DNA cụ thể của mỗi allele, cho phép so sánh dé dàng với các cơ sở dữ liệu hiện hành.Trình tự allele thu được bằng cách khuếch đại PCR từ mẫu lâm sàng, nên vẫn có thểtiễn hành định danh chủng một cách chính xác, ngay cả khi không thé nuôi cấy phân

lập [87].

24