sàng lọc thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa ức chế acetylcholinesterase của lá cây hồng trà long camellia longii orel luu

Vì vậy, việc nghiên cứu về loài C.longii là rất cần thiết, không chỉ cung cấp các cơ sở dữ liệu ban đầu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học C.longii mà còn góp phần minh chứng

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

SÀNG LỌC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA, ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE

CỦA LÁ CÂY HỒNG TRÀ LONG (CAMELLIA LONGII OREL & LUU)

S K L 0 1 1 8 5 3

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2023

GVHD: PGS.TS PHAN THỊ ANH ĐÀO SVTH: TRẦN THANH HUY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SVTH: Trần Thanh Huy MSSV: 19128002

(CAMELLIA LONGII OREL & LUU)

GVHD: PGS TS Phan Thị Anh Đào

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em được vào các phòng thí nghiệm của Khoa và hỗ trợ em trong việc sử dụng thiết bị, dụng cụ tại các phòng thí nghiệm

Đặc biệt, em xin chân thành gửi đến lời cảm ơn đến 2 giảng viên hướng dẫn của mình

là PGS.TS Phan Thị Anh Đào, giảng viên Bộ môn Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm – trường ĐH Sư Phạm Kỹ Thuật Tp.HCM và Thạc

sĩ Lý Hải Triều- Trung tâm Sâm dược liệu thành phố Hồ Chí Minh Những hướng dẫn

và sự khích lệ từ cô Đào, thực sự là động lực giúp em vượt qua những khó khăn trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè xung quanh những người đã giúp đỡ, động viên, tiếp thêm động lực và ủng hộ em trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài

Em mong muốn nhận được sự góp ý và sửa chữa từ quý Thầy Cô để hoàn thiện chất lượng của luận văn một cách tốt nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

Em tên Trần Thanh Huy là sinh viên chuyên ngành Công nghệ kỹ thuật hoá hữu cơ Em xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong bài khóa luận tốt nghiệp này là của riêng bản thân em, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của cô PGS.TS Phan Thị Anh Đào và Ths Lý Hải Triều

Các thông tin trích dẫn trong bài đều được tham khảo từ những nguồn tin đáng tin cậy,

đã được công bố rộng rãi Các tài liệu tham khảo được trích dẫn đầy đủ và tự động bằng phần mềm Zotero Em xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo quy định

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT viii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN x

MỞ ĐẦU xi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về chi Camellia 1

1.1.1 Phân loại khoa học 1

1.1.2 Mô tả thực vật chi Camellia 1

1.1.3 Phân bố chi Camellia tại Việt Nam 2

1.2 Giới thiệu về loài Hồng trà long (Camellia longii Orel & Luu) 3

1.2.1 Mô tả thực vật C.longii 3

1.2.2 Phân bố của C longii 3

1.3 Thành phần hóa học của chi Camellia 4

1.3.1 Polyphenol 5

1.3.2 Anthocyanin 7

1.3.3 Triterpenoid và phytosterol 8

1.3.4 Polyglycoside 9

1.3.5 Saponin 10

1.3.6 Vitamin và acid amine 10

1.3.7 Nhóm tinh dầu 12

1.4 Hoạt tính sinh học chi Camellia 12

1.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa 13

1.4.2 Hoạt tính ức chế AChE 14

1.5 Vấn đề tồn tại và định hướng nghiên cứu 15

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu-Hóa chất-Thiết bị 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Hóa chất 17

2.1.3 Thiết bị sử dụng 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Điều chế cao trích và xác định hiệu suất trích ly 21

2.3.2 Định tính nhóm chức bằng phổ hồng ngoại ( FT-IR ) 23

2.3.3 Định tính nhóm chức bằng phản ứng hoá học 23

2.3.4 Phân tích thành phần hoá học bằng LC-MS 25

2.3.5 Phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol, flavonoid, saponin 26

2.3.6 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa 31

2.3.7 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế AChE 35

2.4 Xử lý kết quả: 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 Kết quả điều chế cao trích 38

3.2 Định tính nhóm chức 39

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng 39

3.2.2 Định tính bằng FT-IR 40

3.3 Thành phần hóa học: 42

3.3.1 Xác định thành phần hóa học bằng LC-MS 42

3.3.2 Tổng hàm lượng polyphenol (TPC) 49

3.3.3 Tổng hàm lượng flavonoid (TFC) 50

3.3.4 Tổng hàm lượng saponin ( TSC) 51

3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học 52

3.4.1: Khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp năng lực khử sắt (FRAP ) 52

3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa bằng phản ứng ức chế gốc tự do ( DPPH) 55

3.4.3 Phân tích về tương quan thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa 58

3.4.4 Hoạt tính ức chế AChE trên cao CLL-Ew 59

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ ĐỀ TÀI 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC : 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Một số loại trà thuộc chi Camellia Việt Nam 2

Bảng 1 2: Phân loại khoa học của loài C longii 4

Bảng 1 3 : Các hợp chất polyphenol được phân lập từ một số loài cây trà Camellia 5

Bảng 1 4: Hoạt tính sinh học của một số loài trà Camellia 13

Bảng 2 1: Hóa chất sử dụng……… 17

Bảng 2 2: Các thiết bị sử dụng 18

Bảng 2 3: Mã hóa các mẫu cao lá Camellia longii 21

Bảng 2 4: Phương pháp định tính nhóm chức 24

Bảng 2 5: Chương tình pha động 25

Bảng 2 6 : Giá trị cài đặt các thông số MS 26

Bảng 3.1: Hiệu suất trích ly và độ ẩm của cao trích lá C longii………38

Bảng 3 2: Kết quả định tính nhóm chức bằng phản ứng hóa học đặc trưng 39

Bảng 3 3: Số sóng của các đỉnh hấp thu trong phổ FT-IR 5 mẫu cao lá C longii 40

Bảng 3 4: Các hợp chất được dự đoán dựa trên phổ LC-MS của mẫu cao lá 43

Bảng 3 5: Giá trị độ hấp thu quang của mẫu Vitamin C và 5 mẫu cao trích 53

Bảng 3 6: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C và 4 mẫu cao trích 55

Bảng 3.7: Ý nghĩa của hệ số tương quan Pearson 58

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1: Hình dạng chóp lá 2

Hình 1 2: Hình dạng gốc lá 2

Hình 1 3: C longii ở VQG Bù Gia Mập- Bình Phước 3

Hình 1 4: Một số hợp chất thuộc nhóm polyphenol trích xuất từ chi Camellia 6

Hình 1 5: Một số hợp chất nhóm catechine trích xuất từ chi Camellia 7

Hình 1 6: Một số hợp chất anthocyanin trích xuất từ hoa trà đỏ (Benibana-cha) 8

Hình 1 7: Các nhóm triterpenoid và phytosterol từ C niprisssima, C euphlebia 9

Hình 1 8: Một số hợp chất thuộc nhóm polyglycoside trích xuất từ chi Camellia .10

Hình 1 9: Cấu trúc của các hợp chất acid amine được phân lập từ chi Camellia 11

Hình 1 10: Cấu trúc của các hợp chất acid amine được phân lập từ chi Camellia 11

Hình 1 11: Một số tinh dầu trích xuất từ lá trà và hoa hoa vàng C nitidissima 12

Hình 2 1:Sơ đồ nghiên cứu 20

Hình 2 2: Qui trình điều chế cao chiết 22

Hình 2 3: Sơ đồ quy trình xác định tổng hàm lượng polyphenol (TPC) .27

Hình 2 4: Sơ đồ quy trình xác định hàm lượng tổng flavonoid (TFC) 29

Hình 2 5: Sơ đồ quy trình xác định tổng hàm lượng saponin (TSC) .31

Hình 2 6: Sơ đồ quy trình xác định khả năng khử sắt của mẫu cao trích 32

Hình 2 7: Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 34

Hình 2 8: Quy trình thử nghiệm ức chế AchE 36

Hình 3 1: Đồ thị phổ FT-IR của 5 mẫu cao chiết……… 42

Hình 3 3: Một số hợp chất điển hình trong lá C longii 49

Hình 3 4: Đồ thị so sánh tổng hàm lượng polyphenol của 5 mẫu cao lá C longii 49

Hình 3.5: Đồ thị so sánh tổng hàm lượng flavonoid của 5 mẫu cao lá C.longii 51

Hình 3 6: Đồ thị so sánh tổng hàm lượng saponin của 5 mẫu cao lá C longii 52

Hình 3.7: Đồ thị khảo sát ức chế AChE của mẫu cao tổng donepezil (A) và CLL-Ew (B) 59

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

cao tổng

DTNB 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) -

DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl -

EC50 Effective concentration Nồng độ mẫu đạt độ hấp thu

IC50 The half maximal inhibitory

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Mẫu lá Hồng trà Long (Camellia longii Orel & Luu) được thu thập từ VQG Bù Gia

Mập -Bình Phước Nguyên liệu thô sau khi thu nhận, được xử lý và tiến hành điều chế

cao trích bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi ethanol 70% (v/v) Từ cao thô tiến hành chiết lỏng-lỏng phân đoạn lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexane, ethyl acetate, n-butanol

Khảo sát thành phần hóa học bằng phương pháp phổ hồng ngoại FT-IR, các phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) đã tìm thấy các hợp chất:

epicatechine gallate (ECG) 17,12%, β-sitosterol 15,79%, tryptopan (Trp) 13,73%,

isovitexin 12,91%, olibanumol L 9,04%, acid gallic 3,26%, quercetin 3,06%, acid ellagic 2,37%, phloroglucinol 0,98% là những thành phần chính thuộc nhóm: polyphenol, flavonoid, saponin, acid amine, triterpenoid và phytosterol

Kết quả thực nghiệm, cho thấy cao chiết thô (CLL-Ew) chiếm tổng chiếm polyphenol

và saponin cao nhất lần lượt là 132,61 mg GAE/g DW và 471,32 mg OAE/g DW Tổng

hàm lượng flavonoid cao nhất ở mẫu cao butanol (CLL-B) với 131,44 mg CE/g DW

Các hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu cao lá được đánh giá bằng các thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH và năng lực khử FRAP Giá trị IC50 thay đổi từ 2,09 µg/mL – 6,43 µg/mL đối với DPPH và EC50 thay đổi từ 10,16 µg/mL – 34,64 µg/mL đối với FRAP

Cả phương pháp đều cho thấy mẫu CLL-B (EC50 = 10,16 µg/mL, IC50 = 2,09 µg/mL)

thể hiện các hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong 5 mẫu cao lá C.longii và tác dụng

tương đương với Vitamin C, tiếp đến là CLL-Ew với (EC50 = 12,65 µg/mL, IC50=3,07 µg/mL), CLL-Ea, CLL-W, CLL-H

Dựa trên kết quả sàng lọc, chọn mẫu cao tổng (CLL-Ew) tiến hành thử nghiệm đo khả năng ức chế acetylcholinesterase (AChE) Kết quả thực nghiệm cho thấy, CLL-Ew có

khả năng ức chế AChE in vitro (IC50 = 330,88 µg/mL)

Tóm lại, từ kết quả thực nghiệm có thể kết luận loài Camellia longii Orel & Luu là

nguồn dược liệu tốt, có tiềm năng trong việc ứng dụng vào các lĩnh vực dược-mỹ phẩm

MỞ ĐẦU

Chi trà (Camellia) tại VQG Bù Gia Mập sinh trưởng ở địa hình khu vực có khí hậu

chuyển tiếp từ cao nguyên xuống Đông Nam Bộ [1] Trong những loài thực vật đặc hữu

tại VQG Bù Gia Mập, Camellia longii Orel & Luu với tên gọi là Hồng trà long, trà hoa

đỏ, thuộc chi Camellia Cho đến nay, chưa có công bố về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của loài này Một số nghiên cứu đã chỉ ra những lợi ích sức khỏe và tiềm

năng chữa bệnh của chi trà Camellia Trong đó, việc sử dụng trà thường xuyên có thể

giúp con người chống lại lão hóa và đặc biệt là chức năng giảm cholesterol, bảo vệ tế

bào thần kinh [2] Các loài thuộc chi Camellia chứa thành phần hóa thực vật đa dạng

như: polyphenol, flavonoid, polysaccharide, acid amine, caffeine và vitamin Trong đó, đặc biệt là polyphenol và flavonoid là những thành phần hoạt chất chính, có tác dụng ức chế acetyl cholinestase (AChE) vượt trội Theo báo cáo nghiên cứu bệnh Alzheimer năm

2020, chỉ ra mối tương quan đáng kể giữa sự hiện diện của chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholine với sự tiến triển của bệnh Alzheimer [3] Sự ức chế của hoạt động của AChE là một trong những phương pháp làm giảm bớt bệnh Alzheimer Đây là

một trong những chức năng quan trọng góp phần đưa chi Camellia vào nhóm thảo dược

tiềm năng trong việc xây dựng dược phẩm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer

Vì vậy, việc nghiên cứu về loài C.longii là rất cần thiết, không chỉ cung cấp các cơ sở

dữ liệu ban đầu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học C.longii mà còn góp phần

minh chứng giá trị dược liệu, hỗ trợ công tác bảo tồn loài Hồng trà Long tại VQG Bù

Gia Mập-Bình Phước

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận :

- Khảo sát thành phần hóa học của 5 mẫu cao trích bằng phản ứng định tính nhóm chức, phương pháp đo phổ hồng ngoại FT-IR, sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu

dò khối phổ MS- ESI (HPLC-ESI-MS)

- Định lượng tổng hàm lượng polyphenol (TPC), tổng hàm lượng flavonoid (TFC), tổng hàm lượng saponin (TSC) có trong 5 mẫu cao chiết

- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp xác định năng lực khử sắt, khả năng ức chế gốc tự do DPPH

- Từ mối tương quan giữa thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cao lá

C.longii, chọn ra mẫu cao để thử hoạt tính mạnh để đánh giá khả năng ức chế AchE

Đối tượng nghiên cứu: Trà hoa đỏ Camellia longii Orel & Luu được thu từ VQG Bù

Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước (9/2022)

Phạm vi nghiên cứu: Sàng lọc thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, ức

chếAchE in vitro của lá cây Hồng trà Long (Camellia longii Orel & Luu)

Điểm mới của đề tài:

Đây là bài nghiên cứu ban đầu về khảo sát thành phần hóa học và xác định hoạt tính

chống oxy hóa và khả năng ức chế AChE của lá Camellia longii Orel & Luu

Nghiên cứu trình bày các kết quả nhằm cung cấp những hiểu biết sơ bộ về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học, làm cơ sở cho việc nghiên cứu các Camellia longii Orel

& Luu ở VQG Bù Gia Mập nói riêng, Việt Nam nói chung

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả là cơ sở khoa học, minh chứng về dược tính mẫu cao lá C.longii, định hướng

phát triển dược phẩm hỗ trợ điều trị Alzheimer

Từ cơ sở nghiên cứu, có thể phát triển những nghiên cứu chuyên sâu hơn để đưa những

hoạt chất tiềm năng từ mẫu lá C longii vào ứng dụng trong ngành dược- mỹ phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Camellia

1.1.1 Phân loại khoa học

Chi Camellia thuộc họ chè (Theaceae) là một trong những họ thực vật truyền thống và

nổi tiếng nhất ở châu Á với nhiều công dụng cho lợi ích sức khỏe con người Trên thế

giới có khoảng gần 500 loài thuộc 18 chi khác nhau, trong đó chi trà Camellia có khoảng 120-300 loài [4] Ở Việt Nam, trà Camellia trồng và mọc hoang ngoài tự nhiên trải dài

từ Bắc vào Nam với khoảng 58 loài được ghi nhận [4] Sự phong phú và giá trị kinh tế mang lại đã thúc đẩy sự quan tâm đến các đặc tính sinh học của chi thực vật này

Hiện nay, khá nhiều nghiên cứu tìm hiểu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh

học của các loài thuộc chi Camellia Ở nước ta, VQG Bù Gia Mập được coi là địa hình khu vực đại diện cho vùng khí hậu chuyển tiếp từ cao nguyên xuống Đông Nam Bộ [1]

Vì thế, thực vật nói chung và chi Camellia nói riêng ở đây rất đặc thù, mang nhiều thành

phần dược tính có trong nhóm thực vật chuyển hóa thứ cấp khá cao so với các loài cùng chi

1.1.2 Mô tả thực vật chi Camellia

Cây bụi hoặc cây nhỏ thường xanh với lá thường có cuống đơn, mọc cách không có lá kèm, kích thước là thay đổi, dài từ vài cm đến 45 cm Hình thái gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép lá có răng cưa nhọn hay tù Hoa lưỡng tính với kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn hoặc mọc tập trung 2-5 hoa Hoa có màu đỏ, trắng hoặc vàng; cuống hoa ngắn hoặc có thể không có

Lá bắc từ 2-10, mọc xoắn trên cuống hoa, lá đài 5-5 phiến Quả nang hình cầu, hình cầu dẹt hay hình trứng, khi khô, chẻ ô từ trên xuống thành 3-5 mảnh, có thể có hoặc không

có trụ quả Hạt thường có dạng hình cầu, nửa cầu hay hình nêm với vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt hoặc nâu hồng, hạt nhẵn hoặc phủ lông [1] Hình 1.1 và 1.2 bên dưới mô tả

hình dạng lá Camellia được trích dẫn từ tài liệu [1]

Hình 1 1: Hình dạng chóp lá

A: Gốc lá hình nêm; B: Gốc lá tròn; C: Gốc lá hình tim có tai

Hình 1 2: Hình dạng gốc lá 1.1.3 Phân bố chi Camellia tại Việt Nam

Theo dữ liệu nghiên cứu thực vật học, hiện tại giống trà Camellia phân bố đa dạng ở

Việt Nam trải dài khắp lãnh thổ nước ta từ bắc xuống nam Bảng 1.1 bên dưới mô tả

phạm vi phân bố một số loài thuộc chi Camellia ở Việt Nam

Bảng 1 1: Một số loại trà thuộc chi Camellia Việt Nam

1 Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen

2 C luteopallida Luong, T.Q.T.Nguyen Lạng Sơn [5]

3 Camellia Luongii Tran et Li Thái Nguyên [5]

4 Camellia hamyenensis M.Sealy Hàm Yên, Tuyên Quang [5]

5 C cucphuongensis Ninh Rosmann Ninh Bình [6]

6 Camellia quephongensis Hakoda et

7 C caudate Wallich VQG Tam Đảo [8]

STT Tên khoa học Phân bố TLTK

8 C bugiamapensis Orel, Curry, Luu &

Q.D

VQG Bù Gia Mập, Bình Phước

[9]

9 C capitata Orel VQG Cát Tiên [10]

1.2 Giới thiệu về loài Hồng trà long (Camellia longii Orel & Luu)

1.2.1 Mô tả thực vật C.longii

Năm 2014, trung tâm Đa dạng sinh học và phát triển của Thành phố Hồ Chí Minh, Việt

Nam vào đã công bố hình thái Camellia longii Orel & Luu Đây loài mới đặc hữu của

rừng mưa nhiệt đới xuất hiện ở độ cao từ 1500 đến 1700 m so với mực nước biển ở phía nam dãy Trường Sơn của Việt Nam [1]

C longii có lá đài, hoa màu cam đậm đến đỏ đậm với viền trắng không đều, 5 – 6 cánh

hoa và 3 – 2 cánh hoa, dạng sợi liên kết với nhau với các cánh hoa lồng vào nhau, bầu nhụy hình thoi

1.2.2 Phân bố của C longii

Theo dữ liệu công bố thực vật tại Vườn VQG Bù Gia Mập, trà hoa đỏ C.longii lần đầu

tiên được phát hiện tại các tiểu khu 27, 8, 7 vào năm 2010 Hình thái loài mới này được công bố vào năm 2014 và phạm vi phân bố của loài chỉ nằm trong khoảng 1 km2 tại

VQG Bù Gia Mập - Bình Phước và Lâm Đồng [1] Hình thái hoa và lá C.longii ở VQG

Bù Gia Mập-Bình Phước được trình bày hình 1.3

Hình 1 3: C longii ở VQG Bù Gia Mập- Bình Phước

C.longii là loài cây bụi gỗ nhỏ, lâu năm, cao 2,5-4 m Lá dài 27-31 cm, rộng 6-9 (10,5)

cm; Phiến lá mỏng, dạng hình elip hẹp hoặc thuôn hẹp Cuống lá dài tới 2 cm, rộng 5(6) mm Hoa đơn độc, hình elip đến hình trứng không đều, dài 4,5-5,5cm, đường kính 3,5-5,5 cm, hoa nhiều nhị Số lượng cây trưởng thành vô cùng ít (ước lượng khoảng từ 49-70 cây) và được xếp vào bảo tồn bậc CR (cực kỳ nguy cấp) Xét về giá trị bảo tồn, hiện nay trà hoa đỏ Bù Gia Mập vô cùng quý hiếm cần được bảo tồn và nhân giống

4-Bảng 1.2 được trích dẫn từ tạp chí thực vật học [1], trình bày về phân loại khoa học

C.longii Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

C longii vẫn chưa có Vì vậy, tổng quan về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của chi Camellia trong và ngoài nước, làm cơ sở khoa học hiểu rõ về C longii là rất cần thiết

Bảng 1 2: Phân loại khoa học của loài C longii

Hệ thống phân loại (Taxonomy)

Lớp Magnoliopsida Loài C longii

Tên khoa học Camellia longii Orel & Luu

1.3 Thành phần hóa học của chi Camellia

Nghiên cứu thành phần hóa học từ lá trà C dalatensis Luong, Tran & Hakoda, nhóm tác

giả ( ĐH Đà Lạt ) chỉ ra các hợp chất thuộc trà hoa vàng là các nhóm như polyphenol, flavonoid, acid amine và tinh dầu [11] Một công bố khác về thành phần hóa học của trà

C quephongnensis Hakoda et Ninh, cũng được Viện công nghệ Hóa dược (VAST) công

bố năm 2017 Trong đó, các tác giả đều chỉ ra các nhóm chất của C quephongnensis

chủ yếu thuộc nhóm polyphenol, flavonoid như pyrogallol, kaempferol, catechol, acid gallic, rutine, epicatechine, piceatannol [7]

Hiện nay, các công bố trên thế giới về thành phần hóa học các loài thuộc chi Camellia chủ yếu ở Nhật Bản, Trung Quốc Nghiên cứu Y Y Chen và các cộng sự trên lá và hoa trà vàng C nitidissima (TQ) [12], C.chrysantha (TQ) [13] Các kết quả nghiên cứu thành phần được trình bày bảng 1.3 và hình 1.4

Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, chỉ ra các hoạt chất chính trích xuất từ chi

Camellia thuộc nhóm polyphenol, flavonoid, acid amine, tanin, vitamin và các nhóm

tinh dầu Thành phần hóa học chính của chi Camellia trình bày các mục 1.3.1 đến 1.3.7

1.3.1 Polyphenol

Bảng 1 3 : Các hợp chất polyphenol được phân lập từ một số loài cây trà Camellia

Bảng 1.3 mô tả các hợp chất polyphenol được trích xuất từ các loài trà hoa vàng

C.chrysantha, C niprisssima, C euphlebia, C quephongnensis Hakoda et Ninh.Trong

đó, các hợp chất polyphenol được coi là thành phần chính của tất cả các loài hoa trà và

đã ghi nhận sự nghiên cứu nhiều nhất Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH và vị trí tương

hỗ của polyphenol gắn trực tiếp vào vòng benzene mà tính chất vật lý và hóa học khác

nhau Trong số 14 hoa trà vàng các loài ở Trung Quốc, lá non của C pingguoensis có

glucopyranoside, Quercetin 7-O-(6"

-O-E- caffeoyl)- β -Dglucopyranoside

[13]

C euphlebia Lá và hoa Ellagitannin, proanthocyanidin,

kaempferol, quercetin, catechine [14]

chứa tổng số cao nhất flavonoid (220,11 mg/g DW), trong khi tổng hàm lượng flavonoid

thấp nhất được tìm thấy trong lá một năm tuổi của C tubghinensis (15,8 mg/g DW) [15]

Hình 1.4 mô tả các hợp chất polyphenol điển hình từ 16 loại trà hoa vàng thuộc chi

Hình 1 4: Một số hợp chất thuộc nhóm polyphenol trích xuất từ chi Camellia

Hình 1.5 mô tả các catechine và dẫn xuất catechine được phân lập từ trà hoa vàng [16] Catechine và những dẫn xuất catechine là những chất đặc trưng, chất đánh dấu (marker)

của chi trà Camellia Nghiên cứu của Jia-Ni Lin năm 2013 và cộng sự trên 6 loài trà hoa

vàng, đã phát hiện 8 loại: catechine, epigallocatechine gallate (EGCG), epigallocatechine (EGC), epicatechine gallate (ECG), epicatechine (EC), catechine(C), gallocatechine(GC), gallocatechine gallate (GCG), catechine gallate (CG) Các kết quả

tương tự trên trà xanh C sinensis L, C euphlebia cũng tìm thấy các catechine và dẫn

xuất catechine như: EC, EGC, GC, ECG, GCG, EGCG [14], [17]

Hình 1 5: Một số hợp chất nhóm catechine trích xuất từ chi Camellia

1.3.2 Anthocyanin

Terahara và cộng sự (2001) lần đầu phân lập và xác định ba anthocyanin, cụ thể là

delphinidin 3-O-β-D-galactosides, cyanidin 3-O-β-D-galactosides từ hoa trà đỏ

(Benibana-cha), C sinensis [18]

Rothenberg và cộng sự (2019) đã xác định được các thành phần anthocyanin trong hoa

trà (Benibana-cha), bao gồm cyanidin 3-O-rutinoside, cyanidin, procyanidin B2, procyanidin B3, malvidin 3,5-diglucoside [19] Hình 1.6 trình bày các hợp chất

anthocyanin được trích xuất từ Benibana-cha [18], [19]

EGCG (6) EGC (7)

ECG (8) EC (9)

Catechine (10) GC (11)

Hình 1 6: Một số hợp chất anthocyanin trích xuất từ hoa trà đỏ (Benibana-cha)

1.3.3 Triterpenoid và phytosterol

Nghiên cứu trên lá trà hoa vàng C niprisssima, một số hợp chất triterpene đã được phân

lập được lần lượt là 3-β-acetoxy-20-lupanol, A1-barrigenol-22a-angelaten [20] Hoa trà

C niprisssima, các hợp chất như lupeol, acid oleanolic, β-sitosterol cũng đã được tìm

thấy theo nghiên cứu J Qi et al [21] Hình 1.7 bên dưới mô tả các hợp chất thuộc nhóm

triterpenoid và phytosterol được phân lập từ lá và hoa trà hoa vàng C niprisssima [20]

Các kết quả nghiên cứu Jia-Ni Lin đã trích xuất các hợp chất: β-sitosterol 17,24%,

α-spinasterol 13,60% và olibanumol L bằng kĩ thuật GC-MS [14] Với cao chiết hexane

và dichloromethane của C dalatensis Luong, Tran & Hakoda, nhóm nghiên cứu của

Nguyen et al (2019) đã phân lập hai phytosterol là spinasterol, stigmasterol và một

triterpene là acid oleanolic [22]

Procyanidin B2 (12) Cyanidin 3-O-rutinoside (13)

Malvidin 3,5-diglucoside (14) Cyanidin 3-O-β-D-galactosides (15)

Hình 1 7: Các nhóm triterpenoid và phytosterol từ C niprisssima, C euphlebia

1.3.4 Polyglycoside

Nhóm đường polyglycoside trong trà (TPS) là một polysacarite có tính acid liên kết với protein không chứa tinh bột [23] Thành phần carbohydrate của TPS bao gồm glucose (Glc), galactose (Gal), arabinose (Ara), rhamnose (Rha), xyloza (Xyl), mannose (Man), ribose (Rib) và acid glucuronic Hình 1.8 trình bày các hợp chất thuộc nhóm đường

polyglycoside được trích từ chi Camellia [23]

Acid oleanolic (18) β-sitosterol (19)

α-spinasterol (20) Olibanumol L (21)

Glucose (22) Galactose (23) Arabinose (24)

Rhamnose (25) Mantose (26) Ribose (27)

Hình 1 8: Một số hợp chất thuộc nhóm polyglycoside trích xuất từ chi Camellia

1.3.5 Saponin

Nghiên cứu Morikawa et al vào năm 2012 [24], hoa các loài thuộc chi Camellia có chứa

lượng lớn saponin, được phân loại là oleanane triterpene oligogycosides, dao động từ 10,35 đến 78,84 mg/g DW

Cho đến nay, tổng cộng có 26 saponin (floratheasaponin A-K, chakasaponin I-VI,

floraassamsaponin I-VIII và assamsaponin E) đã được xác định trong nụ hoa trà [25] Hàm lượng saponin có trong các mẫu trà phụ thuộc vào vị trí địa lý và hình thái sinh trưởng, , thổ ngưỡng khí hậu sinh trưởng của thực vật

Morikawa, Lee và cộng sự đã chứng minh những loài thuộc chi Camellia đến từ Nhật Bản, Đài Loan, Ấn Độ có hàm lượng saponin trong mẫu hoa thấp hơn so mẫu hoa trà

đến từ Trung Quốc.Với những đặc thù về khí hậu và thổ nhưỡng Trung Quốc phù hợp

với sự sinh trưởng nên chiết xuất Camellia Trung Quốc chứa nhiều chakasaponin và

floratheasaponin [24]

1.3.6 Vitamin và acid amine

Chi Camellia chứa nhiều loại vitamin, mang lại khả năng chống oxy hóa mạnh Hàm

lượng vitamin giữa các giống phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển khác nhau của hoa trà Trong hoa trà, lượng vitamin B2 dao động trong khoảng 0,14 đến 0,20 mg/100g DW [26]

Acid amine là tiền chất thiết yếu trong lá trà và đóng một vai trò quan trọng trong trong việc tạo mùi thơm của chi trà Theanin là acid amine chiếm phần lớn trong hoa trà (4,77

mg/g DW) và nó là chất đặc trưng tạo mùi vị trà Nghiên cứu của L.Wang et al [27] phát

hiện ra mười hai acid amine tự do được tìm thấy trong hoa trà và được trình bày hình 1.9 và hình 1.10

Hình 1 9: Cấu trúc của các hợp chất acid amine được phân lập từ chi Camellia

Hình 1 10: Cấu trúc của các hợp chất acid amine được phân lập từ chi Camellia

Alanine (28) Asparagin (29) Acid aspartic (30)

Methionine (34) Theanine (35) Serine (36)

Threonine (37) Tryptophan (38) Tyrosine (39)

1.3.7 Nhóm tinh dầu

Nhóm nghiên cứu về loài trà hoa vàng C nitidissima đã phân lập được 56 chất tinh dầu

từ lá và 34 chất từ hoa Các chất thơm chính là linalool, phytol, cis-geranyl acetone, hexanal, methyl salicylate, eudesmol [28] được thể hiện ở hình 1.11

n-Cis-geranyl acetone (43) Eudesmol (44) Methylsalicylate (45)

Hình 1 11: Một số tinh dầu trích xuất từ lá trà và hoa hoa vàng C nitidissima

1.4 Hoạt tính sinh học chi Camellia

Những lợi ích sức khỏe của trà xanh (Camellia sinensis) đối với nhiều loại bệnh, bao

gồm các loại ung thư, bệnh tim, bệnh gan khác nhau và các loại bệnh khác Nghiên cứu

in vitro và in vivo cho thấy các cơ chế và các hoạt tính sinh học của catechine trà xanh

Catechine trong trà có tác dụng chống lại béo phì và có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành giảm huyết áp, điều hòa đường huyết đường, hạ cholesterol, hạ lipid máu, chống khối u và nâng cao hệ miễn dịch [35]

Polyphenol, flavonoid trong trà hoa vàng là những hoạt chất có nhiều tác dụng sinh học

quan trọng, điển hình là các hợp chất như catechine, rutin, quercetin, vitexin [21] Các

hoạt tính sinh học của một số loài trên chi Camellia được mô tả ở bảng 1.4

Nhóm catechine bao gồm: catechine (C); epicatechine (EC); epigallocatechine 3-gallate (EGCG); epicatechine 3-gallate (ECG) Catechine có tác dụng với khả năng phòng chống một số bệnh nguy hiểm như ung thư, béo phì, nhồi máu cơ tim [33] Vitexin

(apigenin-8-C-glucosid) cũng là một flavonoid quan trọng, nó được chứng minh là tác dụng kháng viêm, chống tăng nhãn áp và bảo vệ thần kinh [47]

Bảng 1 4: Hoạt tính sinh học của một số loài trà Camellia

C.chrysantha

Lá Điều hòa và hạ lipid

C sinensis L

Những hợp chất thuộc nhóm flavonoid và polysaccharid là những hoạt chất có nhiều tác dụng sinh học quan trọng, điển hình là quercetin và vitexin Quercetin có tác dụng cải thiện tuần hoàn, tăng trí nhớ, có tác dụng tích cực trong việc điều trị bệnh Alzheimer Hơn nữa, quercetin có còn được biết đến với các tác dụng sinh học quan trọng như tác dụng chống viêm, phòng ngừa các bệnh tim mạch, hỗ trợ điều trị các triệu chứng rối loạn thần kinh như Alzheimer hay Parkinson, kháng ung thư, viêm loét d ạ dày, tá tràng, kháng khuẩn, kháng nấm, điều trị dị ứng và cảm sốt [36], [37]

1.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Thành phần hóa học của chi Camellia rất giàu chất chống oxy hóa với khả năng chống

lại các gốc hydroxyl tự do, gốc peroxyl, ion superoxyde Việc sử dụng của catechine lâu

dài đã được chứng minh làm giảm malondialdehyde, sản phẩm oxy hóa cuối cùng của perxide lipid [48], [49] Flavanol từ trà xanh thể hiện hoạt động chống oxy hóa thông qua các xét nghiệm khác nhau như khả năng khử sắt (FRAP) và xét nghiệm bắt gốc tự

do DPPH

Công bố khoa học từ trường ĐH Bình Dương, khả năng kháng oxy hóa vượt trội từ

catechine phân lập từ trà xanh (Camellia sinensis) với IC50 (7,60 ± 0,48 µg/mL) [40] Một số nghiên cứu khác, đã ghi nhận rằng catechine và polyphenol có trong trà xanh là chất cho điện tử tốt và cũng có thể bắt các gốc tự do [41] Các vòng thơm và các nhóm hydroxyl của polyphenol chủ yếu đóng góp vào hoạt động chống oxy hóa bằng cách trung hòa các gốc tự do lipid [32]

Hơn nữa, nghiên cứu về các loài thuộc chi Camellia đến từ phía Bắc Thái Lan [42] đã

chỉ ra khả năng chống oxy hóa thông qua năng lực khử có xu hướng hoạt động mạnh trên dịch chiết acetone và ethanol Nghiên cứu này chỉ ra rằng chiết xuất của lá trà trưởng thành (1,938 mg TEAC/g mẫu) và dịch chiết etanolic của lá non (1,751 mg TEAC/g mẫu) cao hơn so với các dịch chiết khác với mẫu nguyên liệu lá giống nhau (p <0,05) [43]

1.4.2 Hoạt tính ức chế AChE

Bệnh Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất ở người cao tuổi Đây là một căn bệnh thần kinh mạn tính và tiến triển chậm với những triệu chứng thường gặp là mất

trí nhớ và suy giảm chức năng thần kinh

Những nghiên cứu 2020 về bệnh Alzheimer, đã xác định mối tương quan đáng kể giữa

sự hiện diện của chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholine, chất vốn cần cho việc hình thành và lưu giữ trí nhớ Qua nghiên cứu này cũng đưa chỉ ra mối tương quan đáng kể giữa sự hiện diện của chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholine với sự tiến triển của bệnh Alzheimer[3] AChE xúc tác quá trình thủy phân acetylcholine thành choline và acetate Sự ức chế của hoạt động của AChE là một trong những phương pháp làm giảm bớt bệnh Alzheimer [44]

Nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, ức chế acetylcholinesterase (AChE) của

hạt và vỏ quả của cây chè (Camellia sinensis) đã chỉ ra dịch chiết metanol của vỏ quả

có hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất với (IC50=336,88±5,52 µg/mL) [45] Các hoạt chất

chính caffeine, acid gallic, một số hợp chất polyphenol và các hợp chất có nguồn gốc acid béo đã được phát hiện trong chiết xuất hạt chè là thành phần chính đóng vai trò kháng oxy hóa và đảm nhận vai trò chủ yếu ức chế AChE [45]

Một nghiên cứu khác cũng chứng minh tác dụng cao chiết trà Camellia có khả năng

kháng cholinesterase in vitro [46] Trong đó, trà xanh và trà đen được biết đến với khả

năng ức chế AChE với IC50 lần lượt là 300 µg/mL và 600 µg/mL [46] Các kết quả tương

tự cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của tác giả H K Kim và các cộng sự, kết quả ức chế AChE trên lá trà xanh (IC50 = 30 µg/mL) [47] Tác dụng ức chế của chiết xuất trà xanh (đối với hoạt động của AchE bằng cách sử dụng acetylthiocholine làm cơ chất với

IC50 là 42,05 µg/mL [48]

Những kết quả nghiên cứu trước đây, đều cho thấy cao chiết từ loài Camellia có khả

năng ức chế AchE đáng kể phụ thuộc vào liều lượng Đây là một chi dược liệu tiềm năng trong việc nghiên cứu dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên có thể hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer

1.5 Vấn đề tồn tại và định hướng nghiên cứu

Những nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học,

cho thấy chi Camellia là một chi thảo mộc tiềm năng Những thành phần như

polyphenol, flavonoid, anthocyanin, vitamin và acid amine là những nhóm đảm nhận vai trò chính cho các hoạt tính sinh học như khả năng chống oxy hóa, kháng viêm cũng như ức chế AChE

Một trong những thành phần đáng chú ý là polyphenol được tìm thấy trong cao chiết các

loài thuộc chi Camellia, có khả năng chống lại các gốc tự do, oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh [2] Điều này góp phần đưa chi Camellia trở thành một trong những loại thảo

dược tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer

Hiện nay, bệnh Alzheimer được biết đến là một bệnh lý thần kinh nhận thức phổ biến, gây sa sút trí tuệ ở người cao tuổi và hiện vẫn chưa có phương pháp điều trị hiệu quả Việc sử dụng các chất ức chế AChE như tacrin, donepezil, galantamin và rivastigmin

đã được áp dụng Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc lâu dài, gây ra những tác dụng phụ đến đường tiêu hóa và gây ra độc tính lên gan [17] Do đó, việc tìm kiếm mẫu hoạt

chất thiên nhiên tiềm năng từ những loài thuộc chi Camellia để hỗ trợ điều trị bệnh

Alzheimer là rất cần thiết

Trong những loài thuộc chi Camellia, Camellia longii Orel & Luu là loài thực vật mới

- đặc hữu của VQG Bù Gia Mập- Bình Phước và công bố năm 2014 Cho đến nay, những

nghiên cứu về những thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của lá trà C longii

vẫn chưa hiểu rõ

Vì vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa, ức chế AChE là rất cần thiết cho việc góp phần minh chứng giá trị dược liệu và công tác bảo tồn giống

trà hoa đỏ C longii tại VQG Bù Gia Mập-Bình Phước

Để giải quyết các vấn đề tồn tại, đề tài định hướng nghiên cứu:

1 Xác định thành phần hóa học trong mẫu cao chiết lá trà C.longii Các phương

pháp phân tích hóa học như phản ứng định tính nhóm chức, phổ hồng ngoại

FT-IR và sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp đầu dò khối phổ MS-ESI ESI-MS) sẽ được sử dụng để định danh các chất quan trọng trong mẫu

(HPLC-2 Định lượng tổng hàm lượng polyphenol (TPC), tổng hàm lượng flavonoid (TFC),

tổng hàm lượng saponin (TSC) có trong 5 mẫu cao dịch chiết

3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu cao chiết bằng các phương pháp xác định năng lực khử sắt và khả năng bắt gốc tự do DPPH

4 Dựa trên các kết quả thu được, nghiên cứu sẽ chọn ra mẫu cao có hoạt tính mạnh

trong 5 mẫu cao lá C.longii cho để đánh giá khả năng ức chế AChE

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu-Hóa chất-Thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Camellia longii Orel & Luu ( Hồng trà long hay trà hoa đỏ) được thu từ vườn quốc qia

Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước vào tháng 9 năm 2022 Hồng trà long hay trà hoa đỏ được Ks Khương Hữu Thắng -VQG Bù Gia Mập định danh và gửi mẫu

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày bảng 2.1

Bảng 2 1: Hóa chất sử dụng

14 Ferric chloride (FeCl3) 7705-08-0

15 Folin-Ciocalteu (FC) 7732-18-5 Sigma-Aldrich, USA

STT Tên hóa chất CAS Nguồn gốc

25 Sodium nitrite (NaNO2) 7632-00-0

26 Potasium Iodide (KI) 7681-11-0

2.1.3 Thiết bị sử dụng

Các thiết bị, hãng sản xuất và model máy được sử dụng trong quá trình nghiên cứu được trình bày theo bảng 2.2

Bảng 2 2: Các thiết bị sử dụng

3 Cân phân tích 4 số, 2 số Precisa, Thụy Sỹ