Sàng lọc thành phần hóa học của ba loài camellia longii, camellia bugiamapensis, camellia sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN SÀNG LỌC THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA BA LỒI CAMELLIA LONGII, CAMELLIA BUGIAMAPENSIS, CAMELLIA SP MÃ SỐ: SV2022-58 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TRẦN THANH HUY SKC 0 Tp Hồ Chí Minh, tháng 11/2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN SÀNG LỌC THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA BA LỒI CAMELLIA LONGII, CAMELLIA BUGIAMAPENSIS, CAMELLIA SP SV2022_58 Thuộc nhóm ngành khoa học: Cơng nghệ hóa học SV thực hiện: Trần Thanh Huy Nam, Nữ: Nam Nguyễn Văn Tân Nam Huỳnh Thị Yến Ly Nữ Đào Trọng Tín Nam Đồn Thị Phương Giang Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: 19128H, Công nghệ hóa học thực phẩm Năm thứ: /Số năm đào tạo: 2019 - 2023 Ngành học: Công nghệ hóa học Người hướng dẫn: TS Phan Thị Anh Đào TP Hồ Chí Minh, 11/2022 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC HÌNH ẢNH iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT iv LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Camellia L 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Mô tả thực vật chi Camellia L 1.1.3 Một số loài thuộc chi Camellia L phân bố vườn quốc gia Bù Gia Mập 1.2 Các nghiên cứu loài thực vật chi Camellia L 10 1.3 Thành phần hoạt chất số loài thuộc chi Camellia L 13 1.3.1 Nhóm polyphenol 14 1.3.2 Nhóm triterpenoid phytosterol 22 1.3.3 Nhóm monoterpene 23 1.3.4 Nhóm saponin 24 1.3.5 Nhóm vitamin acid amine 25 1.3.6 Catechin 26 1.3.7 Các hợp chất khác: 27 1.4 Hoạt tính sinh học số loài chi Camellia L 27 1.5 Hoạt tính chống oxy hóa 30 1.5.1 Tổng quan gốc tự 30 1.5.2 Chất chống oxy hóa 31 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33 2.1 Nguyên liệu-Hóa chất-Thiết bị 33 2.1.2 Hóa chất 33 2.1.3 Thiết bị 35 2.2 Nội dung nghiên cứu 37 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 37 2.2.2 Điều chế cao trích 37 2.2.3.Phân tích định tính nhóm chức phản ứng hố học FT-IR 39 2.2.4.Phân tích định tính nhóm chức phản ứng hoá học 40 2.2.5 Phân tích thành phần hố học HPLC-MS 43 2.2.6 Xác định tổng hàm lượng polyphenol flavonoid 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 3.1 Kết điều chế cao trích 52 3.2 Định tính nhóm chức 53 3.2.1 Định tính nhóm chức phản ứng đặc trưng 53 3.2.2 Định tính nhóm chức phổ FT-IR 55 3.3 Định lượng thành phần hóa học 58 3.3.1 Phân tích thành phần hóa học LC-MS 58 3.3.2 Tổng hàm lượng polyphenol 66 3.3.3 Tổng hàm lượng flavonoid 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 76 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số loài trà thuộc chi trà Camellia Việt Nam Bảng 1.2 Phân loại khoa học loài Camellia longii Bảng 1.3 Phân loại khoa học loài C.bugiamapensis Bảng 1.4: Phân loại khoa học loài Camellia Sp Bảng 1.5 Các hợp chất polyphenol, flavonoid phân lập từ phận số loài trà hoa vàng thuộc chi Camellia L 14 Bảng 1.6 Hoạt tính sinh học số loài trà hoa vàng 27 Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng…………………………………………………………………………………………33 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng 35 Bảng 2.3 Phương pháp định tính nhóm chức 40 Bảng 2.4 Chương trình pha động 44 Bảng 2.5 Giá trị cài đặt thông số MS 44 Bảng 2.6 Phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol flavonoid 46 Bảng 3.1: Hiệu suất độ ẩm mẫu cao trích ………………………………………………………………52 Bảng 3.2: Kết định tính nhóm chức phản ứng hóa học đặc trưng cao Camellia bugiamapensis, Camellia longgii, Camellia SP 53 Bảng 3.3: Số sóng đỉnh hấp thu phổ FT-IR loài bugiamapensis ,Camellia Longgi, Camellia Sp 55 Bảng 3.4 Các chất dự đoán dựa phổ HPLC-MS mẫu thân 59 Bảng 3.5 Các chất dự đoán dựa phổ HPLC-MS mẫu 59 i Bảng 3.6 Các hợp chất dự đoán dựa phổ HPLC-MS mẫu cao 61 Bảng 3.7 Các hợp chất dự đoán dựa phổ HPLC-MS mẫu cao 61 Bảng 3.8 Các hợp chất dự đoán dựa phổ HPLC-MS mẫu cao thân 62 Bảng 3.9 Các hợp chất dự đoán dựa phổ HPLC-MS mẫu cao 62 Bảng 3.10 Các hợp chất trích xuất có phần trăm lớn cao CLL-EW 65 Bảng 3.11 Tổng hàm lượng polyphenol mẫu cao trích 66 Bảng 3.12 Độ lệch chuẩn TPC (n=3) có mẫu cao trích 67 Bảng 3.13 Tổng hàm lượng flavonoid có mẫu cao trích 68 ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dạng chóp Hình 1.2 Hình dạng gốc Hình 1.3 Quả hình cầu Hình 1.5 Cây Camellia longii ngồi tự nhiên vùng rừng Cát Lộc Hình 1.6 Cây trà hoa vàng C.bugiamapensis VQG Bù Gia Mập Hình 1.7 Cây trà hoa trắng Camellia sp – Vườn quốc gia Bù Gia Mập 10 Hình 1.8 Cấu trúc hợp chất polyphenol phân lập từ chi Camellia L 21 Hình 1.9 Cấu trúc hợp chất triterpenoid and phytosterols phân lập từ chi Camellia L 23 Hình 1.10 Cấu trúc hợp chất monoterpenes phân lập từ C.bugimapensis 24 Hình 1.11 Cấu trúc hợp chất saponin phân lập từ C.bugimapensis 25 Hình 1.12 Cấu trúc hợp chất acid amine phân lập từ chi Camellia L 26 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu………………………………………………………………………………………… 37 Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao trích 38 Hình 2.3 Quy trình xác định hàm lượng polyphenol (TPC) 48 Hình 2.4 Quy trình xác định hàm lượng flavonoid (TFC) 50 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu TÊN TIẾNG ANH TÊN TIẾNG VIỆT DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl - FRAP Ferric reducing/antioxidant power assay Thử nghiệm lực khử sắt CE Catechin equivalent Lượng tương đương với catechin Lượng tương đương với acid GAE Gallic acid equivalent gallic LC-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ FT-IR Fourrier Transformation InfraRed TPC Total phenolic content TFC Total flavonoid content VQG - Vườn quốc gia RT Retention time Thời gian lưu DW Dry Weight Chất khô Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Tổng hàm lượng hợp chất phenolic Tổng hàm lượng hợp chất flavonoid iv BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: SÀNG LỌC THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BA LOÀI CAMELLIA LONGII, CAMELLIA BUGIAMAPENSIS, CAMELLIA SP - Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Huy - Lớp: 19128H Mã số SV: 19128002 Khoa: Cơng nghệ hóa học thực phẩm - Thành viên đề tài: Stt Họ tên MSSV Lớp Khoa Cơng nghệ hóa Đồn Thị Phương Giang 19128028 19128H học thực phẩm Công nghệ hóa Đào Trọng Tín 19128083 19128H học thực phẩm Cơng nghệ hóa Huỳnh Thị Yến Ly 19128048 19128H học thực phẩm Cơng nghệ hóa Nguyễn Văn Tân 19128069 19128H học thực phẩm - Người hướng dẫn:TS Phan Thị Anh Đào Peak list Phổ MS hợp chất: C27H30O16 104 Peak list Phổ MS hợp chất: C15H14O5 105 Peak list Phổ MS hợp chất: C32H52O3 106 Peak list Phụ lục :TPC Phụ lục 3.1: Xây dựng đường chuẩn acid galic ĐƯỜNG CHUẨN ACID GALID Nồng độ (mg/mL) 10 20 STD1 0.13 0.219 0.555 0.893 1.903 STD2 0.134 0.228 0.547 0.895 1.916 107 STD3 0.112 0.225 0.553 0.91 1.912 TB 0.125 0.224 0.552 0.899 1.910 ĐỒ TH Ị ĐƯ Ờ NG CH UẨN ACID G ALID 1.910 y = 0.0926x + 0.0385 R² = 0.9965 1.6 ABS 1.2 0.899 0.8 0.552 0.4 0.224 0.125 0 10 15 20 25 C (MG/ML) Từ phương trình đường chuẩn y = 0.0926x+0.0385 (ax+b) ta tính hàm lượng polyphenol có mL mẫu Với mẫu CBS-EW: 0,458 = 0.0926x+0.0385→ x =4,53 ppm Với mẫu CBL-EW: 0,829 = 0.0926x+0.0385→ x =8,54 ppm Với mẫu CLL-EW: 1,236 = 0.0926x+0.0385 → x =12,93 ppm Với mẫu CLS-EW: 1,357 = 0.0926x+0.0385→ x =14,23 ppm Với mẫu SPS-EW: 0,967 = 0.0926x+0.0385→ x =10,03 ppm Với mẫu SPL-EW: 1,201 = 0.0926x+0.0385→ x =12,55 ppm 108 Hàm lượng polyphenol 0.2 g mẫu thử tính cơng thức: TPC = C.Vm d m (100−wm).10 Trong đó: TPC – Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g chất khơ) C: nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn (mg/L) Vm – Thể tích mẫu (mL) m – Khối lượng mẫu (g) wm – Độ ẩm mẫu (%) d – Hệ số pha loãng Hệ số pha loãng rút 1mL định thành 50mL, sau rút 1.3 mL định thành 2.7mL hệ số pha lỗng d= 50 × 2.7 1.3 ≈ 100 𝑙ầ𝑛 Độ hấp thu quang 770nm Mẫu Nồng độ (µg/mL) STD1 STD2 STD3 Average Độ lệch chuẩn CBS-EW 200 0,461 0,455 0,458 0,458 0,151 CBL-EW 200 0,823 0,834 0,831 0,829 0,540 CLL-EW 37,04 1,2391 1,2251 1,2452 1,236 0,013 CLS-EW 37,04 1,4025 1,3125 1,3562 1,357 0,045 SPS-EW 100 0,974 0,966 0,962 0,967 0,003 SPL-EW 100 1,174 1,186 1,242 1,201 0,195 109 Với mẫu CBL-EW CBS-EW có hệ số pha lỗng 200 lần, độ ẩm mẫu CBL-EW, CBSEW 10,11% 10,08% (theo kết bảng 3.2) giá trị nồng độ polyphenol từ đường chuẩn mẫu CBL-EW, CBS-EW 8,54 4,53 ppm thể tích mẫu 10 Ml TPCCBS-EW = C.Vm.d m.(100−wm ).10 C Vm d TPCCBL-EW = m (100−wm).10 = = 4,53×10×200 0.2×(100−10,08)×10 8,54×10×200 0.2×(100−10,11)×10 = 50,38 (mg GAE/g chất khô) = 95 (mg GAE/g chất khơ) Hệ số pha lỗng cân rút 0.5mL định thành 100mL, sau rút 1mL định thành 2,7mL hệ số pha lỗng d = 100 0.5 × 2.7 = 540 𝑙ầ𝑛 Với mẫu CLL-EW CLS-EW có hệ số pha loãng 540 lần, độ ẩm mẫu CLL-EW CLS-EW 10,11% 10,08% (theo kết bảng 3.2) giá trị nồng độ polyphenol từ đường chuẩn mẫu CLL-EW, CLS-EW 12,93 14,23ppm thể tích mẫu 10 mL TPCCLL-EW = TPCCLS-EW = C.Vm.d m.(100−wm ).10 C.Vm d m (100−wm).10 = = 12,93×10×540 0.2×(100−10,11)×10 14,23×10×540 0.2×(100−10,08)×10 = 388,37 (mg GAE/g chất khô) = 427,28 (mg GAE/g chất khô) Hệ số pha lỗng rút 1mL định thành 100mL, sau rút 1.3 mL định thành 2.7mL hệ số pha lỗng d= 100 × 2.7 1.3 ≈ 200 𝑙ầ𝑛 Với mẫu SPS-EW SPL-EW có hệ số pha lỗng 200 lần, độ ẩm mẫu CBL-EW, CBSEW 7,08% 7,04% (theo kết bảng 3.2) giá trị nồng độ polyphenol từ đường chuẩn mẫu SPS-EW, SPL-EW 10,03 12,55 ppm thể tích mẫu 10 mL TPCSPS-EW = C Vm d m (100−wm).10 = 10,03×10×200 0.2×(100−7,08)×10 = 107,94 (mg GAE/g chất khơ) 110 TPCSPL-EW = C.Vm.d m.(100−wm ).10 = 12,55×10×200 0.2×(100−7,04)×10 = 135 (mg GAE/g chất khô) Phụ lục 4: TFC Chuẩn bị mẫu: Cân xác 0,2 g mẫu cao cho vào ống chiết thủy tinh, cho 10,0 mL EtOH 70% vào ống chiết Hàm lượng mẫu pha : Cmẫu= 0,2𝑔 10𝑚𝑙 = 0,2.103 𝑚𝑔 0,01𝑙 =20000ppm Đậy nắp đánh siêu âm để cao trích tan hồn tồn Sau đó, pha lỗng mẫu tới nồng độ 200 μg/mL cách lấy 1ml mẫu ban đầu pha loãng 100 lần Lên màu: Lần lượt rút 2,5 mL dịch chiết pha loãng; 0,15 mL dung dịch AlCl3 10%; 0,15 mL dung dịch NaNO2 10% 1,2 mL nước cất vào ống nghiệm, lắc ủ 30 phút Sau đó, thêm 1,0 mL NaOH vào ống nghiệm, lắc ủ 30 phút Hệ số pha loãng mẫu: d= =2 2,5 Nồng độ mẫu ống nghiệm Cmẫu= 200𝑝𝑝𝑚 =100ppm Chuẩn bị mẫu blank: Lần lượt rút mL nước cất; 0,3 mL dung dịch AlCl3 10%; 0,3 mL dung dịch NaNO2 10% 2,4 mL nước cất vào ống nghiệm, lắc ủ 30 phút Sau đó, thêm 2,0 mL NaOH vào ống nghiệm, lắc ủ 30 phút Độ hấp thu quang mẫu cao đo bước sóng 550 nm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần lấy giá trị trung bình Mẫu trắng sử dụng EtOH 70% 111 Bảng: Kết độ hấp thu quang để xác định tổng hàm lượng flavonoid mẫu cao với lần lặp lại Nồng độ Mẫu Độ hấp thu quang (µg/mL) STD1 STD2 STD3 STDTB CLS-EW 100 0,542 0,533 0,523 0,533 CLL-EW 100 0,393 0,390 0,389 0,391 CBS-EW 100 0,195 0,197 0,193 0,195 CBL-EW 100 0,307 0,304 0,305 0,305 SPS-EW 100 0,308 0,295 0,311 0,305 SPL-EW 100 0,516 0,532 0,526 0,525 Xây dựng đường chuẩn catechin Cân xác 0,2 g mẫu chuẩn cho vào ống chiết thủy tinh, cho 10,0 mL EtOH 70% vào ống chiết Hàm lượng mẫu pha : Cmẫu chuẩn = 0,2𝑔 10𝑚𝑙 = 0,2.103 𝑚𝑔 0,01𝑙 =20000ppm Đậy nắp đánh siêu âm để mẫu tan hồn tồn Sau đó, pha loãng mẫu tới nồng độ 200 μg/mL cách lấy 1ml mẫu ban đầu pha loãng 100 lần Bảng: Pha đường chuẩn catechin 112 Đường chuẩn catechin /TFC Nồng độ 0.4 200ppm 10 25 50 75 100 625 1250 1875 2500 Catechin 10 25 125 250 AlCl3 150 150 150 150 150 150 150 150 NaNO2 150 150 150 150 150 150 150 150 NaOH 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Nước cất 3690 3675 3575 3450 3075 2450 1825 1200 Tổng V 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 Chú thích : Dãy nồng độ thử xác định dựa vào thể tích hút mẫu chuẩn nồng độ 200ppm Cthử= 200.𝑋 5000 (X thể tích mẫu 200ppm hút) Mẫu Blank chuẩn mẫu thử khơng chứa catechin với thể tích lần mẫu thử Bảng: Kết độ hấp thu quang đường chuẩn catechin Nồng độ 0,4 10 25 50 75 100 STD1 0,007 0,026 0,111 0,214 0,505 0,991 1,465 1,978 STD2 0,010 0,033 0,102 0,225 0,476 0,966 1,467 1,989 STD3 0,009 0,023 0,099 0,201 0,497 0,983 1,444 1,968 TB 0,009 0,027 0,104 0,213 0,493 0,980 1,459 1,978 (µg/ml) 113 ,5 y = 0,0196x + 0,0056 R² = 0,9998 ,0 Độ hấp ,5 thu ,0 ,5 ,0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (µg/ml) Hình: Đồ thị đường chuẩn Catechine Từ phương trình đương chuẩn catechin y = 0,0196x + 0,0056 với độ hấp thu trung bình mẫu y suy tổng hàm lượng flavonoid có mẫu CLS-EW (100ppm) x= CLL-EW (100ppm) x= = 𝑌−0,0056 0,0196 0,0196 CBL-EW (100ppm) x= SPL-EW (100ppm) x= 0,0196 𝑌−0,0056 CBS-EW (100ppm) x= SPS-EW (100ppm) x= 𝑌−0,0056 𝑌−0,0056 0,0196 𝑌−0,0056 0,0196 =26,9 (µg/ml) 0,391−0,0056 0,0196 =19,67 (µg/ml) =9,66 (µg/ml) 0,0196 = = 0,0196 0,195−0,0056 = = 𝑌−0,0056 0,0196 = 0,533−0,0056 0,305−0,0056 =15,28 (µg/ml) 0,0196 0,305−0,0056 0,0196 =15,28 (µg/ml) 0,525−0,0056 0,0196 =26,5 (µg/ml) Hàm lượng tổng flavonoid mẫu thử (mg CAE/ g chất khô): TFC = C.Vm d m (100−wm).10 114 Trong đó: TFC – Hàm lượng flavonoid tổng số (mg CAE/g chất khơ) C: nồng độ flavonoid tính từ đường chuẩn (µg/ml) Vm – Thể tích mẫu (mL) m – Khối lượng mẫu (g) wm – Độ ẩm mẫu (%) d – Hệ số pha loãng Đối với mẫu CLS-EW TFC = C.Vm d m.(100−wm = = ) 26,9µg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,08%) 26,9.10−3mg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,08%) = 53,8𝑚𝑔 0,1784𝑔𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎô =301,57mgCAE/gchất khô Đối với mẫu CLL-EW TFC = C.Vm d m.(100−wm = = ) 19,67µg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,11%) 19,67.10−3mg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,11%) = 39,34𝑚𝑔 0,1784𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎơ =220,51mgCAE/gchất khô Đối với mẫu CBS-EW TFC = C.Vm d = 9,66µg/ml.10ml.200 m.(100−wm) 0,2𝑔.(100%−10,08%) = 9,66.10−3mg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,08%) = 19,32𝑚𝑔 0,1784𝑔𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎơ =108,3mgCAE/gchất khô Đối với mẫu CBL-EW TFC = C Vm d m (100−wm = = ) 15,28µg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,11%) 15,28.10−3 mg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−10,11%) = 30,56𝑚𝑔 0,1798𝑔𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎô =169,97 mgCAE/gchất khô 115 Đối với mẫu SPS-EW TFC = C.Vm d m.(100−wm ) = = 15,28µg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−7,08%) 15,28.10−3 mg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−7,08%) = 30,56𝑚𝑔 0,1858𝑔𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎơ =164,44 mgCAE/gchất khô Đối với mẫu SPL-EW TFC = C.Vm d m.(100−wm = = ) 26,5µg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−7,04%) 26,5.10−3 mg/ml.10ml.200 0,2𝑔.(100%−7,04%) = 53𝑚𝑔 0,1859𝑔𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎô =285,07mgCAE/gchất khô Bảng: Độ lệch chuẩn TFC (n=3) có mẫu cao trích TFC Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng flavonoid (µg/ml) CLS-EW (mg/CAE/g chất Độ lệch khô chuẩn 0,542 27,37 306,83 0,533 26,9 301,57 5,43 CLL-EW 0,523 26,4 295,96 0,393 19,77 221,64 0,390 19,61 218,84 1,51 0,389 19,56 219,28 116 TFC Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng flavonoid (µg/ml) CBS-EW CBL-EW SPS-EW SPL-EW (mg/CAE/g chất Độ lệch khô chuẩn 0,195 9,66 107,47 0,197 9,77 108,6 0,193 9,56 106,33 0,307 15,38 171,07 0,304 15,22 169,47 0,305 15,28 169,93 0,308 15,43 166,04 0,295 14,77 158,9 0,311 15,58 167,69 0,516 26,04 280,13 0,532 26,86 288,91 0,52 26,55 285,62 1,13 0,56 4,49 2,89 117