Khảo sát thành phần hóa học của loài nấm cordyceps neovolkiana

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA GVHD: ThS Lê Thị Thu Hương ThS Dương Thúc Huy SVTH: Lê Tấn Lộc MSSV: K38.106.069 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA LỒI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA GVHD: ThS Lê Thị Thu Hương ThS Dương Thúc Huy SVTH: Lê Tấn Lộc MSSV: K38.106.069 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Bằng tất trân trọng lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến với: Cô Lê Thị Thu Hương thầy Dương Thúc Huy – thầy đầy tâm huyết nhiệt tình Thầy, cô dạy cho em kiến thức chuyên môn với kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa học em suốt thời gian hướng dẫn Tất q Thầy khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian em theo học hoàn thành khóa luận Các anh chị học viên cao học bạn sinh viên mơn Hóa Hữu cơ, khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh động viên, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Và cuối xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững tinh thần suốt thời gian theo học thực đề tài trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ v LỜI MỞ ĐẦU vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .1 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa phân loại chi Cordyceps .1 1.1.2 Hoạt tính hợp chất có chi Cordyceps 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HĨA HỌC CỦA CÁC LỒI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .7 2.1.1 Hóa chất 2.1.2 Thiết bị 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 2.3.1 Rửa tủa phân đoạn cao A1 2.3.2 Sắc ký cột phân đoạn cao A3 .8 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T3 10 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT1 12 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 15 4.1 KẾT LUẬN 15 4.2 KIẾN NGHỊ 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 PHỤ LỤC ii MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR H-NMR Ac AcOH C COSY d dd DMSO EA H HMBC HSQC J m : Mũi đa (Multiplet) Me : NMR : Cộn ppm : s : t : UV : iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Hình 1.1: Polysaccharide xác định Yu cộng sự, 2009 Hình 1.2: Các hợp chất lập từ lồi nấm thuộc chi Cordyceps Hình 3.1: Khung Ergostane 10 Hình 3.2: Tương quan HMBC phần aglycon hợp chất T3 11 Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất T3 12 Hình 3.4: Cấu trúc hợp chất TT1 13 Hình 4.1: Cấu trúc hợp chất T3 hợp chất TT1 15 Sơ đồ 2.1: Quy trình lập hợp chất T3 TT1 Bảng 2.1 : Phân đoạn cao methanol thô Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR hợp chất T3, ergosterol 3-O-β-D-glucopyranoside, TT1 ergosterol 14 iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục Phổ H-NMR hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 Phụ lục Phổ 13 C hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 Phụ lục Phổ HSQC hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 Phụ lục Phổ HMBC hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 Phụ lục Phổ COSY hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 Phụ lục Phổ H-NMR hợp chất TT1 dung môi CDCl3 v LỜI MỞ ĐẦU Cùng với phát triển Y học nói chung Y học dân tộc nói riêng xu hướng quay sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lại hiệu cao vừa tác dụng phụ Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên đóng góp thành tựu quý báu cho ngành Hóa học ngành Sinh học Y dược học Sự kết hợp chứng khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học góp phần củng cố phát triển Y học cổ truyền Từ thời xa xưa loài nấm thuộc chi Cordyceps xem nguồn nguyên liệu quý, thuốc quý y học để giúp người chữa bệnh Phổ biến loại nấm Cordyceps sinensis (còn gọi Đông Trùng Hạ Thảo) Những nghiên cứu gần cho biết polysaccharide diện C sinensis thể đa dạng hoạt tính sinh học kháng oxi hóa, ức chế miễn dịch chống xơ vữa động mạch, nucleoside mang đa tác dụng macrophage cordycepin có hoạt tính ức chế phát triển khối u ức chế miễn dịch Vì thế, loài nấm thu hút nhiều nhà nghiên cứu năm gần dựa giá trị dinh dưỡng dược học Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên loài nấm giảm dần mơi trường sống khắc nghiệt khai thác mức nguồn nguyên liệu Gần đây, vài loài nấm thuộc chi Cordyceps chiết tách nuôi cấy phịng thí nghiệm [25] Tuy nhiên số nguyên cứu gần chứng tỏ có khác thành phần hàm lượng hợp chất hóa học nấm tự nhiên nấm nuôi cấy Xuất phát từ ứng dụng Y học quý giá kế thừa kết nghiên cứu nước chi Cordyceps, tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học lồi nấm Cordyceps neovolkiana vi Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa phân loại chi Cordyceps Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C sinensis, C militaris, C pruinosa C ophioglossoides nguồn nguyên liệu quý dược học Thành phần dược liệu lồi nấm khơ thuộc chi Cordyceps phát triển ấu trùng Trong đó, phổ biến loài nấm Cordyceps sinensis, gọi với tên Đông Trùng Hạ Thảo (Tiếng Trung Quốc, Dong-Chong-Xia-Cao hay Tochukaso, tiếng Nhật) Tên gọi bắt nguồn từ thay đổi theo mùa Vào mùa đơng, ấu trùng nhiễm nấm chuyển thành sâu sống đất gọi Đông Trùng Khi sang hè, stroma phát triển đầu ấu trùng có hình dáng giống cỏ nên gọi Hạ Thảo Ở Trung Quốc, vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm [22] 1.1.2 Hoạt tính hợp chất có chi Cordyceps Thành phần hóa học chi Cordyceps tìm thấy gồm có cordycepin (30deoxyadenosin) dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein peptides có chứa thành phần aminoisobutyric acid Các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng ung thư, kháng đột biến (anti-metastatic), ức chế miễn dịch (immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng khuẩn, hạ lipit máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh thận Những nghiên cứu gần cho biết polysaccharide diện C sinensis thể đa dạng hoạt tính sinh học : chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, nucleoside mang đa tác dụng macrophage cordycepin có hoạt tính ức chế phát triển khối u ức chế miễn dịch 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS Các hợp chất Cordycepin (3’-deoxyadenosine), 3’-amino-3’deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid Dmannitol lập từ lồi nấm thuộc chi Cordyceps từ năm 1950 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc Từ kiện phổ so sánh với liệu phổ ergosterol [7] , hợp chất T1 kết luận ergosterol H H3 C CH3 CH3 H HO CH3 H H Hình 3.4: Cấu trúc hợp chất TT1 13 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR hợp chất T3, ergosterol 3-O-β-D[1] glucopyranoside ,TT1 ergosterol [7] T3 (*) N δH, J (Hz) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 3.56 (m) 5.52 (m) 5.33 (m) 0.57 (s) 0.86 (s) 1.00 (d, 6.5) 5.17 22 (dd, 15.0, 8.0) 5.23 23 (dd, 15.5, 7.0) 24 25 26 27 28 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’A 6’B (*) ghi DMSO; 0.80 (d, 7.0) 0.79 (d, 6.5) 0.87 (d, 7.0) 4.23 (d, 7.5) 2.98 (m) 3.07 (m) 3.12 (m) 3.00 (m) 3.63 (m) 3.40 (m) (**) ghi C5D5N5 (***) ghi CDCl3 14 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Từ loài nấm Cordyceps neovolkiana, tiến hành điều chế thu cao ethanol thơ Cao ethanol thơ hịa tan nhiều lần methanol, tách riêng phần kết tủa dịch methanol thô Sau tiến hành phương pháp sắc ký cột sắc ký bảng mỏng cao methanol thô thu hợp chất T3 TT1 xác định ergosterol 3-O-βD-glucopyranoside ergosterol H CH3 H3C H OH H O O HO HO H HO H Hình 4.1: Cấu trúc hợp chất T3 hợp chất TT1 4.2 KIẾN NGHỊ Vì điều kiện thời gian vật chất không cho phép, nên phạm vi đề tài này, khảo sát phân đoạn cao A1, A3 Trong thời gian tới, có điều kiện chúng tơi tiến hành khảo sát phân đoạn cao lại Đồng thời tiến hành thử nghiệm số hoạt tính sinh học loại cao hợp chất lập H 15 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ahmad V U., Basha A., “Spectroscopic data of steroid glycosides: Cholestanes, ergostanes, withanolides, stigmastane", Springer, New York, USA, pp 359–522, 2006 [2] Boros C., Hamilton S M., Katz B., Kulanthaivel P., “Comparison of balanol from Verticillium balanoides and ophiocordin from Cordyceps ophioglossoides”, J Antibiot (Tokyo), 47, 1010–1016, 1994 [3] Chatterjee R., Srinivasan K S., Maiti P C., “Cordyceps sinesis (Berkeley) Saccardo: structure of cordycepic acid”, J Am Pharm Assoc Am Pharm Assoc (Baltimore), 46, 114–118, 1957 [4] Cheung JK , Li J., Cheung AW., Zhu Y., Zheng KY., Bi CW., Duan R., Choi RC., Lau DT., Dong TT., Lau BW., Tsim KW., “Cordysinocan, a polysaccharide isolated from cultured Cordyceps, activates immune responses in cultured T-lymphocytes and macrophages: signaling cascade and induction of cytokines”, J Ethnopharmacol., 124(1), 61-8, 2009 [5] Chun K Lob, Jerry K H Cheungb, Shang Q Zhub, Karl W K Tsimb, “A polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine, protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury, Life Sciences 73, 2503–2513”, 2003 [6] Cunningham K G., Manson W., Spring F S., Hutchinson S A., “Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link”, Nature, 166, 949, 1950 [7] Huneck S., Yoshimura I., “Intendification of lichen substance”, Springer, Berlin, 391, 1997 [8] Isaka M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620 II Structure elucidation.” , J Antibiot (Tokyo), 54, 36–43, 2001 16 Khóa Luận Tốt Nghiệp [9] Lê Tấn Lộc Isaka M., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Structures of cordypyridones A-D, antimalarial N-hydroxy- and N-methoxy-2-pyridones from the insect pathogenic fungus Cordyceps nipponica.”, J Org Chem., 66, 4803–4808, 2001 [10] Kaczka E A., Trenner N R., Arison B., Walker R W., Folkers K., “Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’-deoxyadenosine”, Biochem Biophys Res Commun., 14, 456–457, 1964 [11] Kawaguchi N., Ohmori T., Takeshita Y., Kawanishi G., Katayama S., Yamada H., “Occurrence of Gal beta (1—3) GalNAc-Ser/Thr in the linkage region of polygalactosamine containing fungal glycoprotein from Cordyceps ophioglossoides”, Biochem Biophys Res Commun., 140, 350–356, 1986 [12] Kim K M., Kwon Y G., Chung H T., Yun Y G., Pae H O., Han J A., Ha K S., Kim T W., Kim Y M., “Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits in vitro and in vivo inflammatory mediators by suppressing NF-kappaB activation”, Toxicol Appl Pharmacol., 190, 1–8, 2003 [13] Kim S W., Hwang H J., Xu C P., Sung J M., Choi J W., Yun J W., “Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738”, J Appl Microbiol., 94, 120–126, 2003 [14] Kim S W., Xu C P., Hwang H J., Choi J W., Kim C W., Yun J W., “Production and characterization of exopolysaccharides from an enthomopathogenic fungus Cordyceps militaris”, NG3 Biotechnol Progr., 19, 428–435, 2003 [15] Krasnoff S B., Reátegui R F., Wagenaar M M., Gloer J B., Gibson D M., “Cicadapeptins I and II: new Aib-containing peptides from the entomopathogenic fungus Cordyceps heteropoda”, J Nat Prod 68: 5-50, 2005 [16] Kneifel H., Konig W A., Loeffler W., Muller R., “Ophiocordin, an antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides Arch.”, Microbiol., 113, 121–130, 1977 [17] Kredich N M., GuarinoA J., “Homocitrullyl amino adenosine, a nucleoside isolated from Cordyceps militaris”, J Biol Chem., 236, 3300–3302, 1961 17 Khóa Luận Tốt Nghiệp [18] Lê Tấn Lộc Li S P., Li P., Dong T T., Tsim K W., “Anti-oxidationactivity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia”, Phytomedicine, 8, 207– 212, 2001 [19] Li S P., Li P., Dong T T., Tsim K W., “Determination of nucleosides in natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia by capillary electrophoresis”, Electrophoresis, 22, 144–150, 2001 [20] Li S P., Li P., Lai C M., Gong Y X., Kan K K., Dong T T., Tsim K W., Wang Y T., “Simultaneous determination of ergosterol, nucleosides and their bases from natural and cultured Cordyceps by pressurised liquid extraction and high-performance liquid chromatography”, J Chromatogr A, 1036, 239–243, 2004 [21] Liu J M., Zhong, Y R., Yang Z., Cui S L., Wang F H., “Chemical constituents of Cordyceps militaris (L.) Link.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 14, 608–609, 1989 [22] Methacanon P., Madla S., Kirtikara K., Prasitsil M., “Structural elucidation of bioactive fungi-derived polymers”, Carbohydrate Polymers, 60, 199–203, 2005 [23] Ng T B., Wang H X., “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, Journal of Pharmacy and pharmacology, 57, 1509–1519, 2005 [24] Rongmin Yu, Yin Yin, Wei Yang, Weili Ma, Lin Yang, Xiujuan Chen, Zhang Zhang, Bin Ye, Liyan Song, “Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers 75, 166–171, 2009 [25] Rukachaisirikul V., Pramjit S., Pakawatchai C., Isaka M., Supothina S “10- membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816”, J Nat Prod., 67, 1953–1955, 2004 [26] Wang J., Kan L., Nie S., Chen H., Cui S W., Phillips A O., Phillips G O., Li Y., Xie M., “Comparison of chemical composition, bioactive components and antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps sinensis”, LWT - Food Science and Technology, 63, 2-7, 2015 [27] Wu Y L., Sun C R., & Pan Y J., “Studies on isolation and structural features of a polysaccharide from the mycelium of a Chinese edible fungus (Cordycepsm sinensis)”, Carbohydrate Polymers, 63, 251–256, 2006 18 Khóa Luận Tốt Nghiệp [28] Lê Tấn Lộc Xiao J H., Chen D X., Wan W H., Hu X J., Qi Y., Liang Z Q., “Enhanced simultaneous production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions”, Process Biochemistry, 41, 1887–1893, 2006 [29] Yang M L., Kuo P C., Hwang T L., Wu T S., “Anti-inflammatory Principles from Cordyceps sinensis”, J Nat Prod., 74, 1996–2000, 2011 [30] Yu R M., Song L Y., Zhao Y., Bin W., Wang L., Zhang H.,et al., “Isolation and biological properties of polysaccharide CPS-1 from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 465–472, 2004 [31] Yu R M., Wang L., Zhang H., Zhou C X., Zhao Y., “Isolation, purification and identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 662–666, 2004 [32] Yu R M., Yang W., Song L Y., Yan C Y., Zhang Z., Zhao Y., “Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers, 70, 430–436, 2007 19 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất T3 dung môi DMSO- 2' 5235.5 5165.330324 5.5.3195.2472165.5.2025.1871715.4.8944.885 6393.6133.3.5453.4063833.1183.3.0673.015997 2.2.8912.882 5235.5.516 37542.42.01338.36237.68494436.70236 Phụ lục Phổ 13C h ợp chất T3 dung môi DMSO-d6 378119 459140.707139.135.321131.484 f1 (ppm) 5.6 5.4 5.2 42 22 5.0 24 13 40 1.18322 052 1.09 001 H H HO HO HO H Phụ lục Phổ HSQC hợp chất T3 dung môi DMSO- 6.5 7.0 130 135 140 145 27 26 19 28 25 24 17 14 6' 3' 5' 2' 1' Phụ lục Phổ HMBC hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 18 23 5.5 H H3C H Phụ lục Phổ COSY hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 H 4'-OH HO 23 HO 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 5' 4.0 2' 3' 4' 4.5 6' 6' 5.0 5.5 5.5 f1 (ppm) 5.8 5.6 2.31 1.03 2552 2832 2.307 2.310 4492 2.454 2.458 2.463 2.477 2.482 2.487 2.491 5.148 5.179 5.194 5.203 5.217 5.248 5.373 5.378 5.384 5.389 5.395 5.564 5.569 5.575 5.580 Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất TT1 dung môi CDCl 001 58 05 755 95 5 45 3955 38 95 38 45 378 37 35 248 335 175 20 35 19 45 795 645 148 CS-TT1-CDCL3-13C H H3C H 5.4 5.2 CH3 19 HO H 21 23 22 5.0 ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA GVHD: ThS Lê... khác thành phần hàm lượng hợp chất hóa học nấm tự nhiên nấm nuôi cấy Xuất phát từ ứng dụng Y học quý giá kế thừa kết nghiên cứu nước chi Cordyceps, tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học lồi nấm. .. ngành Hóa học ngành Sinh học Y dược học Sự kết hợp chứng khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học góp phần củng cố phát triển Y học cổ truyền Từ thời xa xưa loài nấm