tiểu luận chất kháng sinh penicillin

Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin...7 2.Công thức cấu tạo của penicillin...9 3.Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc...10 3.1.Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNGĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài Tiểu luận

Vi Sinh Vật Công Nghiệp

Đề Tài: Chất Kháng Sinh Penicillin

GV: Nguyễn Thị Thu Huyền

Học Kỳ II Năm Học 2023-2024

Lời Cam ĐoanChúng tôi xin cam đoan tiểu luận này do chúng tôi tự tìm hiểu và thực hiện.

Tiểu luận này đảm bảo tính trung thực, không vi phạm bản quyền và không saochép bài của người khác

Các tài liệu được sử dụng trong tiểu luận này đều nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng đảmbảo tính khoa học

Chúng tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với các nội dung được nêu trong tiểu độinày

(Ký và ghi rõ họ tên)

II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 7

1 Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin 7

2.Công thức cấu tạo của penicillin 9

3.Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc 10

3.1.Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P.chrysogenum 10

3.2.Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P.chrysogenum 10

3.3.Tác động của các thông số công nghệ đến quá trình sinh tổng hợp penicillin 11

4.Phân loại penicillin 15

III Quy trình sản xuất penicillin từ vi sinh vật: 16

1.Chuẩn bị lên men: 17

2.Kỹ thuật lên men: 18

2.1.Kỹ thuật lên men bề mặt: 18

2.2.Kỹ thuật lên men chìm: 20

3.Xử lí dịch lên men và tinh chế thu penicillin tự nhiên: 21

IV Ứng dụng của Penicillin 22

V.Kết luận 23

I.Giới Thiệu Chung về chất kháng sinh

1.Lịch sử phát hiện chất kháng sinh:

Chất kháng sinh (antibiotic) được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin,

vào những năm 40 của thế kỷ XX Tuy nhiên, thực tế, từ lâu con người đã biết dùng

nấm mốc (mold, milew) trên đậu phụ để đắp chữa các vết thương nhỏ Nhiều thế kỷ

trước tại châu Âu, châu Mỹ, người ta đã biết cách dùng bánh mỳ, ngô hay giày da cũ

đã lên mốc để điều trị các vết lở loét, lên mủ ở da

Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì móc meo trên đậu phụ hay trên bánh mỳthực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn, chân khuẩn

là gì, lại càng không biết chất kháng sinh là gì Năm 1928, Flemming là nhà vi khuẩn học làm việc tại Bệnh viện Saint Mary ở London Trong khi kiểm tra các đĩa nuôi

cấy chứa vi khuẩn, ông phát hiện hiện tượng khác thường: nấm xuất hiện trên đĩa vàphát triển thành các tảng nấm; xung quanh tảng nấm, những mảng vi khuẩn đã bị pháhủy

Ông kết luận rằng, nấm này đã tạo 1 chất giết chết các vi khuẩn Loại nấm mọc

giống như dạng các bụi cây này sau được đặt tên khoa học là penicillium notatum, còn chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn được đặt là pennicillin Ban đầu, penicillin

được dùng chữa các vết thương bề mặt, nó chỉ mang lại thành công nhất định vì trong

penicillin thô có rất ít các hoạt chất Flemming đã cố gắng tách penicillin nguyên chất nhưng không thành công 10 năm sau, ở Oxford, dưới sự chỉ đạo của Howara Walter Florey - nhà giải phẫu bệnh học người Australia và Ernst Boris Chain đã nghiên cứu với mục đích là chế tạo penicillin trên quy mô công nghiệp Nhiều kỹ

thuật như dùng tia cực tím, tia X và các chất hóa học tác động đến cấu trúc di truyền

của nấm đều được sử dụng nhằm tạo ra chủng penicillin với sản lượng cao

Năm 1943, dự án chế tạo penicillin đứng thứ nhì trong danh sách các công trình

ưu tiên sau dự án Mahattan chế tạo bom nguyên tử Năm 1944, một ca chữa trị bằng penicillin tốn 200 đô-la, tuy nhiên, giá này nhanh chóng giảm xuống, rẻ hơn cả giá

đóng gói sản phẩm

Năm 1945, Flemming, Chain và Florey được trao tặng giải thưởng Nobel y

học.Sau Chiến tranh thế giới thứ 2, cùng với bước tiến lớn trong khoa học kỹ thuật,nhiều loại thuốc kháng sinh đã lần lượt được tạo ra và phát triển mạnh mẽ

Chính penicilin đã hối thúc các nhà khoa học lao vào nghiên cứu, khám phá ra các

loại thuốc kháng sinh mới Họ không sợ vất vả hay nguy hiểm để tìm chọn các loại

khuẩn mới từ những nơi dơ bẩn nhất như trong đất mùn, nước cống rãnh hôi thối vàđống rác sinh hoạt đã bốc mùi… bởi họ cho rằng càng ở những nơi như vậy thì mớicàng có nhiều loại khuẩn ký sinh và việc thu thập hay chọn lựa mới mang lại nhiềuhiệu quả Khi đó có thể được gọi là đã mở ra một “cơn sốt” tìm thuốc kháng sinhtrong đống rác trên toàn thế giới, chủ yếu lúc bấy giờ là tại phương Tây

Kết quả là chỉ trong một thời gian ngắn, nhiều loại thuốc kháng sinh đã ra đời,

đáng kể đó là streptomycin, neomycin, erythromycin… Trên kinh nghiệm bào chế penicilin nên việc phát hiện và sản xuất các loại kháng sinh mới khác gặp nhiều thuận

lợi Tuy vậy các nhà khoa học cũng đã bỏ ra khá nhiều công sức Có thể nói mỗi sảnphẩm mới đều là sự nổ lực hết mình của họ

Sự ra đời của streptomycin là một ví dụ, các nhà khoa học do Waksman lãnh đạo

đã vùi đầu trong phòng thí nghiệm để chọn lọc từ 10.000 giống vi khuẩn Cuối cùng

họ mới tách ra được một giống lý tưởng nhất, đó chính là streptomycin mà chúng ta

đang dùng rộng rãi ngày nay Từ thập niên 60 của thế kỷ trước tới nay, nhiều công

trình nghiên cứu thuốc kháng sinh phát triển theo chiều sâu Chloromycetin (pasaxin) là loại thuốc kháng sinh đầu tiên dùng phương pháp tổng hợp hóa học bào

chế nên

Từ thập niên 80 của thế kỷ trước, các công trình nghiên cứu bào chế kháng sinh đã

có nhiều bước tiến vượt bậc và đã đưa vào sử dụng loại thuốc kháng sinh đa năng mới

bằng phương pháp bán tổng hợp là cephalosperin (cynnematin) Chỉ riêng mỗi loại

này hiện cũng đã có hơn 30 chủng khác nhau Hằng năm, số lượng các thuốc khángsinh mới được đưa ra thị trường lên đến hàng chục và tính đến nay số loại kháng sinh

có thể đến hàng ngàn Ước tính đến nay, con người biết được khoảng 8000 loại khángsinh, trong đó khoảng 100 loại được sử dụng trong y học

Theo quan niệm truyền thống kháng sinh được định nghĩa là những chất do các vi

sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) tạo ra có khả năng ức chế sự phát triển hoặc

tiêu diệt vi khuẩn

Ngày nay kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được tạo rabằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinhcũng thay đổi, hiện nay kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc visinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học Với liều thấp nhất có tác dụngkìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.

Kháng sinh còn có nhiều cách phân loại nhưng chủ yếu là phân loại theo phổ tác dụng

và theo cơ chế tác dụng của kháng sinh:

+ Theo phổ tác dụng: được chia làm 2 loại gồm Kháng sinh phổ hẹp và kháng sinh phổ rộng

+ Theo cơ chế tác dụng : theo các nhóm Beta lactam, Aminoglycosid, Macrolid, Lincosamid, Quinolon, Glycopeptide, các nhóm khác như Oxazolidone, Chloramphenicol, Tetracyclin,

Nitro-imidazol, Sulphonamid, Trimethoprime, Polymyxin,….

3.Cơ chế tác dụng:

1 Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

 Với vi khuẩn Gram âm:

Nhóm bêta lactam đi vào tế bào thông qua kênh porin ở màng ngoài của tế bào

vi khuẩn và gắn với PBP (Penicillin Binding Protein), là một enzyme tham giavào quá trình nối peptidoglycan để tạo vách vi khuẩn

 Với vi khuẩn Gram dương:

Vi khuẩn gram dương không có lớp màng ngoài của tế bào, nên bêta-lactam tácđộng trực tiếp lên PBP Nhóm Glycopeptide (Vancomycin) gắn với D-alanyl-D-alanine, từ đó ảnh hưởng lên quá trình tổng hợp peptidoglycan

2 Gây ức chế màng bào tương

 Màng bào tương có chức năng chính là thẩm thấu chọn lọc các chất Khi khángsinh gắn được lên màng làm thay đổi tính thấm chọn lọc của màng khiến chocác thành phần ion bên trong bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài đi vào, hậuquả là gây chết tế bào

Ví dụ: Polymyxin B, colistin gắn vào màng tế bào của vi khuẩn gram âm

3 Ức chế sinh tổng hợp Protein

 Tetracycline: gắn lên tiểu đơn vị 30s, ngăn cản tRNA gắn với ribosome, là kháng sinh kiềm khuẩn

mRNA- Aminoglycoside: gắn lên tiểu đơn vị 30s, ngăn cản quá trình phiên mã mRNA,đồng thời làm mRNA phiên mã sai, là kháng sinh diệt khuẩn.

 Macrolide, lincosamide: gắn lên tiểu đơn vị 50s, kết thúc quá trình phát triểncủa chuỗi protein, là kháng sinh kiềm khuẩn

 Clorpheninramin: gắn lên tiểu đơn vị 50s và ngăn cản quá tình gắn các acidamin tạo chuỗi protein, là kháng sinh kiềm khuẩn

 Linezolid: gắn với 23S ribosomal RNA của tiểu đơn vị 50s, ngăn cản quá trìnhtạo phức hợp 70s cần cho tổng hợp protein; là kháng sinh kiềm khuẩn

4 Ức chế sinh tổng hợp Acid Nucleic

 Quinolone: tác động lên enzyme DNA gyrase và topoisomerase IV ảnh hưởnglên quá trình nhân đôi DNA

 Rifampicin: gắn vào DNA-dependent RNA polymerase, ức chế tổng hượpRNA của tế bào vi khuẩn

5 Ức chế sinh tổng hợp folate:

 Sulfonamide: thuốc có cấu trúc gần giống với PABA (para-aminobenzoic), nêncạnh tranh với PABA là chất tham gia vào quá trình chuyển hóa acid folic (làtiền chất để tổng hợp acid nucleic), tác dụng kiềm khuẩn

 Trimethoprime: ức chế enzyme dihydrofolate reductase, ảnh hưởng lên quátrình tổng hợp acid folic, tác dụng kiềm khuẩn

II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN

1 Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin

Một sự kiện tình cờ xảy ra tại một phòng thí nghiệm ở London vào năm 1928 đã thay đổihướng đi của y học Alexander Fleming, một nhà vi khuẩn học tại Bệnh viện St Mary, đãtrở về sau kỳ nghỉ khi đang nói chuyện với một đồng nghiệp, ông nhận thấy một vùngxung quanh một loại nấm xâm lấn trên đĩa thạch mà vi khuẩn không phát triển Sau khiphân lập nấm mốc và xác định nó thuộc chi Penicillium , Fleming đã thu được dịch chiết

từ nấm mốc và đặt tên hoạt chất của nó là penicillin Ông xác định rằng penicillin có tácdụng kháng khuẩn đối với tụ cầu khuẩn và các mầm bệnh gram dương khác

Fleming công bố phát hiện của mình vào năm 1929 Tuy nhiên, những nỗ lực của ông đểtinh chế hợp chất không ổn định từ chiết xuất đã vượt quá khả năng của ông Trong mộtthập kỷ, không có tiến bộ nào trong việc phân lập penicillin như một hợp chất trị liệu.Trong thời gian đó, Fleming đã gửi khuôn Penicillium của mình cho bất kỳ ai yêu cầu với

hy vọng rằng họ có thể phân lập được penicillin để sử dụng trong lâm sàng

Sau đó, Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men

bề mặt (1931) Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lực nhằm tách và tinhchế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh củachế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên

Tại Đại học Oxford, Ernst Chain tìm thấy bài báo năm 1929 của Fleming vềpenicillin và đề xuất với người giám sát của ông, Howard Florey, rằng ông nên cố gắng

cô lập hợp chất này Người tiền nhiệm của Florey, George Dreyer, đã viết thư choFleming trước đó vào những năm 1930 về một mẫu chủng Penicillium của ông để kiểmtra vi khuẩn như một lý do có thể cho hoạt động kháng khuẩn (nó không có) Tuy nhiên,

sự căng thẳng đã được cứu ở Oxford Năm 1939, Howard Florey đã tập hợp một nhóm,trong đó có chuyên gia về nấm, Norman Heatley, người đã nghiên cứu việc trồngPenicillium spp với số lượng lớn, và Chain, người đã tinh chế thành công penicillin từdịch chiết từ nấm mốc

Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột

Năm 1942, đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Penicillium chrysogenumNRRL 1951 (1943) và sau đó đã được biến chủng P chrysogenum Wis Q176 (chủng nàyđược xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trêntoàn thế giới ); đã thành công trong việc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men đểlên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944)

Hình 1: Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 về công trình penicillin

Penicillin được xem là loại kháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng rãi trongđiều trị và được sản xuất ra với lượng lớn nhất trong số các chất kháng sinh đã được biếthiện nay Chúng tác dụng lên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ địnhđiều trị trong các trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ nhưviêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùngmáu Thời gian đầu penicillin được ứng dụng điều trị rất hiệu quả Tuy nhiên, chỉ vàinăm sau đã xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượng này ngày càng phổ biếnhơn

Vì vậy 1959, Batchelor và đồng nghiệp đã tách ra được axit 6-aminopenicillanic.Đây là nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau

Đối với Việt Nam, năm 1946, giáo sư Đặng Văn Ngữ đã thành công trong việc sảnxuất nước lọc penicillin trong môi trưởng nước ngô góp phần đáng kể vào việc cứu chữathương bệnh binh và đã được Bác Hồ thưởng Huân chương Lao động hạng ba cho thànhtựu kỳ diệu chưa từng ai làm được này

2.Công thức cấu tạo của penicillin

Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòngthiazolidine, một vòng -lactam, một nhóm amino có gắn với CO2 và một mạch bên (R).ẞ-lactam, một nhóm amino có gắn với CO2 và một mạch bên (R).Tất cả các penicillin đều là dẫn suất của acid 6-aminopenicillanic Sự thay thế R tạo nhiềuacid amin khác nhau, hầu hết các penicillin đều được phân phối dưới dạng muối natrihoặc muối kali

Hình 2: Cấu tạo chung của phân tử penicillin

Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm penicillin (trong đóchỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và tiếp tục triển khai đểsản xuất các chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác

3.Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc

3.1.Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P.chrysogenum

Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng cácchủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum và P baculatum Nhưng từ khi trường đạihọc Wisconsin (Mỹ) phân lập được chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao hơn thì chủngnày dần dần đã thay thế và từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX đến nay tất cả cáccông ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng các biến chủng P.chrysogenum côngnghiệp

Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin trên nguyên tắccũng trải qua sáu giai đoạn cơ bản, trong đó giải pháp kỹ thuật đã được áp dụng hiệu quả

để thu nhận biến chúng "siêu tổng hợp" penicillin lại chính là các kỹ thuật gây đột biến

thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím và tạo đột biến bằng hoá chất, thí dụnhư Metylbis - amin (metyl-2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris-β-clo- etylamin),Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4-diepoxybutan.

3.2.Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P.chrysogenum

Theo quan điểm phổ biến hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc

P chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α-aminoadipic, cystein

và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ - (a-aminoadipyl) - cysteinyl - valin; tiếp theo làquá trình khép mạch tạo vòng β-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N;rồi trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sảnphẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G trong hình

Hình 3: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-α-aminoadipic, L-cystein

và L-valin

Tuy nhiên, cũng có thể nó được giải phóng ra và tích tụ trong môi trường (vì trongquá trình lên men sản xuất penicillin V bao giờ cũng phát hiện thấy trong dịch lên menlượng lớn α-aminoadipic dạng vòng) Như vậy, quá trình sinh tổng hợp penicillin, phụthuộc vào điều kiện lên men cụ thể nhất định, có thể xảy ra theo sáu đường hướng khácnhau Do đó, hiệu suất chuyển hoá cơ chất - sản phẩm cũng biến đổi và phụ thuộc vàođường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyết thì hiệu suất lên men sẽ trongkhoảng 683 - 1544 Ul penicillin/g glucoza; song, trong thực tế, với những chủng có hoạttính sinh tổng hợp cao nhất cũng mới chỉ đạt khoảng 200 UI/g glucoza

3.3.Tác động của các thông số công nghệ đến quá trình sinh tổng hợp penicillin.

3.3.1Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm

Sự phát triển hệ sợi nấm trong quá trình lên men bao gồm:

- Sự tăng trưởng về kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, sự lớn lên về kích thước, mức độphân nhánh của hệ sợi )

- Sự biến thiên về số lượng khóm sợi nấm trong môi trường: Thông thường, sự phát triểnnày được đánh giá qua hai chỉ tiêu là: hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên hàmlượng sinh khối trong môi trường Hai chỉ tiêu này có thể xác định bằng nhiều phươngpháp khác nhau như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi hoặc sinh khối khô), mật độquang dịch lên men, trở lực lọc của dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượnghydratcacbon, hàm lượng axit nucleic Trong các phương pháp trên, được áp dụng phổbiến hơn cả trong sản xuất công nghiệp là phương pháp xác định qua hàm lượng sinhkhối

-Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt các yếu tố khác nhau trong quá trìnhlên men và sự tích tụ penicillin thường xảy ra mạnh mẽ khi hệ sợi phát triển đạt trạng tháicân bằng Trạng thái này có thể xác lập được khi chỉ cung cấp vừa đủ và liên tục lượngthức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm sẽ tự phân, còn nếu cung cấpquá nhu cầu trên, hệ sợi sẽ phát triển, nhưng không tích tụ mạnh penicillin mà tích tụnhiều axit gluconic và axit malic

- Đặc điểm hình thái và cấu trúc hệ sợi nấm: Trong quá trình lên men, do nhiều nguyênnhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm bao giờ cũng có xu hướng tăng lên, ngay cảtrong quá trình lên men tĩnh Trong điều kiện lên men có sục khí và khuấy trộn, do tácdụng va đập cơ học với cánh khuấy và các chuyển động dòng xoáy trong môi trường, mộtmặt sự đứt gãy hệ sợi nấm xảy ra nhiều hơn và hệ sợi nấm bao giờ cũng có xu hướng vóncuộn lại thành cấu trúc búi sợi cuộn xoắn, được gọi là pellet

+ Pellet xốp (fluffy loose pellets) là dạng pellet có phần bên trong hệ sợi cuộn thành khốichắc và mịn, lớp sợi phía bên ngoài cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp hơn

+ Pellet chắc và mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm là phần sợi phía bên trongpellet cuộn tương đối chặt chẽ ra đến gần sát lớp sợi phía ngoài, lớp sợi phía ngoài cùngcũng cuộn đủ chắc thành lớp sợi mịn

+ Pellet rỗng (hollow pellets) là dạng pellet có phần sợi bên trong bị tự phân tạo thànhkhoảng rỗng, hệ sợi phía bên ngoài cuộn rất chặt thành lớp sợi mịn và chắc chắn