CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN

Các kháng sinh là một nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ các thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các vi khuẩn. Trong các loại kháng sinh thì penicillin là kháng sinh được tìm thấy đầu tiên trên thế giới bởi nhà khoa học alexander fleming vào năm 1928 và được sử dụng phổ biến cho đến hôm nay. Chủng nấm penicillium chrysogenum cho năng suất tạo penicillin cao hơn các chủng khác nên từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX đến nay tất cả các công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng các biến chủng p.chrysogenum công nghiệp. Bài tiểu luận này sẻ nói về quy trình sản xuất penicillin theo quy mô công nghiệp từ chủng p.chrysogenum.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  BÀI TIỂU LUẬN Đề Tài: CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN GVHD: PHẠM MINH TUẤN SVTH: Trần Vũ Phong Trương Huy Kha Diệp Anh Nguyễn Thị Xuân Hiệu Nguyễn Thị Thu Thảo Nguyễn Thị Thân TP.HCM, tháng 12 năm 2012 MSSV: 2008100138 2008100120 2008100049 2008100112 2008100187 2008100146 MỤC LỤC  LỜI MỞ ĐẦU .2  NỘI DUNG 1.Sơ lược lịch sử phát triển penicillin 2.Quy trình sản xuất penicillin công nghiệp từ nấm Penicillium chrysogenum 2.1.Phân loại penicillin 2.2.Đặc điểm chung quy trình 2.3.Quy trình sản xuất Penicilin 2.4.Thuyết minh quy trình .11 2.4.1.Chuẩn bị lên men 11 2.4.2.Các kỹ thuật lên men 12 2.4.2.1.Kỹ thuật lên men bề mặt .12 2.4.2.2.Kỹ thuật lên men chìm 15 2.4.2.3.Đặc điểm thiết bị lên men 18 2.4.3.Hiệu kinh tế chung trình lên men 20 2.5.Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên 20 2.5.1.Lọc dịch lên men 23 2.5.1.1.Mục đích 23 2.5.1.2.Thiết bị lọc Thu hồi sinh khối nấm .23 2.5.2.Trích ly .24 2.5.3.Tẩy màu 24 2.5.4.Kết tinh, lọc, rửa, sấy thu penicillin tự nhiên .25  KẾT QUẢ 26 Lời mở đầu Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây vi khuẩn Trong loại kháng sinh penicillin kháng sinh tìm thấy giới nhà khoa học alexander fleming vào năm 1928 sử dụng phổ biến hôm Chủng nấm penicillium chrysogenum cho suất tạo penicillin cao chủng khác nên từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng p.chrysogenum công nghiệp Bài tiểu luận sẻ nói quy trình sản xuất penicillin theo quy mơ công nghiệp từ chủng p.chrysogenum Nội dung Sơ lược lịch sử phát triển penicillin Phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vịng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm.Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Tại Mỹ, bắt đầu triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt vào năm 1931 Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại khơng bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột Năm 1942: tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng toàn giới ); thành cơng việc điều chỉnh đường hướng q trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) Hình1.1 Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 cơng trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Hình1.2 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Quy trình sản xuất penicillin công nghiệp từ nấm Penicillium chrysogenum 2.1 Phân loại penicillin Dựa vào nguồn gốc xếp Penicillin vào nhóm : - Penicillin nhóm I :gồm penicillin tự nhiên chiết xuất từ môi trường nuôi cấy nấm Penicillium notatum P chrysogenum Penicillin G Penicillin V Các Penicillin hấp thu nhanh thải trừ khỏi thể nhanh nên thời gian tác dụng ngắn Muốn kéo dài tác dụng phải dùng dẫn xuất chúng procain benzyl Penicillin (kéo dài 24 h) benzathin benzyl Penicillin ( kéo dài tuần ) Các Penicillin chậm dung để tim bắp không tiêm tỉnh mạch - Penicillin nhóm II : Gồm dẫn xuất Penicillin bán tổng hợp có phổ kháng khuẩn hẹp Penicillin G có khả kháng Penicilinase dùng để chữa bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu kháng Penicillin nhóm I methycylin, cloxaxilin - Penicilin nhóm III : Gồm Penicillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng Penicilase kháng vi khuẩn Gram (-) mà Penicillin nhóm II tác dụng bền vững mơi trường dịch vị nên dùng để uống ampixillin, amoxycilin 2.2 Đặc điểm chung quy trình Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao dùng công nghiệp kháng sinh Những chủng nuôi cấy phương pháp bề mặt sở chất tự nhiên tạo thành 10-15 đv/ml kháng sinh Penicillium chrysogenum môi trường nuôi cấy tạo thành hai kiểu khuẩn lạc: - Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng khơng có bào tử; khuẩn ty chất màu nâu; chất màu khơng hồ vào mơi trường - Kiểu II: khuẩn lạc có khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty chất có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì cần phải tách khuẩn lạc kiểu I môi trường thường xuyên kiểm tra để chọn khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ đặc tính giống Hình 2.1 Chủng penicillium ni cấy đĩa petri Hình 2.2 Các chủng penicillium giai đoạn phát triển khác Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại ổn định Đặc tính đặt cho nhà vi sinh vật nhiệm vụ khó khăn: tạo khả sinh kháng sinh cao nhất, giữ ổn định trình nghiên cứu sản xuất Nhiệm vụ có ý nghĩa lớn công nghiệp giống bảo vệ kệ, trạng thái đông khô tới ba năm, đất vơ trùng hai năm Ngày nhờ di truyền học tạo giống ổn định, sau sáu hệ khơng giảm hoạt tính kháng sinh Các nấm Penicillium thường dễ biến đổi hình thái giảm khả sinh kháng sinh Khi xảy biến đổi sinh hàng loạt chủng từ giống nhiệm vụ nhà vi sinh vật lúc phải chọn lại khuẩn lạc khoẻ có nhiều ưu điểm, cần phải tiến hành biện pháp bảo quản thích hợp Trong trình ni cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: - Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ , tế bào chất chưa phân hóa Thỉnh thoảng khơng bào có hạt nhỏ bắt màu trung tính - Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, hạt nhỏ không bào biến cuối giai đọan xuất giọt chất béo nhỏ - Giai đoạn III: Tạo thành giọt chất béo to, khơng cịn khơng bào, tế bào chất ưa kiềm - Giai đoạn IV : Xuất không bào với hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, hạt chất béo nhỏ giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm - Giai đoạn V : Khuẩn ty có hình trống có không bào, vài hạt lớn Các hạt chất béo biến , tính ưa kiềm giảm - Giai đoạn VI : Khuẩn ty có dạng hình trống khơng cịn hạt bắt màu trung tính, khơng bào bắt màu da cam, màu hồng đồng Các hạt chất béo khơng cịn Xuất tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân Quá trình lên men penicillin thuộc loại lên men pha : Pha sinh trưởng ứng với giai đoạn I,II,III Pha sinh penicillin ứng với giai đoạn IV,V,VI Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng sở sản xuất thông tin hạn chế cung cấp công khai, sáng chế thường giới hạn cơng đoạn định; khó đưa công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin phân chia làm bốn cơng đoạn sau (sơ đồ hình 3.3.): - Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G) - Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên - Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên) - Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại Hình 2.3 Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)) 2.3 Quy trình sản xuất Penicilin 10 45 phút Ngay sau kết thúc trùng, chúng tải vào khay hình chữ nhật có kích thước dài 1-1,2 m, rộng 0,6-0,8 m, cao 5-6 cm Lớp môi trường cho vào dày 2-3 cm để đảm bảo độ thóang khí tịan bề mặt mặt môi trường Một số sở dùng nguyên liệu hạt ngũ cốc lớp môi trường dày (3-4 cm) hạt ngũ cốc tạo mơi trường có độ thống khí Trong trường hợp cám mịn phải trộn thêm trấu xay nhỏ (thêm khoảng 20-25%) cùi bắp xay nhỏ trước trùng Để làm môi trường nhân giống, người ta làm Chỉ có điểm khác sau làm ẩm môi trường đến độ ẩm định, người ta phân phối chúng vào dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy kín nút bơng trùng 121oC(0.5 at) 30 phút để nguội cấy giống  Quá trình nhân giống: giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm ống Một ống dùng để kiểm tra trước sản xuất, dùng để sản xuất dùng để bảo quản Song song đó, người ta chuẩn bị bình tam giác dung tích 200-250ml chuẩn bị 50g môi trường Môi trường trùng làm nguội đến 30oC Đổ 10ml trùng làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn vào nước Bằng biện pháp vô trùng (thực tủ cấy vô trùng) chuyển tồn vào bình tam giác trên, lắc cho thật chuyển chúng sang tủ ấm30-37oc Nuôi điều kiện bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường 15 Ta gọi trình thực trình nhân giống cấp 1.Cứ tiếp tục thực ta có giống cấp 2, cấp đủ 5-10% giống cho sản xuất Cứ cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10-15 lần Trong trường hợp vượt ký người ta nuôi khay  Q trình lên men: mơi trường khử trùng làm nguội đến 30oC, tiến hành trộn giống với tỉ lệ 5-10% Các khay xếp chồng lên giá đỡ với khoảng cách định để thống khí thống nhiệt Nấm penicillium q trình phát triển thường tạo nhiệt nấm Aspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả phát triển sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí quạt gió có lắp hệ thống làm Q trình lên men kéo dài 6-7 ngày 24-28oC Trong lên men bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng Môi trường lỏng dùng nuôi cấy bề mặt thu nhận penicillin bao gồm: Bảng 2.1 Thành phần môi trường lỏng Cao ngô 50g Lactose KH2PO4 0,5g MgSO4 ZnSO4 0,044g Nước (bắp) 30g 0,25g NaNO3 3g C6H5CH2COOH 0,2g 1000ml Dung dịch lên men khử trùng 121 oC (0,5 at) 30 phút, phân khối vào khay giống khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáy khay không đục lỗ phải chứa mơi trường lỏng Chiều cao dung dịch môi trường khay - cm Người ta tiến hành lên men khoảng thời gian - ngày nhiệt độ lên men 24 - 28oC 16 Váng nấm sợi giữ lại sau rút hết dịch lên men, tiếp tục sử dụng cho lần lên men Ở lần lên mentiếp theo người ta đổ thêm dịch lên men vào Các thí nghiệm cho thấy nên sử dụng lại 3-4 lần, lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh giảm dần Hình 2.6 Khu vực lên men sản xuất penicillin 2.4.2.2 Kỹ thuật lên men chìm Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp hiên thường vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc không) Trong trình lên men chìm người ta nhân giống mơi trường lỏng Mục đích q trình nhân giống thu nhận số lượng tế bào cao ( thường tính tổng lượng tế bào/ml)  Q trình nhân giống :được bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn mơi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào bình lên men dung tích từ lít hàng ngàn lít Nhiệt độ q trình nhân giống trì khoảng 26 ± oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72 17 Người ta thường nhân giống penicillium mơi trường có thành phần sau: Bảng 2.2 Thành phần môi trường nhân giống Penicillium 0,5% Cao ngô 2% Glucose Sunfat 0,025 sunfat magiê % natri 2% lactose Kaliphotpha 0,05% t monoboric Nitrat amon 0,125% 0,5% 0,2% CaCO3 Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh nay, thường dùng chủng biến đổi gen Công nghệ biến đổi gen tạo chủng siêu tổng hợp kháng sinh Theo Talaro (1993), từ chủng Penicillin chrysogenum có khả sinh tổng hợp 6mg/l, người ta có chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả sinh tổng hợp 85000mg/l penicillin  Quá trình lên men: Q trình lên men mơi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nhất: nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - Pha thứ hai: lên mên thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ 18 glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose ln mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngoài nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H 3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy q trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hịa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang cơng đoạn trích ly tinh chế thu penicillin Bảng 2.3 Thành phần trình lên men STT Thành phần Môi trường Môi trường Môi trường 19 Cao ngô 2,0-2,4 - - 2,0-2,4 2,0-3,0 Khô hạt có dầu (lạc, đậu tương, hướng - dương) Lactose 5,0 5,0 1,0 Glucose hydol 1,0 1,0 1,0 Dầu thực vật 0,5-1,0 0,5-1,0 2,5-3,5 Amon nitrat 0,4 0,4 0,4 Sulfat natri 0,05 0,05 0,05 Kali photphat 0,4 0,4 0,4 Magie sulfat 0,025 0,025 0,25 10 Natri hyposunfit 0,2 0,2 0,2 11 Canxi cacbonat 0.5-1.0 0.5-1.0 0.5-1.0 12 Tiên chất 0.2-0.4 0.3-0.4 0.3-0.4 2.4.2.3 Đặc điểm thiết bị lên men Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mịn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dịng thùng) Cơng suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m3/h Khơng khí nén vô khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vịng xốy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốcbin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt q trình lên men 20 Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m 3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhận sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nên bố trí cho có thểíap dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ thiết bị này) Các thơng số kiểm tra q trình lên men bao gồm: pH mơi trường, nồng độ oxy hịa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên men xây dựng sở khai thác hai kiểu tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát trình lên men dần chiếm ưu sản xuất cơng nghiệp Hình 2.7 Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin 2.4.3 Hiệu kinh tế chung trình lên men 21 Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, cơng nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành cơng nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, cịn lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men) 2.5 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ môi trường ni cấy, là: - Trích ly dung mơi hữu - Hấp phụ - Trao đổi ion Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung môi hữu sử dụng nhiều phương pháp dựa ưu điểm sau: - Muối penicillin dễ tan nước - Acid penicillic dễ tan dung môi hữu Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt sơ đồ hình 3.8 , bao gồm cơng đoạn sau đây: 22 Hình 2.8 Sơ đồ tóm tắt cơng đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên 23  Sơ đồ khối q trình xử lí dịch lên men : 24 2.5.1 Lọc dịch lên men 2.5.1.1 Mục đích Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân 2.5.1.2 Thiết bị lọc Phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc 2.5.1.3 Thu hồi sinh khối nấm Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc 2.5.2 Trích ly Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung mơi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 30C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, q trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dịng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin 25 Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H 2SO4 H3PO4 lỗng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung mơi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung mơi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đệm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO3; sau penicillin lại trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung mơi Hình 2.9 Sơ đồ cơng nghệ trích ly lần dung môi tinh chế Penicillin 2.5.3 Tẩy màu Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung mơi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc 26 đưa chưng thu hồi dung môi xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho mẻ sau 2.5.4 Kết tinh, lọc, rửa, sấy thu penicillin tự nhiên Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH lỗng (hay NaOH lỗng), tiến hành chân khơng nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thơng số cơng nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hịa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy khơng khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác 27 Kết luận Penicillin lọai kháng sinh dùng để điều trị viêm nhiễm người Khám phá penicillin từ phát tình cờ có ý nghĩa to lớn nhân lọai Penicillin thải nhanh người bệnh nhân có chức thận bình thường, đưa vào thể qua đường tỉnh mạch bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng Tác dụng ngược quan trọng phổ biến Penicillin dị ứng Hiện tượng vi khuẩn lờn kháng sinh ngày phổ biến nước, trở nên trầm trọng nơi khơng hạn chế lạm dụng Do đó, không ngừng phải đổi kháng sinh điều trị, ln ln cần có kháng sinh thuộc hệ mới, khoảng cách hai hệ rút ngắn dần Mỗi lần cho hệ đời, công nghệ cần chuyển đổi, đơi phức tạp, địi hỏi đầu tư bổ sung, làm cho giá thành sản phẩm bị nâng cao, kháng sinh đắt 28 Tài liệu tham khảo  Phạm Thành Hổ, Nhập Môn Công Nghệ Sinh Học, nhà xuất Giáo Dục, 2006  Nguyễn Đức Lượng, Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp, NXB ĐHQG tp.HCM, 2006  SOLTERO, F V., AND JOHNSON, M J 1954 Continuous addition of glucose for evaluation of penicillin-producing cultures Appl MIicrobiol., 2, 41-44  UMBREIT, W W., AND BOND, V S 1936 Analyses of plant tissue: Application of a semi-micro Kjeldahl method Ind Eng Chem Anal Ed., 8, 276-278 29 ... khơng giảm hoạt tính kháng sinh Các nấm Penicillium thường dễ biến đổi hình thái giảm khả sinh kháng sinh Khi xảy biến đổi sinh hàng loạt chủng từ giống nhiệm vụ nhà vi sinh vật lúc phải chọn... phẩm penicillin tự nhiên - Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên) - Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại Hình 2.3 Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin. .. tổng hợp có phổ kháng khuẩn hẹp Penicillin G có khả kháng Penicilinase dùng để chữa bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu kháng Penicillin nhóm I methycylin, cloxaxilin - Penicilin nhóm III : Gồm Penicillin bán