BÀI TIỂU LUẬN MÔN : VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP Đề Tài : KHÁNG SINH PENICILLIN (SINH DƯỢC)

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỶ THUẬT MÔI TRƯỜNG BÀI TIỂU LUẬN MÔN : VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP Đề Tài : KHÁNG SINH PENICILLIN (SINH DƯỢC) GVHD: ĐỖ THI HỒNG TUYẾN DANH SÁCH NHĨM: Nguyễn Văn Gió Trần Thị Bích Hà Nguyễn Thị Kim Loan Hồ Trường Sơn Trương Thị Thùy Vân  TP.HCM, Tháng 12, 2013 2008110066 2008110081 2008110150 2008110244 2008110353 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin PHỤ LỤC GIỚI THIỆU CHUNG VE CHẤT KHÁNG SINH 1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.2 Cơ chế tác dụng 2 CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 Lịch sử phát sản xuất penicillin 2.2 Công thức cấu tạo penicillin 2.3 Những vi sinh vật sản sinh penicillin đặc điểm dinh dưỡng chúng: 2.3.1 Penicillium chrysogenum 2.3.2 Penicillium notatum QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT .9 3.1 Đặc điểm chung: .9 3.2 Chuẩn bị lên men 10 3.3 Kỹ thuật lên men 12 3.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt 12 3.3.2 Kỹ thuật lên men chìm 14 3.3.3 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên 18 3.3.4 Lọc dịch lên men 19 3.3.5 Trích ly 20 3.3.6 Tẩy màu 21 3.3.7 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên .21 ỨNG DỤNG CỦA PENICILIN TRONG Y HỌC .22 4.1 Benzylpenicilin .22 4.2 Penicillin V Kali 400.000IU 22 4.3 Procaine penicillin 23 Tài liệu nước .23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1 Định nghĩa kháng sinh Chất kháng sinh hiểu chất hố học xác định, khơng có chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấp (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị 1.2 Cơ chế tác dụng Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất Hình: Vị trí tác dụng số chất kháng sinh GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 Lịch sử phát sản xuất penicillin Penicillin phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Sau đó, Mỹ triển khai lên men thành cơng penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại khơng bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột Năm 1942, tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng toàn giới ); thành công việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin Hình Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 cơng trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Đối với Việt Nam, năm 1946, giáo sư Đặng Văn Ngữ thành công việc sản xuất nước lọc penicillin mơi trường nước ngơ góp phần đáng kể vào việc cứu chữa thương bệnh binh Bác Hồ thưởng Huân chương Lao động hạng ba cho thành tựu kỳ diệu chưa làm GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược 2.2 Kháng sinh penicillin Công thức cấu tạo penicillin Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm vòng thiazolidine, vịng -lactam, nhóm amino có gắn với CO2 mạch bên (R) Tất penicillin dẫn suất acid 6-aminopenicillanic Sự thay R tạo nhiều acid amin khác hầu hết penicillin phân phối dạng muối natrii muối kali Hình: Cấu tạo chung phân tử penicillin Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Hình : Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược 2.3 Kháng sinh penicillin Những vi sinh vật sản sinh penicillin đặc điểm dinh dưỡng chúng: Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc giống nấm mốc penicillium Aspergillus Nhưng chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao dùng công nghiệp kháng sinh Những chủng nuôi cấy phương pháp bề mặt sở chất tự nhiên tạo thành 10-15 đv/ml kháng sinh 2.3.1 Penicillium chrysogenum Khuẩn lạc 5-6 cm đường kính, màu lục vàng, lục xanh, mặt dạng nhung, đơi có vài vùng xốp bơng nhẹ, nhiều rãnh xuyên tâm Mặt trái khuẩn lạc môi trường xung quanh màu vàng, màu nâu tươi Giọt tiết màu vàng chanh Giá bào tử trần nhẵn, phát triển từ hệ sợi nền, phần lớn 3,0-3,5 x 150-350 μm, mang 1-2 nhánh Nhánh với vịng cuống thể bình, vịng thể bình tạo thành chổi ba vịng Nhánh nhẵn 3,0-3,5 x 15-25 μm Cuống thể bình 2-5 đỉnh nhánh 2-3 x 12-15 μm Thể bình xếp thành vòng 4-6 đỉnh cuống thể bình 2,0-2,5 x 8-10 μm Bào tử trần hình eclip, nhẵn, 2,5-3,5 x 3-4 μm, thành cột dài tới 200 μm Hình : Penicillium Chrysogenium Penicillium chrysogenum mơi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc: Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng khơng có bào tử; khuẩn ty chất màu nâu; chất màu khơng hồ vào mơi trường Kiểu II: khuẩn lạc có khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin chất có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì cần phải tách khuẩn lạc kiểu I môi trường thường xuyên kiểm tra để chọn khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ đặc tính giống Hình : Penicillium chrysogenium Thom a- Chổi (bộ máy mang bào tử trần) với chuỗi bào tử trần tụ lại thành dạng cột, b- Chi tiết máy mang bào tử trần (Ảnh: Bùi Xuân Đồng Nguyễn Huy Văn) 2.3.2 Penicillium notatum Khuẩn lạc 3,0-4,5 cm đường kính, màu lục xanh, lục xám xanh, mặt dạng nhung, nhiều rãnh xuyên tâm Mặt trái khuẩn lạc màu vàng tươi, vàng nâu tươi Giọt tiết nhiều, màu vàng tươi, vàng nâu nhạt Giá bào tử trần nhẵn, phát triển hầu hết từ hệ sợi 2,5-3,0 x 250-500 μm, nhánh mang 1-2 nhánh Nhánh có nhẵn, 2,5-3,0 x 10-20 μm Cuống thể bình thành vịng 3-6 đỉnh giá bào tử trần đỉnh nhánh 2,5-3,0 x 10-15 μm Thể bình xếp thành vòng 3-6 2,0-2,5 x 8-10 μm Bào tử trần hình cầu, gần cầu, nhẵn 3,0-3,5 μm đường kính, xếp thành chuỗi song song hay dạng cột, dài tới 100 µm GVHD:ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin Hình : Penicillium notatum Hình : Penicillium notatum Westling Chú thích: a- Chổi (bộ máy mang bào tử trần), b- Bào tử trần, c- Khuẩn lạc chủng nấm Fleming phân lập (chủng NRRI 824) (Raper Thom, 1949) Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại ổn định Đặc tính đặt cho nhà vi sinh vật nhiệm vụ khó khăn: tạo khả sinh kháng sinh cao nhất, giữ ổn định trình nghiên cứu sản xuất Nhiệm vụ có ý nghĩa lớn công nghiệp giống bảo vệ kệ, trạng thái đơng khơ tới ba năm, đất vô trùng hai năm Ngày nhờ di truyền học tạo giống ổn định, sau sáu hệ khơng giảm hoạt tính kháng sinh Chúng ta cần phải nhận thức nấm penicillium thường dễ biến đổi GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin hình thái giảm khả sinh kháng sinh Khi xảy biến đổi sinh hàng loạt chủng từ giống nhiệm vụ nhà vi sinh vật lúc phải chọn lại khuẩn lạc khoẻ có nhiều ưu điểm, cần phải tiến hành biện pháp bảo quản thích hợp QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.1 Đặc điểm chung: Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng sở sản xuất thông tin hạn chế cung cấp công khai, sáng chế thường giới hạn cơng đoạn định Vì khó đưa công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin phân chia làm bốn cơng đoạn sau  Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G)  Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên  Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin Thanh trùng gián đoạn 1210C ( hay trùng liên tục khoảng 140146 0C) lọc qua vật liệu siêu lọc bơm vào thùng lên men Nếu đặc tính cơng nghệ thiết bị lên men cho phép, pha chế trùng đồng thời dịch lên men thiết bị Tất cấu tử bổ sung vào môi trường lên men phải xử lý khử khuẩn trước sau bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn  Thiết bị lên men: Phải vô khuẩn trước đưa vào sử dụng Thường trùng nhiệt 2,5 – 3,0 at thời gian Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc tất thiết bị phụ trợ khác….Trong trình lên men lun cố gắng trì áp suất dư thiết bị nhằm hạn chế rũi ro nhiễm tạp Khơng khí thường khử khuẩn sơ nén đoạn nhiệt, sau qua màng lọc vơ khuẩn hay màng siêu lọc - Chuẩn bị môi trường nhân giống  Chuẩn bị môi trường nhân giống: Để làm môi trường nhân giống người ta chuẩn bị môi trường lên men chúng không chứa lactose (nếu có chứa lượng nhỏ), số khống chất tiền khống chất Mặt khác thành phần mơi trường nhân giống cần tính tốn để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, chất khoáng thành phần khác, đảm bảo cho hình thành phát triển thuận lợi pellet Sau làm ẩm môi trường đến độ ẩm định, người ta phân phối vào chúng vào dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy nút đem trùng 121 oC (0,5 at) 30 phút 3.3 Kỹ thuật lên men: 3.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt: Áp dụng từ lâu, khơng cịn triển khai sản xuất lớn Gồm phương pháp: GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 12 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin * Lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngơ có bổ sung đường lactose) * Lên men bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường lactose - nước chiết ngơ)  Q trình nhân giống Q trình nhân giống giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm ống Một ống dùng kiểm tra trước sản xuất, ống dùng để sản xuất ống dùng để bảo quản Song song đó, người ta chuẩn bị bình tam giác dung tích 200 – 250 ml chuẩn bị 50 g mơi trường phần trình bày Mơi trường trùng làm nguội đến 30oC Đổ 10ml trùng làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn với nước Bằng biện pháp vô trùng (thực tủ ni cấy vơ trùng) chuyển tồn vào bình tam giác lắc cho thật chuyển chúng sang tủ ấm 30 – 37oC Nuôi điều kiện chi đến bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường Ta gọi trình thực trình nhân giống cấp Cứ thực tiếp ta có giống cấp 2, cấp 3…cho đến đủ – 10% giống cho sản xuất Mỗi cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần  Quá trình lên men Đối với phương pháp lên men ngun liệu rắn (cám mì, cám ngơ có bổ sung đường lactose), môi trường khử trùng làm nguội đến 30oC, tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ từ – 10% Các khay xếp chồng lên giá đỡ có khoảng cách định để thống khí thống nhiệt Q trình lên men kéo dài – ngày nhiệt độ 24 – 28oC Ưu điểm phương pháp đường lactose nấm mốc đồng hóa chậm nên không xảy tượng dư thừa đường tế bào, cịn dịch nước chiết ngơ cung cấp cho nấm mốc GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 13 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin nguồn thức ăn nitơ, chất khống chất sinh trưởng, phenylalanin bị thủy phân tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử penicillin Khi lên men môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường 0,2-0,8 kg phenylacetic/m3 dịch lên men Dung dịch lên men sau khử trùng phân phối vào khay có kích thước giống khay ni cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáy khay khơng đục lỗ phải chứa môi trường lỏng Chiều cao dung dịch môi trường khay – cm người ta tiến hành lên men khoảng thời gian – ngày nhiệt độ lên men 24 – 28oC Tiến hành lên men điều kiện môi trường lỏng này, lượng penicillin G tổng hợp tăng rõ rệt hàm lượng penicillin khác giảm Để hạn chế q trình oxy hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường lượng nhỏ axit axetic Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môi trường thường tăng nhẹ, sau tương đối ổn định vào cuối q trình lên men thường khoảng pH = 6,8 – 7.4 Khi sử dụng chất lactose, người ta xác định penicillin tổng hợp tích tụ mạnh mẽ mơi trường nấm mốc sử dụng đường lactose có dấu hiệu cạn kiệt sợi nấm bắt đầu tự phân Vì người ta thường kết thúc trình lên men vào thời điểm hết đường lactose 3.3.2 Kỹ thuật lên men chìm: Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp hiên thường vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc khơng) GVHD:ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN Page 14 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin  Quá trình nhân giống Trong trình lên men chìm người ta nhân giống mơi trường lỏng Mục đích trình nhân giống thu nhận số lượng tế bào cao( thường tính tổng lượng tế bào/ml) Quá trình nhân giống bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào bình lên men dung tích từ lít hàng ngàn lít Nhiệt độ q trình nhân giống trì khoảng 26 ± 1oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72  Quá trình lên men Quá trình lên men mơi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - Pha thứ hai lên mên thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose ln mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên khơng xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngồi nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 15 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hòa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang cơng đoạn trích ly tinh chế thu penicillin * Đặc điểm thiết bị lên men chìm: Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dịng thùng) Cơng suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m3/h Khơng khí nén vơ khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vịng xốy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốc-bin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m 3, hệ số đổ GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 16 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhân sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nên bố trí cho áp dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ thiết bị này) Các thơng số kiểm tra q trình lên men bao gồm: pH mơi trường, nồng độ oxy hịa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên men xây dựng sở khai thác hai kiểu tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát trình lên men dần chiếm ưu sản xuất cơng nghiệp Hình: Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 17 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin * Hiệu kinh tế chung trình lên men chìm Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, cơng nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ ngun liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, cịn lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men ) 3.3.3 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ mơi trường ni cấy, là:  Trích ly dung môi hữu  Hấp phụ  Trao đổi ion Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung mơi hữu sử dụng nhiều phương pháp dựa ưu điểm sau:  Muối penicillin dễ tan nước  Acid penicillic dễ tan dung môi hữu Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt sơ đồ hình 2.9 , bao gồm cơng đoạn sau đây: GVHD:ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN Page 18 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin Hình: Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên 3.3.4 Lọc dịch lên men: Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 19 Đề Tài: Sinh Dược 3.3.5 Kháng sinh penicillin Trích ly: Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung mơi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 30C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, q trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dịng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 H3PO4 lỗng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung mơi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung mơi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đệm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO3; sau penicillin lại trích ly sang dung mơi lần thứ 2, với lượng dung mơi Hình: Sơ đồ cơng nghệ trích ly lần dung mơi tinh chế penicillin GVHD:ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN Page 20 Đề Tài: Sinh Dược 3.3.6 Kháng sinh penicillin Tẩy màu: Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung mơi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung môi xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho mẻ sau 3.3.7 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên: Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH lỗng (hay NaOH lỗng), tiến hành chân khơng nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thơng số cơng nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hịa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy khơng khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác phương pháp phân tán tĩnh điện nguyên tắc phương pháp sử dụng GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 21 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin hiệu điện cao (lên đến 25 kV) để tạo vi giọt dung dịch chứa penicillin ỨNG DỤNG CỦA PENICILIN TRONG Y HỌC 4.1 Benzylpenicilin Benzylpenicilin hay penicilin G kháng sinh nhóm beta - lactam Là penicilin dùng điều trị Penicilin G diệt khuẩn cách ức chế tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, tác dụng bị giảm penicilinase beta - lactamase khác Penicilin G khơng bền mơi trường acid, khơng hấp thu qua đường uống Khả dụng sinh học theo đường uống đạt khoảng 15 - 30% Do vậy, penicilin G chủ yếu dùng đường tiêm tốt nên tiêm tĩnh mạch 4.2 Penicillin V Kali 400.000IU Phenoxymethyl penicilin kali (penicilin V kali) tác dụng diệt khuẩn cách ức chế tổng hợp peptidoglycan, mucopeptid thành tế bào vi khuẩn Phổ kháng khuẩn: Penicilin V kali có tác dụng tốt cầu khuẩn Gram dương thường gặp liên cầu tan huyết nhóm beta, liên cầu viridans phế cầu Thuốc có tác dụng với Staphylococcus (ngoại trừ chủng sinh penicilinase) Nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) thường khoảng 0,01 - 0,1 mg/ lít Penicilin V kali coi thuốc lựa chọn cho hầu hết nhiễm khuẩn đường hô hấp, da mô mềm Các vi khuẩn kháng penicilin V kali: Thuốc có tác dụng số vi khuẩn đặc biệt vi khuẩn Gram âm, chủng sinh beta-lactamse có khả kháng thuốc hồn tồn GVHD:ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN Page 22 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin 4.3 Procaine penicillin Procain penicilin G chất đồng phân tử procain penicilin G dùng tiêm bắp dạng hỗn dịch Procain penicilin thủy phân in vivo thành penicilin G thường coi dạng dự trữ có tác dụng kéo dài penicilin G Penicilin G có tác dụng diệt khuẩn, chống vi sinh vật nhạy cảm với penicilin thời kỳ sinh sôi nảy nở nhân lên nhanh Tài liệu nước [1] Alexander Fleming’s Discovery of Penicillin Penicillin heralded the dawn of the antibiotic age Before its introduction there was no effective treatment for infections such as pneumonia, gonorrhea or rheumatic fever Hospitals were full of people with blood poisoning contracted from a cut or a scratch, and doctors could little for them but wait and hope Antibiotics are compounds produced by bacteria and fungi which are capable of killing, or inhibiting, competing microbial species This phenomenon has long been known; it may explain why the ancient Egyptians had the practice of applying a poultice of moldy bread to infected wounds But it was not until 1928 that penicillin, the first true antibiotic, was discovered by Alexander Fleming, Professor of Bacteriology at St Mary's Hospital in London Returning from holiday on September 3, 1928, Fleming began to sort through petri dishes containing colonies of Staphylococcus, bacteria that cause boils, sore throats and abscesses He noticed something unusual on one dish It was dotted with colonies, save for one area where a blob of mold was growing The zone immediately around the mold—later identified as a rare strain of Penicillium notatum—was clear, as if the mold had secreted something that inhibited bacterial growth GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 23 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin Fleming found that his "mold juice" was capable of killing a wide range of harmful bacteria, such as streptococcus, meningococcus and the diphtheria bacillus He then set his assistants, Stuart Craddock and Frederick Ridley, the difficult task of isolating pure penicillin from the mold juice It proved to be very unstable, and they were only able to prepare solutions of crude material to work with Fleming published his findings in the British Journal of Experimental Pathology in June 1929, with only a passing reference to penicillin's potential therapeutic benefits At this stage it looked as if its main application would be in isolating penicillininsensitive bacteria from penicillin-sensitive bacteria in a mixed culture This at least was of practical benefit to bacteriologists, and kept interest in penicillin going Others, including Harold Raistrick, Professor of Biochemistry at the London School of Hygiene and Tropical Medicine, tried to purify penicillin but failed [2] Penicillin Production in the United States during WWII Substantial amounts of penicillin would be needed for the extensive clinical trials required to confirm the promise of the early results and to provide adequate supplies of the drug for therapeutic use if it did live up to its potential Florey recognized that large-scale production of penicillin was probably out of the question in Britain, where the chemical industry was fully absorbed in the war effort With the support of the Rockefeller Foundation, Florey and his colleague Norman Heatley traveled to the United States in the summer of 1941 to see if they could interest the American pharmaceutical industry in the effort to produce penicillin on a large scale Yale physiologist John Fulton helped to put his British colleagues in touch with individuals who might be able to assist them in their goal They were referred to Robert Thom of the Department of Agriculture, a foremost mycologist and authority on the Penicillium mold, and eventually to the Department's Northern Regional Research Laboratory (NRRL) in Peoria, Illinois, because of the expertise of its Fermentation Division This contact proved to be crucial to the success of the project, as the NRRL was a key contributor of innovations that made large-scale production of penicillin possible [3] Penicillin: the first miracle drug Many of you are here only because penicillin saved your life, or the life of one of your parents or grandparents Penicillin's ability to cure people of many once-fatal GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 24 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin bacterial infections has saved so many lives that it is easy to understand why it was once called a "miracle drug" Antibiotics are chemicals, effective at very low concentrations, created as part of the life process of one organism, which can kill or stop the growth of a diseasecausing microbe a germ In 1929, Alexander Fleming, a doctor and researcher at St Mary's Hospital in London, England, published a paper on a chemical he called "penicillin", which he had isolated from from a mold, Penicillium notatum Penicillin, Fleming wrote, had prevented the growth of a neighboring colony of germs in the same petri dish Dr Fleming was never able to purify his samples of penicillin, but he became the first person to publish the news of its germ-killing power Howard Florey, Ernst Chain and Norman Heatley expanded on Fleming's work in 1938, at Oxford University They and their staff developed methods for growing, extracting and purifying enough penicillin to prove its value as a drug World War II (1939-1945) had begun by the time their research was showing results The main research and production was moved to the United States in 1941, to protect it from the bombs pounding England Work began on how to grow the mold efficiently to make penicillin in the large quantities that would be needed for thousands of soldiers As the destruction of the war grew, so did interest in penicillin in laboratories, universities and drug companies on both sides of the Atlantic The scientists knew they were in a race against death, because an infection was as likely to kill a wounded soldier as his wound GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 25 Đề Tài: Sinh Dược Kháng sinh penicillin TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 2000 Vi vật học Hà Nội: NXB Giáo Dục [2] Trường Đại Học Nông Nghiệp 2008 Nghiên cứu quy trình sản xuất chất kháng sinh penicillin từ vi sinh vật [3] Lý Vũ Quốc Bảo, Nguyễn Duy Hà.2006 Công nghệ sản xuất chất kháng sinh penicillin Trường ĐH Tôn Đức Thắng [4] http://luanvan.co/luan-van/tieu-luan-san-xuat-chat-khang-sinh-penicillin-tu-vi- sinh-vat-66/ [5] http://luanvan.net.vn/luan-van/do-an-cong-nghe-san-xuat-chat-khang-sinh- penicilin-35580/ [6] http://123doc.vn/document/41769-seminar-nam-penicillium.htm [7] http://vi.wikipedia.org/wiki/Penicillin [8]http://www.acs.org/content/acs/en/education/whatischemistry/landmarks/flemingpenici llin.html [9] [10] http://www.drugs.com/penicillin.html http://herbarium.usu.edu/fungi/funfacts/penicillin.htm GVHD:ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN Page 26