Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho các loài tê tê(pholidota manidae) Để phục vụ cho công tác bảo tồn Ở việt nam

Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho các loài tê tê(pholidota manidae) Để phục vụ cho công tác bảo tồn Ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

−−−−−−−−−−−−−−−

BÙI THỊ PHƯƠNG THANH

XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU DI TRUYỀN CHO CÁC LOÀI TÊ TÊ (PHOLIDOTA: MANIDAE) ĐỂ PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC BẢO TỒN Ở

VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

−−−−−−−−−−−−−−−

BÙI THỊ PHƯƠNG THANH

XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU DI TRUYỀN CHO CÁC LOÀI TÊ TÊ (PHOLIDOTA: MANIDAE) ĐỂ PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC BẢO TỒN Ở

VIỆT NAM

Chuyên ngành : Khoa học môi trường

Mã số : 8440301.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS Lê Đức Minh

2 PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

HÀ NỘI – 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bảo vệ trước bất kỳ hội đồng nào để nhận học vị trước đây Các số liệu tham khảo đều được trích dẫn nguồn theo quy định

Tác giả

Bùi Thị Phương Thanh

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Đức Minh và PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quảng Trường (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật), ThS Ngô Thị Hạnh (Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) và các đồng nghiệp đã hỗ trợ trong quá trình lấy mẫu và phân tích số liệu để hoàn thiện luận văn

Xin trân trọng cảm ơn các thầy cô của Khoa Môi trường và Bộ môn Sinh thái học (Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và làm luận văn

Xin cảm ơn đồng nghiệp cùng tập thể các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Khoa

Để thu thập mẫu vật phục vụ công tác nghiên cứu, tôi xin cảm ơn các chuyên gia của Trung tâm Bảo tồn động vật hoang dã Việt Nam (Vườn quốc gia Cúc Phương)

và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã cung cấp mẫu vật phục vụ công tác nghiên cứu Nghiên cứu được hoàn thành với sự hỗ trợ Tổ CITES, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Quỹ US Fish and Wildlife Service và Quỹ Môi trường Thiên nhiên Nagao (Nhật Bản)

Hà Nội, tháng năm 2023

Học viên

Bùi Thị Phương Thanh

MỤC LỤC

Mở đầu 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Tổng quan về họ Manidae 4

1.2 Tình hình buôn bán và hiện trạng bảo tồn tê tê trên thế giới 7

1.2.1 Tình hình buôn bán tê tê trên thế giới 7

1.2.2 Hiện trạng bảo tồn tê tê trên thế giới 13

1.3 Tình hình buôn bán và hiện trạng bảo tồn tê tê ở Việt Nam 15

1.3.1 Tình hình buôn bán tê tê ở Việt Nam 15

1.3.2 Hiện trạng bảo tồn tê tê ở Việt Nam 17

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thu mẫu 28

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự 29

2.2.3 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 33

2.2.4 Xác định tuyến đường buôn bán tê tê ở Việt Nam 34

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả định danh các cá thể tê tê cá thể tê tê được cứu hộ và mẫu vật thu được từ buôn bán 35

3.1.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 35

3.1.2 Kết quả phản ứng PCR 35

3.1.3 Kết quả giải trình tự 38

3.2 Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền 42

3.3 Xác định tuyến đường buôn bán tê tê ở Việt Nam và đề xuất phương án tái thả phù hợp 47

3.3.1 Xác định tuyến đường buôn bán tê tê ở Việt Nam 47

3.3.2 Đề xuất phương án tái thả phù hợp 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Danh sách 8 loài Tê tê và khu vực phân bố của chúng trên Thế giới 4

Bảng 2: Hiện trạng bảo tồn của các loài tê tê trên thế giới 14

Bảng 3: Thông tin các mẫu sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 4: Trình tự mồi cho phản ứng PCR 27

Bảng 5: Khoảng cách di truyền giữa các mẫu của loài Manis javanica 44

Bảng 6 : Số vụ bắt giữ tê tê tại các tỉnh thành gửi về Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật giai đoạn 2019 – 2021 48

Bảng 7: Thông tin các vụ tịch thu tê tê được lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Bản đồ phân bố của các loài tê tê trên thế giới 6

Hình 2: Các tuyến vận chuyển buôn bán tê tê lớn 9

Hình 3: Số lượng tê tê bất hợp pháp bị bắt giữ ở 5 quốc gia đứng đầu về nguồn gốc và điểm đến trong giai đoạn 2005 – 2015 10

Hình 4: Số lượng vảy tê tê bị phát hiện và thu giữ ở Singapore ngày 4/4/2019 11

Hình 5: Các vụ bắt giữ tê tê tại châu Á (2015 – 2021) 12

Hình 6: Các vụ bắt giữ tê tê nổi bật ở châu Á 13

Hình 7: Các nhân viên Trung tâm Nghiên cứu và bảo tồn động vật hoang dã tái thả tê tê……….18

Hình 8: Kết quả điện di ADN tổng số 35

Hình 9: Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi L24 – H49 36

Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Cytb_1_M – Cytb_2_M 36

Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi L15997 – DH15972 37

Hình 12: Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ManF – ManR 37

Hình 13: Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi PangF – PangR 38

Hình 14: Kết quả giải trình tự hai chiều từ một mẫu máu khi sử dụng mồi L24 – H49………38

Hình 15: Kết quả giải trình tự hai chiều từ một mẫu vảy khi sử dụng mồi Cytb_1_M – Cytb_2_M 39

Hình 16: Kết quả giải trình tự hai chiều từ một mẫu máu khi sử dụng mồi L15997 – DH15972 39

Hình 17: Kết quả giải trình tự hai chiều từ một mẫu máu khi sử dụng mồi ManF – ManR 39

Hình 18: Kết quả giải trình tự hai chiều từ một mẫu máu khi sử dụng mồi PangF – PangR 40 Hình 19:Kết quả kiểm tra mẫu máu bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng Gen 40 Hình 20: Kết quả kiểm tra mẫu thịt bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng Gen 40 Hình 21: Kết quả kiểm tra mẫu vảy bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng Gen 41 Hình 22: Kết quả kiểm tra mẫu vảy bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng Gen 41 Hình 23: Kết quả kiểm tra mẫu vảy bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng Gen 41

Hình 24: Cây quan hệ di truyền bằng phương pháp Bayesian chạy trong 10x106 thế

hệ theo mô hình GTR+I+G chọn mẫu cách 1000 thế hệ 43

Hình 25: Cây quan hệ di truyền bằng phương pháp Bayesian chạy trong 10x106 thế

hệ theo mô hình GTR+I chọn mẫu cách 1000 thế hệ 46 Hình 26: Số vụ bắt giữ tê tê giai đoạn 2019 – 2021 được gửi về Viện STTNSV 47

Hình 27: Số vụ việc được phản ánh tại các tỉnh, thành phố 49

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

CITES Convention on International Trade in Endangered Species of

ENV Trung tâm Giáo dục Thiên nhiên

IUCN International Union for Conservation of Nature

Liên minh Bảo tồn thiên nhiên quốc tế PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

SVW Save Vietnam’s Wildlife

UNODC United Nations Office on Drugs and Crime

Văn phòng Liên Hợp Quốc về chống Ma túy và Tội phạm

VU Vulnerable – Sắp nguy cấp

WJC Wildlife Justice Commission

Mở đầu

Trong vài thập kỷ trở lại đây, buôn bán trái phép động vật hoang dã đã trở thành vấn đề mang tính toàn cầu, đe dọa sự sống còn của hàng nghìn loài động vật hoang

dã, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đa dạng sinh học (Cao và cs 2005) Trong đó, tê tê

đã và đang là nhóm thú bị buôn bán nhiều nhất trên thế giới, chiếm tới 20% tổng số lượng động vật hoang dã bị buôn bán bất hợp pháp (Challerder và cs 2016) Do vậy, tất cả các loài tê tê đều được xếp vào nhóm từ sắp nguy cấp (VU) đến cực kỳ nguy cấp (CR) theo Danh sách đỏ của Liên minh bảo tồn thiên nhiên quốc tế (IUCN) và vào Phụ lục I theo Công ước quốc tế về buôn bán các loại động, thực vật hoang dã nguy cấp, quý, hiếm (CITES) Việt Nam ghi nhận phân bố của hai loài tê tê, bao gồm

tê tê gia-va (Manis javanica) và tê tê vàng (Manis pentadactyla) Tuy nhiên, cả hai

loài tê tê đều nằm trong danh mục loài động vật được ưu tiên bảo tồn, có tên trong Phụ lục I của Nghị định 160/2013/NĐ-CP và Nghị định 06/2019/NĐ-CP

Do lợi nhuận quá lớn và nhu cầu cao, bất chấp quy định của các tổ chức bảo vệ động vật hoang dã và chính sách pháp luật ở các quốc gia, các hoạt động khai thác, săn bắt và buôn bán tê tê diễn ra thường xuyên với số lượng lớn và có xu hướng mở rộng trên thị trường nhiều nước (Zhang và cs 2015) Để kiểm soát tốt việc buôn bán trái pháp luật các loài động vật hoang dã, trong đó có tê tê, thì việc xây dựng cơ sở

dữ liệu ADN hỗ trợ công tác giám định loài để thực thi pháp luật, tái thả và xác định con đường vận chuyển là cực kì quan trọng Đây là việc làm giúp cho cơ quan chức năng có đầy đủ minh chứng chính xác để đưa ra các biện pháp xử lý phù hợp từ khâu thu giữ, xử lý vật chứng, cứu hộ, tái thả động vật cho đến điều tra, khởi tố và xét xử tội phạm

Vì vậy, đề tài: “Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho các loài tê tê (Pholidota: Manidae) để phục vụ cho công tác bảo tồn ở Việt Nam” được thực

hiện với mục đích cung cấp dữ liệu di truyền hỗ trợ định danh loài, xác định mối quan

hệ di truyền của các loài tê tê và nguồn gốc của các mẫu vật thu được trong buôn bán Bên cạnh đó, nghiên cứu sẽ này là cơ sở vững chắc cho việc tái thả các cá thể về tự

nhiên mà không làm xáo trộn nguồn gen của loài, suy giảm sức sống của các thế hệ sau Từ đó, cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý, hỗ trợ được công tác cứu

hộ, bảo tồn tê tê và thực thi pháp luật tốt hơn

Mục tiêu nghiên cứu

- Thu thập, định danh các cá thể tê tê được cứu hộ tại Trung tâm Nghiên cứu và Bảo tồn Động vật hoang dã (Vườn Quốc gia Cúc Phương) và các mẫu tê tê thu được từ buôn bán đang được lưu trữ ở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật dựa vào thông tin các mẫu biết rõ nguồn gốc từ các nghiên cứu trước

- Xác định mối quan hệ di truyền của các mẫu tê tê thu được với các loài tê tê trên thế giới

- Xác định rõ tuyến đường buôn bán tê tê ở Việt Nam và đề xuất phương án tái thả phù hợp với các khu vực ngoài tự nhiên

Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Thu thập, định danh các cá thể tê tê được cứu hộ và mẫu vật thu

được từ buôn bán

Thu thập ADN từ các cá thể tê tê được cứu hộ ở Vườn Quốc gia Cúc Phương

và các mẫu vật thu được từ hoạt động buôn bán hiện đang lưu trữ ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Tiến hành tách chiết ADN tổng số, nhân bản hai đoạn gen ty thể (cytb, D-loop)

và hai đoạn gen nhân (FGB7, TTN), tinh sạch sản phẩm PCR thành công và gửi giải trình tự

- Nội dung 2: Xác định mối quan hệ di truyền của các mẫu tê tê thu được với

các loài tê tê trên thế giới

Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền của các loài tê tê dựa trên việc kết hợp trình

tự của các mẫu thu được trong nghiên cứu với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen (GenBank-NCBI)

- Nội dung 3: Xác định rõ tuyến đường buôn bán tê tê ở Việt Nam và đề xuất

phương án tái thả phù hợp với các khu vực ngoài tự nhiên

Khảo sát hiện trạng buôn bán tê tê ở Việt Nam

Thu thập thông tin, dữ liệu của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, kết hợp

dữ liệu từ nghiên cứu từ đó xác định tuyến đường buôn bán tê tê ở Việt Nam

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về họ Manidae

Họ Tê tê (Manidae) thuộc Bộ Tê tê (Pholidota) hiện có ba giống: Manis, Phataginus và Smutsia gồm 8 loài phân bố ở liên vùng nhiệt đới của châu Á và châu

Brunei Darussalam, Campuchia, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Singapore, Thái Lan, Việt Nam

2

Tê tê vàng

(Manis pentadactyla)

Bhutan, Trung Quốc, Hồng Kông, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Nepal, Đài Loan, một tỉnh của Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam

3

Tê tê phi – lip

– pin

(Manis culionensis)

Philippines (đại lục Palawan; Đảo Busuanga, Đảo Coron, Đảo Culion, Đảo Dumaran, Đảo Balabac được thả vào Đảo Apulit)

4

Tê tê bụng trắng

(Phataginus

tricuspis)

Angola, Benin, Cameroon, Cộng Hòa Trung Phi, Cộng Hòa Congo, Cộng Hòa Dân Chủ Congo, Bờ Biển Ngà, Guinea vùng xích đạo (Bioko, Guinea vùng xích đạo (đại lục)), Gabon, Ghana, Guinea, Guinea-Bissau, Kenya, Liberia, Nigeria, Rwanda, Sierra Leone, Nam Sudan, Cộng Hòa Hợp Nhất Tanzania, Togo, Uganda, Zambia

6

Tê tê ấn độ

(Manis crassicaudata)

Ấn Độ, Nepal, Pakistan, Sri Lanka Có thể đã tuyệt chủng: Bangladesh

7

Tê tê bụng đen

(Phataginus

tetradactyla)

Cameroon, Cộng Hòa Trung Phi, Cộng Hòa Congo, Cộng Hòa Dân Chủ Congo, Bờ Biển Ngà Guinea vùng xích đạo (đại lục), Gabon, Ghana, Liberia, Nigeria, Sierra Leone

Hình 1: Bản đồ phân bố của các loài tê tê trên thế giới theo danh sách đỏ của IUCN (Nguồn: IUCN 2019)

Một số đặc điểm hình thái của tê tê

Tê tê có vảy keratin lớn được cấu tạo giống móng tay của người và có cấu trúc

và cấu tạo rất khác biệt so với vảy của loài bò sát [37, 51] Các loài tê tê châu Á có lông cứng giữa các vảy, còn các loài tê tê châu Phi thì không [18] Tê tê thường có kích thước từ 30 đến 100 cm Chúng có đôi chân ngắn, với móng vuốt sắc nhọn, được

sử dụng để đào sâu vào tổ kiến, mối và leo trèo [23] Tê tê sống trong thân cây rỗng hoặc hang tùy thuộc vào loài [17, 39] Chúng là những động vật ăn đêm nhút nhát Khi bị tấn công, chúng thường cuộn tròn thành một quả bóng để bảo vệ chúng khỏi những loài săn mồi Ngoài ra, tê tê còn có thể phát ra một chất hóa học có mùi độc hại từ các tuyến gần hậu môn, tương tự như thuốc xịt của một con chồn hôi để xua đuổi kẻ thù [21]

Tê tê không có răng, nhưng lại có một chiếc lưỡi dài và có chất dính đặc biệt, rất phù hợp để săn kiến và mối [38] Chúng có thể tiêu thụ tới 200.000 con kiến mỗi ngày [63] Trong tự nhiên, thức ăn của tê tê thường là kiến, mối và đây là thức ăn chuyên hóa của chúng [52] Ngoài ra, theo thông tin thu được từ một số thợ săn ở

Việt Nam, thức ăn của tê tê hoang dã bao gồm cả ấu trùng ong [39] Với chiều dài tới

40 cm và gắn với khung chậu bằng các rễ cơ, lưỡi của tê tê được bao phủ bằng nước bọt dính do tuyến nước bọt lớn nằm ở phía ngực tạo ra [16, 21] Tê tê không có cơ nhai và không có răng nên thay vào đó phụ thuộc vào các hoạt động nghiền của các hòn sỏi rất nhỏ nằm trong thành dày và nhiều cơ của dạ dày để tiêu hóa con mồi, giống như mề gà nghiền hạt [18, 62]

Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của tê tê

Thời gian mang thai của tê tê là khác nhau tùy theo loài, dao động từ 120 –

150 ngày [30] Một cá thể tê tê cái thường đẻ một con non trong một lần sinh sản (rất hiếm trường hợp đẻ 2) [35, 36, 40] Khi sinh ra, tê tê con dài khoảng 15 cm (6 in) và nặng khoảng 120 gram Vảy của chúng mềm và xanh xao, sau đó bắt đầu cứng lại vào ngày thứ hai và ngày càng cứng hơn Giai đoạn sơ sinh vào khoảng 3 – 4 tháng, nhưng chúng có thể bắt đầu ăn mối và kiến khi được một tháng Vào thời điểm đó, các con tê tê sơ sinh bắt đầu đi ăn cùng mẹ bên ngoài hang, bám trên đuôi của tê tê

mẹ và được mẹ cho ăn côn trùng [21, 30]

1.2 Tình hình buôn bán và hiện trạng bảo tồn tê tê trên thế giới

1.2.1 Tình hình buôn bán tê tê trên thế giới

Tê tê là nhóm động vật còn ít được nghiên cứu Tuy nhiên, chúng đã và đang

bị săn bắt, buôn bán bất hợp pháp với số lượng lớn Ở châu Á, tê tê bị giết để lấy thịt

và vảy của chúng đã được sử dụng làm thuốc, mặc dù các sản phẩm này không có tác dụng chữa bệnh theo các bằng chứng khoa học [24, 26, 49] Các sản phẩm từ tê tê đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc làm dược liệu để điều trị nhiều loại bệnh Phần vảy được cho là có tác dụng thúc đẩy tuần hoàn máu và tăng tiết sữa ở phụ nữ mang thai, trong khi phần thịt được dùng làm thuốc bổ [24, 33, 41, 60] Chúng cũng được dùng làm thuốc ở châu Phi Ở Nigeria, các bộ phận của tê tê được sử dụng

để điều trị các bệnh về thể chất và tâm lý [50] Do đó, quần thể của các loài tê tê đang suy giảm nghiêm trọng và được cho là bị tuyệt chủng cục bộ ở một số khu vực của

cả châu Á và châu Phi [24, 62]

Trong thập kỷ qua, hàng tấn vảy tê tê và thịt đã bị tịch thu trên toàn thế giới mỗi năm [55] và số lượng thu giữ có khả năng chỉ chiếm một phần nhỏ trong giao dịch bất hợp pháp lớn trên thực tế [12, 41]

Buôn bán tê tê có lịch sử lâu dài ở Đông Nam Á, với các báo cáo xuất khẩu Tê

tê gia-va có từ năm 1925 Theo Herklots (1937), Trung Quốc là nơi thu mua tê tê lớn nhất trên toàn thế giới [27] Theo Wu và cộng sự (2004, 2007), ước tính quần thể tê

tê vàng (Manis pentadactyla), của Trung Quốc đã suy giảm mạnh từ những năm 1960

do nhu cầu quá cao để làm thuốc và thức ăn [58, 59] Dữ liệu được thu thập từ báo chí và cơ quan thực thi pháp luật tại Đông Nam Á từ năm 2000 và 2007 cho thấy khoảng 30.000 con tê tê đã bị tịch thu [42] Tê tê gia – va và Tê tê vàng cũng được cho là đã bị săn bắt cạn kiệt ở Đông Dương; vì vậy, hầu hết tê tê bị buôn bán hiện nay được khai thác ở Indonesia và Malaysia [48] Việt Nam vừa được coi là thị trường tiêu thụ vừa là một điểm trung chuyển buôn bán tê tê có nguồn gốc Indonesia sang Trung Quốc Trong khi đó, Thái Lan và Myanmar cũng là địa điểm trung chuyển buôn bán tê tê từ Malaysia và Ấn Độ vào Trung Quốc [39, 55] Các vụ bắt giữ gần đây ở Trung Quốc cũng cho thấy một số lượng lớn vảy tê tê có nguồn gốc từ các nước châu Phi [41, 60]

Buôn bán tê tê bất hợp pháp đã tăng đáng kể từ năm 2008 Số lượng loài tê tê châu Á giảm nhanh do nạn săn bắt, bên cạnh đó sự gia tăng buôn bán các sản phẩm

từ tê tê châu Phi đã được ghi nhận [14] Theo báo cáo của TRAFFIC 2017, tổng cộng

có 1270 vụ việc đã bị phát hiện và bắt giữ trong 5 năm (2010 – 2015), trong đó bao gồm ít nhất 20.749 kg của 7154 bộ phận cơ thể tê tê, 55.251 kg vảy và 44.475 kg tê

tê nguyên con Có 33 quốc gia và vùng lãnh thổ là địa điểm buôn bán tê tê quốc

tế Đáng chú ý, có 27 tuyến vận chuyển buôn bán tê tê hàng năm, mạng lưới buôn bán và đường dây vận chuyển liên tục thay đổi Các vụ bắt giữ liên quan đến 67 quốc gia và vùng lãnh thổ trên cả sáu châu lục thể hiện tính chất toàn cầu của buôn bán tê

tê, không chỉ giới hạn ở các quốc gia châu Á và châu Phi [25, 57]

Trung Quốc và Hoa Kỳ được xác định là hai điểm đến phổ biến nhất trong buôn bán tê tê quốc tế trong thời gian sáu năm từ 2010 – 2015 Trung Quốc là điểm đến chính của các lô hàng quy mô lớn về khối lượng vảy ≥ 1000 kg), trong khi Hoa

Kỳ là điểm đến chính cho các lô hàng ≥ 100 bộ phận cơ thể Châu Âu (Đức, Pháp, Bỉ) được xác định là một trung tâm trung chuyển quan trọng, chủ yếu là cho tê tê châu Phi (và các bộ phận của chúng) được vận chuyển đến châu Á Hà Lan cũng là điểm trung chuyển sản phẩm tê tê từ Uganda về Trung Quốc Tuy nhiên, hầu hết buôn bán

tê tê quốc tế (và các sản phẩm của chúng) xảy ra ở châu Á và chủ yếu ở Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Lào, Indonesia Phân tích các lô hàng có số lượng lớn cho thấy 80% giao dịch các sản phẩm tê tê là từ Trung Quốc và Việt Nam và được dành riêng cho Hoa Kỳ (Hình 2) Buôn bán vảy chủ yếu là từ châu Phi và được vận chuyển bằng đường hàng không về châu Á Các lô hàng số lượng lớn cho thấy 55% các lô hàng này có nguồn gốc từ châu Phi, cụ thể là từ Cameroon, Nigeria, Sierra Leone và Uganda Tê tê sống chủ yếu được vận chuyển bằng đường bộ giữa các nước châu Á Nguồn gốc chủ yếu là từ Indonesia (36%) và Malaysia (36%) và điểm đến bao gồm Trung Quốc, Singapore, Thái Lan và Việt Nam (Hình 3) [25, 53]

Hình 2: Các tuyến vận chuyển buôn bán tê tê lớn Màu xanh lam (buôn bán với số lượng ≥ 100 bộ phận cơ thể), màu đỏ (khối lượng vảy ≥ 1000 kg), màu vàng (số lượng cá thể ≥ 500 cá thể), mũi tên đơn (>) biểu thị tuyến vận chuyển quá cảnh, mũi tên kép (>>) biểu thị vận chuyển trực tiếp (Nguồn: TRAFFIC)

Hình 3: Số lượng tê tê bất hợp pháp bị bắt giữ ở 5 quốc gia đứng đầu về nguồn gốc và điểm đến trong giai đoạn 2005 – 2015 (Nguồn: UNODC 2020)

Từ năm 2016 – 2019, ước tính có khoảng 206,4 tấn vảy tê tê đã bị bắt giữ và tịch thu từ 52 vụ bắt giữ Tổ chức Wildlife Justice Commission (WJC) tin rằng đây chỉ là một phần nhỏ trong tổng số khối lượng bị buôn bán, vì có khả năng là một tỷ

lệ đáng kể buôn lậu không bị phát hiện Trong khoảng thời gian 4 năm cho thấy sự gia tăng buôn bán ở mức độ chưa từng thấy Năm 2019, trọng lượng trung bình của một lô hàng vảy tê tê là 6,2 tấn nhiều hơn so với ba năm trước đó là 2,2 tấn Trong báo cáo của WJC, tỷ lệ bắt giữ được phát hiện trong nước so với các lô hàng xuất phát, quá cảnh hoặc vận chuyển đến một số quốc gia nhất định ở sáu quốc gia chủ yếu như sau: Trung Quốc (50%), Cộng hòa Dân chủ Congo (DRC) (0%), Hồng Kông (100%), Nigeria (16,7%), Singapore (33,3%) và Việt Nam (40%) Nigeria và Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong chuỗi cung ứng Từ năm 2016 - 2019, hai nước này có liên quan đến gần 70% các vụ bắt giữ quy mô tê tê, lên tới 143,6 tấn Hơn nữa, trong năm 2018 – 2019, tỷ lệ này tăng lên vì 84% tổng số lô hàng được phát hiện có liên quan đến một hoặc cả hai quốc gia Tuyến đường buôn lậu Nigeria - Singapore - Việt Nam cũng được xác định là tuyến đường vận chuyển quan trọng đối với hoạt động buôn lậu vảy riêng hoặc kết hợp với ngà voi [57]

Các mức giá bán sản phẩm ở châu Phi thấp hơn nhiều so với châu Á Trong năm

2018, giá một kg tại Nigeria là 52 USD Trong khi ở châu Á, giá cao hơn nhiều và được bán với giá 226 USD tại Indonesia và 283 USD tại Việt Nam Giá bán lẻ cao nhất được ghi nhận tại Lào, đạt 739 USD/kg Năm 2019 giá bán lẻ ở châu Á đã tăng

và được bán với giá 350 USD/kg ở Malaysia, 355 USD/kg ở Trung Quốc và 149 USD/kg ở Việt Nam [57]

Buôn bán bằng đường biển vẫn là phương thức được ưa chuộng để vận chuyển

số lượng lớn vảy tê tê, chiếm 53,8% (28 trên 52) các vụ bắt giữ Các vụ bắt giữ vảy

tê tê tại các cảng biển quốc tế ngày càng gia tăng, nhưng nhiều khả năng một tỷ lệ đáng kể buôn lậu bằng đường biển vẫn không bị phát hiện [53] Buôn bán bằng đường hàng không đã giảm mạnh trong năm 2018 – 2019 Điều này có thể là do hàng hóa đường hàng không không thể vận chuyển số lượng lớn như vậy Tuy nhiên, cũng có nguy cơ bị phát hiện cao hơn do kiểm tra thủ tục vận chuyển hàng không nghiêm ngặt hơn [53]

Hình 4: Số lượng vảy tê tê bị phát hiện và thu giữ ở Singapore ngày 4/4/2019

(Nguồn: REUTERS)

Hình 5: Các vụ bắt giữ tê tê tại châu Á (2015 – 2021) (Nguồn: TRAFFIC 2022)

Dữ liệu của TRAFFIC (Cơ sở dữ liệu WiTIS của TRAFFIC, tổng hợp thông tin

từ các dữ liệu có nguồn mở cũng như dữ liệu chọn lọc do các cơ quan hành pháp và

tổ chức khác cung cấp) cho thấy đã có 1.141 vụ bắt giữ tê tê tại Châu Á trong khoảng thời gian từ 2015 – 2021, bao gồm cả hai loài tê tê Châu Phi và Châu Á Giai đoạn

2017 – 2019 đã chứng kiến một số vụ bắt giữ có quy mô lớn nhất, hầu hết đều liên quan đến vảy tê tê Châu Phi Hơn 609 vụ bắt giữ đều xảy ra ở Châu Á, tang vật thu giữ gồm 244.600kg vảy và 10.971 cá thể tê tê (Tất cả số liệu đều là ước tính tối thiểu dựa trên trọng lượng và kiểm đếm các cá thể) Tuy nhiên, trong giai đoạn 2020 – 2021 các vụ bắt giữ tê tê đã suy giảm so với các năm trước đó, với khoảng 233 vụ, thu giữ 13.389kg vảy và 247 cá thể tê tê Điều này nhiều khả năng là do đại dịch COVID-19 làm gián đoạn hệ thống vận chuyển hàng hoá toàn cầu chứ không phải là suy giảm thực tế của hoạt động săn trộm Cần xem xét cẩn trọng những dữ liệu này do có thể đây chỉ là con số tạm thời và khi thế giới trở lại trạng thái bình thường, các hoạt động buôn lậu (cũng như khả năng phát hiện các vụ vi phạm) có thể sẽ tăng trở lại [56]

Hình 6: Các vụ bắt giữ tê tê nổi bật ở châu Á (Nguồn: TRAFFIC 2022) 1.2.2 Hiện trạng bảo tồn tê tê trên thế giới

Theo Danh lục đỏ IUCN 2019, hầu như có rất ít thông tin về hiện trạng quần thể cũng như số lượng cá thể của các loài loài tê tê Các loài này hiếm khi quan sát được do tập tính khó tiếp cận, sống cô độc và hoạt động về ban đêm [38, 28] Rất ít nghiên cứu được thực hiện về loài này và có rất ít thông tin về sự phân bố cũng như không có ước tính về mật độ quần thể được công bố [35, 39]

Cả tám loài tê tê đều nằm trong danh mục loài sắp nguy cấp cho đến cực kỳ nguy cấp theo chuẩn của Liên minh bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) và Phụ Lục

I của Công ước quốc tế về buôn bán các loại động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) tức là mức bị đe doạ tuyệt chủng do các hoạt động khai thác buôn bán và xuất nhập khẩu giữa các nước [2, 17] Ngoài ra, tất cả các loài tê tê còn được pháp luật bảo vệ tại các quốc gia có tê tê phân bố [17] Tháng 11 năm 2010, tê tê đã được thêm vào danh sách các thú có đặc điểm khác biệt về tiến hóa và có nguy cơ tuyệt chủng cao ở mức độ toàn cầu bởi Hiệp hội Động vật học London (Zoological Society

of London's) [21]

Bảng 2: Hiện trạng bảo tồn của các loài tê tê trên thế giới [1, 2, 4, 5, 61] STT Tên loài

CITES (2019)

IUCN (2020)

SĐVN (2007)

NĐ160 (2013)

NĐ06 (2019)

7

Tê tê bụng đen

(Phataginus tetradactyla)

Phụ lục

I

VU A2cd+4cd

8 Tê tê đất Temminck

(Smutsia temminckii)

Phụ lục

I

VU A4cd

Về tình trạng bảo tồn của tám loài tê tê như sau: ba loài tê tê, bao gồm Tê tê

gia – va (Manis javanica), tê tê vàng (Manis pentadactyla) và Tê tê phi – lip – pin

(Manis culionensis) được xếp vào mức cực kỳ nguy cấp (CR); ba loài tê tê, bao gồm,

Tê tê ấn độ (Manis crassicaudata), Tê tê bụng trắng (Phataginus tricuspis) và Tê tê đất khổng lồ (Smutsia gigantea) được xếp vào mức nguy cấp (EN); và hai loài tê tê, bao gồm Tê tê bụng đen (Phataginus tetradactyla) và Tê tê đất Temminck (Smutsia temminckii) được xếp vào mức sắp nguy cấp (VU) [61]

Mối đe dọa chính của các loài này là săn bắt trái phép để phục vụ mục đích buôn bán trái phép ở mức độ quốc tế (Zhang và cs 2015; Gomez và cs 2016; Cota – Larson 2017) [17, 24, 60] Giao dịch này diễn ra bất chấp các lệnh cấm buôn bán tê

tê theo Công ước CITES (Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật và thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng) Các ước tính gần đây dựa trên dữ liệu thu giữ cho thấy hơn 895.000 cá thể tê tê đã bị buôn bán trái phép trên toàn cầu từ năm 2000 đến năm 2019 [13]

Nạn săn trộm đang làm suy giảm nghiêm trọng số lượng tê tê ở châu Á [25] Các nghiên cứu cho thấy quần thể tê tê ở Trung Quốc đã giảm 94% và bằng chứng cho thấy tê tê đã bị tuyệt chủng cục bộ ở các khu vực khác [58] Tiếp theo là

sự mất mát, thay đổi, mất môi trường sống và vùng phân bố của các loài bị phân mảnh Mất môi trường sống bao gồm sử dụng thuốc trừ sâu và lắp đặt hàng rào điện gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với tê tê châu Phi sống trên mặt đất [15, 25] Tê

tê thường cuộn xung quanh các dây phía dưới của những hàng rào này và tử vong Người ta ước tính rằng hàng rào điện gây ra tỷ lệ tử vong 2 – 13% số lượng tê

tê ở Temminck của Nam Phi hàng năm [43]

1.3 Tình hình buôn bán và hiện trạng bảo tồn tê tê ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình buôn bán tê tê ở Việt Nam

Với vị trí địa lý quan trọng, Việt Nam trở thành một trong các tuyến đường buôn bán và trung chuyển tê tê trên thế giới Tê tê được buôn bán từ trong nước, các nước Đông Nam Á, châu Phi qua Việt Nam vào thị trường chính là Trung Quốc [26,

39, 55] Hoạt động buôn bán trái phép tê tê diễn ra phức tạp và tinh vi Theo báo Con người và Thiên nhiên, trong những năm trước đây chỉ ghi nhận các vụ buôn bán các

loài tê tê châu Á, song kể từ năm 2014 đã ghi nhận các vụ buôn bán tê tê có nguồn gốc châu Phi Theo Trung tâm Giáo dục Thiên nhiên, đối với nhưng lô hàng tê tê động lạnh và vảy có số lượng lớn thường được buôn qua đường biển với các điểm trung chuyển tại Quảng Ninh, Hải Phòng trước khi được tái xuất sang Trung Quốc [9, 10] Các đối tượng buôn bán sử dụng các thủ đoạn giấu hàng và khai báo sai về loại hàng hóa như thủy sản, rong biển, vỏ sò Trên bộ, hoạt động buôn bán tê tê (chủ yếu là con sống) thường được nhập khẩu trái phép vào Việt Nam qua các cửa khẩu miền trung từ Lào, Campuchia vào Việt Nam Các đối tượng chủ yếu dùng ô tô vận chuyển với các thủ đoạn ngụy trang tinh vi như dùng biển số giả, trộn lẫn với các loại hàng hóa khác, giấu trong các container [8].

Các thị trường chính cho các bộ phận tê tê là ở Việt Nam và Trung Quốc trong

đó Tê tê gia – va là nhiều nhất [49] Một số vụ buôn bán tê tê xuyên quốc gia lớn bị bắt giữ bởi lực lượng chức năng như vụ bắt giữ 24 tấn tê tê đông lạnh tại cảng Hải Phòng có nguồn gốc từ Indonesia Do buôn bán trái phép tràn lan, các loài tê tê đã bị suy giảm nghiêm trọng trong khu vực Đông Nam Á [60]

Theo thống kê của Trung tâm giáo dục Thiên nhiên, từ năm 2013 – 2016 có hơn 2600 cá thể tê tê sống và khoảng 30 tấn vảy tê tê đã được lực lượng chức năng thu giữ ở Việt Nam [9] Trong 5 năm (2013 – 2017), các cơ quan chức năng đã bắt giữ 111 vụ việc vi phạm với 1.949 cá thể tê tê và 8.337 kg tê tê và sản phẩm vảy tê tê – chiếm tỷ lệ cao thứ hai (20,17%) sau ngà voi trong tổng khối lượng động vật hoang

dã (ĐVHD) bị bắt giữ, tịch thu Trong số này, phần lớn là tê tê còn sống, chiếm 95,33% (1.858/1.949) so với tổng số lượng cá thể tê tê và chiếm 81,48% (7.627/8.3367 kg) so với tổng khối lượng ĐVHD là tê tê bị bắt giữ, tịch thu Còn lại

tê tê đã chết, đông lạnh Vảy tê tê chỉ chiếm 18,52% (1.735/8.337 kg) so với tổng khối lượng ĐVHD là tê tê bị bắt giữ, tịch thu Phần lớn vi phạm ở mức quy mô lớn với 23,6% (27/117) vi phạm có khối lượng tê tê bắt giữ trung bình lớn hơn 150 kg trong đó các vụ có khối lượng lớn xảy ra tại Quảng Ninh (3.318 kg), Hải Phòng (1.083 kg), Hưng Yên (821 kg), Ninh Bình (722 kg) Cũng cần lưu ý rằng trong dữ liệu thu

thập được, một số địa phương, không ghi rõ khối lượng tê tê bị bắt giữ và tịch thu [11]

Hầu hết tê tê sống được chuyển đến thị trường Trung Quốc, mặc dù một số tìm đến các nhà hàng hoặc cửa hàng thuốc đông y ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh

và các thành phố lớn khác ở Việt Nam Trong năm 2019, ENV đã ghi nhận 124 vụ vi phạm về tê tê, khiến cơ quan chức năng tịch thu hơn 23.700 kg vảy và tê tê Gần 17.000 kg vảy tê tê đó được phát hiện và thu giữ tại Hải Phòng, phần lớn được đựng trong các container có xuất xứ từ Nigeria Năm 2020, số lượng vảy tê tê bị bắt giữ ít hơn, nhưng có 124 vụ vi phạm về tê tê khác được ENV ghi nhận và 66 con tê tê đã bị tịch thu từ hoạt động buôn bán trái phép [9] Năm 2021, ENV đã triệt phá một đường dây buôn bán tê tê với quy mô lớn nhất và thu giữ 984 kg vảy tê tê bụng trắng Ngoài

ra, các cơ quan chức năng đã tiến hành bắt giữ 25 vụ buôn bán, tàng trữ tê tê trái phép với tổng khối lượng tê tê hoặc các sản phẩm làm từ tê tê bị tịch thu lên tới hơn 1,100

kg trong đó đa phần là vảy tê tê Có 11 đối tượng tham gia vào các hoạt động săn bắt

và buôn bán tê tê trái phép đã bị bắt giữ [10]

1.3.2 Hiện trạng bảo tồn tê tê ở Việt Nam

Việt Nam có ghi nhận phân bố của hai loài tê tê, bao gồm Tê tê gia-va (Manis javanica) và Tê tê vàng (Manis pentadactyla) [6] và cả hai loài đều thuộc Danh mục

các loài nguy cấp, quý, hiếm, được ưu tiên bảo vệ, có tên trong Nghị định 64/2019/NĐ-CP và thuộc nhóm IB trong Nghị định 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ [4, 5] Đồng thời có tên trong Phụ lục I CITES theo Thông báo số 296/TB-CTVN-HTQT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn [2]

Theo Bộ luật Hình sự 2017mức hình phạt cao nhất đối với cá nhân vi phạm luật

về bảo vệ loài hoang dã gồm hành vi buôn bán, săn bắt Tê tê là phạt tù 15 năm và 2

tỷ đồng tiền phạt Đối với các tổ chức thương mại là 15 tỷ đồng tiền phạt và bị đình chỉ hoạt động kinh doanh vĩnh viễn [7]

Trong những năm gần đây, công tác cứu hộ các cá thể tê tê bị tịch thu từ buôn bán và tái thả về tự nhiên ngày càng được quan tâm Năm 2017, Trung tâm Bảo tồn

động vật hoang dã Việt Nam (Save Vietnam’s Wildlife) trong 8 tháng đã cứu hộ được

407 cá thể tê tê tịch thu từ buôn bán trái phép, trong đó 304 cá thể đã được tái thả về

tự nhiên an toàn (Hình 7) Ngày 9/7/2018, Trung tâm tiến hành cứu hộ 116 con tê tê (tổng trọng lượng 530 kg) và sau quá trình kiểm tra chăm sóc đã thả về rừng Cúc Phương Vào ngày 6/10/2018, công an huyện Quảng Xương phối hợp với Chi cục Kiểm lâm Thanh Hóa đã tịch thu 24 cá thể tê tê với trọng lượng là 106,4 kg đang trên đường vận chuyển Chiều cùng ngày, số tê tê này đã được tổ công tác liên ngành bàn giao cho Trung tâm Bảo tồn động vật hoang dã Việt Nam để đưa về bảo vệ tại rừng quốc gia Cúc Phương Từ 2014 đến 6/2022 SVW đã trực tiếp cứu hộ được 1591 cá thể tê tê, phục hồi và tái thả hơn 60% tê tê cứu hộ về tự nhiên

Hình 7: Các nhân viên Trung tâm Nghiên cứu và bảo tồn động vật hoang dã

đang tái thả tê tê (Nguồn: Save Vietnam’s Wildlife)

Như vậy, tình trạng săn bắt và buôn bán tê tê trái pháp luật trên thế giới và Việt Nam rất đáng lo ngại, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quần thể của các loài tê tê trong tự nhiên Việc xác định chính xác tên loài, nguồn gốc của sản phẩm tê tê bị buôn bán qua Việt Nam là hết sức cần thiết, góp phần cung cấp cơ sở khoa học cho

các nhà quản lý và bảo tồn động vật hoang dã trong xử lý vi phạm và cứu hộ các loài động vật quý hiếm, bị đe dọa tuyệt chủng

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

*Đối tượng nghiên cứu: Các cá thể tê tê được cứu hộ tại Trung tâm Nghiên

cứu và Bảo tồn Động vật hoang dã (Vườn Quốc gia Cúc Phương) và các mẫu tê tê thu được từ buôn bán đang được lưu trữ ở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

*Vật liệu nghiên cứu:

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thu thập được 81 mẫu máu từ các cá thể tê

tê được cứu hộ tại Trung tâm Bảo tồn động vật hoang dã Việt Nam (Vườn quốc gia Cúc Phương), 69 mẫu vảy và 21 mẫu mô thu từ các hoạt động buôn bán, hiện đang lưu trữ ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Bảng 3)

Bảng 3: Thông tin các mẫu sử dụng trong nghiên cứu

Số thứ

tự Kí hiệu PTN Ngày thu

mẫu

Kí hiệu cá thể/mẫu vật từ buôn bán

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo theo Gaubert và cộng

sự (2016), theo nghiên cứu của Hsing – Mei Hsieh và cộng sự (2010) và theo nghiên cứu của Edward và cộng sự (2021) (Bảng 4) Các mồi được tổng hợp bởi hãng IDT (Integrated DNA Technologies) – Mỹ

• Các hóa chất được sử dụng để tách chiết ADN: bộ Kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, CHLB Đức), Ethanol (Merck, CHLB Đức)

• Phản ứng PCR được thực hiện bằng: Hotstar Taq Master Mix (Qiagen, CHLB Đức), Dream Taq Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Lithuania), các mồi (L24, H49; L15997, DH15972; PangF, PangR; ManF, ManR; Cytb_1_M, Cytb_2_M), nước khử ion (1st base, Malaysia)

• Sản phẩm phản ứng PCR được hiển thị bằng phương pháp điện di, sử sụng các hóa chất sau: đệm TBE 10X với công thức pha 250 ml: 27g Tris Base (Merck, CHLB Đức), 13,75g Boric Acid (Merck, CHLB Đức) và 1,875g EDTA (Merck, CHLB Đức); Ethidium bromide của Invitrogen, gel agarose (1st base, Malaysia), marker 100bp, 1kb (Thermo Fisher Scientific, Lithuania)

• Sản phẩm PCR thành công được tinh sạch sử dụng bộ kit GeneJET PCR Purification (Thermo Fisher Scientific, Lithuania)

- Thiết bị sử dụng:

Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu có tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội bao gồm: bể ổn nhiệt, máy li tâm Hettich Mikro 22R, Máy PCR SimpliAmp™ Thermal Cycler, máy soi gel, bể điện di Bio-RAD, pipet các

*Thời gian: Việc thu mẫu được thực hiện từ 03/2019 đến 01/2021 tại Trung tâm Bảo

tồn động vật hoang dã Việt Nam và từ 12/2019 đến 11/2021 tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

*Thu thập mẫu vật

- Chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu: Cồn, ống tuýp, xi lanh, dao cắt, máy khoan, lọ đựng mẫu, sổ ghi nhật kí và thông tin mẫu, máy ảnh, găng tay, bông

- Phương pháp thu mẫu:

+ Thu thập mẫu máu (đối với các cá thể còn sống): Sử dụng xi lanh Mẫu thu được

để trong ống tuýp có cồn, EDTA hoặc giấy thu mẫu (blood collector card)

+Thu thập mẫu vảy: Sử dụng máy khoan đã khử trùng, khoan lấy khoảng 250 mg bột và để trong ống tuýp 1,5 ml

+Thu thập mẫu mô (đối với các cá thể đã chết): Mẫu mô được bảo quản trong cồn Merck 70% hoặc tủ -20oC

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự

*Tách chiết ADN tổng số

Các mẫu được tách chiết ADN tổng số sử dụng bộ kit: Dneasy Blood and Tissue (Quiagen, CHLB Đức) Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có chỉnh lý theo Lê và cộng sự (2006) [34] Do các mẫu phân tích khác nhau nên chúng tôi chia ra làm hai nhóm bao gồm: nhóm 1 là mẫu vảy, nhóm 2

là mẫu máu và mô Quy trình tách chiết được thực hiện riêng theo từng nhóm mẫu đã được chỉnh sửa và hoàn thiện (để thu được tối đa lượng ADN có trong đó) với các bước cụ thể như sau:

❖ Nhóm 1: Nhóm mẫu máu và mô:

Bước 1: Tiền xử lý mẫu

Cắt mẫu thành các mảnh nhỏ trên Parafilm, để khô rồi gắp vào ống eppendorf 1.5 ml mới

Bước 2: Ly giải tế bào

Bổ sung 180 µl dung dịch đệm ATL và 20µl Proteinase K Ủ mẫu ở 56˚C trong 1 ngày

Bước 3: Kết tủa ADN

Bổ sung 200 µl dung dịch đệm AL, trộn đều hỗn hợp Ủ mẫu ở 70˚C trong 10 phút

Bổ sung 200 µl cồn (96 – 100 %), trộn nhẹ nhàng hỗn hợp

Bước 4: Thu ADN trên cột lọc

Chuyển hỗn hợp dịch từ ống eppendorf sang cột lọc gắn ống xả 2 ml Ly tâm ở tốc

độ 6000 rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 5: Rửa mẫu

Loại bỏ ống xả và dung dịch trong đó, thay ống xả mới Bổ sung 500 µl dung dịch đệm AW1 Ly tâm ở tốc độ 6000 rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

Loại bỏ ống xả và dung dịch trong đó, thay ống xả mới Bổ sung 500 µl dung dịch đệm AW2 Ly tâm ở tốc độ 20000 rcf trong 3 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 6: Làm khô màng lọc

Loại bỏ dung dịch trong ống xả rồi gắn lại vào cột lọc Ly tâm ở tốc độ 6000 rcf trong

1 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 7: Thu ADN

Loại bỏ ống xả và dung dịch trong đó Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5 ml mới

Bổ sung 60 µl dung dịch đệm AE Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng từ 15 – 20 phút Ly tâm

ở tốc độ 6000 rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

ADN tổng số sau đó được bảo quản ở 4˚C