nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số hợp chất flavonoid từ lá ổi

Việc nghiên cứu, chiết xuất, phân lập xác định thành phần flavonoid sẽ góp phần làm phong phú hơn dữ liệu về thành phần này, tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về tác dụng và cơ

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ CÂY ỔI (Psidium guajava L.)

Theo hệ thống phân loại Armen Takhtajan, cây Psidium guajava L có vị trí phân loại được tóm tắt như sau:[71]

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng)

1.1.2 Đặc điểm thực vật cây ổi :

Tùy vào điều kiện thời tiết và môi trường phát triển mà mỗi cây sẽ có đặc điểm khác nhau nhưng đa số cây ổi là những cây gỗ nhỏ với chiều cao trung bình là 3 - 6 m Thân cây ổi thường có một lớp vỏ mỏng cảm giác trơn nhẵn, thân cây sẽ bong ra thành từng mảng khi cây già đi Có nhiều lông mịn ở cành non, lá và các bộ phận của hoa Những cành non của cây có hình tứ giác và tại những cành này có những lông tơ mịn [3], [50]

Lá cây thường mọc đối, cuống lá ngắn, nhẵn Lá ổi có mùi thơm khi vò nát, đây là mùi đặc trưng của tinh dầu Phiến lá có hình bầu dục hoặc hình elip, thuôn dài; dài 7

- 16 cm, rộng 3 - 5 cm Lá thường có màu xanh nhạt đến xanh đậm Gân lá thường có hình lông chim và ở mặt dưới lá có lông tơ mịn [6], [50]

Hoa ổi màu trắng, mọc đơn độc hoặc tập trung 2 - 3 cái ở kẽ lá, lưỡng tính Cuống hoa có lông mịn, màu xanh Tràng hoa có 5 cánh, có lông mềm, gần đều, màu trắng mỏng thường nhanh chóng rụng Một búi thường gồm 250 nhị hoa màu trắng có đầu màu nhạt và có bao phấn màu vàng [3], [50]

Quả ổi là loại quả mọng; hình cầu, hình trứng hoặc tùy theo loài; vỏ quả giữa dày; ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại Khi chín quả thường có màu vàng; ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng Có chứa nhiều hạt, hình thận, không đều [1], [3]

1.1.3 Phân bố và sinh thái [1], [3] Ổi có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ Theo Dc Candolle, vùng trồng phổ biến của ổi có thể nằm giữa Mexico và Peru Chính những người Tây Ban Nha đã đưa cây đến các đảo ở Thái Bình Dương và Philippin, còn người Bồ Đào Nha du nhập cây vào Ấn Độ Trong quá trình du nhập, trồng trọt và lai tạo giống, người ta đã tạo nên rất nhiều giống ổi khác nhau Về sau chúng được trồng phổ biến ở khắp miền nhiệt đới Châu Á, Châu Phi Đặc biệt ở nước ta, ổi được trồng khá phổ biến ở khắp các địa phương, cả vùng đồng bằng tới miền núi trừ vùng cao trên 1500m Chỉ tính riêng quần thể ổi trồng đã có khoảng 7-10 giống khác nhau Quần thể mọc hoang dại thường chỉ thấy ở vùng trung du và vùng núi thấp Chúng mọc lẫn với nhiều loại cây bụi khác nhau ở các vùng đất, tại vị trí sau nương rẫy hay dọc theo các đường đi Quần thể ổi mọc hoang dại có hoa quả nhiều nhưng chất lượng quả kém nên ít được chú ý Ổi là cây ưa sáng, sinh trưởng và phát triển trong một giới hạn rộng của vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Giới hạn về nhiệt độ từ 15 đến 45 o C, nhiệt độ tốt nhất cho cây sinh trưởng và cho ra nhiều quả ở nhiệt độ từ 23 đến 28 o C, lượng mưa 1000 -

2000 mm/năm Cây có thể sống được trong thời tiết khô nóng tuy nhiên trong thời tiết quá ẩm ướt thường xuyên, kèm sương mù thì cây ra hoa kết quả kém Ổi ra hoa quả nhiều trong một năm Cụm hoa thường xuất hiện trên những cành non mới ra cùng năm

Các nước trồng nhiều ổi nhất thế giới là Brasil, Mexico, Thái Lan, Indonesia và một số nước khác Châu Á Ước tính mỗi năm có khoảng vài trăm ngàn tấn quả được đưa ra thị trường thế giới Hoa Kỳ, Nhật Bản và Châu Âu là những nước thường xuyên nhập khẩu ổi từ các nước nhiệt đới

1.1.4 Bộ phận dùng: Ổi không chỉ dùng làm thực phẩm mà còn có tác dụng làm thuốc nhờ vào các bộ phận: búp non, lá, quả, vỏ thân và vỏ rễ nhưng hay dùng nhất là búp và lá non Dùng tươi hay phơi hoặc sấy khô [1], [2]

Trong đông y ổi cũng đóng góp quan trọng trong một số bài thuốc để phòng và điều trị bệnh Dưới đây là một số bài thuốc đông y từ ổi:[3]

+ Búp ổi 12g, vỏ thân ổi, tô mộc mỗi vị 8g; gừng 2g sắc uống ngày 1 thang + Búp ổi (sao qua) 20g, vỏ quýt khô 10g, gừng nướng chín 10g Sắc uống ngày 1 thang

+ Búp ổi 20g, lá khổ sâm 12g, gừng sống 8g Băm nhỏ, sắc uống 2 lần trong 1 ngày

+ Lá ổi, vỏ quả bòng khô, mỗi vị 20g, lá chè tươi 10g, gừng tươi 2 lát Sắc uống trong ngày

+ Búp ổi, củ sả 16g, củ riềng (thái lát) 8g, sao qua, sắc đặc uống trong ngày + Lá ổi 8g; vỏ rụt 12g; thần khúc, thảo quả, hoắc hương, mỗi vị 8g; can khương 6g Tán bột, làm viên, ngày uống 8-10g

- Chữa lỵ: vỏ rộp ổi, hạt mã đề, hoa hòe, rễ mơ lông, mỗi vị 8g Sao vàng sắc uống ngày 1 thang

- Chữa thổ tả: vỏ rộp ổi sao đen, lá phèn đen mỗi vị 40g; hoài sơn sao đen, liên nhục sao đen mỗi vị 20g; trạch tả sao, trư linh, bạch truật sao vàng, bạch linh, hoắc hương mỗi vị 12g Tất cả phơi khô tán bột rây mịn Mỗi lần uống 1 thìa cà phê, ngày 2 lần

- Chữa khí hư: vỏ rộp ổi, vỏ cây sắn thuyền, rễ cỏ tranh mỗi vị 30g, sắc uống ngày

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.) 4 1 Một số nghiên cứu flavonoid trong lá ổi

Lá ổi là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng vi lượng, đa lượng tốt cho sức khỏe và các hợp chất có hoạt tính sinh học Trong lá ổi thường chứa 0,62% chất béo; 18,53% protein; 12,74% carbohydrat; 103 mg axit ascorbic và 1717 mg axit gallic[8]

Lá ổi có chứa thành phần chính là flavonoid, terpenoid, và 1 số hợp chất khác

1.2.1 Một số nghiên cứu flavonoid trong lá ổi

❖ Nghiên cứu flavonoid trên thế giới

Flavonoid là thành phần chính, chiếm tỷ lệ chủ yếu trong lá ổi Các flavonoid đã được nghiên cứu là thành phần có hoạt tính sinh học rất quan trọng trong lá ổi Hiện tại trên thế giới đã phân lập được flavonoid từ lá ổi thuộc các nhóm flavan, flavanon, flavon, isoflavon, flavonol,

- Flavan: năm 1994 Matsuo Tomoaki và các cộng sự đã phân lập được gallocatechin từ lá ổi [46]; sau đó Qa’dan Fadi và các cộng sự năm 2005 đã phân lập được catechin từ lá ổi [55];

- Flavanon: trong báo cáo của Jiang Lirong và các cộng sự phát hiện trong lá ổi có chứa naringenin, demthoxymatteucinol thuộc nhóm flavanon [31];

- Flavon: trong báo cáo của Jiang Lirong và các cộng sự đã phát hiện các flavon khác từ lá ổi là apigenin, ononin [31];

- Isoflavon: Jiang Lirong và các cộng sự phát hiện trong lá ổi có chứa các isoflavon: genistein, glycitin, daidzein, formononetin, biochanin, prunetin [31];

- Flavonol: Shao M và các cộng sự đã phân lập được 4 chất thuộc nhóm flavonol gồm quercetin, kaempferol, guaijaverin, guavinosid A [65]; năm 1994, Lozoya X cùng các cộng sự đã phân lập được isoquercetin nhóm flavonol từ lá ổi [45]; trong nghiên cứu của Arima & Danno năm 2002, đã phân lập được 3 hoạt chất từ lá ổi đó là morin-3-O-α-L-lyxopyranosid, morin-3-O-α-L-arabopyranosid [7]; năm

2010, từ lá ổi Metwally A.M và các cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất thuộc nhóm flavonol là quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid, quercetin-3-O-β-D- galactosid, quercetin-3-O-β-D-glucosid và quercetin-3-O-β-D-arabinopyranosid [48]; Shu Ji-Cheng và các cộng sự năm 2011 đã phân lập ra chất mới từ lá ổi đó là reynoutrin [67]; trong báo cáo của Jiang Lirong và cộng sự phát hiện các flavonol dịch chiết lá ổi là quercetin-3-O-β-D-glucuronid,quercetin-3-O-(6”-feruloyl)-β-D- galactopyranosid,quercetin-3-O-β-D-xylopyranosid,quercetin-3-O-gentiotis, [31]

Bảng 1.1: Một số Flavonoid phân lập được từ lá ổi trên thế giới

STT Tên hợp chất Công thức hóa học

Tài liệu tham khảo Flavan

❖ Một số nghiên cứu flavonoid lá ổi ở Việt Nam

Năm 2021, Lê Thị Bạch và các cộng sự phân lập được hai hợp chất flavonoid (avicularin, kaempferol) từ lá ổi bằng cách sử dụng kỹ thuật sắc ký cột silical gel và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Tác giả sử dụng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với tỷ lệ (100:0 - 0:100 tt/tt) thu được 15 phân đoạn (EE1-15) Avicularin được phân lập tại phân đoạn EE5 có khối lượng là 50 mg Tại phân đoạn EE6, tác giả đã phân lập được kaempferol với khối lượng thu được là 20 mg [39] Sau đó đến năm 2023, Nguyễn Phúc Đàm và các cộng sự đã lần đầu tiên phân lập được quercetin-3-O-sulfat Nhóm tác giả bằng hệ dung môi diclomethan: ethyl acetat: methanol (100: 0: 0 – 0: 0: 100 tt/tt/tt) thu được 10 phân đoạn Từ phân đoạn 7 bằng các hệ dung môi thích hợp đã phân lập được 7 mg quercetin-3-O-sulfat [51].Đến hiện tại các nghiên cứu phân lập flavonoid từ lá ổi tại Việt Nam vẫn còn hạn chế vì vậy cần phải tiến hành nghiên cứu phân lập thêm các flavonoid từ lá ổi

Bảng 1.2: Một số flavonoid từ lá ổi phân lập được từ Việt Nam

STT Tên hợp chất Công thức hóa học Tài liệu tham khảo

1.2.2 Một số nghiên cứu về các nhóm chất khác của lá ổi

+ Nhóm ursan: acid ursolic [3], acid 2-hydroxyursolic [13],

+ Nhóm olean: acid oleanolic, acid arjunolic [26], acid maslinic [3], acid guavanoic, acid guavacoumaric [13],

- Sesquiterpenoid: psiguadials A [66], diguajadial, psiguadiol A, psiguadiol B, psiguadiol C [83],

- Terpernoid khác: acid asiatic, acid jacoumaric, acid isoneriucoumaric, [13]; lupeol [10]

- Nhóm benzophenon: 2,6-dihydroxy-3,5-dimethyl-4-O-β-D-gluacosyl pyranosyl benzophenon; 2,6-dihydroxy-3,5-dimethyl-4-O-(6”-O-galloyl-β-D-glucopyranosyl) benzophenon; 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-O-(6”-O-galloyl-β-D-glucopyranosyl) - benzophenon [29]

- Tanin: lá ổi rất giàu tanin, búp và lá non chứa 8 - 9% tanin loại pyrrogalol như acid galic, acid ellagic Bên cạnh đó, lá ổi còn chứa tanin catechol và loại kết hợp giữa tanin thủy phân và tanin ngưng tụ [3].

TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOID TỪ LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L)

Flavonoid là thành phần chính trong dịch chiết lá ổi Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu chứng minh flavonoid có tác dụng kháng khuẩn, hạ đường huyết, chống ung thư, chống viêm, tác dụng trên hệ tiêu hóa và các hoạt tính sinh học khác

1.3.1 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết từ lá ổi đã được chứng minh có khả năng chống được một số bệnh ung thư Nghiên cứu của Kaileh M và các cộng sự vào năm 2007 đã chứng minh dịch chiết lá ổi có khả năng gây độc tế bào và chống các khối u cụ thể là trong các tế bào ung thư vú ở người [32] Năm 2014, Vieira Braga cùng các cộng sự đã nhận thấy dịch chiết từ lá ổi có khả năng chống các khối u và có khả năng chống ung thư biểu mô đại trực tràng [75] Hơn nữa, tinh dầu từ lá ổi có tác dụng chống tăng sinh đối với các dòng tế bào ung thư biểu bì miệng ở người và bệnh bạch cầu ở chuột [20] Lá ổi giàu flavonoid đã được chứng minh có khả năng chống sự tăng sinh mạnh mẽ, chống lại các dòng tế bào ung thư ở người [38] Flavonoid trong lá ổi được chứng minh có khả năng chống lại dòng tế bào DU-145 tuyến tiền liệt di căn có nguồn gốc từ não theo cách phụ thuộc vào liều tới 36,1% (48 giờ) và 3,59% (72 giờ) [16] Wang và cộng sự vào năm 2000 đã đánh giá hoạt tính chống tăng sinh của apigenin và khả năng chống lại ba dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng ở người vì chúng chứa sự kết hợp giữa đột biến p53 và ras (đột biến trên tế bào ung thư) [80] Kawakami và cộng sự đã nhận thấy quercetin và quercetin glycosid làm giảm tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng ở người [33] Cùng với đó trong nghiên cứu của Seufi đã chứng minh quercetin có khả năng ung thư biểu mô tế bào gan [63] Qua các nghiên cứu trên có thể thấy flavonoid trong lá ổi đóng vai trò rất quan trọng trong phòng và điều trị ung thư

Sự phát triển của các chủng gây bệnh mới và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh cổ điển hiện đang là mối lo ngại nghiêm trọng Các bệnh nhiễm khuẩn gây ra hầu hết là do các mầm bệnh vô cùng nguy hiểm với con người

Staphylococcus, Pseudomonas, Escherichiacoli, Bacillus shigella, Bacillus, Cao, lá, hoa và quả ổi có tác dụng ức chế các vi khuẩn tụ cầu vàng và Escherichia coli, ức chế mức độ trung bình vi khuẩn gây bệnh đường ruột Salmonella và Shigella Tinh dầu lá ổi ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.coli, Bacillus, tụ cầu vàng [3] Các chất hóa học có chứa trong lá kháng khuẩn theo cơ chế ức chế sự phát triển, phá vỡ và ly giải thành tế bào vi khuẩn, cản trở sự hình thành màng sinh học, ức chế sự sao chép và phiên mã

DNA, cản trở việc sản xuất adenosin triphosphat (ATP), ức chế độc tố vi khuẩn và tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) [38] Phân tích dịch chiết nước và hữu cơ của lá ổi ta tìm thấy flavonoid có tác dụng kháng khuẩn cao Các flavonoid là rutin, isoquercitrin, avicularin, quercitrin, kaempferol, morin có khả năng ức chế ergosterol, một thành phần màng tế bào nấm và glucosamin, một chất chỉ thị tăng trưởng tế bào nấm [38] Với sự hiện diện của các flavonol trong lá ổi đã giúp kiểm soát sự phát triển của vi-rút cúm, bao gồm cả các chủng kháng oseltamivir, thông qua việc ngăn chặn vi-rút xâm nhập vào tế bào vật chủ [20] Bốn chất flavonoid kháng khuẩn (morin-3-O-lyxosid, morin-3-O- arabinosid, quercetin và quercetin-3-O-arabinosid) của chiết xuất lá Psidium guajava được phát hiện là có hiệu quả chống lại vi khuẩn gây bệnh bao gồm Bacillus stearothermophilus, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus Brochothrix thermosphacta, Pseudomonas fluorescens, Vibrio cholera, Escherichia coli O157:H7 và Listeria monocytogenes [58]

1.3.3 Tác dụng chống oxy hóa

Các gốc tự do tạo ra trong quá trình trao đổi chất là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh trong cơ thể con người [70] Các hợp chất chống oxy hóa từ dịch chiết lá ổi trong việc giảm thiểu tác hại của các gốc tự do đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu Dịch chiết lá ổi được phát hiện có chức năng như chất chống oxy hóa vừa phải với giá trị IC 50 ~ 460,37 ± 1,33 μg/mL [41] Dịch chiết lá ổi đã được phát hiện là có hoạt tính chống oxy hóa trong các thử nghiệm như thử nghiệm DPPH, thử nghiệm oxy hóa khử, thử nghiệm loại bỏ gốc H2O2 và thử nghiệm loại bỏ gốc SO [76] Shabana và các cộng sự đã phân lập quercetin và hai quercetin glycosid (avicularin và guaijaverin) từ lá ổi có hoạt tính ức chế urease và có hoạt tính chống gốc tự do [64] Bốn hợp chất là guavinosid C, D, E và F được phân lập từ lá của cây ổi bởi Feng và các cộng sự, các hợp chất này được nhóm tác giả này nhận thấy có hoạt tính chống oxy hóa trong DPPH, acid 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sul-phonic, khả năng chống oxy hóa khử sắt [23] Taha cùng các cộng sự đã chứng minh bảy hợp chất flavonoid là quercetin, hesperetin, kaempferol, quercitrin, rutin, catechin và apigenin trong dịch chiết lá ổi có khả năng chống oxy hóa mạnh [72]

1.3.4 Tác dụng hạ đường huyết

Tiêm phúc mạc 1g/kg dịch ép quả ổi xanh gây hạ đường huyết rõ rệt ở chuột nhắt trắng bình thường và chuột gây đái tháo đường bằng alloxan Thời gian tác dụng ngắn hơn và tác dụng yếu hơn so với clopropamid và metformin [3] Guaijaverin và avicularin flavonoid của dịch chiết lá ổi có sự cải thiện đáng kể chức năng của tế bào β của đảo tụy và hình thái tế bào gan ở chuột mắc bệnh tiểu đường [84] Guaijaverin có tác dụng ức chế hoạt động của enzym cân bằng nội môi đường huyết, cùng với đó avicularin có khả năng ức chế sự kết tụ lipid nội bào Catechin và quercetin được chứng minh có tác dụng ức chế hơn 80% trong khi axit ferulic không có hoạt tính Trong một nghiên cứu, bảy hợp chất flavonoid tinh khiết cho thấy hoạt động ức chế mạnh mẽ chống lại sucrase, maltase và α-amylase, đồng thời có tác dụng hiệp đồng rõ ràng chống lại α-glucosidase [78] Nghiên cứu của Deguchi và Miyazaki đã chứng minh rằng thành phần polyphenol bị polyme hóa trong dịch chiết lá ổi có khả năng ức chế hoạt động in vitro của enzyme α-glucosidase Catechin và quercetin trong dịch chiết lá ổi cũng được chứng minh có khả năng ức chế các chất vận chuyển glucose [20]

1.3.5 Tác dụng trên tiêu hóa

Theo các nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết lá ổi có đặc tính chống tiêu chảy rất tốt, bằng cách chống co thắt ruột Mazumdar và cộng sự đã chỉ ra rằng lá ổi có khả năng chống tiêu chảy ở chuột Wistar Ojewole và cộng sự đã chứng minh ở liều 52–

410 mg/kg khi dùng bằng đường uống đã được phát hiện có tác dụng chống tiêu chảy, đồng thời cũng dẫn đến giảm vận chuyển qua đường ruột và loại bỏ sự giãn nở của các sản phẩm dạ dày không mong muốn [38] Một mặt khác, lá ổi còn có khả năng bảo vệ dạ dày khỏi bị loét bằng cách ức chế các tổn thương dạ dày, làm giảm lượng bài tiết và tiết acid của dạ dày, đồng thời nâng cao độ pH dạ dày [20] Hoạt động chống loét này là kết quả của việc bảo vệ niêm mạc, có liên quan đến các flavonoid trong lá [20] Đặc tính chống tiêu chảy của dịch chiết nước và methanol của lá ổi đã được chứng minh và tác dụng chống co thắt của chúng là do quercetin, một loại flavonoid có trong lá ổi [49] Quercetin được chứng minh có tác dụng ức chế nhu động ruột và làm giảm tính thấm mao mạch trong khoang bụng Ở Costa Rica, quercetin và quercetin-3- arabinosid được sử dụng trong điều trị bệnh tiêu chảy [59] Guaijaverin từ dịch chiết lá ổi, cho thấy hoạt tính ức chế cao đối với Streptococcus mutans [54]

Các nghiên cứu đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết lá ổi Nghiên cứu tiến hành trên dòng tế bào được xử lý bằng các dịch chiết khác nhau của lá cho thấy chỉ có dịch chiết ethanol và aceton mới có tác dụng gây độc tế bào ở nồng độ cao Hơn nữa, dịch chiết ethanol của lá ổi cho thấy tác dụng bảo vệ gan lớn hơn và tác dụng gây độc tính tế bào thấp hơn [20] Điều trị bằng dịch chiết lá ổi với nồng độ flavonoid cao đã làm giảm tình trạng kháng insulin và hạn chế sự gia tăng lượng glucose cũng như lipid Một số nghiên cứu đã chứng minh chuột có sử dụng dịch chiết lá ổi thì adenosin monophosphat và PPARα tăng Sự tăng ALT và AST là dấu hiệu của gan nhiễm mỡ, khi sử dụng flavonoid trong dịch chiết lá ổi có thể làm giảm 2 chỉ số này Ngoài ra, bệnh đái tháo đường có mối liên quan chặt chẽ với các chức năng của gan, bao gồm gan to, gan nhiễm mỡ và xơ hóa, vì chức năng chính của gan là ổn định lượng đường trong máu Bất kỳ sự bất thường nào trong quá trình chuyển hóa glucose, lipid và insulin đều được coi là tình trạng kinh điển ở bệnh đái tháo đường týp 2 [38].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu lá ổi tôi đã được nhận từ đề tài Nafosted mã số 108.06-2021.31 Nhóm nghiên cứu thu hái lá ổi bánh tẻ tại thôn Dụ Đại 2, xã Đông Hải, Huyện Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình có tọa độ 20 o 35'52.7''N 106 o 21'49.5''E Trên cây trồng được 5 năm tuổi trở lên, không phun thuốc bảo vệ thực vật trong 1 năm trước khi thu hái Lá ổi được thu hái vào thời điểm 7-9 giờ buổi sáng, vào tháng 9-10 dương lịch.

Nguyên liệu

Phân tích TLC được thực hiện bằng cách sử dụng bản mỏng silica gel 60 GF254 Phát hiện vết dưới bức xạ UV 254, 365 nm và bằng cách phun tẩm với H2SO4 10% sau đó làm nóng bằng súng nhiệt

Việc tinh chế bằng sắc ký cột được thực hiện bằng hạt silica gel 60 Mesh

Các hóa chất được sử dụng bao gồm các dung môi hữu cơ: n-hexan, CH2Cl2, Aceton, MeOH, EtOAc, Ethanol 96% và nước

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

5 Ethyl acetat Trung Quốc DĐVN V

• Cột sắc kí với đường kính 2,5 cm; 2 cm; 1,5 cm

• Dụng cụ thủy tinh: Cốc có mỏ, pipet, phễu, ống nghiệm, ống đong, bình cầu 1L, 500 ml, 100 ml, 50 ml, 25 ml, bình nón

• Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sĩ)

• Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKRR AVANCE AM 600 FT-NMR tại Viện hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam

• Chất nhồi cột: Silical gel pha thuận (240-430 mesh, Merk), silicalgel pha đảo YMC.

Nội dung nghiên cứu

• Chiết xuất dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn lá cây ổi

• Phân lập một số flavonoid từ dịch chiết phân đoạn lá cây ổi

• Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.

Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp ngâm nóng 3 lần với dung môi là EtOH 96%, cất thu hồi dung môi lấy cắn chiết EtOH tổng

Cắn chiết tổng tiếp tục được phân tán vào nước rồi chiết lần luợt với các dung môi n-Hexan, CH2Cl2 và EtOAc Các phân đoạn dịch chiết thu được đem cô lấy cắn

Sử dụng phân đoạn EtOAc để phân lập hợp chất

2.4.2 Phương pháp phân lập hợp chất

Phân đoạn ethyl acetat được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (Merck) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn GF254 (Merck) Các vết được hiện lên bản mỏng sắc ký để quan sát dự đoán các nhóm chất Đưa bản mỏng vào soi đèn

UV với bước sóng 254 nm, 365 nm và dùng thuốc thử hiện màu là H2SO4 10% để quan sát màu các vết

- Nguyên tắc của sắc ký cột: Hấp phụ và giải hấp phụ (trên cơ sở hấp phụ của các chất vào silical gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp) Quá trình hấp phụ sẽ xảy ra khi các chất cần tách có nhóm chức tương tác với chất hấp phụ Khóa luận sử dụng chất hấp phụ silica có nhóm hydroxyl tự do có khả năng liên kết hydro của pha động càng lớn thì càng làm tăng khả năng rửa giải các hợp chất phân cực khi đi qua cột

- Các bước tiến hành lên cột silica gel:

Chuẩn bị cột: chọn cột thủy tinh có đường kính phù hợp, có chiều dài cột gấp ít nhất

3 lần chiều cao lượng silical gel cần cho vào cột để phân lập Cột được rửa sạch và tráng bằng methanol và để khô tự nhiên Nếu cột không màng lót ở đáy cột thì nhét bông để giữ cho silical gel không bị chảy xuống và cố định trên giá một cách chắc chắn

Nhồi cột: Từ lượng cao chuẩn bị lên cột, cân lượng silical gel phù hợp cho vào cốc có mỏ, thường lượng silical gel sẽ gấp ít nhất 3 lần lượng cao cần phân lập Thêm dung môi rửa giải, khuấy đều cho đến khi hết bọt và silica gel trương nở ra Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị ( gõ nhẹ vào phần dưới cột bằng quả bóp cao su để lượng silica gel được trải đều trong cột) Mở khóa cột, rót tiếp dung môi lên cột liên tục trong ít nhất 8 tiếng để ổn định cột Cần chú ý đảm bảo silica gel không bị chảy ra ngoài Giữ lại một ít dung môi để cột không bị khô trước khi khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột

Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu: Có hai dạng mẫu là mẫu khô và mẫu ướt Đối với mẫu khô thì khi lượng chất nhiều, chạy thô hoặc mẫu có một phần không tan trong dung môi chạy cột Mẫu khô được đưa vào bình cầu, hòa tan bằng dung môi trung gian Thêm một lượng pha tĩnh gấp 1,5 – 2 lần lượng mẫu vào bình cầu Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm thu được pha tĩnh khô tơi chứa mẫu Nạp hết pha tĩnh đó vào cột và cho tiếp dung môi chạy cột vào Đối với mẫu ướt thì khi tách tinh, mẫu tan hoàn tan dung môi chạy cột Mẫu được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đợi dung môi trong cột cách mặt silica gel khoảng 2-3 mm thì đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

Rửa giải: Cho hệ dung môi thích hợp vào cột đã được nạp mẫu Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô

Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh, ống nghiệm với thể tích phù hợp Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký mỏng pha thường hoặc pha đảo

Phát hiện vết bằng đèn tử ngoại và dùng thuốc thử H2SO4 10% để hiện màu

Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng

Mục đích: Được sử dụng để thăm dò hệ dung môi phân lập chất và theo dõi quá trình rửa giải

Nguyên tắc: Dựa vào cơ chế hấp phụ Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ, pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau

Tiến hành: Chấm các chất cần phân tích lên bản mỏng Sau đó pha dung môi chạy pha động và cho vào bình chạy sắc ký đậy nắp kín để từ 5-10 phút để bão hòa dung môi trong bình Sau đó đưa bản mỏng sắc ký phụ thuộc vào dung môi pha động và khả năng hấp phụ của chất phân tích lên bản mỏng sắc ký sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau

Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm hoặc bản mỏng được phun dung dịch thử H2SO4 10% để hiện màu

2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được dựa trên: Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) Sau đó so sánh với các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố trong các tài liệu trước đây.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Chiết xuất lá ổi

Lá ổi bánh tẻ sau khi thu hoạch được rửa sạch, sấy khô Lấy 2 kg dược liệu chiết nóng 3 lần với ethanol 96% mỗi lần 6-8h với tỷ lệ dược liệu/dung môi mỗi lần lần lượt là 10:1, 6:1, 4:1 (tt/tt) Kết thúc 3 lần chiết, lọc loại bỏ bã dược liệu, dịch chiết được gộp lại, cất thu hồi dưới áp suất giảm thu được cao đặc có khối lượng thu được là 220g

Phân tán cắn chiết ethanol trong một lượng nước nóng tối thiểu, sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với dung môi n-Hexan, CH2Cl2, EtOAc trong bình gạn thủy tinh Mỗi dung môi chiết nhiều lần cho đến khi lớp dung môi không màu thu được dịch chiết n-Hexan, CH2Cl2, EtOAc Sau đó cất thu hồi dung môi lần lượt từng dịch chiết dưới áp suất giảm, thu được 85g cao chiết phân đoạn n-Hexan, 52g cao chiết phân đoạn CH2Cl2, 45g cao chiết phân đoạn EtOAc và 30g cao nước

Quy trình chiết được trình bày theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết xuất lá ổi

Phân tán cao chiết tổng vào nước Chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần Ngâm nóng 60 o C

Tỷ lệ DM/DL : 10 :1, 6:1, 4:1, tt/tttt Lọc, gộp dịch cô loại dung môi

Cao chiết phân đoạn n-Hexan

Phân lập các hợp chất

Cao ethyl acetat được tiến hành tách phân đoạn bằng cách cho chạy qua cột sắc ký với pha tĩnh là silical gel, rửa giải bằng hệ dung môi diclomethan: methanol (100:1, 0:100 tt/tt) hứng bằng các bình nón 100ml; sau đó chấm kiểm tra các vết tại các lọ bằng TLC để gom các các lọ có vết giống nhau, cất thu hồi dung môi ta thu được 5 phân đoạn A (100:1, 50:1 tt/tt); B (20:1 tt/tt); C (10:1 tt/tt); D (5: 1 tt/tt); E (2:1, 1:1, 0:100 tt/tt)

Phân đoạn D (3g) được cho chạy qua cột pha thuận silical gel, pha động là n- hexan: ethyl acetat: aceton: nước (0,5: 2: 2: 0,1 tt/tt/tt/tt), hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra các ống bằng TLC, sau đó gộp các ống có vết giống nhau, cất thu hồi dung môi ta thu được 4 phân đoạn (D1-D4) Phân đoạn D1 được cho chạy qua cột sắc ký silical gel pha thuận với dung môi rửa giải là diclomethan: ethyl acetat: aceton (1: 1: 0,1 tt/tt/tt), hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra các ống bằng TLC ta phát hiện từ ống 7 đến ống 12 trên bản mỏng chỉ có một vết và vết thu được giống nhau Gộp các ống từ 7 đến 12, cất thu hồi dung môi thu được hợp chất 1 (ký hiệu là LO-

A1) (14mg) Phân đoạn D2 chạy qua cột sắc ký silical gel pha thuận với dung môi rửa giải n-hexan: ethyl acetat: methanol: nước (0,5: 3: 1: 0,05 tt/tt/tt/tt), hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra các ống bằng TLC, sau đó gộp các ống có vết giống nhau, cất thu hồi dung môi thu được 4 phân đoạn (D21-D24) Phân đoạn D22 tiếp tục được chạy qua cột sắc ký pha đảo với dung môi methanol: nước (1:2 tt/tt), hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra ống 20 đến ống 27 trên bản mỏng chỉ có một vết và vết thu được giống nhau Gộp các ống từ 20 đến 27, cất thu hồi dung môi thu được hợp chất 2 (ký hiệu LO-A2) (9mg) ( Xem sơ đồ 3.2)

Phân đoạn E (8g) được cho chạy qua cột sắc ký silical gel pha thuận với pha động diclomethan: methanol: nước (3: 1: 0,1 tt/tt/tt), hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra các ống bằng TLC, sau đó gộp các ống có vết giống nhau, cất thu hồi dung môi thu được 5 phân đoạn (E1-E5) Phân đoạn E3 chạy qua cột sắc ký pha thuận bằng dung môi ethyl acetat: aceton: nước (3:1:0,1 tt/tt/tt) hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra ống 12 đến ống 18 trên bản mỏng chỉ có một vết và vết thu được giống nhau Gộp các ống từ 12 đến 18, cất thu hồi dung môi thu được hợp chất

3 (ký hiệu LO-A3) (18mg) Phân đoạn E4 được chạy qua sắc ký pha thuận silical gel rửa giải bằng hệ dung môi aceton: methanol (10:1 tt/tt) hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra các ống bằng TLC, sau đó gộp các ống có vết giống nhau, cất thu hồi dung môi thu được 5 phân đoạn (E41-E45) Phân đoạn E43 tiếp tục được chạy qua cột sắc ký silical gel pha thuận bằng hệ dung môi ethyl acetat: aceton: nước (2:1:0,1 tt/tt/tt) thu được 3 phân đoạn (E431-E433) Từ phân đoạn E432 chạy qua cột sắc ký pha đảo với dung môi methanol: nước (1:1 tt/tt), hứng bằng các ống nghiệm, chấm kiểm tra ống 23 đến ống 28 trên bản mỏng chỉ có một vết và vết thu được giống nhau Gộp các ống từ 23 đến 28, cất thu hồi dung môi thu được hợp chất 4 (ký hiệu

LO-A4) (10mg) (Xem sơ đồ 3.3)

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập LO-A1, LO-A2 từ lá ổi

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập LO-A3, LO-A4 từ lá ổi

Xác định cấu trúc các hợp chất

Hợp chất LO-A1 thu được dưới dạng kết tinh, không màu

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A1 thu được 5 tín hiệu hấp thụ của proton thơm ở vùng trường thấp là δ H [5,88 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-6); 5,95 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8); 6,86 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'); 6,78 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5') và 6,74 (1H, dd, J 1

= 1,8 Hz, J 2 = 7,8 Hz, H-6')]; trong đó có 2 tín hiệu tại δ H [5,88 (1H, d, J = 2,4 Hz, H- 6); 5,95 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8)] có giá trị của hằng số tương tác J = 2,4 Hz xác định được vị trí của 2 proton trên vòng thơm ở vị trí meta Phân tích hằng số tương tác của

3 proton thơm còn lại trên phổ tại δ H 6,86 [(1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'); 6,78 (1H, d, J 7,8 Hz, H-5') và 6,74 (1H, dd, J 1 = 1,8 Hz, J 2 = 7,8 Hz, H-6')] cho thấy sự có mặt của hệ tương tác spin ABX Ngoài ra, một proton oxymethin tại δ H 4,59 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-2), một proton cacbinol tại δ H 4,00 (1H, td, J 1 = 5,4 Hz, J 2 = 7,8 Hz, H-3), và hai proton methylen được ghi nhận tại δ H [2,53 (1H, dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 16,2 Hz, H-4) và 2,87 (1H, dd, J 1 = 5,4 Hz, J 2 = 16,2 Hz, H-4)] đã được phát hiện (Xem hình 3.1)

Hình 3.1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A1

Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A1 thu được 15 tín hiệu tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học là δ C [82,9 (C-2); 68,8 (C-3); 28,5 (C-4); 156,9 (C-5); 96,3 (C- 6); 157,8 (C-7); 95,5 (C-8); 157,6 (C-9); 100,9 (C-10); 132,2 (C-1'); 115,3 (C-2'); 146,3 (C-3'); 146,2 (C-4'); 116,1 (C-5'); 120,0 (C-6')] (Xem hình 3.2) Kết hợp với các tín hiệu trên phổ 1 H-NMR và so sánh đối chiếu tài liệu tham khảo hợp chất LO-A1 được xác định là catechin Cấu hình hình tuyệt đối tại vị trí C-2 và C-3 được xác định dựa trên cơ sở so sánh chuyển dịch hóa học tại hai vị trí tương ứng của hai hợp chất catechin (2R, 3S – 83,0 và 68,9 ppm), epicatechin (2R, 3R – 79,1 và 65,7 ppm) cho phép xác định cấu hình 2R, 3S – 82,9 và 68,8 ppm của LO-A1 [15]

Hình 3.2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A1

Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của LO-A1

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1 H và 13 C -NMR của hợp chất LO-A1

LO-A1 Tài liệu tham khảo [15] a,b δ H (ppm) a,c δ C (ppm) d δ H (ppm) d δ C (ppm)

Hz, J 2 = 7,8 Hz) 120,0 6,70 120,2 a: Đo trong Methanol-d4, b : 600 MHz, c : 150MHz

Hợp chất LO-A2 thu được dưới dạng kết tinh không màu

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A2 thu được 3 tín hiệu hấp thụ của proton thơm ở vùng trường thấp là δ H [5,88 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-8); 5,94 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-6) và 6,42 (2H, s, H-2', 6')] trong đó có 2 tín hiệu tại δ H [5,88 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-

8); 5,94 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8)] có giá trị của hằng số tương tác J = 2,4 Hz và J = 1,8

Hz xác định được vị trí của 2 proton ở vị trí meta Phân tích hằng số tương tác của 2 proton thơm còn lại trên phổ cho thấy sự có mặt của vòng thơm có vị trí của 2 proton trên vòng thơm ở vị trí meta Phân tích tín hiệu của cặp proton δ H 6,42 (2H, s, H-2', 6') cho thấy sự hiện diện của vòng benzen thế ở 4 vị trí 1, 3, 4, 5 trong cấu trúc của LO- A2 Ngoài ra, một proton oxymethin tại δ H 4,55 (1H, d, J = 6,6 Hz, H-2), một proton cacbinol tại δ H 3,99 (1H, td, J 1 = 5,4 Hz, J 2 = 7,8 Hz, H-3), và hai proton methylen lần lượt được ghi nhận tại δ H [2,52 (1H, dd, J 1 = 7,8 Hz, J 2 = 15,6 Hz, H-4) và 2,83 (1H, dd, J 1 = 5,4 Hz, J 2 = 16,2 Hz, H-4)] đã được phát hiện ( Xem hình 3.4)

Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A2

Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A2 thu được 15 tín hiệu tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học là δ C [82,9 (C-2); 68,8 (C-3); 28,1 (C-4); 156,9 (C-5); 96,3 (C- 6); 157,8 (C-7); 95,5 (C-8); 100,7 (C-4a); 157,6 (C-8a); 131,6 (C-1'); 107,2 (C-2', 6'); 146,9 (C-3', 5'); 134,0 (C-4')] ( Xem hình 3.5) Kết hợp với các tín hiệu trên phổ 1 H- NMR và so sánh đối chiếu tài liệu tham khảo hợp chất LO-A2 được xác định là gallocatechin.Cấu hình hình tuyệt đối tại vị trí C-2 và C-3 được xác định dựa trên cơ sở so sánh chuyển dịch hóa học tại hai vị trí tương ứng của hai hợp chất gallocatechin (2R, 3S-82,8 và 68,4 ppm), epigallocatechin (2R, 3R - 79,5 và 67,0 ppm) cho phép xác định cấu hình 2R, 3S - 82,9 và 68,8 ppm của LO-A2 [19]

Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A2

Hình 3.6: Cấu trúc hợp chất LO-A2

Bảng 3.2 : Số liệu phổ 1 H và 13 C -NMR của hợp chất LO-A2

LO-A2 Tài liệu tham khảo [19] a,b δ H (ppm) a,c δ C (ppm) d δ H (ppm) d δ C ( ppm)

4' - 134,0 - 133,3 a: Đo trong Methanol-d4, b : 600 MHz, c : 150MHz

Hợp chất LO-A3 thu được dưới dạng bột kết tinh màu vàng

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A3 thu được 5 tín hiệu hấp thụ của proton thơm ở vùng trường thấp là δ H [6,26 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-6); 6,41 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8); 7,55 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'); 6,92 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5') và 7,51 (1H, dd, J 1

= 1,8 Hz, J 2 = 8,4 Hz, H-6')], trong đó có 2 tín hiệu tại δ H [6,26 (1H, d, J = 2,4 Hz, H- 6) và 6,41 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8)] có giá trị của hằng số tương tác J = 2,4 Hz xác định được vị trí của 2 proton trên vòng thơm ở vị trí meta Phân tích hằng số tương tác của 3 proton thơm còn lại trên phổ cho thấy sự có mặt của hệ tương tác spin ABX tại δ H [7,55 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'); 6,92 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5') và 7,51 (1H, dd, J 1 1,8 Hz, J 2 = 8,4 Hz, H-6')], chứng tỏ sự xuất hiện của một vòng benzen thế ở vị trí 1', 3', 4' Ngoài ra, cho thấy sự có mặt của một cấu tử đường arabinose với các tín hiệu tại δ H [5,49 (1H, s, H-1''); 4,35 (1H, dd, J 1 = 1,2 Hz, J 2 = 3 Hz, H-2''); 3,93 (1H, dd, J 1 = 3

Hz, J 2 = 5,4 Hz, H-3''); 3,89 (1H, dd, J 1 = 4,8 Hz, J 2 = 8,4 Hz, H-4'') và 3,53 (2H, t, J 4,2 Hz, H-5'')], với hai proton nhóm methylen tại δ H 3,53 (2H, t, J= 4,2 Hz, H-5'') cho phép xác định cấu trúc của đường arabinose là arabinofuran.(Xem hình 3.7)

Hình 3.7: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A3

Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A3 thu được 20 tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học là δ C [158,6 (C-2); 134,9 (C-3); 180,0 (C-4); 163,1 (C-5); 99,9 (C-6); 166,0 (C-7); 94,8 (C-8); 159,3 (C-9); 105,6 (C-10); 122,9 (C-1'); 116,9 (C-2'); 146,4 (C-3'); 149,8 (C-4'); 116,5 (C-5'); 123,1 (C-6'); 109,6 (C-1''); 83,3 (C-2''); 78,7 (C-3''); 88,0 (C-4'') và 62,6 (C-5'')] Trong đó có 15 tín hiệu cacbon đặc trưng cho cấu trúc của khung quercetin tại δ C [158,6 (C-2); 134,9 (C-3); 180,0 (C-4); 163,1 (C-5); 99,9 (C-6); 166,0 (C-7); 94,8 (C-8); 159,3 (C-9); 105,6 (C-10); 122,9 (C-1'); 116,9 (C-2'); 146,4 (C-3');149,8 (C-4'); 116,5 (C-5'); 123,1 (C-6')] Ngoài ra, 5 tín hiệu cacbon còn lại trên phổ có độ dịch chuyển hóa học là δ C [109,6 (C-1''); 83,3 (C-2''); 78,7 (C-3''); 88,0 (C-4'') và 62,6 (C-5'')] đặc trưng cho cấu trúc của đường L – arabinofuranosid Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp so sánh đối chiếu với tài liệu tham khảo, hợp chất LO-A3 được xác định là quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (Avicularin) [35] (Xem hình 3.8)

Hình 3.8: Phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A3

Hình 3.9: Cấu trúc hợp chất LO-A3

Bảng 3.3 : Số liệu phổ 1 H và 13 C -NMR của hợp chất LO-A3

LO-A3 Tài liệu tham khảo

2'' 4,35 (1H, dd, 1,2; 3) 83,3 4,33 (1H, d, 2,7) 83,3 3'' 3,93 (1H, dd, 3; 5,4) 78,7 3,89 (1H, dd, 2,7; 4,8) 78,7 4'' 3,89 (1H, dd, 4,8; 8,4) 88,0 3,8 (1H, dd, 4,8; 9,6) 87,9 5'' 3,53 (2H, t, 4,2) 62,6 3,3 (1H, dd, 1,5; 3,3) 62,5 a: Đo trong Methanol-d4, b : 600 MHz, c : 150MHz

Hợp chất LO-A4 thu được dưới dạng bột kết tinh màu vàng

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A4 thu được 5 tín hiệu hấp thụ của proton thơm ở vùng trường thấp là δ H [6,23 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8); 7,86 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'); 6,89 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5') và 7,61 (1H, dd, J 1

= 1,8 Hz, J 2 = 8,4 Hz, H-6')], trong đó có 2 tín hiệu tại δ H [6,23 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-6) và 6,42 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8)] có giá trị của hằng số tương tác J = 2,4 Hz xác định được vị trí của 2 proton trên vòng thơm ở vị trí meta Phân tích hằng số tương tác của 3 proton thơm còn lại trên phổ cho thấy sự có mặt của hệ tương tác spin ABX tại δ H [7,86 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'); 6,89 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5') và 7,61 (1H, dd, J 1 1,8 Hz, J 2 = 8,4 Hz, H-6')], chứng tỏ sự xuất hiện của một vòng benzen thế ở vị trí 1', 3', 4' Ngoài ra, cho thấy sự có mặt của một cấu tử đường glucose với các tín hiệu tại δ H [5,49 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-1''); 3,48-3,68 (H-2'', H-3'', H-4'', H-5'') và 3,84 (1H, dd,

J 1 = 7,8 Hz, J 2 = 9,6 Hz, H-6''a); 3,87 (1H, br.d, J = 3,0, H-6''b)] với tín hiệu đặc trưng của proton anomeric δ H 5,49 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-1'') có giá trị hằng số tương tác J 7,8 Hz cho phép xác định cấu hình của đường tại C-1'' là β, hai proton nhóm methylen tại δ H [3,84 (1H, dd, J 1 = 7,8 Hz, J 2 = 9,6 Hz, H-6''a); 3,87 (1H, br.d, J = 3,0, H-6''b)] và các nhóm oxymethin nằm ở δ H 3,48 - 3,68 (H-2'', H-3'', H-4'', H-5'') (Xem hình 3.10)

Hình 3.10: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LO-A4

Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A4 thu được 21 tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học là δ C [158,5 (C-2); 135,8 (C-3); 179,6 (C-4); 163,0 (C-5); 99,9 (C-6); 166,1 (C-7); 94,7 (C-8); 158,8 (C-9); 105,6 (C-10); 122,9 (C-1'); 116,1 (C-2'); 145,8 (C-3'); 150,0 (C-4'); 117,8 (C-5'); 123,0 (C-6'); 105,4 (C-1''); 75,1 (C-2''); 77,2 (C-3''); 70,0 (C-4''); 73,2 (C-5'') và 62,0 (C-6'')] Trong đó có 15 tín hiệu cacbon đặc trưng cho cấu trúc của khung quercetin tại δ C [158,5 (C-2); 135,8 (C-3); 179,6 (C-4); 163,0 (C-5); 99,9 (C-6); 166,1 (C-7); 94,7 (C-8); 158,8 (C-9); 105,6 (C-10); 122,9 (C-1'); 116,1 (C-2'); 145,8(C-3'); 150,0 (C-4'); 117,8 (C-5'); 123,0 (C-6')] Ngoài ra, 6 tín hiệu cacbon còn lại trên phổ có độ dịch chuyển hóa học δ C là [105,4 (C-1''); 75,1 (C-2''); 77,2 (C-3''); 70,0 (C-4''); 73,2 (C-5'') và 62,0 (C-6'')] đặc trưng cho cấu trúc của đường

D – glucopyranosid Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp so sánh đối chiếu với tài liệu tham khảo, hợp chất LO-A4 được xác định là quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid (Isoquercetin) [11] (Xem hình 3.11)

Hình 3.11: Phổ 13 C-NMR của hợp chất LO-A4

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của LO-A4

Bảng 3.4 : Số liệu phổ 1 H và 13 C -NMR của hợp chất LO-A4

Vị trí LO-A4 Tài liệu tham khảo [11] a,b δ H (ppm) a,c δ C (ppm) a,b δ H (ppm) a,c δ C (ppm)

3,71 62,6 a: Đo trong Methanol-d4, b : 600 MHz, c : 125MHz

BÀN LUẬN

Về kết quả chiết xuất thu cao tổng và dịch chiết phân đoạn ethyl acetat

Phương pháp dùng để chiết dược liệu là phương pháp ngâm nóng với dung môi chiết ethanol 96% tỷ lệ dược liệu/ dung môi 10:1, 6:1, 4:1 (kg/l), mỗi lần 6-8h

Việc lựa chọn phương pháp ngâm nóng có

+ Là phương pháp đơn giản, sử dụng rộng rãi, dễ thực hiện

+ Thích hợp với nhiều loại dược liệu, nhiều loại dung môi

+ Không tốn quá nhiều thời gian, hiệu suất chiết thu được khá cao

+ Dễ nâng quy mô do điều kiện chiết xuất đồng nhất ở các quy mô nghiên cứu

- Mặt khác phương pháp ngâm nóng này cũng có nhược điểm sau:

+ Dễ bị thủy phân các chất bởi nhiệt

+ Cần chiết nhiều lần để thu được tối đa hoạt chất, dịch chiết loãng và tốn dung môi

Việc lựa chọn dung môi ethanol 96% vì đây là một dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, hòa tan được nhiều hoạt chất hơn, chọn lọc hơn nước, phù hợp với phương pháp chiết ngâm nóng Tuy nhiên dung môi này độ chọn lọc chưa tốt nên hòa tan nhiều hoạt chất khác nhau

Vì vậy để thuận lợi cho quá trình phân lập các chất thì dịch chiết cao tổng ethanol tiếp tục được chiết thành các phân đoạn n-hexan, diclomethan, ethyl acetat

Qua việc khảo sát 3 phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng nhận thấy phân đoạn ethyl acetat có nhiều vết có đặc điểm màu sắc giống với flavonoid nên lựa chọn phân đoạn này để chiết tách các hợp chất flavonoid.

Về phương pháp phân lập các chất

Quá trình phân lập các hợp chất flavonoid từ lá ổi sử dụng phương pháp sắc ký cột thường quy kết hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký cột dùng để tách các phân đoạn sau đó tách ra các chất Phương pháp sắc ký cột dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn phân đoạn, tìm hệ dung môi để rửa giải, và theo dõi các chất trong quá trình chạy cột sắc ký phân lập các chất Ưu điểm của phương pháp này là chi phí hợp lý, dễ dàng thao tác thực hiện, tiết kiệm thời gian…

Về kết quả phân lập các chất

Từ phân đoạn ethyl acetat đã phân lập được bốn hợp chất tinh khiết đó là LO-A1,

LO-A2, LO-A3, LO-A4 Dựa vào đặc điểm về dạng hình thù, khối phổ, phổ cộng hưởng từ, so sánh với các dữ liệu đã được công bố, đã xác định được LO-A1 là catechin, LO-A2 là gallocatechin, LO-A3 là avicularin, LO-A4 là isoquercitin

Hình 4.1: Cấu trúc hóa học của các hợp chất flavonoid đã phân lập

Catechin là nhóm các hợp chất polyphenolic thuộc nhóm flavonoid có nồng độ cao trong nhiều loại trái cây, rau và đồ uống có nguồn gốc thực vật Catechin có tên IUPAC là (2 S ,3 R )-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2 H -chromene-3,5,7-triol Chúng được sử dụng rộng rãi làm dược phẩm dinh dưỡng để tăng cường sức khỏe con người, trong các công thức dược phẩm và trong thuốc mỡ hoặc mỹ phẩm để tăng thời hạn sử dụng của sản phẩm [25] Trong nghiên cứu của Fadi Qa'dan, Frank petereit, Adolf Nahrsted đã phân lập được catechin trong lá ổi bằng phương pháp sắc kí cột tuy nhiên dung môi sử dụng độc hại hơn dung môi đang sử dụng trong khóa luận nghiên cứu của chúng tôi [55] Đây là lần đầu Catechin được phân lập từ lá ổi ở Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký cột và sắc kí lớp mỏng sau đó xác định cấu trúc bằng kỹ thuật quang phổ Trong nghiên cứu của Bernatoniene và Kopustinskiene năm 2018 đã nêu ra catechin có tác dụng sinh học là chống oxy hóa và nhóm tác giả đã phân tích cơ chế hoạt động của catechin liên quan đến việc ngăn ngừa các bệnh như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh thoái hóa thần kinh [12] Catechin còn có tác dụng làm giảm các tình trạng liên quan đến rối loạn chức năng mạch máu [9] Bolduc và cộng sự nhận thấy catechin làm chậm tác động có hại của bệnh rối loạn lipid máu lên cấu trúc thành động mạch não bằng cách bảo vệ chức năng nội mô, do đó hỗ trợ phục hồi lưu lượng máu não [14] Catechin còn là chất ức chế DPP4 từ đó làm tăng thời gian bán hủy của hormon incretin và làm tăng tiết insulin từ đó có tác dụng chống lại bệnh đái tháo đường [21] Trong nghiên cứu Hamaishi K và các cộng sự đã chứng minh catechin có tác dụng chống loét trên động vật thí nghiệm [27] Việc sử dụng catechin đã được Satoh K và các cộng sự chứng minh là có thể làm giảm một số triệu chứng của bệnh về tuyến giáp [62] Ngoài ra, catechin còn được chứng minh có khả năng kháng khuẩn mạnh[83]

Gallocatechol hoặc gallocatechin là một flavan-3-ol, một loại hợp chất hóa học bao gồm catechin và gallat ở vị trí trans đồng phân Tên IUPAC là (2R ,3S )-2-(3,4,5- trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2 H -chromene-3,5,7-triol Nó là một trong những hóa chất chống oxy hóa được tìm thấy trong thực phẩm Gallocatechin lần đầu tiên được phân lập từ trà xanh bởi Michiyo Tsujimura vào năm 1934 Năm 1994, Tomoaki Matsuo và các cộng sự đã phân lập được gallocatechin từ lá ổi bằng phương pháp sắc ký cột và phổ cộng hưởng từ [46] Tuy nhiên khóa luận này đã hạn chế được việc sử dụng các dung môi độc hại so với một số phương pháp đã phân lập trước đó Ngoài ra từ các tài liệu thì khóa luận này là nghiên cứu lần đầu gallocatechin được phân lập từ lá ổi tại Việt Nam Gallocatechin có tác dụng chống oxy hóađược đánh giá bằng hai phương pháp đó là: (i) ức chế quá trình peroxid hóa ascorbat/sắt của liposom phosphatidylcholin; và (ii) loại bỏ cation gốc 2,2-azinobis (3-ethyl-benzothiazolin-6- sulphonat) [53] Ko C.H và các cộng sự đã nghiên cứu nhận thấy gallocatechin có khả năng ức chế quá trình tạo thành xương, tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa xương [37] Năm 2021 Singhal S và các cộng sự đã chứng minh gallocatechin có tác dụng chống ung thư rất tốt [68] Gallocatechin còn có tác dụng ức chế sự phát triển và bám dính của Porphyromonas gingivalis trong tế bào biểu mô miệng [60] Từ nghiên cứu của Haiyanxie và các cộng sự năm 2014 nhận thấy gallocatechin có khả năng phòng và điều trị bệnh Alzheimer [82] Theo nghiên cứu của Sohail và các cộng sự năm 2018 đã chứng minh gallocatechin gây ức chế glyoxal dẫn đến ức chế sự kết tụ cystatin, nó còn được sử dụng trong điều trị ngăn ngừa các rối loạn do tập hợp protein [69]

Avicularin hay tên gọi khác là quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid có tên theo danh pháp IUPAC là 3-[(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymetyl)oxolan-2- yl]oxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxychromen-4-on là một flavonol, một phytochemical Avicularin lần đầu được phân lập bởi Ohta và các cộng sự năm 1940 từ

Polygonum aviculare; được phân lập từ lá ổi bởi El Khadem and Mohammed năm

1958 [34] Tại Việt Nam, năm 2021, Lê Thị Bạch và các cộng sự đã phân lập được avicularin từ lá ổi bằng cách sử dụng kỹ thuật sắc ký cột silical gel và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Tác giả sử dụng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với tỷ lệ (100:0 - 0:100 tt/tt) thu được 15 phân đoạn (EE1-15) Avicularin được phân lập tại phân đoạn EE5 có khối lượng là 50 mg [39] Tuy nhiên trong nghiên cứu của Lê Thị Bạch sử dụng cloroform độc hơn rất nhiều so với dung môi chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này và trong nghiên cứu của chúng tôi cũng sử dụng ít phân đonaj và dung môi hơn để phân lập Do đó phương pháp phân lạp trong khóa luận này đã có những cải tiến hơn Theo nghiên cứu của Kanika Patel và các cộng sự, avicularin có tác dụng chống lại các rối loạn của bệnh ung thư và các biến chứng, bảo vệ các tế bào cơ tim và các tế bào gan [52] Bằng nghiên cứu in vivo và in vitro của Zhiguo Dang và các cộng sự đã phát hiện ra avicularin có tác dụng chống lại ung thư phổi [18].Trong một nghiên cứu đã chỉ ra chất này có khả năng ức chế sự tích tụ lipid nội bào do đó avicularin có tác dụng trong điều trị đái tháo đường [24] Năm 2012 Lee Jae Won và các cộng sự đã làm sáng tỏ cơ chế chống viêm của avicularin trong các tế bào đại thực bào RAW 264,7 được kích thích bằng lipopolysacarid [77] Trong nghiên cứu của Wei Wang và các cộng sự đã xác định rằng avicularin ức chế phản ứng viêm trong các tế bào hoạt dịch ở bệnh viêm khớp dạng thấp [79] Ngoài ra, Avicularin còn có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm của avicularin, Samant và các cộng sự đã chứng minh avicularin có thể ngăn chặn sự tiến triển của bệnh Alzheimer [40],[61]

Isoquercetin hay còn gọi là quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid có tên theo danh pháp IUPAC là 2- (3, 4- dihydroxyphenyl)- 5, 7- dihydroxy-3 -[(2S, 3R, 4S, 5S, 6R)- 3,4,5- trihydroxy-6-(hydroxymetyl)oxan -2-yl]oxychromen-4-one là một quercetin O- glucosid; quercetin có β-D-glucosyl gắn ở vị trí 3 Năm 1949, Carl D.Douglass và các cộng sự đã lần đầu phân lập ra isoquercetin từ vỏ hạt của Cercis Canadensis [22] X Lozoya và các cộng sự năm 1994 đã phân lập được isoquercetin từ lá ổi [45] Từ các tài liệu và nghiên cứu rút ra được đây là lần đầu isoquercetin được phân lập từ lá ổi tại Việt Nam kỹ thuật sắc ký cột và sắc kí lớp mỏng sau đó xác định cấu trúc bằng kỹ thuật quang phổ Isoquercetin có khả năng chống oxy hóa bằng cách loại bỏ ROS và RNS [74] Năm 2016, Li L và cộng sự đã chứng tỏ isoquercetin có khả năng chống viêm bằng cách ức chế sự kích hoạt MAP kinase và NF-kB trong tế bào KU812 dẫn tới ngăn chặn histamin và các cytokin gây viêm [43] Isoquercetin được cho là một chất có khả năng kháng virus phổ rộng với các dẫn chứng đó là ức chế sự nhân lên của virus cúm A và B [36]; ức chế sự lây nhiễm và tăng sinh của tế bào ZIKV và DENV [81]; là một lựa chọn thuốc thay thế dùng để dự phòng Ebola [56]; chống lại sự lây nhiễm SARS-CoV-2 [47]; ức chế virus herpes [4], [17] Theo một số nghiên cứu isoquercetin có thể ức chế sự phát triển của các khối u ác tính khác nhau như ung thư vú, ung thư dạ dày, bệnh bạch cầu, [57],[5] Điều trị bằng isoquercitrin bảo vệ chống lại tổn thương gan do T2DM, giảm ALT huyết thanh, AST và IR, nhưng tăng TP, Alb, SOD, GSH, HDL-C, và GLP-1 [28].Theo nghiên cứu của Jayachandran và các cộng sự năm 2018, isoquercetin được chứng minh có hiệu quả trong việc duy trì cân bằng nội môi đường huyết, tăng nồng độ insulin và điều chỉnh HK, PK và các enzyme chuyển hóa carbohydrat khác [30] Ngoài ra, isoquercitrin được dùng điều trị gãy xương, loãng xương và các bệnh về xương khác [42]

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Sau thời gian tiến hành nghiên cứu, khóa luận đã thu được các kết quả sau:

1 Đã chiết xuất được dịch chiết ethanol toàn phần (220 g), sau đó chiết tách được các phân đoạn phân đoạn n-Hexan 85(g), CH2Cl2 18 (g), EtOAc 25 (g), cao H2O30 (g) từ lá cây ổi Và phân lập được 4 hoạt chất flavonoid từ phân đoạn EtOAc đó là LO-A1, LO-A2, LO-A3, LO-A4

2 Xác định cấu trúc được hoạt chất LO-A1 là catechin, LO-A2 là gallocatechin, LO-A3 là avicularin, LO-A4 là isoquercetin Trong đó có LO- A1, LO-A2, LO-A4 lần đầu phân lập được từ lá ổi ở Việt Nam

Sau khi hoàn thành xong đề tài tôi nhận thấy cây Ổi là một cây thuốc có tiềm năng lớn trong lĩnh vực y học, tuy nhiên số lượng các nghiên cứu về thành phần hóa học về hợp chất flavonoid của cây tại Viêtn Nam còn rất hạn chế Vì vậy tôi xin kiến nghị như sau:

✓ Tiếp tục nghiên cứu phân lập các hoạt chất flavonoid và các hoạt chất khác từ các phân đoạn khác của lá cây ổi (Psidium guajava L.)

✓ Tiến hành các nghiên cứu nâng quy mô để chiết tách, tinh chế các hợp chất flavonoid đã phân lập đạt hiệu suất cao.