TỐM TẮT KHÓA LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát, đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành phức giữa protein isolate từ đậu nành và mủ trôm thủy phân.. Đ
TỔNG QUAN
Đặt vấn đề
Với sự phát triển ngày càng cao của khoa học và kỹ thuật xã hội con người cũng càng ngày nâng tầm yêu cầu và nhu cầu cũng về thực phẩm, dược phẩm những điều liên quan trực tiêp đến sức khỏe con người cũng ngày càng khắt khe Kéo theo mà những vật liệu chứa cũng như bao đã và đang rất được quan tâm vì đó là một trong những yếu tố quyết định và cũng có thể nói là quan trong ảnh hưởng đến thực phẩm cũng như dược phẩm Dẫn đến những năm gần đây ngày càng có nhiều nghiên cứu về việc cải tiến cũng như phát triển chúng vì chúng có khả năng bảo vệ các vật liệu bên trong khỏi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, oxy, độ ẩm, pH,… giải phóng thành phần được bao có kiểm soát trong các điều kiện cụ thể, che dấu mùi khó chịu mùi nồng độ và sự phân tán đồng đều của hoạt chất dễ dàng xử lý hơn, tách các hợp chất phản ứng, bảo vệ môi trường, cải thiện vật liệu [1, 2] Không chỉ trong ngành dược phẩm (68%), thực phẩm (13%) mà còn trong mỹ phẩm (8%), dệt may (5%), y sinh (3%), nông nghiệp (2%) và điện tử (1%) [3]
Có thể hiểu vi bao được mô tả là một quá trình bao bọc các hạt chắt rắn hoặc giọt chất lỏng hoặc khí có kích thước micron trong một lớp vỏ trơ, từ đó cách ly và bảo vệ chúng khỏi môi trường bên ngoài [4] Và quá trình đông tụ phức hợp là quá trình hình thành vi bao nó là quá trình hình thành liên kết ion do lực hút tĩnh điện giữa hai ion trái dấu Cụ thể hơn là sự hình thành phức hợp tạo kết tủa dựa trên tương tác ion giữa hai hoặc nhiều polymer tích điện trái dấu thường là protein và polysaccharid, dẫn đến sự hình thành chất đông tụ trong đó tương tác tĩnh điện là lực chính trong quá trình phân tách pha kết hợp protein-polysaccharide [5, 6] Các vị trí liên kết trên polysaccharide bao gồm các nhóm carboxylat, sulfat, pyruvate hoặc acetat tích điện âm, tương tác với e-amino, α- amino, tích điện dương (được proton hóa), nhóm guanidinium và imidazole trên protein [6] Để quá trình tạo vi bao diễn ra thuận lợi đạt hiệu suất kết quả như mong muốn phải kiểm sót được những yếu tố ảnh hưởng như pH của môi trường phản ứng, cường độ ion, tỷ lệ polysaccharide/protein và tổng nồng độ polymer sinh học, trọng lượng phân tử polymer sinh học tính linh hoạt, mật độ điện tích, khuấy, áp suất và nhiệt độ [7] Vật liệu tạo thành cũng là yếu tố quang trọng trong quá trình tạo vi bao với loại protein khác
2 nhau sẽ mang lại hiệu suất và hiệu quả bao khác nhau Các viên vi bao có xu hướng là đơn nhân hoặc đa nhân về bản chất tùy thuộc vào phương pháp/điều kiện chuẩn bị và vật liệu thành có liên quan [1] Đến nay đã có nhiều loại vật liệu được sử dụng để tổng hợp vi bao chẳng hạn protein động vật có xu hướng dễ hòa tan, và linh hoạt hơn nhưng hiện nay protein thực vật có một số lợi thế thị trường khiến chúng rất hấp dẫn đối với ngành công nghiệp Ví dụ, người tiêu dùng nhận thức được mối lo ngại về bệnh não xốp ở bò, hạn chế sử dụng protein động vật trong chế độ ăn uống; và giá đạm sữa ngày càng tăng [1] Việc sử dụng protein thực vật phản ánh xu hướng “xanh” hiện nay trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm Trong các ứng dụng thực phẩm, protein thực vật được biết là ít gây dị ứng hơn so với protein có nguồn gốc từ động vật [8] Protein có thể được trích ly từ nhiều nguồn thực vật như ngũ cốc, các loại đậu và thậm chí cả trong rau củ,… polysaccharide, gum Arabic, cacboxymetyl xenlulo, natri alginate, mủ trôm Trong nghiên cứu này tôi sử dụng protein từ đậu nành và mủ trôm để tạo vi bao sau đó khảo sát đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố như pH của môi trường, nhiệt độ, nồng độ ion, tỷ lệ phối trộn lên protein, mủ trôm và vi bao được hình thành từ phức của chúng thông qua các phương pháp như đo độ đục, đo zeta, kích thước, độ phân tán phổ hồng ngoại Thông qua đó để đánh giá hiệu suất kết hợp sự tương tác của hai vật liệu đông thời biết được điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tạo vi bao thông qua đó ta sẽ kiểm soát được quá trình loại bỏ điều không mong muốn.
Mục tiêu và đối tượng
Đối tượng: là protein đậu nành, mủ trôm và đặc biệt là phức được tạo thành bởi lực hút tĩnh điện giữa protein và mủ trôm
Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát đánh giá những yếu tố (pH của môi trường, nồng độ ion, nhiệt độ, tỉ lệ phối trộn) ảnh hưởng đến protein đậu nành, mủ trôm và phức hợp tĩnh điện của chúng Đánh giá sự thay đổi điện tích, kích thước hạt, độ phân tán của protein đậu nành, mủ trôm và phức qua quá trình thay đổi pH Cuối cùng qua những khảo sát đã thực hiện đưa ra điều kiện tối ưu đạt hiệu suất cao nhất cho quá trình tạo vi bảo.
Nội dung nghiên cứu
Trích ly protein từ đậu nành và thủy phân mủ trôm Đánh giá sự ảnh hưởng của pH, nồng độ ion, nhiệt độ đến protein, mủ trôm và phức tĩnh điện thông qua phép đo độ đục
Tìm tỷ lệ phối trộm tối ưu giữ protein và mủ trôm bằng hiệu suất thu hồi đồng thời đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi
Xác định mật độ điện tích của protein, mủ trôm và phức ở pH khác nhau bằng phép đo zeta Đánh giá ảnh hưởng của pH đến kích thước hạt, sự phân bố kích thước của protein, mủ trôm và từng tỷ lệ phối trộm của phức thông qua phép đo zeta
Xem xét sự tương tác của các nhóm chức qua phép đo phổ hồng ngoại (FTIR)
GIỚI THIỆU
Giới thiệu về đậu nành
2.1.1 Nguồn gốc Đậu nành (Glycine max (L.) Merr.) là cây họ đậu quan trọng là nguồn protein và dầu hàng đầu trong thức ăn chăn nuôi, cũng như lương thực chính cho con người
Hình 1.1: Cây và hạt đậu nành Đậu nành được trồng và có xuất xứ từ từ đậu tương dại ở Đông Á 6000-9000 năm trước Nguồn gốc trở nên bí ẩn một phần do thiếu nghiên cứu và thông tin khảo cổ học Tuy nhiên, với sự tiến bộ gần đây trong giải mã trình tự toàn bộ bộ gen của cây trồng và cây hoang dã, đậu nành giống cây trồng quan trọng này đã được làm sáng tỏ về lịch sử
Mặc dù bằng chứng lịch sử cho thấy rằng đậu tương được đưa vào từ đông bắc Trung Quốc, dẫn đến cách mạng nông nghiệp thời Đông Chu (Ho, 1975), giống đậu tương có tính đa dạng di truyền cao nhất được tìm thấy ở Vùng Hoàng Hà quanh sông Hoàng Hà (Yellow River) Tập trung xung quanh khu vực này, với sự phong phú của các mẫu vật khảo cổ, lưu vực sông Hoàng Hà là một ứng cử viên cho phát hiện đậu nành
Ngoài ra, Lưu vực Dương Tử (Nam Trung Quốc) cũng đã được đề xuất như một nơi sinh của đậu nành dựa trên các phân tích phát sinh gen và phân cụm sử dụng microsatellites và đa dạng nucleotide [9]
Người ta đã chứng minh rằng thành phần hóa học và các thuộc tính dinh dưỡng của đậu nành và các loại đậu khác thay đổi đáng kể tùy theo giống cây trồng Để sử dụng
5 hiệu quả các giống đậu tương mới phát triển cho dinh dưỡng con người, loại bỏ hoặc giảm các chất kháng dinh dưỡng và đánh giá các thuộc tính dinh dưỡng của chúng là cần thiết [10]
Dầu và protein là hai thành phần chính của hạt mang lại cho hạt đậu nành tiềm năng được sử dụng trong các ứng dụng khác nhau Hạt đậu nành thường chứa 40%-42% protein và 18%-22% dầu Dầu có 85% là acid béo không no Lượng protein trong đậu nành vượt qua lượng trong các loại thực phẩm thực vật khác Đậu nành cũng bao gồm carbohydrate, kali, natri và không chứa cholesterol [11]
Hạt đậu nành rất giàu chất xơ (13,7-16,5 g/100 g,) Thành phần này được đánh giá là chất xơ không hòa tan và hòa tan, sau đó là đường trung tính và acid uronic Chất xơ không hòa tan trở thành phần chất xơ chiếm ưu thế trong đậu nành (74-78%), ngoài ra còn có glucose, acid uronic, galac tose, arabinose và xyloza Chất xơ hòa tan nằm trong khoảng từ 22% đến 26% và các monome chính là acid uronic, galactose và arabinose cuối cùng là galactose, một thành phần quan trọng trong đậu nành (21%) [12]
Hàm lượng protein là 35,6-42,4%, giá trị chất béo trung bình là 18,56 g/100 g, chứa 420,2-545,0 mg phospho trên 100 g và 8,9-9,8 mg sắt trên 100 g Chất xơ, là tổng của các thành phần đơn phân của nó có 16,5 g/100 g, lượng chất xơ không hòa tan trong đậu nành 6,80 g/100 g và thành phần chính của chất xơ không hòa tan trong tất cả là glucose 30-32% Ngoài ra còn có một lượng quan trọng acid uronic 17-20%, và với galactose 2,23 g/100 g Xyloza dao động từ 12 đến 14%, hàm lượng xyloza là 1,43 g/100 g, mannose có một lượng nhỏ 2-4% Chất xơ hòa tan chứa tỷ lệ lớn acid uronic (31-38%) và galactose (27-29%) và một lượng arabinose vừa phải (13-17% ở cây vàng) [10, 12] Đậu nành chứa 2,3 và 3,4 mg g -1 inositol và choline, đậu nành cũng chứa một lượng nhỏ niacin (21-23 μg g -1 ), acid pantothenic (13-22 μg g -1 ), thiamine (11-18 μg g -1 ), pyridoxine (7,1-12 μg g -1 ) và 3,4-3,6 μg carotene và choline [13]
Trên thực tế, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm đã chứng minh rằng việc đưa protein đậu nành vào chế độ ăn ít chất béo bão hòa và ít cholesterol có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành Isoflavone đã được báo cáo là đóng vai trò thiết yếu trong việc ngăn ngừa một số loại ung thư và giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch Hơn nữa, chất
6 xơ đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm mức cholesterol ở một số người mắc bệnh mỡ máu cao và trong bệnh tiểu đường, nó cũng có thể được sử dụng để cải thiện dung nạp glucose Chất xơ dường như cũng có tác động tích cực đối với bệnh tiêu chảy và táo bón và như một phương pháp điều trị chứng ruột kích thích Nó có tác dụng chống viêm và chống ung thư đối với hệ tiêu hóa [12].
Giới thiệu về mủ trôm
Mủ trôm được sản xuất từ cây thuộc loài Sterculia có tên khoa học là gum karaya
Sterculia urens, Sterculia setigera và Sterculia villosa là nguồn khai thác mủ trôm chính Sterculia urens thuộc họ Malvacecae, tuy nhiên trước đó nó thuộc họ Sterculiaceae hiện có trên khắp thế giới nhưng được tìm thấy nhiều ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
Sterculia urens được tìm thấy trong với thân cây cong queo, ngắn và có màu trắng hoặc xám xanh đặc biệt, vỏ nhẵn Vỏ cây dày, dạng bột, bong tróc thành từng mảng mỏng, mỏng như giấy, có màu đỏ rực Cành nằm ngang, lúc đầu cành non có lông tơ Cây tiết ra chất keo bán rắn, màu trắng vàng, dính từ vết thương hoặc vết nứt tự nhiên [14]
Sterculia urens có nguồn gốc từ châu Á và được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới của tiểu lục địa Ấn Độ, miền Bắc và miền Trung Ấn Độ, bờ biển phía Tây ở Ấn Độ, các khu vực rừng khô hạn ở Sri Lanka và Miến Điện Cây này là nguồn chính của kẹo cao su karaya
7 Ở Ấn Độ, cây này được phân bố rộng rãi ở các vùng cận Himalaya, Madhya Pradesh, Andhra Pradesh, Chhattisgarh, Rajasthan, Kerala và Maharashtra Nó được tìm thấy mọc trên các sườn dốc bị phong hóa, khe nứt đá, đỉnh đồi và các rặng núi lộ thiên có đất giàu đá núi lửa, đá phiến và thạch anh ở độ cao 300-750 m ở miền Bắc và miền Trung Ấn Độ [14] Mủ trôm là một sản phẩm tự nhiên độc đáo có khả năng phân hủy sinh học, tương thích sinh học, có thể tái tạo, dễ bảo quản, xử lý và hiệu quả về chi phí đang có nhu cầu ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và các ứng dụng công nghiệp khác [14]
Mủ trôm ưa nước với anion polysaccharide là phức hợp tích điện (Mirhosseini & Amid, 2012), trọng lượng phân tử là 1,6×10 7 Da và bao gồm 55-60 % galactose và rhamnoses, 37-40 % acid glucuronic và galacturonic, và 8% nhóm chức acetyl [15]
Hình 2.2: Cấu trúc mặt phẳng của mủ trôm Hình ảnh này được trích dẫn từ tài liệu số
Xương sống của mủ trôm gồm acid α-D-galacturonic và dư lượng α-L-rhamnose, chuỗi bên được gắn bởi liên kết 1,2 của β-D-galactose hoặc bằng liên kết 1,3 của acid β-D- glucuronic với acid galacturonic của chuỗi chính (hình 2.1.3) Ngoài ra, một nửa số gốc rhamnose của chuỗi chính được liên kết 1,4 với β-D-galactose [15]
Hình 2.3: Cấu trúc ba chiều của mủ trôm Hình được trích dẫn từ tài liệu số 17 2.2.3 Tính chất vật lý
Mủ trôm có dạng bụi mịn, màu xám hồng, mùi và vị hơi axetic, kết hợp với một số hợp chất như glycol, có khả năng tạo thành màng mềm khi được làm dẻo bằng các hợp chất đó [18]
Hình 2.3: Mủ trôm 2.2.4 Tính chất hóa học
Mủ trôm là hợp chất ít tan trong nước và tạo ra dung dịch ở nồng độ rất thấp ( HKG (a) và các tỉ lệ SPI < HKG (b)
4.1.3 Ảnh hưởng của pH và và tỉ lệ phối trộn đến các điểm chuyển tiếp pH tới hạn
Sự hình thành phức hợp protein-polysaccharide sẽ xảy ra ở giữa điểm đẳng điện (pI) của protein và pKa của polysaccharide, Nói cách khác, sự hình thành phức chất giữa các polysaccharide anion và protein được dự đoán diễn ra dưới protein pI [30] Trong hình 4.4 quan sát thấy sự gia tăng nhẹ độ đục (pHc), tiếp theo bắt đầu hình thành phức và tách pha (pHφ1) sau đó là độ đục bắt đầu tăng nhanh đạt cực đại vì sự hình thành phức hợp đông tụ giữa xảy ra là cực đại (pHopt), phức tan hoàn toàn độ đục giảm xuống gần như không đổi sau (pHφ2) Phần này giải thích rõ tương tác giữa protein-polysaccharide qua các điểm chuyển tiếp cũng như sự ảnh hưởng của pH và tỉ lệ phối trộn giữa hai polymer đến các sự kiện thay đổi trong quá trình hình thành phức
Bảng 4.1: Các giai đoạn khác nhau của quá trình chuyển đổi hình thành phức
Giai đoạn pH Mô tả
Trong giai đoạn này hấp thu quang học (OD) không có nhiều sự thay đổi được giải thích do trên pHc, hai polymer sinh học tích điện giống nhau và do đó không tương tác đáng kể với nhau vì thế không có phức chất nào được hình thành
II pHc > pH > pHφ1 Độ đục bắt đầu tăng dần do điện tích dương đã hình thành của protein và điện tích âm của polysaccharide tạo ta tương tác tĩnh điện và hình thành phức
III pHφ1 > pH > pHφ2 Độ đục đạt cực đại và sự hình thành phức tối đa ở pHopt 3,5 tại đó đạt được sự trung hòa về điện tích giữa các polymer sinh học , khi giá trị pH dước pHopt sự phân ly bắt đầu xảy ra do ở pH < pHopt sự proton hóa tăng lên của các nhóm carboxyl dọc theo trục HKG trong quá trình chuẩn độ acid [32]
Giai đoạn này khi pH < 2,5 phức tan hoàn toàn và giá trị độ đục sấp sỉ giống giai đoạn I nguyên nhân là do do thực tế là điện tích của các polysaccharide giảm đi khi độ pH tiến đến pKa và thậm chí không điện tích khi càng về pH acid [33]
Thế zeta của phức hợp SPI:HKG
Vì phức được tạo thành do lực hút tĩnh điện nên phép đo thế zeta nhằm mục đích biểu diễn sự thay đổi điện tích mặt của dung dịch SPI, HKG và phức hợp SPI:HKG (4:1) khi thay đổi pH (Hình 4.6.) Thế zeta của HKG cho giá trị âm -39,45 mV đến 4,231 mV từ pH 10 đến 2,0 Vì bản chất của HKG là một polysaccharide mang nhiều nhóm carboxyl tích điện âm nên HKG được xem là một polyanion luôn mang điện tích âm Khi pH càng tiến về pH acid thì đường biểu diễn càng tiến về không và độ phân ly trở nên không đáng kể và do đó cuối cùng không có điện tích trong các polysaccharide Với SPI ở pH từ 10 đến 4 luôn là điện tích âm và bắt đầu tích điện dương khi pH từ 4 đến 1 Nguyên nhân do các nhóm carboxyl và các nhóm amin của protein đang dần trở nên proton hóa [34] Cụ thể thế zeta của dung dịch SPI cho giá trị -18,09 mV đến -1,817 mV trong khoảng pH từ 10 đến 1 và cho giá trị +9,328 mV đến +27,16 mV trong khoảng tử 3,5 đến 1
Tỉ lệ SPI-HKG (a) pH c pH j1 pH opt pH j2
Phức SPI:HKG có thể được hình thành trong khoảng pH từ 1,5 đến 4, bởi trong khoảng pH này cả hai polymer được có điện tích trái dấu nhau tạo điều kiện cho tương tác tĩnh điện có thể hình thành Mặc dù, lượng HKG chiếm thấp hơp so với SPI trong hỗp hợp, tuy nhiên lượng điện tích của nó được cho là vượt trôi so với lượng điện tích của SPI [34] Trong hình 4.6 đối với phức thế Zeta < 0mV ở pH lớn hơn 3,5 và mang điện tích âm khi pH nhỏ hơn 3,5 thế Zeta > 0mV lúc đó hỗn hợp SPI:HKG mang điện tích dương Trong phần 4.1.2 độ đục cực đại được ghi nhận ở pH 3,5 với tỉ lệ SPI:HKG 4:1 tuy nhiên phức chất SPI:HKG lại mang điện tích âm ở pH này (thế zeta là -1,697 mV) vì thế mà cũng có thể hiểu tại pH này còn một số nhóm carboxyl tự do không tương tác với SPI
Hình 4.6: Thế zeta của các dung dịch HKG và SPI và phức hợp SPI:HKG (4:1) nồng độ 0,005% tại các giá trị pH khác nhau
Ảnh hưởng của sự thay đổi pH và tỉ lệ phối trộn giữa SPI - HKG đến hiệu suất
Tỷ lệ trộn polymer sinh học rất quan trọng để kiểm soát sự cân bằng điện tích giữa protein và polysaccharide , cường độ tương tác và mức độ tự tổng hợp trong quá trình tạo phức vì thế mà nó ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi sản phẩm Trong phần trình bày ở phần 4.1.3 ta biết được quá trình đông tụ phức hợp giữa một protein với một
32 polysaccharide pH bắt đầu hình thành kết tủa phức từ pHc đến pHopt và pH đạt cực đại là pHopt Trong nghiên cứu này khảo sát hiệu suất thu hồi phức hợp SPI:HKG với các tỉ lệ khác nhau (từ 1:3 đến 10:1) được chỉnh về 7 điểm pH cố định bao gồm 5; 4,5; 4; 3,5; 3; 2,5; 2 và so sánh hiệu suất thu hồi phức giữa các pHopt
Bảng 4.2: Hiệu suất thu hồi phức hợp SPI: HKG tại các điểm pH khác nhau
Tại các tỉ lệ có hàm lượng HKG lớn hơn SPI (1:3 và 1:2) đều không thu được hiệu suất thu hồi tại tất cả các giá trị pH (bảng 4.2) Như đã đề cập ở mục 4.1.2, nguyên nhân chính bởi HKG có độ nhớt cao từ đó và lượng điện tích âm quá lớn tạo lực đẩy cản trở sự hình thành phức đông tụ Khi ở các tỉ lệ (protein lớn hơn polysacharide) có hiệu suất thu hồi phức ở các pH khác nhau nhưng nhìn chung đều tăng khi pH bắt đầu giảm và điều đạt cục đại ở pHopt sau đó giảm dần đều khi pH < pHopt Kết quả này phù hợp với kết quả đo độ đục ở phần 4.1.2, trong bảng 4.2 ta cũng quan sát thấy hiệu suất thu hồi ở pHopt tăng dần từ 1:1 và đạt hiệu suất thu hồi lớn nhất tại 4:1 sau đó giảm dần ở 5:1 đến 6:1 Ở trong bảng 4.2 ta cũng thấy được khi tăng tỉ lệ phối trộn thì điểm pH có phức dần lệch về pI của protein Trong nhiều nghiên cứu được thực hiện bởi các cặp protein và polysaccharide khác nhau như protein sồi và gum arabic hiệu suất thu hồi phưc tối đa ở 4:1 với pH là 3,2 [34], còn ở trong protein đậu và gum arabic thì đạt cực đại ở tỉ lệ 2:1 [29] Khi protein đậu cô lập và polysaccharide alginat thì tỷ lệ trộn tối đa là 4:1 [31] Vì thế mà ta có thể thấy rằng với các cặp protein và polysaccharid khác nhau thì tỉ lệ trộn và pHopt cũng khác nhau pH
Tỉ lệ phối trộn SPI:HKG
Hình 4.7: Độ hấp thụ tối đa (ODmax) tương ứng hiệu suất thu hồi phức tại ở các tỉ lệ
Như đã đề cập ở trên kết quả bảng 4.2 phù hợp với kết quả đo độ đục ở phần 4.1.2 và trong hình 4.7 biểu diễn rõ điều đó Cụ thể quan sát và thấy không có phức được hình thành ở tỉ lệ 1:3 và 1:2 vì thế không có sự xuất hiện của cột hiệu suất, cột hiệu suất tăng dần và đạt cực đại ở 4:1 sau đó giảm ở 5:1 và 6:1 Tương đồng với cột hiệu suất thì đường biều diễn độ hấp thụ cũng tăng và giảm tượng tự Vì thế khi muốn tìm tỉ lệ phối trộn phù hợp để đạt hiểu suất tối ưu thì sử dụng kết quả đo độ đục cũng có thể cho kết quả gần như tương đồng
Ảnh hưởng của nồng độ ion đến sự hình thành phức SPI:HKG
Kiểm soát độ pH và cường độ ion là rất quan trọng để tối đa hóa độ mạnh của các tương tác protein-polysaccharide trong quá trình hình thành phức hợp pH của dung môi ảnh hưởng đến số lượng tích điện trên bề mặt polymer sinh học, trong khi cường độ ion có tác dụng thúc đẩy khả năng hòa tan ở nồng độ thấp, nhưng lại cản trở lực hút tĩnh điện ở nồng độ cao [32] Trong phần này nghiên cứu và trình bày ảnh hưởng của nồng độ ion
34 đến sự tạo phức giữa SPI:HKG (tỉ lệ 4:1, Cp = 0,05% w/w) được xác định bằng phương pháp đo độ đục ở các nồng độ NaCl khác nhau từ 0 – 200 mM
Quan sát thấy khi trong phức có NaCl đường cong độ đục trở thấp hơn khi nồng độ NaCl tăng lên (hình 4.8) Khi nồng độ ion tăng từ 0 đến 200 mM quan sát hình 4.8 có sự thay đổi pHc nhưng không quá lớn (trong khoảng ± 0,5) đơn vị pH Cụ thể pHc tăng từ 6 lên
7, pHφ1 cũng có sự thay đổi giảm từ 4 xuống 3 ( trong khoảng 0,5 đến 1,5) đơn vị pH (hình 4.9) Nguyên nhân sự dịch chuyển các điểm chuyển tiếp pHc và pHφ1 về giá trị pH cao hơn được cho là do tác động khi nồng độ NaCl tăng bởi trong quá trình tương tác, nồng độ NaCl tăng lên cho phép Na + cạnh tranh với vị trí liên kết tích điện dương của protein liên kết với polysaccharide, Cl - cạnh tranh với vị trí liên kết tích điện âm của HKG liên kết với protein [27], nhưng do nồng độ của protein (tỉ lệ 4:1) trong phức hợp lớn hơn polysaccharide nên protein sẽ tự tương tác với nhau làm pH dần tiến về pI của protein [34]
Hình 4.8: Đường cong độ đục của phức hợp SPI:HKG ở tỉ lệ 4:1 (0,05% w/w) với nồng độ NaCl ( 0-200 mM)
Khi nồng độ trong khoảng từ 0-200 mM pHopt được ghi nhận là không thay đổi cho thấy sự không phụ thuộc pHopt và nồng độ muối (Hình 4.8 ) nhưng độ hấp thu lại giảm Cụ thể là độ đục giảm từ 0,8937 xuống 0,3329 ở nồng độ 20 mM nguyên nhân được cho là do sự cạnh tranh của các ion Na + và Cl - trong dung dịch làm giảm tương tác giữa SPI và HKG Bởi sự hiện diện của muối trong dung dịch làm suy yếu sự tương tác, và thậm chí có thể ngăn chặn sự hình thành các phức hợp đông tụ giữa protein và polysaccharide ở nồng độ cao ngoài ra vì ion có trong dung dịch có khả năng sàng lọc điện tích của các polymer và do đó làm giảm phạm vi tương tác kết hợp của chúng Kết quả là, các polymer tương tác ở độ pH thấp hơn, ở đó protein mang nhiều điện tích dương hơn Việc sàng lọc các điện tích cũng làm giảm số lượng và phép cân bằng hóa học của các phức chất hòa tan được hình thành, và cường độ hấp thụ ở đó thấp hơn [27] Đối với pHφ2 được ghi nhận có xu hướng tăng từ 1,5 đến 2,5 khi nồng độ NaCl tăng lên 200 mM Điều này cho thấy khả năng tăng độ hòa tan của NaCl
Hình 4.9: Các giá trị pH tới hạn (pHc, pHφ1, pHopt, và pHφ2) ứng với mỗi nồng độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành phức hợp SPI:HKG
Sự thay đổi nhiệt độ sẽ ảnh tương tác polymer sinh học/polymer sinh học bằng cách thay đổi năng lượng tương tác Flory Huggins Nếu có sự tham gia của các tương tác entanpi khác ngoài tương tác Coulombic, thì nhiệt độ cũng sẽ có ảnh hưởng Nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho sự hình thành liên kết hydro và các tương tác kỵ nước được tăng cường khi tăng nhiệt độ Trong nghiên cứu này, phép chuẩn độ độ đục được thực hiện ở các
Nồng độ NaCl (mM) pH c pH j1 pH opt pH j2
36 nhiệt độ khác nhau trong khoảng 6-60 o C [35], với phức SPI:HKG (tỉ lệ 4:1,Cp = 0,05%,
25 o C) Quan sát hinh 4.10 khi nhiệt độ được hạ xuống từ 25 đến 6 o C độ đục giảm từ 0,8937 xuống 0,8148 ở pHopt = 3,5 (Hình 4.10)
Hình 4.10: Đường cong độ đục của phức hợp SPI:HKG ở tỉ lệ 4:1 (0,05% w/w) với sự thay đổi nhiệt độ 6-60 ℃ Nhiệt độ tăng lên độ đục giảm cụ thể độ đục tại nhiệt độ 45 ℃ ghi nhận ở pHopt = 3,5 với độ đục là 0,7844 và khi nhiệt độ 60 ℃ ở pHopt = 3,5 độ đục là 0,5876, nguyên nhân được cho là do sự suy giảm liên kết hydro nhưng tạo điều kiện cho các tương tác kị nước bởi tác nhân nhiệt độ cao [35] Mặc dù các tương tác kỵ nước dường như không tác động đến sự hình thành phức, nhưng chúng đã đóng một vai trò trong sự ổn định của phức SPI:HKG, trên cơ sở phép đo độ đục thấy ở pH < pHopt cho thấy rằng các tương tác kỵ nước trong các tập hợp protein-protein đang trở nên chiếm ưu thế [29] Khi quan sát hình 4.11 ta thấy điểm pHopt không đổi ở tất cả nhiệt độ điều đạt cực đại ở 3,5 Nhưng
37 điểm pHφ2 lại tăng khi nhiệt độ tăng là do khi nhiệt độ tăng lên làm giảm liên kết hydro kết tủa dể tan hơn
Hình 4.11: Các giá trị pH tới hạn của phức hợp SPI:HKG tỉ lệ 4:1 (0,05% w/w) (pHc, pHφ1, pHopt, và pHφ2) ứng với mỗi nhiệt độ
Quang phổ hồng ngoại (FTIR)
Phổ FTIR cho thấy sự tương tác giữa các phân tử ở cấp độ nhóm chức của phức SPI-HKG Kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR ở hình 4.12 của các mẫu được thực hiện trong vung từ 4000–400 cm -1
Hình 4.12: Phổ FTIR của SPI, HKG và phức hợp SPI:HKG Bảng 4.3: Phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) của các SPI, HKG và phức SPI:HKG
Liên kết Số sóng (cm -1 )
Các amide I, II, III được quan sát và phát hiện có sự hiện diên ở protein với đặt điểm phổ mạnh dài hình 4.12 Cụ thể dải amide I có đỉnh nhọn hẹp mạnh ghi nhận ở 1631 cm -
1, anime II với đỉnh cũng nhọn và hẹp nhưng yếu hơn bật 1 ở 1527 cm -1 , cuối cùng là amide III là đỉnh yếu được ghi nhận ở 1235 cm -1 Dựa vào nghiên cứu dải amide I đặt trưng cho cấp trúc thứ cấp của protein họ đậu với cấu trúc tấm xếp ly β (1615-1640 và 1689-1698 cm -1 ), xoắn α (1650-1659 cm -1 ), chuỗi xoắn ngẫu nhiên (1641–1649 cm -1 ) và cấu trúc vòng ngược β với nhiều dải từ 1660 đến 1688 cm -1 , có thể kết luận rằng cấu trúc bậc hai của SPI là cấu trúc xếp ly β) [36] Bên cạnh đó SPI xuất hiện một đỉnh ở
3282 cm -1 với hình dạnh mũi rộng và mạnh được cho là có liên quan đến dao động O-H trong cùng protein Ngoài ra còn có đỉnh số sóng ở 1033 cm -1 có liên quan đến các dao động của C–O do liên kết este O=C-O Quan sát phổ FTIR của mẫu HKG cho thấy xuất
39 hiện số sóng ở 3290 cm-1 được cho là có liên quan đến sự có mặt của các nhóm -OH Ở đỉnh số sóng ghi nhân ở 2930 cm -1 được cho là có mặt của các dao động của nhóm C-
H Ngoài ra còn xuất hiện dải ở 1411 cm -1 và 1602 cm -1 tương ứng có liên quan đến sự kéo dài không đối xứng và đối xứng của cacboxyl [34] và số sống ở 1033 cm -1 có liên quan đến các dao động uốn C-O
Trong phổ FTIR của phức hợp SPI-HKG vị trí của các đỉnh thay đổi một chút và dịch sang trái hoặc phải nhưng cường độ của chúng tăng lên Tổ hợp SPI-HKG cho thấy các amide từ I đến III ở các bước sóng cao hơn lần lượt chuyển từ 1629, 1527 và 1235 cm -1 trong SPI sang 1631, 1537 và 1237 cm -1 trong phức hợp [34], có thể chỉ ra tương tác tĩnh điện giữa các nhóm amide của SPI là một nhóm dương và các nhóm carboxyl tự do của HKG là một nhóm âm [27] Từ phổ FTIR của phức có thể thấy sự biến mất của các nhóm COO - thông qua việc không ghi nhận sự có mặt của các đỉnh 1602 và 1411 cm -1 của HKG trong phổ FTIR của phức Quan sát hình 4.12 ở cả ba dãy phổ ta thấy dải tương ứng với O-H (3278 cm -1 ) trong phức hợp SPI-HKG với đỉnh rộng đã dịch chuyển sang phải so với đỉnh hẹp hơn của protein (3282 cm -1 ) và polysaccharide (3290 cm -1 ) việc này cho thấy các liên kết hydro trong phức hợp mạnh hơn so với trong protein và polysaccharide, theo kết quả nghiên cứu này có thể nói bên cạnh tương tác tĩnh điện, liên kết hyđro có ảnh hưởng đến sự hình thành phức chất.Hơn nữa số sóng của COO– ở 1602 cm -1 và 1411 cm -1 không được phát hiện trong phổ của phức hợp SPI-HKG, xác nhận lực tương tác tĩnh điện giữa các nhóm cacboxyl (COO - ) với nhóm amide của SPI (NH3 +) [34].
Ảnh hưởng của pH đến độ phân tán và kích thước hạt
Phân tích kích thước hạt được sử dụng rộng rãi để theo dõi sự hình thành và phát triển của coacervate giữa protein và polysaccharide Do đó, sự phân bố kích thước hạt của các dung dịch SPI, HKG và dung dịch hỗn hợp SPI:HKG được theo dõi bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động để cung cấp thông tin chi tiết hơn về tương tác giữa SPI và HKG trong quá trình đông tụ phức hợp
Quan sát hình 4.13 ở HKG độ phân và cả kích thước hạt tăng khi pH giảm về pH acid cụ thể ở pH có kích thước là 250,5 nm độ phân tán là 0,7622 và tăng khi pH=1kích thươc hạt 811,2 nm độ phân tán 0,7848 Trong dung dịch SPI có hai đỉnh cực đại cả
40 trong kích thước và độ phân tán với kích thước hạt đạt 1257 nm và một đỉnh 1931 nm ở pH = 4,5 và có độ phân tán lơn trong khoảng pH=5 đến pH=3
Hình 4.13: Kích thước hạt và độ phân tán của dung dịch HKG ( 0,005%), SPI (
0,005%) và phức hợp SPI:HKG ( tỉ lệ 4:1 đến 1:4 Cp= 0,005%) theo hàm pH Đối với các phức hợp SPI-HKG (tỉ lệ 4:1 đến 1:4), với tỉ lệ 1:1 đạt kích thước hạt lớn nhất là 7505 nm có độ phân tán lớn trong khoảng pH= 2,5 đến 1 và một khoảng rộng ở pH=7 đến 2,5 Ở các tỉ lệ khi SPI-HKG lớn hơn 1 kích thước đạt lớn nhất với tỉ lệ 2:1 là
3360 (tỉ lệ 2:1 ở pH=2), tỉ lệ 3:1 là 2868 nm (pH khoảng 2), tỉ lệ 4:1 là 2568 nm (pH khoảng 4) và những điểm đạt kích thước hạt lớn thường nằm trong vùng có độ phân tán cao cụ thể là khi tỉ lệ 2:1 độ phân tán cao ở khoảng pH=3,5 đến 2, tỉ lệ 3:1 là 3,5 đến 1,5 cuối cùng ở tỉ lệ 4:1 độ phân tán cao ở trong vùng pH= 4,5 đến 1 Kết quả này phù hợp với độ đục của hỗn hợp SPI:HKG (2:1 đến 4:1) đã được đo trước đó với khoảng pH bắt đầu có sự gia tăng về độ hấp thu Quan sát này cho thấy sự bắt đầu hình thành của phức chất không hòa tan, báo hiệu phức hợp SPI:HKG đang tiến gần đến điểm pH tương đương điện Kết quả này phù hợp với độ đục trong của hỗn hợp SPI:HKG khi ghi nhận sự tăng nhanh của độ đục Khi phức được phối trộn với tỉ lệ SPI-HKG bé hơn 1 (1:2 đến 1:4) kích thước hạt lớn nhất ở 1:2; 1:3 và 1:4 lần lược là 3593 nm, 3390 nm và 1458 nm tương tự như trên những hạt lớn này luôn nằm trong vùng có độ phân tán lớn cụ thể là ở tỉ lệ 2:1, 3:1 và 4:1 vùng phân tán lớn đều nằm trong khoảng pH=2,5 đến 1
