Trong các nghiên cứu cho thấy quá trình trích ly có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi của CGA trong quá trình trích ly, các thông số của các yếu tố trích ly có sự tác động qua lại
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây kinh giới
Chi kinh giới (Elsholtzia willd) thuộc họ Lamiaceae [11], có khoảng 40 loài kinh giới trên thế giới phân bố chủ yếu ở Đông Á, Châu Phi, Bắc Mỹ, và một số quốc gia Châu Âu Ở Việt Nam, có 7 loài thuộc chi kinh giới được nghiên cứu và ứng dụng làm thực phẩm và dược phẩm [12]
Cây kinh giới còn có tên gọi khác là khương giới, giả tô, kinh giới rìa, bán biên tô, tiểu kinh giới, bài hương thảo Tên khoa học là Elsholtzia ciliata
Kinh giới là cây thảo sống hằng năm có đặc điểm như sau:
Thân thuộc loại cỏ đứng, cao 0,6-0,8m toàn cây có lông màu trắng, có mùi rất thơm Thân non màu xanh, tiết diện vuông hơi khuyết ở bốn cạnh Thân già màu nâu tía có bốn góc lồi tròn dọc thân
Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập Phiến là màu xanh đậm hơn ở mặt trên, hình trứng đinh nhọn một phần dọc theo hai bên cuống lá, bìa răng cưa nhọn không đều và mặt dưới nhiều chấm nhỏ (lông tiết) Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới Cuống lá hình trụ hơi phẳng ở mặt trên, gốc cuống lồi thành u nhỏ, mặt trên có lông rậm màu trắng ở giữa
Hoa mọc thành cụm ở ngọn cành, tạt về một phía dày đặc hoa, cuống hoa có màu xanh rất ngắn hoặc gần như không có Lá đài màu xanh, gần đều, dính nhau thành một ống hình chuông, mặt ngoài đầy lông tơ trắng, nhiều hơn ở rìa Cánh hoa màu trắng hay tím nhạt đậm dần phía trên, mặt ngoài phủ đầy lông dài màu trắng và có nhiều điểm tuyến màu vàng, dính nhau ở dưới thành ống hơi thắt ở gần đáy, dài khoảng 2-3 mm
Hình 2.1: Cấu tạo cây kinh giới
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng trong 100g cây kinh giới [13]
Thành phần dinh dưỡng Đơn vị Hàm lượng
Nghiên cứu của Pudziuvelyte và cộng sự, 2020, về E ciliata (Thunb.) Hyl trích ly từ các bộ phận khác nhau của thực vật Sử dụng phương pháp phân tích HPLC
6 phân tích dịch trích ly ethanol từ thân, lá, hoa và toàn bộ cây kinh giới E ciliata, kết quả cho thấy: có 12 hợp chất phenolics đã được tìm thấy trong nguyên liệu, trong đó CGA, RA là những hợp chất chiếm ưu thế; lượng phenolic có trong dịch chiết từ lá là 89,55 ± 3,91 mg GAE/g chất khô cao hơn so với dịch chiết từ thân (61,25 ± 1,91 mg GAE/g chất khô) và dịch chiết từ hoa (77,39 ± 0,94 mg GAE/g chất khô) Lượng hoạt chất kháng oxy hóa theo DPPH; RA và CGA trong dịch chiết từ lá lần lượt là 319,78 ± 15,15 μmol TE/ g chất khô; 0,115 ± 0,011 mg/g và 10,477 ± 0,391 (mg/g) [14]
Nghiên cứu của Liu và cộng sự, 2012, về đánh giá hoạt động chống oxy hóa của dịch chiết và các phần phân đoạn từ các bộ phận khác nhau của cây E Ciliata, kết quả cho thấy hàm lượng phenolic ở lá là 30,64 ± 1,04 g/100g [15]
Tổng quan về Chlorogenic acid
Trọng lượng phân tử: 354, 31 g/mol [16]
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4- dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid Tên khác: 3-O-Caffeoylquinic acid
3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid 3-Caffeoylquinic acid
Hình 2.2: Cấu trúc phân tử Chlorogenic acid
Về mặt cấu trúc, CGA là este được hình thành giữa acid caffeic và 3-hydroxyl của acid L-quinic Các chất đồng phân của CGA bao gồm este caffeoyl tại các vị trí hydroxyl khác trên vòng acid quinic
CGA là một acid phenolic hòa tan trong nước, được thực vật tổng hợp trong quá trình hô hấp hiếu khí [17], có sẵn nhiều nhất trong thực phẩm như hạt cà phê xanh, trà, khoai tây, cà tím, đào, mận khô,
CGA là chất rắn, dạng bột màu trắng hoặc hơi ngả vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamid Đây là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là 4°C Nhiệt độ nóng chảy: 205 o C – 209°C Độ hòa tan: 40 mg/mL ở 25°C
2.2.3 Công dụng của acid chlorogenic
CGA có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng nên nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, thực phẩm, chăm sóc sức khỏe và công nghiệp hóa chất như sau [16]:
Tác dụng chống oxy hóa: Hoạt động chống oxy hóa là một trong những hoạt động quan trọng của CGA vì chúng có thể loại bỏ ba loại oxy hóa khử như superoxide, hydroperoxide và các gốc hydroxyl, khi nồng độ CGA cao tác dụng gốc tự do thể hiện rất rõ, tuy nhiên khi nồng độ thấp khả năng kháng oxy giảm đi và có thể thúc đẩy quá trình oxy hóa CGA làm giảm tổn thương gan do rượu bằng cách làm giảm sự tích tụ các sản phẩm oxy hóa như superoxide, hydroperoxide và các gốc hydroxyl, bên cạnh đó nó còn giúp ức chế stress do oxy hóa [18]
Tác dụng chống viêm: CGA chống viêm bằng cách ức chế các phản ứng viêm và tăng cường hệ thống phòng thủ chống oxy hóa Một số nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm của CGA như chống viêm mô tụy, phổi ở chuột bị viêm phổi [19] Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus: về kháng khuẩn CGA có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng và có khả năng ức chế nhất định đối với E.coli, S.aureus, nấm men,
Aspergillus niger và Bacillus subtilis CGA kháng nấm mạnh hơn kháng vi khuẩn, tác
8 dụng kháng khuẩn của CGA bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, tác dụng tăng khi nhiệt độ tăng, tuy nhiên nếu nhiệt độ vượt quá 60℃, tác dụng kìm khuẩn sẽ giảm [20]
Tác dụng hạ đường huyết và hạ lipid máu: CGA có thể duy trì nồng độ đường trong máu và ngăn chặn bệnh đái tháo đường ở một mức độ nhất định Về tác dụng hạ lipid máu, CGA giúp điều chỉnh quá trình chuyển hóa cholesterol bằng cách ức chế hoạt động của hydroxymethyl glutaric coenzyme A reductase Ngoài ra, CGA cũng giúp ức chế lipase tuyến tụy nên nó được sử dụng để can thiệp bệnh béo phì và đái tháo đường [21]
Tác dụng chống bệnh tim mạch: CGA loại bỏ các gốc tự do và chống peroxy hóa lipid, làm tăng nồng độ các ion kali trong máu, giảm nồng độ triacylglycerol và cholesterol trong máu, bảo vệ các tế bào nội mô mạch máu và do đó có tác dụng bảo vệ hiệu quả đối với hệ thống tim mạch [16]
Tác dụng chống đột biến và chống ung thư: CGA ức chế đột biến mạnh mẽ, ức chế đột biến do Aflatoxin B và quá trình nitro hóa gây ra [22], đồng thời làm giảm hiệu quả sự đột biến của các tế bào hồng cầu trong tủy xương do bức xạ gây ra Về tác dụng chống ung thư, CGA có tác dụng ức chế đáng kể đối với ung thư đại trực tràng, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư ruột kết…nên chúng được xem là một chất hóa học bảo vệ ung thư hiệu quả Đồng thời, CGA cũng giúp ngăn chặn chu kỳ phát triển của tế bào bằng cách gây ra quá trình chết theo chương trình và cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [16]
Tác dụng điều hòa miễn dịch: CGA đóng vai trò điều hòa miễn dịch bằng cách ức chế sản suất các cytokine chống viêm bằng đại thực bào, loại bỏ các tế bào khối u ác tính [23]
Tổng quan tình hình nghiên cứu về cây kinh giới
2.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu của Chan và cộng sự, 2012, về nghiên cứu đặc tính chống oxy hóa của các loại thảo mộc với tác dụng tăng cường của phương pháp xử lý sấy khô: có 3 loài thảo mộc được thực hiện sấy khô bằng lò, sấy trong lò vi sóng và đông lạnh với các độ trưởng thành khác nhau của lá Kết quả cho thấy hàm lượng TPC, khả năng kháng oxy hóa của lá M Alba tăng lên đáng kể khi sấy bằng lò vi sóng so với lá tươi,
9 trong khi đó khi đông khô lá E elatior giúp tăng lượng TPC lên 26%; tăng hợp chất chống oxy hóa lên 45% so với mẫu lá tươi và hàm lượng CGA thu được là 294 mg/100g cao hơn hẳn so với kim ngân hoa Nhật Bản
Nghiên cứu của Chan và cộng sự, 2016, về đánh giá các phương pháp tiền xử lý và trích ly khác nhau cho trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá
Orthosiphon stamineus thông qua phân tích cấu trúc vi mô: sử dụng nguyên liệu lá trà Java ở Malaysia, được rửa sạch và sấy khô đối lưu cưỡng bức ở 45℃ qua đêm cho đến khi độ ẩm đạt dưới 15%; sau đó mẫu sẽ được nghiền và sàng rây để đạt nhiều kích thước hạt khác nhau 0,5mm; 250 – 500mm; 100 – 250mm và được bảo quản ở 4℃ trước khi mang phân tích Các phương pháp tiền xử lý trích ly sử dụng trong nghiên cứu này gồm trích ly có hỗ trợ siêu âm, trích ly có hỗ trợ vi sóng và xử lý mẫu bằng acid và kiềm, dung môi sử dụng là ethanol 70% Nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp phân tích kính hiển vi điện tử quét (SEM) của dịch chiết mẫu để kiểm tra sự biến đổi cấu trúc của các mẫu thực vật trước và sau mỗi phương pháp chiết làm ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Kết quả nghiên cứu cho thấy: hiệu suất của phương pháp trích ly về năng suất và thời gian trích ly phụ thuộc vào tác động đến cấu trúc vi mô của mẫu thực vật, đặc biệt là bộ ba tuyến vì nó là nơi chính để sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật, phương pháp hỗ trợ siêu âm và hỗ trợ vi sóng có thể bị phá vỡ nhiều nhất do đó dẫn đến trích ly cao hơn, năng suất và thời gian xử lý ngắn hơn, cho thấy có mối quan hệtỉ lệ thuận giữa hiệu suất khai thác và mức độ phá vỡ cấu trúc vi mô của thực vật [24]
Nghiên cứu của Santos và cộng sự, 2022, về tác động của phương pháp sấy trong tiền xử lý chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ jambolana (Syzygium cumini L.) Skeels: sử dụng nguyên liệu là cùi và vỏ quả jamolan (không sử dụng hạt) được thực hiện với hai phương pháp tiền xử lý: lò lưu thông không khí (AOC) - sấy tuần hoàn không khí sau đó sấy khô ở 55℃ trong 8 giờ không gián đoạn và Lyophilization (LYO)- sấy khô bằng thiết bị đông khô trong 48 giờ Các mẫu được nghiền bằng máy nghiền dao Willey, sau đó bảo quản ở -18℃ trước khi mang đi phân tích Các mẫu này được mang đi phân tích cấu trúc vi mô bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (hình ảnh đượcthực hiện theo gia số từ 50 đến 350 lần, ở điện áp 10kV)
10 Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt LYO có đường kính 225μm, hình dạng hơi tròn và độ xốp cao khi so sánh với các hạt xử lý AOC (kích thước lớn hơn và hình dạng không xác định) Ngoài ra, hiệu suất chiết từ các hạt LYO có nồng độ các hợp chất sinh học cao hơn so với các hạt AOC [25]
Nghiên cứu của Bamidele và cộng sự, 2017, về ảnh hưởng của thời gian chần đến hoạt tính phenolic tổng số, hoạt động chất chống oxy hóa và hàm lượng khoáng chất của rau lá xanh chọn lọc: sử dụng trên 6 loại rau lá xanh được tiêu thụ phổ biến ở Nigeria, chúng được chần ở cùng nhiệt độ là 90℃ với thời gian khác nhau làm giảm hàm lượng chất khô của rau, kết quả là thời gian chần 5 phút làm tăng đáng kể tổng phenolic (280,6- 980,6 mg GAE/ 100g db) và hoạt tính kháng oxy hóa (25,1 - 95,1 mg TE/100g) tương đương trong tất cả các loại rau [26]
Nghiên cứu của Weiguang Yi và Hazel Y Wetzstein, 2011, về ảnh hưởng của điều kiện sấy khô và quá trình trích ly trên hoạt tính sinh hóa của các loài thảo mộc được lựa chọn: sử dụng ba loại thảo mộc dùng làm thực phẩm và dược liệu gồm có hương thảo (Rosmarinus officinalis), ngải cứu (Leonurus hearta) và bạc hà cay (Mentha Piperita) Lá của 3 loại thảo mộc trên được làm khô bằng 3 phương pháp: làm khô dưới ánh nắng mặt trời, sấy khô trong lò ở 40℃ và sấy khô ở 70℃ và được trích ly bằng 80% metanol hoặc 80% ethanol Kết quả nghiên cứu cho thấy cả điều kiện sấy khô và trích ly đều ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng CGA, TPP và TEAC trong ba loài thảo mộc Các loại thảo mộc sấy khô dưới ánh nắng mặt trời hoặc sấy ở 40℃ cho hàm lượng CGA, TPP và khả năng TEAC cao hơn đáng kể so với các mẫu tươi Việc sấy ở nhiệt độ 70℃ gây ra sự mất mát đáng kể chất chống oxy hóa Ngoài ra, khi trích ly bằng ethanol 80% có CGA, TPP và TEAC cao hơn đáng kể so với trích ly bằng metanol 80% đối với cả ba loại thảo mộc, tuy nhiên đối với thảo mộc khô, hiệu quả của trích ly ethanol/methanol thay đổi theo các phương pháp sấy khô khác nhau [27]
Nghiên cứu của Maja Dent và cộng sự, 2012, về ảnh hưởng của dung môi trích ly, nhiệt độ và thời gian đối với thành phần và tỷ lệ khối lượng của TPC trong trích ly cây xô thơm dại Dalmatian (Salvia officinalis L.): các dung dịch nước của ethanol hoặc acetone 30%, nhiệt độ trích ly là 60℃ và thời gian trích ly là 30 phút là hiệu quả
11 nhất để trích ly TPC từ lá cây xô thơm khô Hàm lượng TPC tổng, CGA, RA và luteolin-3-glucuronide và một số TPC khác thu được đáng kể khi trích ly ở điều kiện trên [28]
2.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam
Nghiên cứu của Võ Văn Quốc Bảo và cộng sự, 2021, về ảnh hưởng của chế độ chần và lượng giấm bổ sung đến chất lượng của gừng dầm giấm sử dụng nguyên liệu gừng xử lý thái mỏng và chần với sự thay đổi ở các nhiệt độ 70, 75, 80, 85 và 90℃ trong 2 phút, sau đó khảo sát tương tự thời gian chần với các mốc nhiệt độ khác nhau 0; 1;1,5; 2; 2,5 và 3 phút; nồng độ giấm bổ sung vào dịch rót với các nồng độ 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 và 1% Kết quả nghiên cứu cho thấy, sản phẩm gừng dầm giấm có chất lượng cao nhất khi được chần ở 85℃ trong vòng 15 phút, nồng độ giấm bổ sung là 0,9% sản phẩm gừng dầm giấm cũng ổn định chất dinh dưỡng và tăng giá trị cảm quan so với nguyên liệu ban đầu [7]
Nghiên cứu của Nguyễn Minh Phước, 2020, về ảnh hưởng cùa quá trình chần và sấy khô với sản suất trà thảo mộc khô từ Bạc hà (Mentha piperita L.): sử dụng lá trà ở tỉnh Hậu Giang, Việt Nam, lá trà được thu hái và bảo quản ở 20℃ sau đó sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Lá trà được chần ở nước nóng có 1,5% acid citric với điều kiện lần lượt như sau: 100℃ trong 5 giây; 95℃ trong 10 giây; 90℃ trong
15 giây; 85℃ trong 20 giây; điều kiện sấy cố định trong nghiên cứu này là 60℃ đến khi độ ẩm 9,5% [9]
Nghiên cứu của Trương Quốc Tất và cộng sự, 2021, về ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng hợp chất TPC, phenolic, sắc tố carotenoids, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa của cây rau càng cua (Peperomia pellucida L.) thu ở tỉnh Tiền
Giang: sử dụng cây rau càng cua tươi được sấy ở các điều kiện lần lượt 50, 60, 70 và 80℃ đến khi đạt độ ẩm ≤ 10%, sau đó nghiền thành bột mịn và mang đi trích lý với ethanol 70%, kết quả cho thấy mẫu rau càng cua sấy ở nhiệt độ 70℃ giữ lại hàm lượng TPP, khả năng chống oxy hóa tốt hơn và giữ lại màu sắc khá tốt so với các mẫu còn lại; hàm lượng TPP là 12,88 (mg GAE/g chất khô); sắc tố carotenoids là 119,05 (mg/g chất khô), khả năng chống oxy hóa tốt với phần trăm gốc tự di DPPH bị khử là 69,54% [6]
12 Nghiên cứu của Dương Thị Phượng Liên và Nguyễn Nhật Minh Phương, 2014, về ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến khả năng trích ly và sự ổn định anthcyanin từ bắp cải tím (Brassica oleracia): sử dụng nguyên liệu là bắp cải tím tươi, sau đó rửa sạch và nghiền nhỏ với kích thước nguyên liệu d < 5mm; nguyên liệu cân 20g cho vào mỗi túi và tiến hành xử lý nguyên liệu với các phương pháp khác nhau gồm sấy nguyên liệu ở 40℃ cho đến khi nguyên liệu đạt độ ẩm 20%; lạnh đông nguyên liệu ở nhiệt độ -15 ℃ trong 24 giờ và kết hợp sấy – lạnh đông Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc xử lý nguyên liệu bằng sấy và lạnh đông riêng biệt đều cho hàm lượng anthocyanin cao hơn so với xử lý kết hợp sấy – lạnh đông, quá trình sấy và quá trình lạnh đông đều gây ra sự phá vỡ cấu trúc tế bào tốt hơn quá trình kết hợp sấy – lạnh đông giúp tăng khả năng tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu [30] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Thúy và cộng sự, 2018, về ảnh hưởng của dung môi và pH đến quá trình trích ly các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa từ tía tô (Perilla frutescens): sử dụng nguyên liệu nghiên cứu là lá tía tô, dung môi trích ly thích hợp là ethanol ở nồng độ 60% với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/35 (w/v) trong điều kiện trích ly tốt nhất là pH 3 Lá tía tô cũng được xử lý sấy khô ở nhiệt độ 70℃ trong 3giờ, xây nhỏ, sàng rây d=0,2cm, dịch chiết thu được ở điều kiện tối ưu có hàm lượng TPC, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa lần lượt là 0,781±0,005g GAE/ 100g chất khô; 0,308±0,001g QE/ 100g chất khô; 125,091±0,211mg vitamin C/L [29]
Tổng quan về quá trình trích ly
2.4.1 Phương pháp ngâm Đây là phương pháp cổ điển, quá trình thực hiện tương đối đơn giản Nguyên liệu đã nghiền nhỏ tới kích thước thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong một thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng lọc thu lấy dịch chiết
Phương pháp này được tiến hành theo 2 cách: Trích ly một lần hoặc trính ly phân đoạn Hiện nay phương pháp ngâm vẫn được sử dụng phổ biến trong trích ly các hoạt chất từ nguyên liệu thực vật như sản suất trà túi lọc, trích ly polyphenol từ lá trà, thời gian ngâm khoảng 24-48h [32] Phương pháp ngâm thường được kết hợp với các tác nhân xúc tác hoặc kỹ thuật khác để tăng hiệu suất trích ly như: kỹ thuật khuấy đảo, tác nhân nhiệt độ (trích ly ở nhiệt độ thường, nhiệt độ cao 40-60 o C, nhiệt độ sôi)
Hình 2.3: Phương pháp trích ly 1 lần
Hình 2.4: Phương pháp trích ly nhiều lần
Phương pháp ngấm kiệt là phương pháp cải tiến của phương pháp pháp ngâm, dung môi được cho chảy theo dòng đi qua nguyên liệu Theo kết quả khảo sát của tác giả Hoàng Thị Lệ Hằng, trong 3 phương pháp trích ly bằng Soxhlet, ngâm cổ điển, ngấm kiệt dùng để trích ly các alkaloid từ lá dâu tằm phương pháp Soxhlet cho hiệu suất trích ly cao nhất đạt 85%, phương pháp ngấm kiệt đạt 72%, thấp nhất là phương pháp ngâm cổ điển 67% Tuy nhiên, theo kết luận của tác giả, do phương pháp Soxhlet tốn thời gian, năng lượng và thiết bị phức tạp nên không được dùng phổ biến, khó ứng dụng trong khi phương pháp ngấm kiệt được cho là đơn giản hiệu quả cao nên được ứng dụng [33] Đây là phương pháp cho dung môi chảy rất chậm qua khối dược liệu đựng trong một dụng cụ “ngấm kiệt” theo quy định trong suốt quá trình không khuấy trộn Dược liệu luôn được tiêp xúc với dung môi mới, luôn tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt được hoạt chất Ưu điểm: Dược liệu được chiết kiệt, dịch chiết đầu đậm đặc
Hình 2.3: Phương pháp trích ly 1 lần có cánh khuấy
15 Nhược điểm: Năng suất thấp, lao động thủ công
2.4.3 Phương pháp chiết ngược dòng
Phương pháp này giống phương pháp ngấm kiệt nhiều lần kết hợp với phương pháp ngâm Phương pháp này không giống phương pháp ngấm kiệt là cho chảy nhỏ giọt, mà mở khóa cho chảy thành dòng sau khi ngâm với thời gian nhất định Đây cũng là phương pháp được ứng dụng nhiều trong sản suất lớn
Theo tác giả Xuejun Pan và cộng sự, glycyrrhizic acid (GA) từ rể cây cam thảo được trích ly rất hiệu quả khi sử dụng sử dụng phưong pháp trích ly chiết ngược dòng với hệ dung môi ethanol 50-60% v/v và amoniac 1-2% (v/v) [34]
Hình 2.4: Thiết bị ngâm kiệt liên tục
Hình 2.5: Nguyên tắc phương pháp chiết ngược dòng
2.4.4 Kỹ thuật chiết lỏng cao áp (PLE):
Phương pháp kết hợp nhiệt độ tăng cao (50 – 200 O C) và áp suất (100 – 140 atm) với các dung môi lỏng (không đạt điểm tới hạn) để tiến hành trích ly nhanh và hiệu quả các chất cần phân tích từ các cơ chất mẫu rắn và nửa rắn Kỹ thuật này có những tên gọi khác nhau, như trích ly dung môi tăng tốc (ASE), trích ly lỏng cao áp (PLE), và trích ly dung môi cao áp (PSE) PLE được sử dụng trong nhiều trường hợp trích ly isoflavone từ đậu nành, thực phẩm từ đậu nành và các cơ chất khác (sắn dây…)
So với phương pháp PSE, phương pháp PLE linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do có thể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực, các trang thiết bị cũng không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt như phương pháp PSE nên dễ dàng ứng dụng thực tế trên quy mô lớn [35]
Nguyên lí làm việc: Dung môi được bơm từ bồn chứa vào đường ống chiết bằng bơm cao áp, hệ thống ống chiết được đặt trong bồn trích ly Quá trình chiết được tiến hành trong các ống chiết Các ống chiết được gia nhiệt trong bồn chiết Khi quá trình chiết kết thúc dịch chiết được thu gom trong bộ phần thu mẫu Dịch trích cuối cùng sẽ được tiến hành cô đặc
2.4.5 Phương pháp chiết Soxhlet: Ưu điểm của phương pháp này là dung một lượng dung môi rất ít mà vẫn có thể trích kiệt được các họat chất có trong nguyên liệu, thích hợp với quy mô nhỏ, thí
Hình 2.6: Sơ đồ nguyên lý hoạt động trích ly lỏng cao áp
17 nghiệm Nhược điểm của phương pháp là chỉ có thể trích ly một lượng nhỏ nguyên liệu, thích hợp trong nghiên cứu và thí nghiệm Với phương pháp này, nguyên liệu được đặt trong túi vải thưa đặt trong bình soxhlet, dung môi trích ly sau khi thấm qua nguyên liệu chảy vào bình chứa sẽ được đun bốc hơi và ngưng tụ tiếp tục hồi lưu vào bình soxhlet cho quá trình chiết [35]
2.4.6 Các phương pháp hiện đại để hỗ trợ quá trình trích ly
Sóng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt, gây ra sự khuếch tán vào trong dung môi của các cấu tử cần trích ly Qua cơ chế này, ta thấy phương pháp dùng sóng siêu âm hỗ trợ thì hiệu quả hơn và nhanh hơn Đồng thời, trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm không dẫn đến sự phá hủy cấu trúc cũng như làm suy giảm chức năng sinh học của các cấu tử từ dịch chiết Do đó, sự lựa chọn phương pháp trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm là tốt nhất do năng lượng nhỏ và thời gian trích ly ngắn hơn Hiện nay, kỹ thuật sóng siêu âm đang được ứng dụng phổ biến trong công nghệ trích ly Theo tác giả Phạm Thành Quân và Tống Văn
18 Hằng, Xuejun Pan, và cộng sự kết luận hiệu suất trích ly các hợp chất polyphenol trong lá trà, Cryptotanshinone từ cây Salvia miltiorrhiza bunge có hỗ trợ sóng siêu âm cao hơn hẳn so với phương pháp trích trích ly gia nhiệt thông thường [36]
Vi sóng: Vi sóng làm tăng hiệu quả của quá trình nâng nhiệt Bức xạ của vi sóng thâm nhập vào nguyên liệu và tương tác với các cấu tử phân cực thông qua quá trình dẫn điện bằng ion và sự quay lưỡng cực từ đó tạo ra nhiệt Hiệu quả của vi sóng là sự suất hiện của quá trình nâng nhiệt cục bộ làm tăng áp lực cục bộ lên tế bào và làm vỡ tế bào Từ đó các hợp chất từ trong nguyên liệu sẽ được khuếch tán vào trong dung môi
Nhóm tác giả Spigno và De Faveri đã sử dụng phương pháp trích ly bằng vi sóng và cho thấy hiệu suất trích ly các polyphenol trong trà đen trong 90s sử dụng phương pháp vi sóng cao hơn 43% so với phương pháp truyền thống trong 210s [37]
Các khái niệm về phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp phân tích dùng để tách hỗn hợp các cấu tử ra khỏi nhau nhờ vào sự tương tác khác nhau của chất phân tích đối với pha động và pha tĩnh Trong hệ thống săc ký, phần chuyển động được gọi là pha động, có nhiệm vụ đưa mẫu phân tích đi đến pha tĩnh Pha tĩnh trong hệ thống được cố định, dùng để bắt giữ và phân tách các cấu tử có trong mẫu phân tích ra khỏi nhau
Săc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách hỗn hợp các cấu tử ra khỏi nhau, với pha động được sử dụng là các loại dung môi, được đưa qua cột với bơm cao áp với áp suất lên đến 5000 psi, đi qua cột nhồi có kích thước rất nhỏ (5 – 10μm) Nhờ vào đó, quá trình tách được thực hiện rất tốt Các đầu dò thường được sử dụng cho hệ thống HPLC là: đầu dò Photo Diode Array (PDA), đầu dò huỳnh quang (FLD), đầu dò khối phổ (MS)
2.5.1 Cơ chế tách của phương pháp HPLC
Trong quá trình săc ký các phân tử chất phân tích phân bố vào pha động, được pha động dẫn truyền qua pha tĩnh Khi đến pha tĩnh, nhờ vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất phân tích với pha tĩnh, các chất phân tích hấp phụ lên pha tĩnh Sau khi xảy ra quá trình tách, chất phân tích được rửa giải để đưa ra khỏi pha tĩnh Để phát
19 hiện và định lượng chất phân tích, ta sử dụng các loại đầu dò Tùy thuộc vào chất phân tích mà ta sử dụng các loại đầu dò thích hợp
Yếu tố quyết định đến hiệu quả của việc tách săc ký là các mối tương tác sau đây:
- Tương tác giữa chất phân tích và pha động
- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh
- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động, tuy nhiên tương tác này rất ít, hầu như không ảnh hưởng đến hiệu quả của việc tách săc ký
Hình 2.8: Sự phân bố giữa chất phân tích và hai pha
Chất phân tích tương tác càng mạnh với pha tĩnh, sẽ được rửa giải ra sau cùng, và ngược lại, chất phân tích tương tác yếu với pha tĩnh sẽ được rửa giải ra trước tiên
2.5.2 Các đại lượng đặc trưng trong sắc ký
Trong sắc ký, sự phân bố không đồng đều của các cấu tử chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động không trộn lẫn vào nhau khi pha động đưa chất phân tích đi qua pha tĩnh giúp cho các chất phân tích tách ra khỏi nhau Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và nó được tính theo công thức:
- CiS: nồng độ chất tan i trong pha tĩnh
- CiM: nồng độ chất tan i trong pha động
- Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh)
Chất càng tương tác mạnh với pha tĩnh, hệ số phân bố Ki càng lớn và ngược lại
Hệ số phân bố Ki phụ thuộc vào bản chất của chất tan, pha tĩnh, pha động và nhiệt độ, không phụ thuộc vào các đặc tính của cột (chiều dài cột, kích thước hạt, …)
Khi mẫu được pha động dẫn qua pha tĩnh, các thành phần tương tác với pha tĩnh sẽ được lưu giữ lại trên pha tĩnh Thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào và cho chạy qua pha tĩnh bởi pha động cho đến khi nhận được tín hiệu cực đại của peak săc ký được gọi là thời gian lưu của một chất Kí hiệu là tR (Retention Time)
Peak nhỏ trong hình bên dưới biểu diễn một cấu tử gần như không tương tác với cột, bị đưa ra khỏi pha tĩnh ngay khi quá trình rửa giải bắt đầu Thời gian từ lúc tiêm mẫu đến khi peak này suất hiện được gọi là thời gian lưu chết Kí hiệu là tM
Hình 2.9: Sắc ký đồ biểu diễn của thời gian lưu của các chất
21 Hiệu của thời gian lưu và thời gian lưu chết được gọi là thời gian lưu hiệu chỉnh, chính là thời gian chất bị lưu giữ trong pha tĩnh Thời gian lưu hiệu chỉnh được kí hiệu là t’R, được tính theo công thức: t’R = tR – tM
Hệ số chứa hay dung lượng cột là một thông số quan trọng trong săc ký, nó là đại lượng biểu diễn mối tương quan giữa thời gian của chất tan lưu lại trong pha tĩnh so với thời gian chất tan lưu trong pha động Hệ số chứa được định nghĩa như sau:
- VS: thể tích của pha tĩnh
- VM: thể tích của pha động
Hệ số dung lượng K’ phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh & pha động, bản chất của chất phân tích và đặc tính của cột Pha động có năng suất tửa giải càng mạnh, K’ càng nhỏ, các mũi ra nhanh và gần nhau hơn Khi hệ số dung lượng 1.2, α càng lớn thì mũi của peak càng cách xa nhau, tách khỏi nhau hoàn toàn Hệ số chọn lọc phụ thuộc vào tính chất của các cấu tử cần tách, pha động, pha tĩnh và nhiệt độ của cột Để cho quá trình tách tốt hơn, người ta cần thay đổi các điều kiện sau:
- Thành phần pha động, độ phân cực của pha động
Cùng với hệ số chọn lọc, độ phân giải cũng là một đại lượng dùng để biểu thị khả năng tách ra khỏi nhau của hai peak, được kí hiệu là RS và định nghĩa như sau:
Các mô hình động học sử dụng trong nghiên cứu
Đồ thị đường cong của quá trình trích ly thông thường có 2 pha: pha trích ly nhanh (pha rửa – washing stage) và pha trích ly chậm (pha khuếch tán – diffusion stage), theo hình bên dưới:
Quá trình trích ly được bắt đầu khi các cấu tử thấm vào trong môi trường dung môi từ nguyên liệu thực vật tại các lớp bào tương tiếp xúc trực tiếp với dung môi [40] Vào khoảng thời gian đầu của quá trình trích ly, pha trích ly nhanh sẽ có tỉ lệ trích ly là hằng số [41] Trong thời gian diễn ra pha chậm, các cấu tử khuếch tán từ bên trong nguyên liệu và hòa tan vào trong dung môi Hiệu suất trích ly trong pha chậm phụ thuộc rất nhiều vào tế bào còn nguyên vẹn sau pha rửa [40]
Sự khuếch tán của các cấu tử từ bên trong nguyên liệu vào trong dung môi có thể được mô hình hóa thông qua các mô hình lý thuyết và mô hình thực nghiệm sau đây
2.6.1 Định luật Fick (Fick law)
Quá trình khuếch tán trong trích ly dạng mẻ phụ thuộc vào 2 hàm trích ly: khuếch tán bên trong và khuếch tán bên ngoài Động lực của quá trình khuếch tán của
Hình 2.12: Đường cong quá trình trích ly các hợp chất từ thực vật [39]
26 các hợp chất là sự khác biệt nồng độ chất tan giữa môi trường bên trong tế bào và dung môi trích ly bên ngoài theo phương trình [42]
- 𝑁: thông lượng dòng trích ly (g/m 2 s)
- D: độ khuếch tán hay hệ số khuếch tán (m 2 /s)
- C: nồng độ chất hòa tan bên trong nguyên liệu tại thời điểm bất kỳ (g/m 3 )
- x: khoảng cách của hướng khuếch tán (m) Đối với quá trình khuếch tán bên ngoài, các hợp chất được khuếch tán từ bề mặt bên ngoài của nguyên liệu vào môi trường dung môi Quá trình xác định cơ chế, tỉ lệ giới hạn của pha khuếch tán đóng một vai trò quan trọng trong việc xây dựng mô hình động học cũng như xác định thuật toán tiếp cận với mô hình trích ly đó Để đảm bảo hiệu quả của quá trình trích ly thì cần phải tối thiểu sự cản trở quá trình khuếch tán ngoài, vì thế hiệu suất trích ly chỉ còn phụ thuộc vào quá trình khuếch tán bên trong của hợp chất Độ khuếch tán trong định luật Fick là một tính chất quan trọng vì nó chỉ ra hệ số truyền khối và nó rất hữu ích cho việc thiết kế thiết bị trích ly [43]
Tính chất của quá trình trích ly xác định thông qua việc giải phương trình Fick với các điều kiện ban đầu và điều kiện biên Một số giả định có thể được áp dụng để đơn giản hóa quá trình truyền khối như bên ngoài [44]
- Nguyên liệu thì có dạng đối xứng Hình dạng của nguyên liệu được giả định là hình cầu với bán kính R hoặc bản mỏng với nửa bề dày là L
- Nguyên liệu được giả định là môi trường đồng nhất Nồng độ của các cấu tử bên trong nguyên liệu phụ thuộc vào thời gian và bán kính hoặc bề dày
- Các cấu tử được phân phối đồng đều trong nguyên liệu
- Dung môi và nguyên liệu được pha trộn đồng nhất Nồng độ của các cấu tử trong dịch trích chỉ phụ thuộc vào thời gian
- Quá trình truyền khối của các hợp chất từ nguyên liệu là hiện tưởng khuếch tán mà hệ số khuếch tán không phụ thuộc vào thời gian
- Quá trình khuếch tán các cấu thử khác nhau diễn ra song song và không có phản ứng nào giữa chúng
- Sự cản trở của quá trình truyền khối ra bên ngoài được xem như không có Nồng độ của cấu tử bên trong nguyên liệu thì bằng với nồng độ của cấu tử trong dung môi
Với các giả định như trên thì, động học của quá trình trích ly có thể được phát triển dựa vào quá trình cân bằng vật chất của nguyên liệu có dạng hình cầu như phương trình:
Với t là thời gian trích ly Khi xem xét nguyên liệu có dạng hình cầu với bán kính r, ta có các điều kiện ban đầu và điều kiện biên như sau:
- 𝐶0 là nồng độ chất tan ban đầu trong nguyên liệu (g/m 3 )
- 𝐶𝑖 : nồng độ chất tan tại bề mặt của nguyên liệu (g/m 3 )
Với giả định sự cản trở của quá trình truyền khối bên ngoài được loại bỏ thì nồng độ tại bề mặt nguyên liệu sẽ bằng 0 như phương trình trên Từ đó, phương trình động học của quá trình trích ly đối với nguyên liệu hình cầu và bản mỏng có thể được diễn tả như phương trình bên dưới [44]
Nguyên liệu có dạng hình cầu:
𝑅 2 }] (6) Nguyên liệu có dạng bản mỏng:
28 Gọi M là khối lượng của hợp chất khuếch tán vào dung môi tại thời điểm t, M có thể tính toán được bằng cách kết hợp nồng độ của chất tan tại bán kính hoặc độ dày bất kỳ ở phương trình (6) hoặc phương trình (7), ta thu được phương trình sau đây
Nguyên liệu có dạng hình cầu
Nguyên liệu có dạng bản mỏng
Với 𝑀∞ (g) là tổng khối lượng chất hòa tan khuếch tán vào dung môi sau thời gian vô cực Thông thường, sau một khoảng thời gian – thường là sau pha rửa thì chỉ dãy số đầu tiên của chuỗi là còn nhiều giá trị [45] Do đó, phương trình (8) và (9) có thể được đơn giản bằng phương trình dưới đây [43]:
- A là hằng số của mô hình
- B là hằng số khuếch tán
Theo lý thuyết thì: Đối với chất điểm hình cầu
𝐵 = π 2 D r 2 (11) Đối với chất điểm dạng bản mỏng
𝑀 ∞ ,với q là hiệu suất trích ly (%) Phương trình (10) được biễu diễn dưới dạng đường thẳng như sau: ln(1 − 𝑞) = 𝑙𝑛𝐴 − 𝐵𝑡
2.6.2 Định luật Fick điêu chỉnh (Fick modified)
Mô hình sử dụng định luật Fick điều chỉnh được đề nghị từ rất sớm và nó phù hợp để sử dụng trong nghiên cứu và thiết kế thiết bị Các thông số của phương trình
29 là những con số vật lý có ý nghĩa Những mô hình đơn giản hơn như lý thuyết về bản mỏng [46] hoặc quá trình khuếch tán không ổn định của nguyên liệu thực vật [47] thì phù hợp để mô tả pha rửa và pha khuếch tán trong quá trình trích ly Mô hình 2 thông số từ định luật Fick được diễn tả qua 2 phương trình dưới:
Mô hình cho cấu tử bản mỏng
Mô hình cho quá trình trích ly không ổn định
- 𝑏, 𝑏′: đặc trưng cho hệ số của quá trình trích ly ở pha rửa
- 𝑘, 𝑘′:đặc trưng cho hệ số của quá trình trích ly ở pha khuếch tán
- 𝑐: nồng độ của chất tan bên trong nguyên liệu sau thời gian trích ly t
- 𝑐0 : nồng độ của chất tan bên trong nguyên liệu ban đầu
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Cây kinh giới (Elsholtzia ciliata) được mua tại Lâm Đồng từ tháng 09/2023 đến tháng 11/2023 Cây lá kinh giới được thu mua ngay sau khi thu hoạch từ 5 giờ sáng (đã cắt bỏ rễ), tại trang trại rau sạch ở Lâm Đồng (không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và thuốc tăng trưởng), thân cây cao khoảng 50cm, được bọc trong giấy kraf và xếp vào thùng xốp (EPS) đầy khoảng 2/3 thể tích thùng, thùng được đậy nắp và có đục lỗ, được vận chuyển trên xe có nhiệt độ khoảng 20℃ về TP.HCM và các thùng xốp EPS được được chuyển đến phòng thí nghiệm, bảo quản trong tủ mát 10 - 15℃ trong từng túi plastic EVA (co-polymer của polyethylene và vinylacetat) với khối lượng phù hợp cho thí nghiệm, được bảo quản trong điều kiện trên trong vòng 3 ngày
Hình 3.1: Nguyên liệu lá kinh giới
Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng
STT Tên dung môi Nhà sản suất Tiêu chuẩn Hàm lượng (%)
1 Acid acetic Merk KGaA Dùng cho HPLC 99,80 %
2 Nước Merk KGaA Dùng cho HPLC 99,80 %
3 Acetonnitrile Macron Dùng cho HPLC 99,80 %
5 Chlorogenic acid Hoa Kì Chất chuẩn 99,99%
Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng
STT Loại thiết bị Tên thiết bị Nhà sản suất
1 Khay đựng các dung môi Bottle Stand BS-4000-1 Jasco
2 Bơm cao áp HPLC Pump PU-4180 Jasco
3 Bộ tiêm mẫu tự động Autosampler AS-4150 Jasco
4 Lò cột Column Oven CO-4060 Jasco
5 Thiết bị nối với máy tính Interface Box LC NetII/ADC Jasco
6 Đầu dò UV PDA Detector MD-4010 Jasco
7 Cột sắc ký C18 Column Jasco
8 Thiết bị lọc chân không - -
11 Máy quang phổ UV – VIS
Phương pháp nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu chính của đề tài được trình bày bằng sơ đồ dưới đây:
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu
3.2.2 Quy trình thu nhận dịch trích ly quy mô phòng thí nghiệm
3.2.3.1 Làm sạch – chần - làm lạnh nhanh
Lá của cây kinh giới sau khi được thu hái đem đi rửa bằng nước sạch Sau đó được chần ở nhiệt độ 80 o C trong bể điều nhiệu với thời gian 90 giây nhằm mục đích tiêu diệt một số vi sinh vật bám trên bề mặt, song song đó là việc ức chế quá trình
Hình 3.3: Quy trình trích ly CGA
37 hoạt động sinh hóa của các enzyme có trong nguyên liệu đặc biệt là các Polyphenol oxidase (PPO) và Peroxidase (POD) được tìm thấy trong nguyên liệu
Sau đó nguyên liệu được làm lạnh nhanh bằng nước lạnh ở 0-5 o C nhằm tránh các phản ứng tiếp tục xảy ra với tác nhân nhiệt độ
3.2.3.2 Làm ráo – Lạnh đông - xay
Sau khi nguyên liệu được đưa về nhiệt độ lạnh, tiến hành làm ráo nước bằng dụng cụ quay li tâm Khi đó, loại bỏ được nước bám trên lá trong quá trình chần Tiến hành xay nhuyễn lá bằng máy xay, nhằm giảm kích thước nguyên liệu và tang diện tích tiếp xúc, điều này có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly của quá trình
Quá trình trích ly sẽ hòa tan các cấu tử trong nguyên liệu vào dung môi, từ đó ta có thể thu được cấu tử cần thu nhận Quá trình trích ly được thực hiện với nhiều điều kiện khác nhau để xác định yếu tố ảnh hưởng và mô hình động học phù hợp Chúng tôi thực hiện quá trình trích ly với tổng thời gian là 60 phút
Sau quá trình trích ly, dịch trích được lọc qua giấy lọc Whatman No.4 bằng thiết bị lọc chân không
Dịch trích sau quá trình trích ly sẽ được xác định hàm lượng CGA từ đó xác định hiệu suất của quá trình trích ly.
Nội dung nghiên cứu
Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ khảo sát quá trình trích ly tại các điều kiện khác nhau và tiến hành xác định mô hình động học phù hợp cho từng điều kiện trích ly Sử dụng quy hoạch thực nghiệm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến các hệ số của mô hình động học trích ly
Khảo sát ảnh hưởng của các thông số quá trình đến hiệu suất trích ly
38 Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của 4 thông số quá trình đến hiệu suất của quá trình trích ly bao gồm nhiệt độ trích ly, nồng độ dung môi, tỉ lệ dung môi : nguyên liệu và pH
Thí nghiệm đươc tiến hành theo bảng sau:
Bảng 3.3: Ma trận thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các thông số đến hiệu suất trích ly
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu pH
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 70 4:1 5:1
60 70 Hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly CGA theo thời gian
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ trích ly, nồng độ dung môi, tỉ lệ dung môi: nguyên liệu và pH đến hệ số của của mô hình động học
Tiến hành sử dụng quy hoạch thực nghiệm toàn phần không lặp 2 4 để đánh giá ảnh hưởng của các thông số quá trình đến các hệ số của phương trình động học
Bảng 3.4: Quy hoạch thực nghiệm các yếu tố trích ly
Trong đó x1, x2, x3, x4 lần lượt là các biến mã hóa nhiệt độ trích ly ( o C), tỉ lệ dung môi : nguyên liệu, pH và nồng độ dung môi (%) T1, T2, T3 là 3 thí nghiệm tại tâm
Dựa vào kết quả thực nghiệm để xây dựng phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các thông số quá trình đến hệ số của các phương trình động học trích ly: Ŷ = b 0 + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x 3 + b 4 x 4 + b 12 x 12 + b 13 x 13 + b 14 x 14 + b 23 x 23 + b 24 x 24 + b 34 x 34 + b 123 x 123 + b 124 x 124 + b 134 x 134 + b 1234 x 1234
40 Trong đó hàm mục tiêu là các hệ số của phương trình động học tương ứng
3.3.1.3 Xác định hiệu suất trích ly q = 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝐶𝐺𝐴 𝑡𝑟í𝑐ℎ 𝑙𝑦 đượ𝑐
3.3.1.4 Thẩm định mô hình động học
Mô hình động học được thẩm định dựa trên sai số hiệu dụng (Root mean square error– RMSE) của độ sai lệch giữa giá trị thực nghiệm và giá trị tính toán từ mô hình, từ đó đánh giá sự khác biệt về giá trị giữa thực tế và dự đoán
- RMSE: Sai số bình phương trung bình (Mô hình tốt khi RMSE giao động 0-0,2)
- 𝑞 𝑒𝑥𝑝 : Hiệu suất trích ly từ thực nghiệm
- 𝑞 𝑐𝑎𝑙 : Hiệu suất trích ly tính toán từ mô hình
- N: Số lượng mẫu trên một thí nghiệm
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả khảo sát giữa phương pháp HPLC và UVVis
Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký được thực hiện với dung dịch CGA có nồng độ 20ppm Tốc độ dòng là 1 ml/phút Sử dụng đầu dò DAD để quét phổ trong dải bước sóng 190 - 800 nm, kết quả cho thấy mẫu có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 327 nm
Sau khi khảo sát, điều kiện sắc ký tối ưu khi phân tích bằng phương pháp HPLC là pha tĩnh cột silicagel C18, pha động acetonitrile : acid acetic 1% với tỷ lệ 15:85, tốc độ dòng 1 ml/phút, đầu dò UV ghi tại bước sóng 327 nm Sắc ký đồ được thể hiện trong hình 3.1
Tiến hành khảo sát điều kiện xử lí mẫu, ta thấy điều kiện tối ưu nhất để xử lí mẫu phân tích là dùng 70mg graphite carbon trong 1mL dung dịch mẫu trích ly, đồng nhất mẫu trên thiết bị vortex 5 phút sau đó lọc qua màng lọc syringe nylon hydrophilic đường kớnh 0,22 àm Sắc ký đồ được thể hiện như hỡnh 4.2
Hình 4.2: Sắc ký đồ dịch trích ly sau khi xử lý làm sạch Hình 4.1: Sắc ký đồ chất chuẩn CGA ở nồng độ 20ppm
42 Tiến hành trích ly mẫu 7 lần, dịch trích ly được đo lần lượt 2 thiết bị phân tích là Uv-Vis là HPLC đầu dò UV để so sánh kết quả phân tích
Bảng 4.1: Bảng so sánh kết quả đo giữa 2 phương pháp đo cùng mẫu đo
Mẫu Kết quả đo mẫu trên HPLC
Kết quả đo mẫu trên UV- Vis (mg CGA/kg)
Dựa trên kết quả phân tích, ta thấy cùng một nền mẫu khi trích ly và phân tích lặp lại 7 lần, kết quả đo trên thiết bị HPLC và thiết bị UV-Vis trung bình lần lượt là 11,34 ± 0,31 mg CGA/kg và 12,75 ± 0,34mg CGA/kg, sự chênh lệch kết quả đo giữa
2 thiết bị trên mẫu khảo sát là 11.09% Sự chênh lệch này không đáng kể giữa những phương pháp phân tích, điều này chứng tỏ việc sử dụng thiết bị HPLC hoặc UV-Vis đều có thể áp ứng tốt cho nghiên cứu này Vì thế, ta có thể sử dụng cả 2 thiết bị UV-Vis phân tích trong suốt quá trình nghiên cứu Ở đây, chúng tôi sử dụng thiết bị UV-Vis để tối ưu hóa thời gian và chi phí nghiên cứu
Kết quả quá trình khảo sát ảnh hưởng của các thông số quá trình đến hiệu suất trích ly
quá trình đến hiệu suất trích ly
4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly
Hiệu suất trích ly CGA tăng khi nhiệt độ tăng dần Kết quả cho thấy, dưới tác dụng nhiệt một phần độ nhớt của dung môi giảm dễ dàng thấm qua nguyên liệu, điều này cũng tạo điều kiên tốt hơn cho khả năng hòa tan và di chuyển của CGA từ nguyên liệu đến dung môi trích ly Bên cạnh đó việc trích ly ở nhiệt độ cao còn tạo điều kiện cho các phân tử hoạt động nhanh hơn tăng tương tác giữa nguyên liệu và dung môi, các phân tử CGA sẽ khuếch tán mạnh hơn vào dung môi dẫn đến hiệu suất trích ly cao
Theo Chen và cộng sự (2013)[56], nhiệt độ trích ly ảnh hưởng đến độ hòa tan, tốc độ truyền khối và độ ổn định của các hợp chất phenolic Năng suất và hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào dung môi và nhiệt độ được sử dụng để trích ly Khi nhiệt độ trích ly tăng cao sẽ làm tăng khả năng hòa tan các hợp chất hoạt động và do đó làm tăng hiệu suất trích ly, nhiệt độ cao còn làm giảm độ nhớt của dung môi, làm tăng bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi, giúp các chất phenolic và hợp chất kháng oxy hóa dễ dàng đi vào trong dung môi [57]
Hình 4.3: Hiệu suất trích ly CGA tại các nhiệt độ khác nhau theo thời gian
44 Với các thí nghiệm trong quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy hiệu suất trích ly CGA đạt hiệu suất tăng dần ở nhiệt độ từ 60-70 o C và có xu hướng giảm khi tăng nhiệt độ đên 75 o C Nếu nhiệt độ cao hơn thì sẽ gây ra hiện tượng biến tính protein của tế bào, gây nên hiện tương đông vón và thoái hóa, làm các phân tử CGA trong tế bào khó tiếp cận được dung môi dẫn đến giảm hiệu suất trích ly
Bảng 4.2: Hệ số của phương trình động học tại các nhiệt độ trích ly và giá trị
Mô hình Thông số Nhiệt độ ( o C) RMSE
Kết quả khảo sát cho thấy tại các điều kiện thí nghiệm thì RMSE có giá trị từ
0,0035 đến 0,0078 là rất nhỏ Chứng tỏ rằng giá trị thực nghiệm và giá trị tính toán của mô hình không có sự khác biệt lớn Vì vậy cả 6 mô hình động học đều phù hợp tại các điều kiện thí nghiệm
Xếp theo giá trị trung bình của RMSE thì mức độ phù hợp của mô hình giảm dần từ Rate law (0,0078) > Elovich (0,0063) > Weilbull (0,0060) > Hàm mũ (0,0058)
Hình 4.4: Sai số hiệu dụng của các phương trình động học tại các nhiệt độ khác nhau
4.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi đến hiệu suất trích ly
Hình 4.5 : Hiệu suất trích ly CGA tại các tỉ lệ dung môi : nguyên liệu khác nhau theo thời gian
Kết quả cho thấy khi tỉ lệ dung môi : nguyên liệu càng tăng thì hiệu suất trích ly càng tăng, tuy nhiên tỉ lệ này càng tăng thì sự chênh lệch về hiệu suất trích ly càng nhỏ, điều này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Thúy và cộng sự (2017) [58] khi sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi cao thu được hợp chất phenolic và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất từ lá tía tô
Hiệu suất trích ly cao nhất là 33,54 ± 0,38% tại tỉ lệ dung môi : nguyên liệu là 6:1 hơn hẳn so với tỉ lệ 4:1 là 29,44 ± 0,39 % tuy nhiên lại không khác biệt lớn so với tỉ lệ 5:1 là 32,05 ± 0,42 %
Vào pha ban đầu, khi nồng độ của cấu tử chất tan chưa lớn thì tỉ lệ dung môi : nguyên liệu sẽ không ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly nên nồng độ CGA tại thời gian 30 phút của 4 ti lệ khảo sát nồng độ đều xấp xỉ bằng nhau (20,27 ± 0,34%; 22,55 ± 0,28%; 23,08 ± 0,38% và 23,25 ± 0,38%)
Bảng 4.3: Hệ số của phương trình động học tại các tỉ lệ dung môi và giá trị RMSE
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu RMSE
Hình 4.6: Sai số hiệu dụng của các phương trình động tại các tỉ lệ dung môi khác nhau
Kết quả khảo sát cho thấy tại các điều kiện thí nghiệm thì RMSE có giá trị từ 0,0091 đến 0,0170 là rất nhỏ Chứng tỏ rằng giá trị thực nghiệm và giá trị tính toán của mô hình không có sự khác biệt lớn Vì vậy cả 6 mô hình động học đều phù hợp tại các điều kiện thí nghiệm Xếp theo giá trị trung bình của RMSE thì mức độ phù hợp của mô hình giảm dần từ Fick modified (0,0170) > Fick law (0,0136) > Weilbull (0,0123) > Hàm mũ (0,0117) > Rate law (0,0092) > Elovich (0,0091)
4.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất trích ly
Các hợp chất của phenolic có tính oxy hóa mạnh nên dễ bị oxy hóa ở pH cao đặc biệt là khoảng pH dao động từ 5,0-8,0 khi đó dung môi trích ly có mang tính kiềm nhẹ dẫn đến một lượng phenolic bị oxy hóa làm giảm hàm lượng phenolic thu được Mặt khác, trích ly tại giá trị pH thấp kìm hãm sự hoạt động của enzyme polyphenol oxidase có trong nguyên liệu thu và thu được hàm lượng CGA cao hơn
Kết quả cho thấy, hiệu suất trích ly tỉ lệ thuận với pH trích ly trong khoảng 2,5-3,5 Hiệu suất trích ly đạt tối đa là 37,92 ± 0,57% tại pH 3,5 tương đồng với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Thúy và cộng sự (2018) [58] trên nguyên liệu lá tía tô cũng thu nhận hợp chất TPC và khả năng kháng oxy hóa cao nhất ở pH ở giá trị 3,0 với hàm lượng TPC cao nhất là 0,781 ± 0,005 g GAE/100g CK
Hình 4.7: Hiệu suất trích ly CGA tại các giá trị pH theo thời gian
Bảng 4.4: Hệ số của phương trình động học tại các độ pH và giá trị RMSE
Mô hình Thông số pH RMSE
Hình 4.8: Sai số hiệu dụng của các phương trình động học tại các pH khác nhau
Kết quả khảo sát cho thấy tại các điều kiện thí nghiệm thì RMSE có giá trị từ 0,0063 đến 0,0103 là rất nhỏ Chứng tỏ rằng giá trị thực nghiệm và giá trị tính toán của mô hình không có sự khác biệt lớn Vì vậy cả 6 mô hình động học đều phù hợp tại các điều kiện thí nghiệm Xếp theo giá trị trung bình của RMSE thì mức độ phù hợp của mô hình giảm dần từ Fick modified (0,0103) > Fick law (0,0085) > Hàm mũ (0,0073) = Weilbull (0,0073) > Elovich (0,0063) > Rate law (0,0063)
4.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến hiệu suất trích ly
Hình 4.9 : Hiệu suất trích ly CGA tại các nồng độ Ethanol khác nhau theo thời gian
Kết quả cho thấy, nồng độ ethanol tỉ lệ thuận hiệu suất trích ly CGA Khi tăng nồng độ từ 40% đến 60% hiệu suất trích ly có xu hương tăng dần và có xu hướng giảm tại nồng độ 70%, hiệu suất cao nhất được ghi nhận trong khảo sát là 42,01 ± 0,29% tại nồng độ Ethanol 60%
Nghiên cứu của Nguyễn Nhật Minh Phương và Nguyễn Hữu Nhân (2022) trên cây lá dứa, kết quả ở mức nồng độ ethanol 40% cho các giá trị TPC và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với các nồng độ 60%, 80% và 99,9% [59] có sự tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi Điều này có thể giải thích rằng: về mặt cấu trúc của CGA trong kinh giới có chứa nhiều nhóm hydroxyl linh dộng tuy nhiên về mặt cấu trúc phân tử khá lớn nên độ phân cực gần xấp xỉ độ phân cực của ethanol và ở nồng độ ethanol 60% có độ phân cực tương đương với độ phân cực của CGA nên hòa tan tốt dẫn đến quá trình trích ly tốt hơn Điều này tương tự việc sử dụng ethanol 60% để trích ly TPC và các phenolic trong các nền mẫu khác Mặt khác với nồng độ ethanol ở 70%, các protein trong nền mẫu có xu hướng được trích ly theo CGA, các kim loại có trong protein có
Hiệu s uất tr ích ly ( %)
Thời gian trích ly (phút)
53 thể liên kết với nhóm chống oxy hóa của phenolic, dẫn đến việc giảm nhóm chức oxy hóa của CGA và rất khó tinh sạch sau này
Bảng 4.5: Hệ số của phương trình động học tại các nồng độ Ethanol và giá trị
Mô hình Thông số Nồng độ Ethanol (%) RMSE
Hình 4.10: Sai số hiệu dụng của các phương trình động học tại các nồng độ dung môi khác nhau
Kết quả khảo sát cho thấy tại các điều kiện thí nghiệm thì RMSE có giá trị từ 0,0073 đến 0,0151 Các giá trị này rất nhỏ, chứng tỏ các mô hình động học là phù hợp
Xếp theo giá trị trung bình của RMSE thì mức độ phù hợp của mô hình giảm dần từ Fick modified (0,0151) > Fick law (0,0127) > Weilbull (0,0105) > Hàm mũ (0,0103) > Elovich (0,0086) > Rate law (0,0073)
Tổng hợp thí nghiệm xác định mô hình động học phù hợp với các điều kiện trích
Kết quả khảo sát các thông số quá trình trích ly phù hợp với các nghiên cứu trước đây Các thông số quá trình: nồng độ Ethanol, nhiệt độ trích ly, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và pH đều ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình trích ly CGA Trong giới hạn của các thí nghiệm thì khi tăng các thông số thì hiệu suất trích ly đều tăng
55 Toàn bộ mô hình động học đều đáp ứng tốt tại tất cả điều kiện thí nghiệm (giá trị RMSE từ 0,0035 đến 0,0151) Điều này chứng tỏ quá trình trích ly tuân theo các quy luật lý thuyết và thực nghiệm đã biết
Hình 4.11: Sai số hiệu dụng của các mô hình động học tại của các điều kiện khác nhau Bảng 4.6: Tổng hợp giá trị RMSE trung bình của các mô hình
56 Dựa vào bảng trên ta thấy rằng, qua các điều kiện thí nghiệm, xếp theo độ lệch trung bình của RMSE thì mức độ phù hợp của các phương trình động học giảm dần từ Fick modified (0,0115) > Fick law (0,0097) > Weibull (0,0090) > Hàm Mũ (0,0088) > Rate law (0,0076) > Elovich (0,0075)
Chúng tôi sẽ chọn 3 mô hình Elovich, Rate law, Hàm mũ phù hợp nhất để khảo sát trong thí nghiệm thứ 3
Hình 4.13: Chênh lệch giữa giá trị tính toán và giá trị thực nghiệm của mô hình
Elovich Hình 4.12: Chênh lệch giữa giá trị tính toán và giá trị thực nghiệm của mô hình
Hình 4.14: Chênh lệch giữa giá trị tính toán và giá trị thực nghiệm của mô hình hàm mũ
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hệ số của mô hình động học
Bảng 4.7: Tổng hợp hiệu suất trích ly tại các điều kiện của thí nghiệm 2
Kết quả thí nghiệm 2 phù hợp với các kết luận của thí nghiệm 1, khi tăng các yếu tố nồng độ dung môi, nhiệt độ, pH và tỉ lệ dung môi : nguyên liệu trong khoảng điều kiện khảo sát thì hiệu suất trích ly tăng Kết quả cho thấy hiệu suất trích ly đạt cao nhất tại nhiệt độ 70 o C, tỉ lệ dung môi : nguyên liệu = 6:1, nồng độ Ethanol 60% và pH 3,5
Hình 4.15: Tổng hợp hiệu suất trích ly tại các điều kiện của thí nghiệm 2 theo thời gian
Bảng 4.8: Tổng hợp hệ số của các mô hình động học từ quy hoạch thực nghiệm
Rate law Hàm mũ Elovich
Từ các hệ số tìm được, tiến hành sử dụng quy hoạch thực nghiệm toàn phần không lặp 2 4 để đánh giá ảnh hưởng của các thông số quá trình đến các hệ số của phương trình động học
Bảng 4.9: Tổng hợp hệ số của phương trình hồi quy cho các hệ số của các mô hình động học
Rate law Hàm mũ Elovich
Hệ số của các phương trình động học trong các thí nghiệm tại tâm cùng các thông số 𝑌̅, Sth, Sbj
Bảng 4.10: Phương sai của các thí nghiệm tại tâm
Rate law Hàm mũ Elovich
Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn Student t0,05(2)
Tra bảng phân bố Student tp(f) với p = 0,05; f = N – 1 = 3 – 1 = 2 (số bậc tự do) tp(f) = t0,05(2) = 4,303
Bảng 4.11: Các giá trị phân vị Student tj cho từng hệ số của phương trình hồi quy
Rate law Hàm mũ Elovich
Tiến hành loại bỏ các thông số tj có giá trị nhỏ hơn 𝑡0,05(2) = 4,303 Do có, phương trình hồi quy cho các hệ số của mô hình động học có dạng theo bảng sau:
Bảng 4.12: Phương trình hồi quy các hệ số của mô hình động học
Mô hình Phương trình hồi quy động học
Bảng 4.12 : Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi quy, với p = 0,05
Dựa vào bảng 4.13, ta thấy tất cà hệ số Fα đều lớn hơn hệ số F Vì thế tất cả phương trình hồi quy cho các hệ số của mô hình động học đều có ý nghĩa (theo lí thuyết mô hình trực giao cấp 1)
Rate law Hàm mũ Elovich
Bảng 4.13: Phương trình hồi quy được chọn
Mô hình Phương trình hồi quy động học
Từ phương trình hồi ta thấy được sự ảnh hưởng của cả 4 yếu tố: nồng độ dung môi, nhiệt độ trích ly, tỉ lệ dung môi : nguyên liệu và pH lên hệ số của mô hình động học
Sự xuất hiện của các thông số x13, x14, x23 , x24, x34, x124, x134, x234, … chứng tỏ các yếu tố này cũng tương tác qua lại với nhau và ảnh hưởng tới quá trình trích ly.