Phương pháp hóa học Quá trình sản xuất bằng phương pháp hóa học được tiến hành bằng việc sử dụng axit clohydric, axit sulfuric, axit phosphoric thủy phân chitin tạo ra glucosamine, sau
Chitin
Chitin là một polysaccharide tự nhiên có khả năng phân hủy sinh học với trữ lượng lớn thứ hai thế giới chỉ sau cellulose Chitin đóng vai trò quan trọng trong thành phần cấu trúc của các loài động vật giáp xác (tôm, cua…), thành tế bào của nấm họ Zygenmyctes, các khung xương của động vật thân mềm (bao gồm mực và bạch tuộc), và trên các mô mềm khác của cá Với đường bờ biển dài hơn 3,260 km cùng hệ thống sông ngòi đa dạng và hàng nghìn đảo lớn nhỏ, Việt Nam được đánh giá là đất nước có tiềm năng phát triển ngành nuôi trồng thủy sản mạnh mẽ Cụ thể, theo thống kê của ngân hàng thế giới (World bank) năm 2022, Việt Nam là nước xuất khẩu tôm đứng thứ 2 thế giới với sản lượng đạt khoảng 1,1 triệu tấn/năm [1] – lượng tôm sản xuất tại Việt Nam được tiêu thụ một phần cho thị trường trong nước còn phần lớn được chế biến và xuất khẩu ra thị trường nước ngoài Trong quá trình chế biến tôm, người ta ước tính có khoảng 45-50% khối lượng tôm bị bỏ đi dưới dạng chất thải rắn gồm đầu, nội tạng và vỏ [2] Lượng chất thải này chiếm khoảng 500,000 tấn/năm và phần lớn bị thải trực tiếp ra môi trường biển hoặc chôn lấp gây ô nhiễm nguồn đất, nước và không khí Theo phân tích của Mathew và cộng sự (2020), thành phần của nhóm chất thải này bao gồm: canxi carbonat (20 – 50%), protein (20 – 40%), một phần nhỏ lipid và carotenoid và chitin (15 – 40%) – cũng chính là thành phần khiến chất thải ngành tôm khó phân hủy tự nhiên ngoài môi trường [3] Do đó, việc xử lý ô nhiễm vùng nuôi tôm, đồng thời tận dụng nguồn chất thải nhằm nâng cao lợi ích kinh tế là bài toán cần được gấp rút nghiên cứu trước thực trạng phát triển nhanh chóng của ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản hiện nay
Chitin được cấu tạo phần lớn bởi các đơn phân là N-acetyl-Glucosamine (GlcNAc, NAG) và phần nhỏ D-glucosamine (GlcN), các đơn phân được liên kết bởi các liên kết β-1,4-glycoside [1]
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của GlcN và GlcNAc [4]
2 Trong tự nhiên, chitin tồn tại ở ba dạng kết tinh α, β và γ-chitin Cấu trúc tinh thể của chitin được giữ vững nhờ các liên kết hydro nội phân tử O-H…O và ngoại phân tử N-H…O=C, trong đó liên kết ngoại phân tử được tìm thấy ở cả 3 dạng cấu trúc trong khi liên kết nội phân tử tương đối hiếm gặp ở dạng γ-chitin và không xuất hiện ở dạng β-chitin Việc cùng tồn tại của hai loại liên kết hydro nội và ngoại phân tử giúp α-chitin có cấu trúc ổn định, có trật tự và bền chặt nhất trong 3 dạng, đồng thời đây cũng là dạng chitin phổ biến nhất trong vỏ các loài động vật giáp xác và chân khớp [5]
Hình 1.2 Các dạng liên kết của chitin [6]
Hình 1.3 Mạng lưới liên kết hydrogen [5]
N-acetylGlucosamine
N-acetyl-Glucosamine (NAG), là một dẫn xuất monosaccharide của glucose, trong đó nhóm hydroxyl ở vị trí C2 của glucose được thay thế bằng một nhóm acetylamin Trong cấu tạo của chitin, NAG đóng vai trò là một đơn phân chiếm phần lớn trong cấu trúc với công thức phân tử là C8H15NO6 Độ hòa tan của NAG trong nước là 25% với nhiệt độ nóng chảy là 221ºC [7]
Phương pháp sản xuất NAG
Chitin được đánh giá là nguồn cơ chất thích hợp để sản xuất NAG bởi lẽ việc tận dụng chitin từ các nguồn phế thải sẽ góp phần gia tăng giá trị kinh tế cho sản phẩm, đồng thời giảm bớt gánh nặng ô nhiễm lên môi trường bởi chitin rất khó phân hủy trong tự nhiên Các phương pháp sản xuất NAG từ chitin bao gồm:
• Phương pháp lên men từ vi sinh vật
Hình 1.4 Các phương pháp sản xuất NAG từ chitin [7]
Quá trình sản xuất bằng phương pháp hóa học được tiến hành bằng việc sử dụng axit clohydric, axit sulfuric, axit phosphoric thủy phân chitin tạo ra glucosamine, sau đó phản ứng acetyl hóa được diễn ra để sinh tổng hợp NAG [8] Hackman và cộng sự (1962) đã nghiên cứu quá trình thủy phân chitin được xúc tác bởi các axit HCl, H2SO4, H3PO4 ở cùng nồng độ, kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân với HCl là cao nhất [9]
Nhiệt độ phản ứng không chỉ quyết định tốc độ chuyển hóa chitin mà còn quyết định trực tiếp đến khả năng thu nhận NAG Theo đó, nhiệt độ phản ứng quá thấp sẽ dẫn đến kéo dài thời gian thủy phân mà hiệu suất không cao, mặt khác, nếu nhiệt độ quá cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ không mong muốn [10] Falk và cộng sự (1966) chỉ ra rằng, khi thủy phân chitin bằng HCl 36% ở nhiệt độ 30ºC, 40ºC và 50ºC, tốc độ thủy phân tăng dần, hàm lượng NAG đạt cực đại tại các thời điểm tương ứng là 24 h, 4.5 h và 1 h [11] Nghiờn cứu được tiến hành bởi Gửzaydın và cộng sự (2020) sử dụng muối nóng chảy có tính axit để thủy phân chitin ở nhiệt độ phản ứng là 80ºC trong 3 h cho hiệu suất NAG đạt 53% Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ tới 140ºC, hiệu suất NAG giảm xuống chỉ còn 21% [12] Những kết quả trên cho thấy việc lựa chọn nhiệt độ và thời gian phù hợp có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu suất thu hồi NAG bằng tác nhân hóa học
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu sản xuất NAG bằng phương pháp hóa học
Tỷ lệ chitin/axit Điều kiện phản ứng
Chitin NAG vô định hình
Phương pháp lên men vi sinh vật
Hiện nay, các công bố nghiên cứu thủy phân chitin bằng phương pháp hóa học chủ yếu sử dụng HCl với nồng độ từ 7 – 12M, nhiệt độ từ 60 – 95ºC và thời gian trong khoảng 1 – 2.5 h Hiệu suất tối đa của quá trình này đạt đến 75.5% theo công bố của Dolgopyatova và cộng sự [14] Mặc dù được đánh giá là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cho hàm lượng NAG tương đối cao, tuy nhiên việc sử dụng axit mạnh đòi hỏi lượng hóa chất rất lớn kèm theo yêu cầu về tính an toàn, trang thiết bị phục vụ,… [17] Gozaydin và cộng sự đã nghiên cứu một quy trình thân thiện, an toàn hơn sử dụng muối nóng chảy LiBr được axit hóa và thu được NAG với hiệu suất 71.5% ở 120ºC sau 30 phút [12] Li + tương tác với nhóm O C giúp phá vỡ mạng lưới liên kết hydro của chitin, trong khi đó Br - tương tác với nhóm hydroxyl (-OH) trong polysaccharide, thúc đẩy quá trình trương nở chitin và thủy phân chitin thành NAG Phương pháp này làm giảm lượng axit sử dụng và giúp tăng hiệu suất NAG, tuy nhiên, việc tinh chế NAG và thu hồi muối đang là hạn chế của phương pháp khi ứng dụng với quy mô lớn
Hiện nay, để giảm lượng hóa chất tiêu thụ, hướng đến những giải pháp thân thiện với môi trường thì việc sử dụng enzyme sinh học nhằm thủy phân chitin được cho là một sự thay thế đầy tiềm năng so với phương pháp hóa học
Chitinase là một nhóm enzyme có khả năng cắt liên kết glycoside nối các đơn phân NAG, bao gồm exo-chitinase (EC 3.2.1.52) và endo-chitinase (EC 3.2.1.14) Exo-chitinase có thể được chia thành chitobiosidase (EC 3.2.1.30) và β-N- acetylglucosidase (EC 3.2.1.96) tùy theo vị trí tác động của chúng lên cấu trúc của chitin [18, 19] Thông thường, các endo-chitinase sẽ phân cắt liên kết glycoside giữa các đơn phân NAG một cách ngẫu nhiên tại các vị trí bên trong phân tử chitin, sản phẩm tạo ra gồm các oligosaccharide hòa tan và trọng lượng phân tử thấp như tetramer, trimer và dimer Sau đó, exo-chitinase hoặc chitobiosidase sẽ tiến hành xúc tác quá trình giải phóng dần dần các dimer, xuất phát bắt đầu từ đầu không khử của chitin Cuối cùng, β-N-acetylglucosidase phân cắt các oligome và dimer để tạo ra NAG [7, 19, 20] Những enzyme này được tìm thấy ở nhiều loài sinh vật khác nhau như Streptomyces griseus [21, 22], Aeromonas sp [23], Pseudomonas aeruginosa K – 187 [24], Trichoderma harzianum [25],… Chitinase từ vi sinh vật cho thấy khả năng thủy phân chitin và sản xuất NAG với hiệu suất cao, trong đó chitinase từ Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 cho hiệu suất thủy phân lên đến 98% với nhiệt độ 37ºC, pH = 7, 200 rpm trong 96 h [26]
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sản xuất NAG bằng phương pháp enzyme
Enzyme Vi sinh vật Điều kiện phản ứng
Khả năng thủy phân chitin được nghiên cứu bằng việc kết hợp xử lý sinh học bằng enzyme và xử lý hóa học nhằm phá hủy cấu trúc tinh thể vững chắc của chitin Theo đó, quá trình tiền xử lý bằng axit sẽ làm trương nở cấu trúc chitin, phá vỡ liên kết hydro, đồng thời giảm kích thước phân tử và độ kết tinh của chitin, từ đó làm tăng khả năng tiếp cận của enzyme và nâng cao hiệu quả thủy phân Phương pháp này cho thấy hiệu quả cao trong việc phá vỡ cấu trúc vững chắc của chitin nhưng dễ xảy ra quá trình khử acetyl tạo ra các sản phẩm phụ không thân thiện với môi trường
Các tác nhân vật lý cũng được nhiều tác giả nghiên cứu nhằm tiền xử lý chitin Theo đó, vùng tinh thể trong cấu trúc của chitin rất vững chắc và khó phân hủy ngay cả trong điều kiện nhiệt độ cao từ 180 – 400 o C và việc tiền xử lý bằng phương pháp vật lý có thể biến đổi chitin tinh thể thành chitin vô định hình mà không ảnh hưởng đến mức độ acetyl hóa Zhang và cộng sự (2020) tiến hành nghiền chitin sau 60 phút đã nhận thấy độ kết tinh của chitin giảm 87.7% mà mức độ acetyl hóa gần như không thay đổi [29] Ngoài phương pháp trên, siêu âm, đồng hóa áp suất cao [30], nổ hơi [31] và tia bức xạ [32] là những phương pháp đã được nghiên cứu tiền xử lý chitin [31] Vasilieva và cộng sự (2016) đã sử dụng chùm tia điện tử plasma ở nhiệt độ thấp (< 70ºC) trong 2 phút, kết quả làm giảm trọng lượng phân tử của chitin xuống khoảng 1000 lần mà không xảy ra quá trình khử acetyl [33] Tuy nhiên tiền xử lý bằng tác nhân vật lý còn hạn chế khi đòi hỏi mức tiêu thụ năng lượng cao mà hiệu quả thủy phân còn thấp hơn phương pháp tiền xử lý hóa học
Bảng 1.3 Một số nghiên cứu sản xuất NAG bằng phương pháp kết hợp
Tác nhân tiền xử lý Điều kiện xử lý Enzyme Điều kiện phản ứng
1.2.1.4 Phương pháp lên men vi sinh vật
Mặc dù các quy trình để sản xuất NAG bằng quá trình thủy phân enzyme đã được thiết lập, nhưng vẫn còn một số hạn chế Phương pháp lên men từ vi sinh vật, lợi dụng hệ thống enzyme của vi sinh vật để thủy phân chitin thành NAG, đồng thời tạo ra nhiều sản phẩm có ích, dễ thu hồi sản phẩm và thân thiện môi trường Nghiên cứu sản xuất NAG bằng quá trình lên men vi sinh vật chủ yếu tập trung vào ba khía cạnh: sàng lọc vi sinh vật, kiểm soát chuyển hóa vi sinh vật và tối ưu hóa quá trình lên men
Sản xuất NAG từ vi sinh vật thường sử dụng glucose làm nguồn carbon và axit amin làm nguồn nitơ Hầu hết các nghiên cứu trước năm 2010 đều sử dụng vi khuẩn Escherichia coli để lên men sản xuất NAG và có thể đạt hàm lượng 118,78 g/L trong điều kiện tối ưu [18] Tuy nhiên, do E coli sản sinh nội độc tố trong quá trình lên men nên NAG được tạo ra bằng phương pháp này không an toàn, từ đó hạn chế ứng dụng của nó trong ngành công nghiệp dinh dưỡng và dược phẩm [36] Trong những năm gần đây, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo vi khuẩn biến đổi gen như Bacillus subtilis và Corynebacter glutamicum để lên men sản xuất NAG Trong điều kiện tối ưu, hàm lượng NAG tương ứng đạt 35.77 g/L và
83 g/L thông qua quá trình lên men từ B subtilis và C glutamicum [18, 37] Ngoài ra còn một số nghiên cứu lên men Saccharomyces cerevisiae để sản xuất NAG, nhưng thời gian kéo dài đến 135 h và hiệu suất tạo sản phẩm còn thấp, chỉ đạt 3 g/L [38]
Với hệ enzyme đa dạng, vi sinh vật có thể sử dụng trực tiếp nguồn cơ chất là chitin để sản xuất NAG Li và cộng sự (2005) đã phân lập được vi khuẩn đất
Aeromonas caviae DYU-BT4 có khả năng lên men sử dụng chitin làm cơ chất cho hàm lượng NAG là 0.88 g/L [39] Chitinibacter tainanensis được Chen IK và cộng sự (2011) phân lập từ mẫu đất ở miền nam Đài Loan có khả năng tạo NAG với hiệu suất đạt 75% từ α-chitin và 98% từ β-chitin trong điều kiện nhiệt độ 30ºC, khuấy 200 rpm trong 72 h [40] Điều kiện lên men cũng tác động đến quá trình lên men sản xuất NAG Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất NAG bao gồm tỷ lệ cấp giống, thành phần môi trường, hàm lượng nguồn có chất, tốc độ sục khí, kỹ thuật lên men…
Bảng 1.4 Một số nghiên cứu sản xuất NAG bằng phương pháp lên men vi sinh vật
Vi sinh vật Kỹ thuật lên men Điều kiện lên men
Lên men theo mẻ (50 mL) 250 rpm, 30ºC 3 [38]
Lên men fed- batch (3 L) pH 6.9, 30ºC,
Lên men fed- batch (3 L) pH 7.0, 37ºC,
Lên men fed- batch (1.5 L) pH = 7.4, 37ºC,
Lên men theo mẻ (4 L) pH 7.0, 30ºC,
200 rpm, 72 h 20 [40] Ứng dụng của NAG
NAG thuộc về một nhóm lớn đường amin phục vụ một số chức năng và nằm trong toàn bộ hệ thống của con người Trong những năm gần đây, NAG đã được phát hiện là một tác nhân dược lý có giá trị trong điều trị nhiều loại bệnh như thấp khớp, viêm khớp dạng thấp [7] Ngoài ra, do NAG có tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống khối u nên nó đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm, thúc đẩy quá trình tổng hợp axit hyaluronic trong da, cũng như cải thiện các triệu chứng của các bệnh như tiểu đường, viêm gan Trong nông nghiệp, NAG được ứng dụng trong quá trình xử lý hạt giống, làm phân bón để nâng cao quá trình nảy mầm, tăng sức đề kháng cho cây trồng Theo báo cáo của Sun J và cộng sự (2022), NAG thúc đẩy sự phát triển của cây cà chua thông qua quá trình trao đổi chất hệ vi sinh vật ở vùng rễ [43]
Carotenoid
Cấu trúc và phân loại của carotenoid
Carotenoid là một nhóm gồm hơn 750 sắc tố tự nhiên được tổng hợp bởi thực vật, tảo và vi khuẩn quang hợp [50] Những sắc tố này tạo ra màu vàng, đỏ và cam tươi trong vi sinh vật, thực vật và ở cả một số động vật Theo Rao và cộng sự (2007), gần 40 loại carotenoid có trong chế độ ăn uống của con người, trong đó 20 loại được xác định trong máu và các mô của cơ thể, đặc biệt là α-carotene, β- carotene, lycopene, lutein và zeaxanthin [51] Một số carotenoid đóng vai trò là tiền chất của vitamin A như α-carotene, β-carotene và β-cryptoxathin, torulahodin, với điểm chung đều chứa chuỗi carbon dài kết thúc ở mỗi đầu bởi một vòng ionone trong cấu trúc phân tử
Hình 1.5 Cấu trúc một số carotenoid phổ biến [50]
Carotenoid được phân loại dựa trên đặc tính hóa học và được phân thành hai loại chính là: xanthophylls và carotenes, cả hai nhóm này đều có đặc tính chống oxy hóa Nhóm xanthophylls là các carotenoid được oxy hóa có chứa nhóm carboxyl hoặc hydroxyl bao gồm lutein, neoxanthin, zeaxathin [52] Nhóm
9 carotenes là các hydrocarbon carotenoid không có phân tử oxi bao gồm α-carotene, β-carotene, lycopene [53] β-carotene được biết đến là một carotenoid quan trọng nhất, là chất tạo màu tự nhiên xuất hiện trong chế độ ăn uống của con người Trong số các carotenoid, β-carotene có thể được phân biệt do chúng có vòng β-ionone ở cả hai đầu của phân tử Cấu trúc của β- carotene được suy ra bởi Karrer cùng cộng sự vào 1930 (Hình 1.5) Là tiền chất vitamin A, tuy nhiên β-carotene chỉ được chuyển hóa một phần thành vitamin A, phần còn lại kết hợp với các retinal ester chưa chuyển hóa hết trong chylomicron, được tiết vào bạch huyết và vận chuyển từ niêm mạc ruột đến gan Ngoài ra, torulahodin, một hợp chất của carotenoid, có một vòng β-ionone kết nối với chuỗi polyene, chứa 13 liên kết đôi và một nhóm carboxylic nên torularhodin cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh và mạnh hơn β-carotene [54, 55]
Hình 1.6 Cấu tạo của torulahodin Ứng dụng của carotenoid
Carotenoid là các phân tử có giá trị trong nhiều ngành công nghiệp ứng dụng như dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm Những sắc tố này giúp tăng cường miễn dịch, giảm thiểu rủi ro cho các bệnh thoái hóa như ung thư, bệnh tim mạch [56], đục thủy tinh thể, thoái hóa điểm vàng… [57] Các hợp chất như lutein và zeaxanthin tích tụ trong điểm vàng của mắt, đóng vai trò bảo vệ võng mạc khỏi tổn hại do ánh sáng xanh và tia cực tím [58] Trong ngành công nghiệp thực phẩm, carotenoid được sử dụng làm chất tạo màu trong nước ép trái cây, mì sợi, đồ uống, kẹo, bơ thực vật, phomat và xúc xích [58, 59] Nhu cầu về chất tạo màu tự nhiên ngày càng tăng gần đây do nhận thức của người tiêu dùng đối với các sản phẩm thực phẩm tự nhiên ngày càng cao Carotenoid thường được bổ sung vào thực phẩm vì đặc tính tạo màu cũng như khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ và lợi ích sinh học đối với sức khỏe con người Ngoài ra, trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, carotenoid còn được sử dụng trong các loại kem dưỡng, giúp bảo vệ các tổn thương da chống lại quá trình oxi hóa và bảo vệ da dưới bức xạ UV [61]
Cũng bởi những lợi ích mang lại cho sức khỏe như vậy mà nhu cầu sử dụng carotenoid ngày càng tăng cao Theo báo cáo phân tích cơ hội toàn cầu và dự báo ngành, thị trường carotenoid toàn cầu năm 2021 đạt 1.8 tỷ đô la Mỹ và được dự báo tăng đến 2.7 tỷ đô la Mỹ vào năm 2031; trong đó thức ăn chăn nuôi là phân khúc chiếm thị phần cao nhất trên thị trường carotenoid toàn cầu, hứa hẹn tiềm năng tăng trưởng mạnh mẽ kéo theo sự gia tăng giá trị kinh tế [62]
Ngành chăn nuôi là một bộ phận quan trọng cấu thành ngành nông nghiệp, góp phần xóa đói giảm nghèo và nâng cao đời sống người dân Trước xu thế chuyển đổi hóa của nền kinh tế thế giới, ngành chăn nuôi Việt Nam cũng dần đổi mới và thích nghi theo nhu cầu của thị trường Các sản phẩm thức ăn chăn nuôi trên thị
10 trường hiện nay được đầu tư nghiên cứu kĩ càng về thành phần và tỉ lệ dinh dưỡng, trong đó việc bổ sung carotenoid được cho là sẽ kích thích sinh sản, tăng cường hệ miễn dịch, tiêu hóa và đề kháng cho gia súc gia cầm
Phương pháp sản xuất carotenoid
Ngày nay, để sản xuất carotenoid, người ta sử dụng 3 phương pháp chính gồm: tách chiết trực tiếp từ thực vật, tổng hợp hóa học và lên men [63]
1.3.3.1 Phương pháp tách chiết từ thực vật
Tách chiết từ thực vật sử dụng dung môi hữu cơ là phương pháp truyền thống để thu được carotenoid Carotenoid được chiết xuất từ các bộ phận của cây, hoa, quả, hạt, rễ và củ (cà rốt, bí ngô, rau bina, cà chua và các loại trái cây như dưa hấu và quả mâm xôi) [63 – 65] Nghiên cứu của Saponjac và cộng sự (2021) đã sử dụng dung môi ethanol và acetone để tách chiết carotenoid từ cà rốt cho hàm lượng carotenoid đạt 270 àg/g cơ chất [67] Trong khi đú, khi carotenoid được tỏch chiết từ cà rốt bằng phương pháp có hỗ trợ xung điện trường cho hàm lượng carotenoid đạt 215 àg/g cơ chất [68] Tuy nhiờn, tỏch chiết từ thực vật gặp khú ở chi phớ cao, tốn nhiều nguyên liệu, phụ thuộc nhiều bởi các yếu tố địa lý, tính thời vụ của nguyên liệu mà hiệu suất thu hồi không cao
1.3.3.2 Phương pháp tổng hợp hóa học
Phương pháp tổng hợp hóa học nhằm thu hồi carotenoid được phát triển từ những năm 1950 và chỉ sau đó 4 năm, quá trình tổng hợp β-carotene và carotenoid đã được áp dụng ở quy mô công nghiệp, ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, chất tạo màu thực phẩm [69] Carotenoid được sản xuất bằng cách két hợp hai phân tử muối phosphonium, mỗi phân tử chứa 15 nguyên tử carbon, và một phân tử dialdehyde chứa 10 nguyên tử carbon Sau đó quá trình đồng phân diễn ra tạo thành các hợp chất đối xứng với 40 nguyên tử, quá trình này cho hiệu suất tổng hợp carotenoid là 60% [70] Quy trình trên không yêu cầu lượng lớn nguyên liệu thô mà có thể sản xuất sản phẩm hiệu quả với dải sản phẩm đa dạng Tuy nhiên, phương pháp này thường để lại dư lượng lớn các chất hóa học độc hại, đòi hỏi quy trình xử lý chất thải tốn kém dẫn đến nâng cao chi phí sản xuất Một số nghiên cứu còn chỉ ra rằng: carotenoid được tổng hợp bằng còn đường hóa học khi vào trong cơ thể sẽ tương tác với vitamin E, tăng khả năng mắc các bệnh về da và thậm chí là ung thư da [71]
1.3.3.3 Phương pháp lên men vi sinh vật
Phương pháp lên men sử dụng vi sinh vật được đánh giá là an toàn với chi phí sản xuất thấp do có thể tận dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp thực phẩm dồi dào, giá rẻ Carotenoid có thể được tổng hợp từ nhiều loại vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và tảo [72]
• Với vi khuẩn, carotenoid chủ yếu được nghiên cứu tổng hợp từ E coli tái tổ hợp bởi vi khuẩn này không thể tự tổng hợp carotenoid một cách tự nhiên nên cần biến đổi gen bằng cách đưa các gen idi, crtE, crtI, crtB và crtY vào tế bào Tuy nhiên, việc đưa E coli tái tổ hợp vào sản xuất công nghiệp vẫn
11 còn nhiều khó khăn do tính an toàn và ổn định nguồn gen của vi khuẩn, do đó cần được nghiên cứu kĩ càng hơn [70] Ngoài ra, một số vi khuẩn khác có thể sinh tổng hợp carotenoid được công bố bao gồm: Corynebacter michiganense, Micrococcus roseus, Brevibacteria spp.,… cho khả năng tớch lũy carotenoid lờn đến 880 àg/g sinh khối khụ [72 – 74]
• Nấm mốc: carotenoid được tìm thấy trong hầu hết các loài nấm như
Mucoraceae - thường được dùng để sinh tổng hợp β-carotene [75, 76], loài Chytridiomycota và Zygomycota cho sản phẩm tích lũy dưới dạng β- carotene hoặc γ-carotene, trong khi ở các loài Blastocladiale, γ-carotene đóng vai trò là sản phẩm cuối cùng của quá trình tổng hợp carotenoid [78] Trong số các loài nấm mốc, Blakeslea trispora thuộc loài Mucoraceae được biết đến với khả năng sinh tổng hợp carotenoid tốt nhất, được ứng dụng ở quy mô công nghiệp với hàm lượng carotenoid đạt 45 mg/g sinh khối khô sau 192 h nuôi cấy [71] Quá trình sinh lên men từ nấm mốc có ưu điểm là dễ thu hồi và tách chiết carotenoid, tuy nhiên lên men lỏng hệ sợi nấm cho thấy độ nhớt rất cao, khó ổn định chất lượng các mẻ và cần năng lượng đáng kể để duy trì môi trường hiếu khí và khuấy trộn trong nhiều ngày Bên cạnh đó, với thời gian nuôi cấy dài ngày, yêu cầu vô trùng và khả năng nhiễm tạp cũng rất cao dẫn tới khó khăn trong việc nâng cấp và kiểm soát trên quy mô lớn [79]
• Tảo Chlamydomonas Reinhardtii và Dunaliella salina hiện đang được chú ý nghiên cứu bởi khả năng tổng hợp một lượng lớn carotenoid với hàm lượng từ 30 – 45 mg/g sinh khối khô [63] Dunaliella là một nhóm tảo đơn bào có khả năng lên men trong điều kiện muối cao lên đến 24% và điều kiện ánh sáng gay gắt, loài tảo này cho hàm lượng tích lũy carotenoid đạt 102.5 mg/m 2 /ngày [80] Ngoài carotenoid, tảo còn chứa nhiều hợp chất với hoạt tính sinh học đa dạng như phenolic, axit béo, protein và vitamin, Tuy nhiên, việc nuôi trồng tảo cần đòi hỏi không gian nuôi trồng rộng rãi với bề mặt thoáng, năng lượng tiêu hao lớn đi kèm với chi phí đầu tư và vận hành còn cao
• Nấm men sinh tổng hợp carotenoid được tìm thấy hiện nay hầu hết thuộc loài Rhodotorula, Sporobolomyces, Sporidiobolus Những chủng nấm men này được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể sinh tổng hợp β-caroten, torulen và torularhodin theo các tỷ lệ khác nhau với hàm lượng carotenoid từ 0.3 – 56 mg/L [80 – 82] Quá trình sinh tổng hợp carotenoid do nấm men tạo ra có chu kỳ ngắn, hiệu suất cao và không chịu ảnh hưởng bởi khí hậu vì vậy mang lại hiệu quả sản xuất và kinh tế cao Trong ngành công nghiệp chăn nuôi, nấm men còn được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng giàu protein trong thức ăn gia súc, gia cầm nhằm tăng giá trị vật nuôi Bên cạnh đó, β-glucan trong cấu tạo của thành tế bào nấm men, với khả năng kích thích hệ thống miễn dịch, cũng được bổ sung vào thức ăn nhằm tăng cường sức để kháng cho vật nuôi, giúp giảm hàm lượng kháng sinh sử dụng Nhờ lợi thế dễ dàng sinh trưởng trên nhiều loại cơ chất trong thời gian ngắn với hiệu suất cao, nấm men được nhóm nghiên cứu lựa chọn để sinh tổng hợp
Công nghệ lên men sinh tổng hợp carotenoid
Con đường sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men
Acetyl-CoA, một chất chuyển hóa trong quá trình chuyển hóa carbon sơ cấp, tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau Nó có thể hoạt động như một chất trung gian để chuyển một nhóm acetyl trong quá trình sinh tổng hợp các hóa chất acetyl khác nhau, chẳng hạn như isoprenoid (được sử dụng làm hương liệu, nhiên liệu sinh học, dược phẩm và vitamin) Glucose là nguồn carbon được sử dụng phổ biến để tạo ra acetyl-CoA thông qua con đường đường phân Đầu tiên glucose được chuyển thành pyruvate thông qua con đường glycolytic, sau đó tạo thành acetyl-CoA bởi pyruvate dehydrogenase trong điều kiện hiếu khí hoặc bởi pyruvate-formate lyase trong điều kiện kỵ khí với sự giải phóng CO2 (Hình 1.7)
Hình 1.7 Con đường tổng hợp Acetyl-CoA từ glucose
Con đường chính để sinh tổng hợp carotenoid trong tế bào nấm men được trình bày gồm ba bước [63]:
13 Hình 1.8 Con đường sinh tổng hợp carotenoid từ Acetyl-CoA ở
• Acetyl CoA được chuyển hóa thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl-CoA (HMG-CoA) nhờ xúc tác bởi enzym synthase HMG-CoA Sau đó, HMG-CoA được chuyển thành axit mevalonic (MVA) đóng vai trò là tiền chất của con đường sinh tổng hợp terpenoid MVA bị phosphoryl hóa bởi MVA-kinase và sau đó decarboxyl hóa để tạo thành isopentenyl pyrophosphate (IPP)
• IPP được đồng phân hóa với dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) với việc bổ sung tuần tự ba phân tử IPP vào DMAPP Phản ứng này được xúc tác bởi prenyl-transferase để tạo ra hợp chất geranyl-gerany-pyrophosphate (GGPP) Hai
3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) Acetoacetyl-CoA
Lycopene ò-zeacarotene γ-carotene ò-carotene Torulene
3,3’-dihydro-3,4- dihydro-ò,ψ-carotene- 4-one (HDCO)
Astaxanthin acetyl-CoA acetyl-CoA
14 phân tử GGPP sau đó được kết hợp tạo thành phytoene (carotene C 40 đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp), sau đó được khử bão hòa để tạo thành lycopene
• Lycopene đóng vai trò là tiền chất của carotenoid, trải qua một số phản ứng trao đổi chất để tạo thành β-carotene, γ-carotene, torulene, torularhodin và astaxanthin Quá trình sinh tổng hợp này yêu cầu sự tương tác qua lại của hệ thống bao gồm 150 gen mã hóa 24 enzyme crt khác nhau liên quan đến quy trình tổng hợp carotenoid từ isoprenoid [84, 85]
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid
Gần đây, các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến quá trinh tổng hợp bằng vi sinh vật để tạo ra các chất có giá trị cao như carotenoid Do đó, các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men rất được quan tâm vì chúng vì chúng liên quan đến sản phẩm định hướng, năng suất tích lũy, chi phí vận hành cũng như giá thành sản phẩm
Công nghệ lên men sản xuất carotenoids từ nấm men chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố, trong đó một số yếu tố quan trọng cần xem xét là: thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện lên men, các yếu tố kích thích, …
1.4.2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy
Nguồn carbon là yếu tố quan trọng nhất được nghiên cứu trong thành phần môi trường dinh dưỡng Nấm men có thể sinh tổng hợp carotenoids khi nuôi cấy trong môi trường chứa: glucose [86, 87], xylose [84], cellobiose [89], sucrose [90], [91], glycerol [92] và sorbitol [93] Tuy nhiên những nguồn cơ chất trên có chi phí khá cao, do đó người ta tập trung nghiên cứu đến việc sử dụng nguồn nguyên tự nhiên hoặc phụ phẩm công nghiệp làm nguồn carbon như bột đậu xanh thủy phân [94], nước mía [95], mật rỉ [96], nước ép nho [97]; chiết xuất than bùn và dịch thủy phân than bùn [98]; dịch thủy phân chất thải mù tạt [99], dịch thủy phân gỗ bạch đàn [89], si-rô ngô [100], dịch thủy phân từ thân cây ngô [94],… cho hàm lượng carotenoid đạt được từ 200 – 2,800 àg/g sinh khối khụ El-Banna và cộng sự (2012) nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp carotenoid của chủng Rhodotorula glutinis trên các nguồn carbon khác nhau cho thấy khả năng sinh tổng hợp carotenoid trên dịch thủy phõn từ thõn cõy ngụ là cao nhất, đạt 861 àg/g sinh khối khụ, đồng thời tỉ lệ thành phần các carotenoid cũng thay đổi so với môi trường glucose [101] Vì vậy, việc thay thế nguồn carbon thương mại như trên ngoài nâng cao khả năng tích lũy carotenoid còn giúp tiết kiệm chi phí sản xuất, tăng cơ hội cạnh tranh với các sản phẩm hiện có và góp phần xử lý một lượng lớn rác thải công nghiệp, giúp bảo vệ môi trường
Nguồn nitơ thích hợp trong môi trường nuôi cấy cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu bao gồm: dịch chiết khoai lang [81], dịch thủy phân lông gà [102], các nguồn nitơ vô cơ (ure, (NH4)2SO4, KNO3…) [76, 95, 98, 100] Việc bổ sung 8 g/L dịch thủy phân lông gà của Taskin và cộng sự (2011) đã cho thấy sự gia tăng đáng kể về sinh khối và hàm lượng carotenoid, tương ứng tăng 36% và 53% so với mẫu đối chứng của chủng Rhodotorula glutinis MT-5 [102] Ngoài ra, khi (NH 4 ) 2 SO 4 được sử dụng làm nguồn nito bởi El-Banna và cộng sự (2012), khả năng tích lũy
15 carotenoid cao hơn 20% so với nguồn nito là peptone hay ure , cụ thể đạt 337 àg/g sinh khối khô [101]
Sản xuất carotenoid bằng chất thải công nghiệp, nông nghiệp phụ thuộc vào nguồn gốc, thành phần dinh dưỡng, khoáng chất, vi chất… cũng như trữ lượng của từng loại Xác định thành phần, tỷ lệ, vai trò của từng nhân tố là công việc rất quan trọng để nâng cao khả năng sinh tổng hợp carotenoid và đa dạng hóa phổ sản phẩm từ nấm men
1.4.2.2 Điều kiện lên men a) Tốc độ sục khí
Do cơ chế sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men là hiếu khí nên việc khảo sát tốc độ dòng khí trong nuôi cấy nấm men là một yếu tố thiết yếu để quá trình lên men diễn ra tốt nhất Aksu và cộng sự (2005) đã khảo sát ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp carotenoid của chủng
R.mucilaginosa, nhận thấy hàm lượng carotenoid tăng lên đáng kể khi tăng tốc độ sục khớ, và hàm lượng carotenoid cao nhất đạt 19,8 àg/g sinh khối khụ với tốc độ sục khí là 2.4 vvm [104] b) Nhiệt độ
Nhiệt độ là một tham số khác cần xét đến trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men do nó ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật, tốc độ chuyển hóa các chất và có khả năng biến đổi các con đường sinh tổng hợp, bao gồm cả sinh tổng hợp carotenoid Theo Hayman và cộng sự (1974), nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid, do đó ảnh hưởng đến hàm lượng carotenoid trong vi sinh vật [105] Nhiệt độ quá cao, hoặc quá thấp sẽ làm tăng mức độ biểu hiện gen crtB dẫn đến ức chế quá trình sinh tổng hợp carotenoid [106] Malisorn và Suntornsuk (2008) đã tối ưu nhiệt độ của quá trình sinh tổng hợp carotenoid ở R glutinis là 30°C cho hàm lượng carotenoid đạt 201 àg/g sinh khối khụ [87] Tiến hành khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và năng suất sinh tổng hợp carotenoid của chủng R.mucilaginosa,
Elsanhoty và cộng sự (2017) nhận thấy 28ºC là nhiệt độ tối ưu để phát triển sinh khối và sinh tổng hợp carotenoid [107] c) pH
Giá trị pH ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, tốc độ hòa tan các chất dinh dưỡng và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật Trong quá trình lên men pH luôn biến đổi theo sự phát triển trong các giai đoạn khác nhau Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng: pH có ảnh hưởng đến việc hình thành các hợp chất, làm biến đổi hệ enzyme trong con đường sinh tổng hợp carotenoid [110, 111]
Theo Carla Dias và cộng sự (2015), pH tối ưu để phát triển sinh khối bởi nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides NCYC 921 là 4.0 và để sinh tổng carotenoid là 5.0 [110] Dựa trên sự khác biệt này, công trình cũng đã tiến hành lên men hai giai đoạn để phát triển sinh khối và nâng cao khả năng tích lũy carotenoid Kết quả cho thấy rằng khi thiết lập thông số pH = 4.0 ở giai đoạn sinh trưởng và pH = 5.0
Các phương pháp lên men sinh tổng hợp carotenoid
Lên men theo mẻ là phương pháp lên men truyền thống đơn giản Theo kỹ thuật này, môi trường lên men được chuẩn bị, thanh trùng, làm nguội rồi được cấy giống vi sinh vật Giống vi sinh vật và cơ chất được cấp một lần vào trong quá trình lên men Kết thúc quá trình lên men, người ta sẽ tiến hành tháo dịch để tách thu sản phẩm chung một lần khi kết thúc quá trình Như vậy quá trình lên men được bắt đầu khi cấp giống và kết thúc vào thời điểm thu dịch lên men [119] Ưu điểm: Đơn giản, dễ vận hành, dễ thao tác, giảm nhiễm tạp
17 Nhược điểm: Hiệu suất thường không cao, đặc biệt trong quá trình lên men sử dụng nồng đô cơ chất cao hoặc thành phần môi trường lên men có chất ức chế quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm
Là kỹ thuật vận hành liên tục quá trình lên men, với việc bổ sung lên tục dịch lên men mới vào và tháo liên tục lượng dịch đã lên men tương ứng ra khỏi thiết bị lên men, trong điều kiện xác lập và duy trì các thông số công nghệ lên men khác trong dải công nghệ tối ưu [119] Ưu điểm: tăng hiệu suất sinh tổng hợp so với lên men theo mẻ, thể tích dịch lên men trong thiết bị lên men được duy trì ổn định
Nhược điểm: quá trình vận hành phức tạp, kéo dài, nồng độ sản phẩm trong dịch không cao
Vận dụng cách thức lên men liên tục để sản xuất carotenoid có rất ít, đa số các bài nghiên cứu đều về chủng Phaffia rhodozyma sử dụng cơ chất là than bùn, mục tiêu sản phẩm là astaxanthin Để sản xuất β-caroten, một nghiên cứu sản xuất carotenoid trong chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae đột biến SM14 với nồng độ glucose duy trì 20 g/L là nguồn carbon, thu được hàm lượng 28.73mg/L β-caroten, năng suất thu được là 1.62mg/L.h [120]
Lên men bán liên tục
Lên men bán liên tục là kỹ thuật lên men, trong đó người ta xác lập ít nhất một hay một vài thông số công nghệ “đầu vào” hoặc “đầu ra” ở chế độ liên tục Kỹ thuật lên men này cho phép kiểm soát động học của quá trình lên men tốt hơn và đạt hiệu quả chuyển hóa cơ chất/sản phẩm cao hơn, trong điều kiện khai thác năng lực thiết bị cũng được cải thiện hơn [119]
Việc bổ sung cơ chất có thể kéo dài pha phát triển và pha cân bằng của vi sinh vật, điều này dẫn đến sự tăng nhanh về sinh khối và năng suất chuyển hóa của vi sinh vật Hơn nữa, trong quá trình lên men có thể thay đổi thành phần dịch cấp dưỡng phù hợp từng giai đoạn phát triển của vi sinh vật Đồng thời, kỹ thuật này cũng đã khéo léo tránh được các nhược điểm của kỹ thuật lên men theo mẻ và lên men liên tục như hạn chế về cơ chất, thời gian lên men ngắn hơn lên men liên tục để thu được lượng sản phẩm mong muốn
Dias và cộng sự (2019) đã cấp dưỡng một lần duy nhất ở các thời điểm khác nhau với chủng Rhodotorula mucilaginosa sản xuất carotenoid từ các phụ phẩm nông nghiệp (mật mía, rượu ngâm ngô và glycerol thô) Hàm lượng carotenoid trong quá trình lên men theo mẻ trong môi trường chứa mật rỉ và rượu ngô đạt tối đa 1248,5 μg/L (152,5 μg/g), với nồng độ sinh khối 7,9 g/L Quá trình lên men bán liên tục cấp dưỡng bằng môi trường nuôi cấy tuy không làm tăng khả năng tích lũy carotenoid, nhưng đã tăng lượng sinh khôi thu được dẫn đến hàm lượng carotenoid tổng tăng lên 2,99 lần so với lên men theo mẻ [121]
Mục tiêu nghiên cứu
18 Nhằm tận thu nguồn phụ phẩm từ ngành công nghiệp chế biến tôm, nghiên cứu này tập trung khảo sát quá trình lên men cơ chất NAG từ dịch thủy phân chitin nhằm sinh tổng hợp carotenoid với hi vọng tăng giá trị kinh tế cho phụ phẩm công nghiệp đồng thời giảm ô nhiễm môi trường gây ra từ nguồn phế thải này Đây cũng là công trình đầu tiên nghiên cứu sử dụng NAG làm cơ chất để sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men
Mục tiêu nghiên cứu đặt ra bao gồm:
- Lựa chọn chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ cơ chất NAG
- Nâng cao khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ chủng đã chọn.
Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên nguồn cơ chất NAG
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
- Nâng cao khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp carotenoid trên dịch thủy phân chitin
Vật liệu
Các chủng nấm men thuộc bộ sưu tập vi sinh vật, Phòng thí nghiệm lên men, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội
Bảng 2.1.Các chủng nấm men sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Toàn bộ thiết bị, dụng cụ trong thí nghiệm và hóa chất nghiên cứu được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm lên men, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Tủ nuôi, Taitec, Nhật Bản
• Thiết bị thanh trùng, Hirayama, Nhật Bản
• Máy đo OD, Novaspec III, Anh
• Máy đọc khay vi thể, Thermo Scientific, Mỹ
• Thiết bị ly tâm Sorvall Legend XIR, Thermo Scientific, Mỹ
• Máy Agilent 1200 Series Gradient HPLC, Mỹ
• Tủ sấy, Thermo Scientific, Mỹ
• Bể ổn nhiệt, Thermol Robo, Nhật Bản
• Bình tam giác có khía (thể tích 250 mL), Việt Nam
• Ống đong, qua cấy, micropipette, đĩa petri và các dụng cụ thí nghiệm vi sinh cơ bản khác, Việt Nam
• Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy: glucose, NAG, yeast extract, peptone, agar của Xilong (Trung Quốc)
• Hóa chất dùng trong phân tích: acetone, HCl, nước deion, … của Xilong (Trung Quốc) và Fisher (Hoa Kỳ)
Môi trường nuôi cấy
• Môi trường hoạt hóa (môi trường YPD agar) gồm: 20 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 20 g/L agar
• Môi trường nhân giống (môi trường YPD) gồm: 20 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone
• Môi trường lên men: 20 – 50 g/L NAG, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone
Toàn bộ môi trường được thanh trùng tại 110ºC trong 30 phút trước khi tiến hành nuôi cấy
• Dịch thủy phân chitin với hàm lượng đường khử 10 g/L được cung cấp bởi phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1 Nuôi cấy trên đĩa thạch
Môi trường YPD được thanh trùng ở 110ºC, trong 30 phút, sau đó để nguội đến 60 - 70ºC và tiến hành phân phối vào các đĩa petri
Các chủng nấm men được bảo quản trong 15% glycerol tại -21ºC trước khi tiến hành cấy ria trên môi trường thạch Nuôi trong đĩa thạch ở 25 ºC trong 24 h, rồi tiến hành bảo quản chủng giống ở 4ºC
2.3.1.2 Nuôi trên môi trường lỏng
• Nhân giống: các chủng nấm men được nhân giống trong 30 mL môi trường YPD lỏng ở 25ºC, tốc độ lắc 125 rpm, trong 24 h
• Lên men trong bình tam giác: 50 mL môi trường lên men được chuẩn bị trong các bình tam giác có khía 250 mL, thanh trùng ở 110ºC trong 30 phút Sinh khối từ bình nhân giống được cấp vào lên men với OD660nm khởi điểm là 1 Điều kiện lên men ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, trong 5 – 7 ngày
Lựa chọn nấm men có khả năng sinh tổng hợp carotenoid cao trên cơ chất NAG
Thí nghiệm được tiến hành trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men gồm 20 g/L NAG được thanh trùng ở 110ºC trong 30 phút
Tiến hành sấy khô sinh khối xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β- carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Điều kiện lên men: 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, trong 5 ngày
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
2.3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống
Khảo sát với OD660nm khởi điểm là 0.5; 1; 1.5; 2 trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với 30 g/L NAG Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách xác định OD660nm hàng ngày, cho tới khi chủng bước vào pha suy vong thì tiến hành thu mẫu, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Điều kiện khảo sát: 25ºC, tốc độ lắc 125 rpm trong 3 – 4 ngày
2.3.3.2 Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của pH đến sự tích lũy carotenoid được thực hiện trong khoảng từ 4.0 đến 10.0 và được kiểm soát bằng cách sử dụng H3PO4 4M 4 - 5h một lần trong giai đoạn log và điều chỉnh 24h một lần ở pha cân bằng cho đến khi kết thúc lên men Thí nghiệm được tiến hành trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với 30 g/L NAG Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách đo OD660nm hàng ngày, cho tới khi chủng bước vào pha suy vong thì tiến hành thu mẫu, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1 trong 5 – 7 ngày
2.3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng NAG
NAG với hàm lượng 0 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/L được bổ sung vào các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách đo OD660nm hàng ngày, phân tích hàm lượng
22 sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Mẫu được thu khi chủng sử dụng hết NAG Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH 5 trong 5 – 7 ngày
2.3.3.4 Động học của quá trình lên men Động học của quá trình lên men được khảo sát trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với 30 g/L NAG Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách đo OD660nm hàng ngày, cho tới khi chủng bước vào pha suy vong thì tiến hành thu mẫu, lấy mẫu theo ngày, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH 5 trong thời gian 5 – 7 ngày
Nâng cao khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
2.3.4.1 Khảo sát hàm lượng glucose cấp vào
Glucose cấp vào được khảo sát trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường chứa 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone Hàm lượng glucose khảo sát gồm: 80 g/L, 100 g/L, 120 g/L, 150 g/L
Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách đo OD660nm hàng ngày, cho tới khi chủng bước vào pha suy vong thì tiến hành thu mẫu, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1 trong 3 – 5 ngày
2.3.4.2 Khảo sát kỹ thuật lên men sử dụng 2 nguồn carbon
Kỹ thuật lên men bổ sung cơ chất đồng thời và bổ sung cơ chất gián đoạn được khảo sát trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường chứa 80 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone NAG với hàm lượng 10 g/L được bổ sung ngày từ đầu tiên (lên men đồng thời) hoặc được bổ sung khi chủng sử dụng hết glucose (lên men gián đoạn)
Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách đo OD660nm hàng ngày, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Mẫu được thu khi chủng sử dụng hết đường trong dịch lên men. Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH 5 trong 5 – 7 ngày
2.3.4.3 Lên men 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn
Thí nghiệm được tiến hành trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường gồm 80 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone NAG được bổ sung vào dịch lên men tại thời điểm 96h với hàm lượng 30 và 50 g/L
23 Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách đo OD660nm hàng ngày, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Mẫu được thu khi chủng sử dụng hết đường trong dịch lên men Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH 5 trong thời gian 10 – 12 ngày
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp carotenoid trên dịch thủy phân chitin
Khảo sát trên dịch thủy phân chitin trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với 10 g/L đường khử Tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng bằng cách xác định OD660nm hàng ngày, phân tích hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng β-carotene, carotenoid và hàm lượng đường sót Mẫu được thu khi chủng sử dụng hết đường trong dịch lên men Điều kiện khảo sát ở 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH 5 trong 3 – 4 ngày.
Phương pháp phân tích
Xác định hàm lượng sinh khối khô
Sinh khối thu được sau lên men được thu hồi bằng ly tâm ở 8000×g trong 10 phút rồi rửa 3 lần với nước cất Sấy khô các đĩa đến khối lượng không đổi, cân và ghi khối lượng đĩa, chuyển sinh khối sau khi đã rửa vào đĩa, tiếp tục sấy đến khối lượng không đổi trong tủ sấy ở 60ºC, cân và ghi khối lượng tổng Hàm lượng sinh khối được xác định theo công thức [122]:
𝑚: hàm lượng sinh khối (g/L) 1000: hệ số chuyển đổi từ mL sang L
𝑚 𝑠𝑎𝑢 : khối lượng của đĩa peptri chứa sinh khối (g)
𝑚 𝑡𝑟ướ𝑐 : khối lượng của đĩa peptri (g) 𝑉: thể tích dịch lên men được ly tâm (mL)
Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử dinitrosalicylic axit (DNS) [123] Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử khi đo tại bước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose, NAG tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu thí nghiệm
• Xây dựng đường chuẩn glucose/ NAG với nồng độ glucose/ NAG là 0 – 1 mg/mL
Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm
Hút 0.6 mL DNS vào ống eppendorf
Bổ sung 0.3 mL nước cất Bổ sung 0.3 mL mẫu phân tích
Phản ứng ở 95 - 100ºC trong 5 phút (đun cách thủy) Làm nguội mẫu Đo OD540nm, ghi lại kết quả đo được
Dựa vào đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích
Xác định hàm lượng β-carotene và carotenoid
Hàm lượng các carotenoid được xác định bằng phương pháp đo quang với carotenoid tổng số được xác định ở bước sóng cực đại 470nm với hệ số hấp thụ
𝐴 1𝑐𝑚 1% = 2140 trong acetone [124] β-carotene được định lượng theo phương pháp đo quang ở bước sóng cực đại 450nm dựa trên đường chuẩn β-carotene trong acetone ở 450nm [117], [124]
• Cân chính xác 0.1 g sinh khối khô, bổ sung 1mL HCl 4M, ủ 65ºC trong 1 h
• Ly tâm 12,000 rpm trong 10 phút, loại bỏ dịch lỏng, thu sinh khối đã được phá vỡ thành tế bào
• Bổ sung 1.5mL acetone, vortex mạnh để tách chiết β-carotene và carotenoid từ sinh khối
• Ly tâm 12,000 rpm trong 5 phút, loại bỏ cặn và thu dịch nổi
• Bổ sung 0.1 g Na 2 SO 4 vào mỗi mẫu, ly tâm 12,000 rpm trong 5 phút, thu pha lỏng
• Đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 450nm, 470nm và ghi kết quả Hàm lượng β-carotene được xác định theo công thức:
𝐶 𝛽 : hàm lượng β-carotene trong mẫu (àg/g) 𝑎: hàm lượng β-carotene tớnh theo đường chuẩn (àg) 𝑉: thể tích dịch chiết acetone (mL)
𝑓: hệ số pha loãng mẫu
25 𝑚: hàm lượng sinh khối khô (g/L) Hàm lượng carotenoid tổng số được xác định theo công thức [125]:
𝐶 𝑇 : hàm lượng carotenoid tổng số (àg/g) 𝑉: thể tích dịch chiết acetone (mL) 𝐴: độ hấp thụ quang ở bước sóng 470nm 𝑓: hệ số pha loãng mẫu
𝑚: hàm lượng sinh khối khô (g/L) 2140: hệ số hấp thụ của carotenoid trong acetone [124]
Năng suất β-carotene, carotenoid được xác định theo công thức:
𝐶 𝛽 : hàm lượng β-carotene trong mẫu (àg/g)
𝑌 𝑇 : năng suất carotenoid tổng số (àg/L)
𝐶 𝑇 : hàm lượng carotenoid tổng số (àg/g)
2.4.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography - HPLC)
Dịch chiết carotenoid trong acetone được lọc qua màng cú kớch thước 0.2 àm để phân tích thành phần carotenoid Phân tích được thực hiện trên hệ thống HPLC Agilent 1200, cột C18 (250 ì 4.6 mm, 5 àm, Phenomenex, USA) với detector DAD (Diode Array Detector) Pha động là hệ dung môi acetone (dung môi A) và nước (dung môi B) Bước sóng hấp thụ là 450 nm
• Hút 1 mL dịch canh trường lên men, ly tâm ở 8000×g trong 10 phút rồi rửa 3 lần với nước cất
• Bổ sung bi vào cặn sinh khối đã rửa, vontex mạnh để phá vỡ tế bào
• Bổ sung 1.2 mL acetone, vortex mạnh để tách chiết β-carotene và carotenoid từ sinh khối
• Ly tâm 12,000 rpm trong 5 phút, loại bỏ cặn và thu dịch nổi
• Lọc dịch nổi qua màng 0.2 μm thu được dịch chiết
• Dịch chiết được phân tích thành phần carotenoid bằng HPLC
26 Đường chuẩn β-carotene trong acetone được dựng trong dải nồng độ 1 – 10 àg/mL Điều kiện phân tích:
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần nhằm đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả Số liệu kết quả được xử lý và biểu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel.
Phương pháp tính toán
Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật gồm 4 giai đoạn: pha tiềm phát, pha lũy thừa (pha log), pha cân bằng và pha suy vong Tốc độ sinh trưởng riêng được xác định trong pha lũy thừa theo công thức [126]:
𝜇: tốc độ sinh trưởng riêng (h -1 ) 𝑋: hàm lượng sinh khối tại thời điểm 𝑡 (g/L)
𝑋 0 : hàm lượng sinh khối tại thời điểm 𝑡 0 (g/L) 𝑡: thời gian lên men đạt hàm lượng sinh khối 𝑋 (h)
𝑡 0 : thời gian lên men đạt hàm lượng sinh khối 𝑋 0 (h)
Hiệu suất sinh trưởng được xác định bằng tỷ lệ sinh khối và hàm lượng cơ chất tiêu thụ [127]:
Thời gian (phút) Hệ dung môi A (%) Hệ dung môi B (%)
∆𝑋: chênh lệch hàm lượng sinh khối giữa 2 lần đo (g)
∆𝑆: chênh lệch hàm lượng cơ chất giữa 2 lần đo (g)
Tốc độ tiêu thụ cơ chất
Tốc độ tiêu thụ cơ chất được định nghĩa là mức tiêu thụ cơ chất nhằm tạo một hàm lượng sinh khối trong khoảng thời gian xác định, biểu diễn bằng công thức [128]:
𝑞 𝑠 : tốc độ tiêu thụ cơ chất (g/g/h) 𝜇: tốc độ sinh trưởng riêng (h -1 )
Tuyển chọn chủng nấm men sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
Tập hợp 18 chủng nấm men thuộc bộ sưu tập chủng của phòng thí nghiệm được nuôi cấy trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men chứa
20 g/L NAG, điều kiện nuôi cấy gồm: OD660nm khởi điểm là 1, nhiệt độ 25ºC, lắc
125 rpm trong 120 h Theo các nghiên cứu trước đây, quá trình sinh tổng hợp β- carotene và carotenoid sinh ra trong pha log và đạt đỉnh ở cuối pha log, đầu pha cân bằng nên mẫu được thu khi chủng bước sang pha cân bằng [113, 125] Các mẫu thí nghiệm sau 120 h lên men lên men được thu nhận để đánh giá khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid trong sinh khối
Hình 3.1 Hàm lượng β-carotene và carotenoid của các chủng khảo sát trên môi trường chứa 20 g/L NAG sau 120 h lên men
Kết quả phân tích hàm lượng β-carotene và carotenoid thể hiện trên Hình 3.1 cho thấy: 18 chủng nấm men đều có khả năng sinh tổng hợp β-carotene và carotenoid trên nguồn cơ chất là NAG với hàm lượng β-carotene từ 41.59 đến 428.78 àg/g sinh khối khụ và hàm lượng carotenoid từ 45.95 đến 472.07 àg/g sinh khối khô Mata-Gomez và cộng sự đã chia các chủng sinh tổng hợp carotenoid thành ba nhóm dựa trên mức độ tích lũy carotenoid: thấp (dưới 100 μg/g), trung bình (101-500 μg/g) và cao (trên 500 μg/g) [130] Theo đó, các chủng nấm men trong nghiên cứu này đa số cho khả năng sinh tổng hợp carotenoid thuộc nhóm trung bình
Kết quả phân tích cũng chỉ ra các chủng cho khả năng sinh tổng hợp β- carotene và carotenoid cao nhất theo thứ tự lần lượt là LN1, DC6, DH1, NH2, Q đều thuộc loài Sporidiobolus pararoseus Riêng chủng S pararoseus Q có khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid cao nhất trên môi trường chứa NAG, tương ứng là 428.78 àg/g sinh khối khụ và 472.07 àg/g sinh khối khụ
L1 HL1 HU HHD NH3 HD2 NH2 DC6 O1 Q DH1 LN1 DC2 KLB1 KLB2 RDD DG CS1 DL3 β- ca ro te nne , C ar o te no id (àg /g) β-carotene (àg/g) Carotenoids (àg/g)
R mucilaginosa R ruineniae C slooffiae S pararoseus R toruloides R paludigenum
Hình 3.2 Hàm lượng β-carotene và carotenoid phân tích bằng HPLC
Theo Li và cộng sự (2017), kết quả phân tích bị ảnh hưởng bởi một số carotenoid khác có bước sóng hấp phụ cực đại nằm lân cận với bước sóng hấp phụ của β-carotene [117] Do đó để kiểm tra tính chính xác, nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích hàm lượng β-carotene và carotenoid của 5 chủng S pararoseus NH2, DC6, Q, DH1, LN1 bằng phương pháp HPLC Theo kết quả Hình 3.2, chủng S pararoseus Q có khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid cao nhất tương ứng là
257.85 àg/g sinh khối khụ và 439.9 àg/g sinh khối khụ tương ứng gấp khoảng 2.03, 5.79, 1.36 và 1.40 lần so với chủng S pararoseus NH2, LN1, DC6 và DH1
Vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn chủng S pararoseus Q và sử dụng phương pháp đo quang cho các thí nghiệm tiếp theo.
Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid của S pararoseus Q trên NAG
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu về quá trình lên men sinh tổng hợp carotenoid, cũng đã có công bố trên nấm men đỏ Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid trên nguồn cơ chất là NAG Chính vì vậy, việc nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid trên môi trường chứa NAG là cần thiết để nâng cao hàm lượng carotenoid Nhằm tối ưu hóa quá trình lên men sinh tổng hợp carotenoid từ NAG, một số điều kiện được khảo sát như sau: khảo sát tỷ lệ cấp giống, pH, hàm lượng NAG Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
Trong quá trình lên men, tỷ lệ cấp giống là yếu tố quan trong quyết định tốc độ sinh trưởng, hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm và thời gian lên men Trong nghiên cứu này, tỷ lệ cấp giống được khảo sát với OD660nm khởi điểm là 0.5; 1; 1.5;
2 trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với 30 g/L NAG Điều kiện nuôi cấy gồm: nhiệt độ 25ºC, lắc 125 rpm, pH = 6 trong 80 h
NH2 LN1 DC6 Q DH1 β-carotenne, carotenoid (àg/g) β-carotene (àg/g) Carotenoid (àg/g)
Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng của S pararoseus Q với tỷ lệ cấp giống khác nhau
Kết quả Hình 3.3 chỉ ra rằng chủng sinh trưởng nhanh trong 24 h đầu lên men và tiến vào pha cân bằng tại thời điểm 30 h Với OD660nm khởi điểm là 1, chủng có khả năng sinh trưởng mạnh nhất (tốc độ sinh trưởng là 0.11 h -1 ) với sinh khối tối đa đạt 49.65 trong 72 h nuôi cấy (Hình 3.3) Khi cấp giống với OD660nm khởi điểm là 0.5, chủng phát triển chậm nhất với tốc độ sinh trưởng là 0.08 h -1 , điều này được giải thích bởi khi giống được cấp vào quá ít sẽ mất nhiều thời gian để thích nghi phát triển hơn so với các tỉ lệ cấp giống cao hơn cũng như mất nhiều thời gian hơn để tổng hợp sản phẩm
Hình 3.4 Hàm lượng β-carotene và carotenoid của S pararoseus Q với tỷ lệ cấp giống khác nhau sau 80 h lên men
Kết quả Hình 3.4 cho thấy, hàm lượng sinh khối khô ở cả 4 mẫu dao động trong khoảng 4 g/L, tuy nhiên về khả năng sinh tổng hợp β-carotene và carotenoid lại có sự khác biệt đối với các mẫu có OD khởi điểm khác nhau Khi chủng được cấp với mật độ cao, OD660nm khởi điểm là 1.5 và 2, tốc độ tiêu thụ cơ chất nhanh tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp β-carotene và carotenoid còn thấp Với OD660nm khởi điểm là 1, chủng cho hàm lượng β-carotene và carotenoid cao nhất, tương ứng là 435.32 ug/g sinh khối khô và 460.86 ug/g sinh khối khô, gấp khoảng 1.64
Sinh khối khô (g/L) β-carotene, Carotenoid (àg/g)
OD 660nm khởi điểm β-carotene (àg/g) Carotenoids (àg/g) Sinh khối khụ (g/L)
31 lần mẫu OD660nm khởi điểm là 0.5, gấp khoảng 1.24 lần mẫu OD660nm khởi điểm là 1.5 và gấp khoảng 1.33 lần mẫu OD660nm khởi điểm là 2
Do đó, OD660nm khởi điểm là 1 được lựa chọn để sinh tổng hợp β-carotene và carotenoid ở những thí nghiệm tiếp theo Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid trong tế bào nấm men Trong quá trình lên men từ NAG, nhóm nghiên cứu nhận thấy sự tăng lên của pH trong quá trình lên men, bởi khi NAG được vận chuyển vào trong tế bào chất, qua một số quá trình chuyển hóa để tạo ra glucosamine 6-phosphate, sau đó bằng cách khử amin để tạo ra fructose 6-phosphate rồi đi vào con đường đường phân [48] Như vậy NH3 đã được giải phóng trong quá trình chuyển hóa của NAG dẫn đến pH của môi trường lên men tăng lên, vì vậy để duy trì pH, H3PO4
4M được bổ sung đều đặn 4 – 5 h/lần trong giai đoạn pha log và 24 h/lần trong pha cân bằng
Trong thí nghiệm này, pH được khảo sát trong dải từ 4 – 10 trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với 30 g/L NAG Điều kiện lên men gồm: tốc độ lắc 125 rpm, nhiệt độ 25ºC, OD660nm khởi điểm là 1 Kết quả đường cong sinh trưởng của chủng được thể hiện ở hình sau:
Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng của chủng S pararoseus Q ở pH khác nhau
Kết quả thí nghiệm (Hình 3.5) chỉ ra chủng S pararoseus Q cần 10 h đầu để thích nghi và không cho thấy sự biến đổi về giá trị sinh khối OD660nm giữa các giá trị pH khác nhau trong khoảng thời gian này Với mẫu pH từ 7 đến 10, sinh khối đạt cực đại sau 24 h lên men với tốc độ tăng trưởng riêng lần lượt là 0.13, 0.11, 0.12 và 0.12 h -1 và bước vào pha suy vong ngay sau đó Mặt khác, ở điều kiện pH từ 4 – 6, chủng sinh trưởng mạnh mẽ hơn và đạt đỉnh pha log sau 34 h với tốc độ tăng trưởng riêng lần lượt là 0.16, 0.15 và 0.4 h -1 Sau đó chủng đi vào pha cân bằng rồi chuyển vào pha suy vong sau 72 h lên men Sinh khối OD660nm cao nhất thu được ở mẫu pH 4 là 55.45 tại thời điểm 72 h, gấp khoảng 1.09 lần mẫu ở pH 5 và khoảng 1.33 lần mẫu ở pH 6
Thời gian (giờ) pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10
Hình 3.6 Hàm lượng β-carotene và carotenoid của chủng S pararoseus Q ở pH khác nhau (pH 4 – 6 được thu tại thời điểm 120 h, pH 7 – 10 được thu tại thời điểm 30 h)
Phân tích hàm lượng β-carotene và carotenoid nhận thấy, ở ngưỡng pH từ 4 đến 6 chủng có khả năng tích lũy cao hơn so với ngưỡng pH từ 7 đến 10, với mức tích lũy cao nhất được quan sát thấy ở pH 5 với hàm lượng β-carotene và carotenoid lần lượt là 466.75 àg/g sinh khối khụ và 500.47 àg/g sinh khối khụ (Hỡnh 3.6) Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Saha và cộng sự (2015) lên men chủng S pararoseus từ dextrose ở pH 5 cho hàm lượng β-carotene là cao nhất đạt 15.4 mg/L
[131] Cũng theo Latha và cộng sự (2005), giá trị pH 5 là điều kiện tối ưu cho hoạt động của hệ enzyme sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men [132]
Do đó với mục tiêu thu nhận chủng có khả năng tích lũy cao nhất, pH = 5 được lựa chọn để thực hiện những khảo sát tiếp theo Ảnh hưởng của hàm lượng NAG đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid
Nguồn carbon và nito là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid [130, 131] Trong nghiên cứu này, NAG ngoài đóng vai trò là nguồn carbon, đồng thời là nguồn nito, cung cấp dinh dưỡng cho vi sinh vật
Thí nghiệm này tiến hành khảo sát NAG với dải hàm lượng từ 10 – 50 g/L, mẫu đối chứng không bổ sung NAG, trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men Điều kiện lên men gồm: tốc độ lắc 125 rpm, nhiệt độ 25ºC,
OD660nm khởi điểm là 1, pH = 5
Sinh khối khô (g/L) β-carotene, Carotenoid (àg/g) pH β-carotene (àg/g) Carotenoids (àg/g) Sinh khối khụ (g/L)
Hình 3.7 Đường cong sinh trưởng của chủng S pararoseus Q ở hàm lượng
Theo kết quả trên Error! Reference source not found cho thấy chủng phát triển mạnh mẽ trong 24 h đầu và sinh khối OD660nm tăng dần khi hàm lượng NAG tăng tại thời điểm 24 h Tuy nhiên, ở hàm lượng từ 20 – 30 g/L chủng duy trì sinh trưởng và kéo dài pha cân bằng đến 120 và 144 h, còn lại các mẫu đều suy vong tại thời điểm trước 75 h Sinh khối OD660nm cao nhất thu được ở mẫu chứa 30 g/L NAG là 63.25 tại thời điểm 96 h
Hình 3.8 Tốc độ tiêu thụ NAG của chủng S pararoseus Q Đồ thị phân tích hàm lượng NAG trong lên men cho thấy NAG bắt đầu được tiêu thụ mạnh mẽ sau 24 h tương ứng với thời điểm kết thúc pha log (Hình 3.8) Ở hàm lượng 10 – 30 g/L, chủng tiêu thụ hoàn toàn NAG sau 72 – 144 h, với mẫu chứa 40 – 50 g/L NAG, chủng gần như không sử dụng nguồn cơ chất này Kết quả này cho thấy trong 24 h đầu, chủng sử dụng chủ yếu nguồn pepton và yeast extract cho quá trình sinh trưởng, sau đó, khi hai nguồn cơ chất này hết, chủng mới sử dụng NAG Ở hàm lượng 40 – 50 g/L NAG, chủng bước vào pha suy vong sau 24 h có thể do chủng bị ức chế bởi hàm lượng NAG
Thời gian (giờ) Đối chứng 10 g/L 20 g/L
Thời gian (giờ) Đối chứng 10 g/L 20 g/L
Hình 3.9 Hàm lượng β-carotene và carotenoid của chủng S pararoseus Q ở các hàm lượng NAG khác nhau
(mẫu đối chứng và 10 g/L NAG thu tại thời điểm 72 h, mẫu 20 g/L NAG thu tại thời điểm 120 h, mẫu 30 g/L NAG thu tại thời điểm 144 h, mẫu 40 và 50 g/L NAG thu tại thời điểm 48 h)
Kết quả phân tích β-carotene và carotenoid ở Hình 3.9 cho thấy, hàm lượng sinh khối có xu hướng tăng dần khi hàm lượng NAG tăng từ 0 – 30 g/L và giảm dần khi bổ sung NAG đến 50 g/L Theo đó, hàm lượng sinh khối cao nhất đạt 5.63 g/L với hàm lượng NAG được bổ sung là 30 g/L Khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid của chủng S pararoseus Q cho thấy khả năng tích lũy tăng dần khi hàm lượng NAG tăng từ 10 – 30 g/L, sau đó giảm dần khi tăng hàm lượng NAG đến
50 g/L Hàm lượng β-carotene và carotenoid cao nhất đều thu được ở hàm lượng NAG là 30 g/L với giỏ trị lần lượt đạt 523.47 àg/g sinh khối khụ và 583.28 àg/g sinh khối khô cao hơn khoảng 1.42, 1.28, 1.23, 1.43 và 1.58 lần so với các mẫu không bổ sung NAG hoặc với 10, 20, 40 và 50 g/L NAG tương ứng
Động học của quá trình lên men
Nâng cao khả năng sinh tổng hợp carotenoid từ NAG
Như kết quả của thí nghiệm trước, NAG được chủng S pararoseus Q sử dụng trong pha cân bằng, đồng thời β-carotene và carotenoid cũng được tích lũy nhiều trong giai đoạn này, ít được sử dụng nhằm mục đích tích lũy sinh khối Vì vậy, trong nghiên cứu này nhằm nâng cao hàm lượng sinh lối đồng thời khẳng định vai trò của NAG, nâng cao hàm lượng carotenoid tích lũy, nấm men S pararoseus Q được nuôi cấy theo 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: nâng cao sinh khối với nguồn cơ chất là glucose
- Giai đoạn 2: bổ sung NAG nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp β- carotene và carotenoid
Khảo sát hàm lượng glucose đầu vào
Nhằm nâng cao hàm lượng sinh khối, glucose được khảo sát với các hàm lượng 80 g/L, 100 g/L, 120 g/L, 150 g/L trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lên men với điều kiện gồm: nhiệt độ 25ºC, tốc độ lắc 125 rpm, OD660nm khởi điểm là 1 Kết quả được thể hiện ở Hình 3.12 như sau:
Hình 3.12 Động học sinh trưởng của chủng S pararoseus Q ở các hàm lượng glucose khác nhau (RS: reducing sugar)
Phân tích hàm lượng glucose cho thấy, chủng tiêu thụ glucose mạnh mẽ trong pha log và bước vào pha cân bằng khi tiêu thụ hết glucose Ở hàm lượng glucose
150 g/L, chủng có khả năng sinh trưởng yếu hơn so với các hàm lượng glucose thấp hơn, điều này có thể được lý giải là ở 150 g/L, chủng nấm men bị đã bị ức chế 1 phần dẫn tới sinh khối thấp hơn Sinh khối OD660nm đạt cao nhất là 233.5 của mẫu sử dụng 80 g/L glucose tại thời điểm 144 h
H àm l ượ ng g lu co se ( g /L )
Hình 3.13 Khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid của chủng S pararoseus Q ở hàm lượng glucose khác nhau (các mẫu được thu tại thời điểm 144 h)
Theo Hình 3.12, hàm lượng sinh khối tương đương nhau ở mẫu 80 – 120 g/L glucose và giảm ở hàm lượng 150 g/L glucose, trong đó ở hàm lượng 80 g/L glucose cho sinh khối cao nhất là 30.4 g/L Bên cạnh đó, khi xác định hàm lượng β-carotene và carotenoid của chủng ở các hàm lượng glucose khác nhau thì ở hàm lượng glucose là 80 g/L cho hàm lượng β-carotene và carotenoid cao nhất, tương ứng đạt 253.92 àg/g sinh khối khụ và 272.07 àg/g sinh khối khụ, gấp khoảng 1.20 lần so với hàm lượng glucose là 100 và 20 g/L, gấp 1.48 lần so với mẫu chứa 150 g/L glucose
Như vậy với mục đích nâng cao sinh khối, đồng thời tăng khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid, hàm lượng glucose 80 g/L được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo
Nghiên cứu kỹ thuật lên men sử dụng 2 nguồn carbon
Nhằm nâng cao khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid của chủng nấm men S pararoseus Q trên nguồn cơ chất là NAG, kỹ thuật lên men 2 nguồn carbon đã được sử dụng với 2 quá trình:
- Lên men sử dụng 2 nguồn carbon bổ sung đồng thời, glucose và NAG sẽ được bổ sung đồng thời vào dịch lên men
- Lên men sử dụng 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn, NAG sẽ được bổ sung vào dịch lên men sau khi chủng nấm đã sử dụng hết glucose có trong môi trường
Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác với điều kiện lên men là: môi trường chứa môi trường lên men với 80 g/L glucose, 10 g/L NAG, nhiệt độ 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH = 5; với mẫu đối chứng 80 g/L glucose
Sinh khối khô (g/L) β-carotene, Carotenoid (àg/g)
Hàm lượng glucose (g/L) β-carotene (àg/g) Carotenoid (àg/g) Sinh khối khụ (g/L)
Hình 3.14 Động học sinh trưởng quá trình lên men sử dụng 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn và đồng thời của chủng S pararoseus Q
Phân tích động học sinh trưởng của quá trình lên men (
Hình 3.14) cho thấy, tốc độ sinh trưởng của mẫu kiểm chứng, lên men đồng thời và lên men gián đoạn có sự tương đồng ở 24 h đầu của quá trình lên men Sau
24 h, ở mẫu đối chứng và lên men gián đoạn chủng tiếp tục sinh trưởng mạnh với tốc độ sinh trưởng riêng là 0.056 h -1 Hàm lượng glucose được tiêu thụ hoàn toàn vào giờ thứ 96 và NAG được bổ sung vào môi trường lên men với hàm lượng 10 g/L tại thời điểm này Từ 96 – 120 h của quá trình lên men gián đoạn, chủng duy trì ở pha cân bằng, vì vậy, một lần nữa khẳng định chủng chỉ sử dụng NAG để duy trì pha cân bằng chứ không được sử dụng để phát triển sinh khối và quá trình lên men kết thúc ở 120 h Trong khi đó, với quá trình lên men đồng thời, chủng sinh trưởng chậm hơn sau 24 h đầu lên men, và quá trình lên men kéo dài đến 144 mới sử dụng hết lượng đường có trong môi trường
Hình 3.15 Hàm lượng β-carotene và carotenoid của chủng S.pararoseus Q ở các quá trình lên men
200 220 240 260 280 300 320 340 Đối chứng Lên men gián đoạn
Sinh khối khô (g/L) β-carotene, Carotenoid (àg/g) β- caroten (àg/g) Carotenoid (àg/g) Sinh khối khụ (g/L)
OD LM đồng thời OD đối chứng
OD LM gián đoạn Đường khử LM đồng thời Đường khử đối chứng Đường khử LM gián đoạnNAG 10 g/L
(mẫu đối chứng thu tại thời điểm 96 h, mẫu lên men gián đoạn thu tại thời điểm
120h, mẫu lên men đồng thời thu tại thời điểm 144h)
Kết quả phân tích về khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid cho thấy, quá trình lên men gián đoạn, cho hàm lượng β-carotene và carotenoid cao nhất tương ứng là 260.63 àg/g sinh khối khụ và 317.39 àg/g sinh khối khụ (Hỡnh 3.15) Bờn cạnh đó, hàm lượng β-carotene và carotenoid ở mẫu đối chứng và mẫu lên men đồng thời cho kết quả tương đương nhau, tuy nhiên hàm lượng sinh khối khô ở mẫu lên men đồng thời thấp hơn 1.13 lần so với mẫu đối chứng Điều này được Min và cộng sự (2020) giải thích rằng, trong quá trình chuyển hóa, NAG sẽ bị ức chế khi có mặt của hàm lượng lớn glucose, vì vậy không chỉ kéo dài thời gian lên men mà còn làm giảm sinh khối so với mẫu đối chứng [136]
Từ những kết quả trên, quá trình lên men 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn được lựa chọn để nâng cao hàm lượng sinh khối cũng như tăng khả năng tích lũy carotenoid trên nguồn cơ chất là NAG của chủng S pararoseus Q
Lên men sử dụng 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn
3.3.3.1 Lên men sử dụng 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn với hàm lượng 30 g/L NAG
Theo kết quả khảo sát ở mục 3.2.1, hàm lượng 30 g/L NAG là lựa chọn tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ S pararoseus Q trên nguồn cơ chất là NAG, vì vậy, quá trình lên men gián đoạn sử dụng 2 nguồn carbon được tiến hành và khảo sát với hàm lượng NAG được bổ sung vào giai đoạn 2 là 30 g/L Thí nghiệm được thưc hiện theo 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: chủng S pararoseus Q được lên men trong môi trường chứa 80 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone
- Giai đoạn 2: 30 g/L NAG được bổ sung vào quá trình lên men khi chủng sử dụng hết glucose ở giai đoạn 1
Hình 3.16 Động học sinh trưởng của quá trình lên men sử dụng 2 nguồn carbon bổ sung gián đoạn với 30 g/L NAG của chủng S pararoseus Q
0 50 100 150 200 250 hà m l ượ ng g lu co se , N A G ( g /L )
OD KC OD G80N30 Đường khử KC Đường khử G80N30NAG 30
(KC: mẫu kiểm chứng 80 g/L glucose, G80N30: mẫu chứa 80 g/L glucose và 30 g/L NAG, NAG 30: hàm lượng NAG được sử dụng) Điều kiện thực hiện thí nghiệm: nhiệt độ 25ºC, tốc độ lắc 125rpm, OD660nm khởi điểm là 1, pH = 5
Khảo sát quá trình sinh tổng hợp carotenoid trên dịch thủy phân chitin
Sau khi khi tiến hành khảo sát trên nguồn cơ chất là NAG – sản phẩm của dịch thủy phân chitin, nghiên cứu được tiến hành trên dịch thủy phân nhằm đánh giá sự sinh trưởng của chủng đồng thời đánh giá khả năng sinh tổng hợp carotenoid trên nguồn cơ chất này
Hình 3.23 Động học của quá trình lên men chủng S pararoseus Q trên dịch thủy phân chitin
Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện gồm: môi trường lên men với dịch thủy phân chitin chứa 10 g/L đường khử, OD660nm khởi điểm là 1, pH = 5, nhiệt độ 25ºC, lắc 125 rpm, trong 72 h, mẫu đối chứng chứa môi trường lên men với 10 g/L NAG Động học của quá trình lên men được mô tả trong Hình 3.23 cho thấy tốc độ sinh trưởng của chủng lên men trên dịch thủy phân (tốc độ sinh trưởng riêng đạt 0.07 h -1 ) chậm hơn so với lên men trên môi trường chứa NAG (tốc độ sinh trưởng riêng đạt 0.14 h -1 ) Ở cả hai môi trường, chủng đạt đỉnh pha log sau 48 h lên men, với mẫu đối chứng OD660nm đạt cực đại là 50.95 gấp 1.24 lần so với mẫu nuôi trên dịch thủy phân Bên cạnh đó, khi nuôi trên dịch thủy phân, đường khử được chủng tiêu thụ đường nhanh chóng trong giai đoạn pha log, khoảng 8.68 g/L với tốc độ tiêu thụ cơ chất đạt 0.02 g/g.h, trong khi đó, với mẫu đối chứng, NAG được chủng sử dụng nhanh chóng khi bước vào pha cân bằng với tốc độ tiêu thụ là 0.17 g/g.h
OD đối chứng OD dịch thủy phân Đường khử đối chứng Đường khử dịch thủy phân
Hình 3.24 Hàm lượng β-carotene và carotenoid của chủng S pararoseus Q trên dịch thủy phân chitin
(mâu đối chứng nuôi trên môi trường lên men chứa 10 g/L NAG, các mẫu được thu tại thời điểm 72 h)
Theo kết quả Hình 3.24 cho thấy, hàm lượng sinh khối khô trên mẫu đối chứng đạt 4.75 g/L cao gấp 1.22 lần mẫu nuôi trên dịch thủy phân chitin Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp cũng như năng suất tích lũy β-carotene và carotenoid khi nuôi trên dịch thủy phân chitin cho kết quả cao hơn trên mẫu đối chứng Cụ thể, hàm lượng β-carotene và carotenoid tương ứng đạt 624.86 àg/g sinh khối khụ và 818.89 àg/g sinh khối khụ, cao gấp 1.63 và 1.78 lần so với mẫu đối chứng Điều này có thể được lý giải do trong dịch thủy phân có một số chất kích thích làm tăng khả năng tích lũy β-carotene và carotenoid Năng suất tích lũy β-carotene và carotenoid lần lượt đạt 2,436.95 àg/L và 3,193.67 àg/L cao gấp 1.34 và 1.43 lần so với mẫu đối chứng El-Banna và cộng sự (2012) cho kết quả tương tự khi lên men chủng Rhodotorula glutinis trên siro ngô cho khả năng sinh tổng hợp β- carotene và carotenoid cao hơn 1.2 lần so với lên men trên glucose [101] Từ những kết quả trên cho thấy, tiềm năng trong việc sử dụng dịch thủy phân chitin làm nguồn cơ chất vừa tạo ra sản phẩm có giá trị, nâng cao hiệu quả kinh tế đồng thời giúp giảm ô nhiễm môi trường từ phế thải ngành chế biến tôm
1000 Đối chứng Dịch thủy phân
Sinh khối khô (g/L) β-carotene, Carotenoid (àg/g)
Mẫu β-carotene (àg/g) Carotenoid (àg/g) Sinh khối khụ (g/L)
Kết luận
1 Chủng nấm men Sporidiobolus pararoseus Q được lựa chọn trong số 18 chủng nấm men, cho thấy khả năng sinh tổng hợp carotenoid tốt nhất trên nguồn cơ chất là NAG với hàm lượng β-carotene và carotenoid thu được lần lượt là 257.85 àg/g sinh khối khụ và 439.9 àg/g sinh khối khụ
2 Điều kiện lên men tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp carotenoid trên nguồn cơ chất là NAG là:
- OD660nm cấp giống là 1
Quá trình nuôi cấy tại điều kiện tối ưu cho hàm lượng β-carotene và carotenoid lần lượt là 518.84 àg/g sinh khối khụ và 595.48 àg/g sinh khối khụ, tương ứng tăng gấp 2.01 lần và 1.35 lần
3 Kỹ thuật lên men gián đoạn sử dụng 2 nguồn carbon gồm 80 g/L glucose và 50 g/L NAG cho hàm lượng β-carotene và carotenoid lần lượt đạt 698.21 àg/g sinh khối khụ và 1941.12 àg/g sinh khối khụ Kết quả cao gấp 1.35 lần và 3.26 lần so với quá trình lên men từ 1 nguồn carbon
4 Khả năng sinh tổng hợp trên dịch thủy phân chitin cho hàm lượng β- carotene và carotenoid tương ứng đạt 624.86 àg/g sinh khối khụ và 818.89 àg/g sinh khối khô Kết quả này cao gấp 1.63 và 1.78 lần so với quá trình lên men từ NAG.