Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thử nghiệm tạo sản phẩm nước uống từ tỏi đen

Từ đó, đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm tạo sản phẩm nước uống từ tỏi den” đượcthực hiện nhằm đa dạng hóa các dòng sản phẩm từ tỏi đen, tăng tính tiện dụng và có giáthành hợp lý dé có thé s

Quy trình lên men toi €I - - << G5 0 199993011 999305 19 re 4 1.1.3 Thành phần hóa học tỏi den . - + 25656 E‡E2E2EE SE E39 E1 1211121252111 1 e, 5 1.1.4 Hoat tinh sinh hoc cUa tOi den 01 -1III 6 1.1.4.1 Hoat tinh chong vn -“‹‹4-11 Ầ

Uc chế sự phát triển của tế bào ung thr .ecceccccsesesesseseseseesesesessesesesseseseesesen 8 1.1.4.3 Hoat tinh chong 0008 “ -:ệŒ+1

Tỏi đen chứa hàm lượng các hợp chất organosulphur cao là thành phần kháng ung thư, có thể được chia thành hai nhóm chính Một nhóm là hòa tan lipid: diallyl sulfide, diallyl disulphide (DADS) và diallyl trisulphide (DATS) Nhóm hòa tan trong nước: S- allylcysteine (SAC) va S-allyl mercapto cysteine (SAMC).

Khả năng chống ung thư thông qua kích hoạt các Caspase (enzyme protease dạng cysteine-aspartic) có vai tro tối quan trọng đối với việc chết rụng tế bảo, tham gia vào hoạt động của hệ miễn dịch trong quá trình trưởng thành của lympho bào.

Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của tỏi den cho thay, các hợp chat sulfur hữu cơ, dẫn xuất của tetrahydro-B-carboline được hình thành từ quá trình lên men có hoạt tính mạnh, dọn gốc tự do và ức chế quá trình peroxy hóa lipid cao hơn tỏi thường Kết quả nghiên cứu gan day cho thay, dịch chiết tỏi den có hiệu lực mạnh kháng lại các tế bào khối u, do vậy có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị ung thư Cơ chế tác dụng của tỏi đen không phải băng cách trực tiếp gây độc tế bào mà thông qua con đường kích thích đáp ứng miễn dịch, loại trừ khả năng di căn, ức chế sự nhân lên các tế bào khối u [13].

1.1.4.3 Hoạt tính chống béo phì

Bệnh béo phì là một tác nhân gây ra các bệnh khác như: bệnh đái tháo đường type

2, bệnh tim, bệnh gan và hiện tượng gan ton thương, bao gồm tăng trương mạch máu, sự

8 thay đối trọng lượng gan, nồng độ AST (alanine aminotransferase) va ALT (aspartate aminotransferase) trong huyét thanh.

Nghiên cứu của Jung et al., 2011 đã chỉ ra rằng chiết xuất từ tỏi đen lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng sinh học mạnh mẽ, thể hiện qua khả năng chống oxy hóa và bảo vệ sức khỏe đối với chuột béo phì được cho ăn chế độ ăn nhiều calo Sau 91 ngày áp dụng chế độ ăn này, chuột có xu hướng phát triển béo phì, tăng đường huyết, tăng mỡ máu và tổn thương gan, thận Tuy nhiên, việc bổ sung tỏi đen và tỏi lên men với Saccharomyces cerevisiae ở 3 liều lượng khác nhau đã cho thấy hiệu quả bảo vệ gan, thận, lipid máu và chống ung thư mạnh mẽ hơn so với nhóm đối chứng ăn chế độ ăn thiếu hụt Đặc biệt, cả tỏi đen lên men với Saccharomyces cerevisiae và tỏi đen qua xử lý nhiệt đều không gây ra biến chứng tiểu đường.

Tác động điều hòa miễn dich c.ccccccccscscsessscscscscscssssssscscsesssesscscscscsrscsescssevenens 9 1.1.4.5 Giảm mỡ, cholesterol mấu + ô<< + 2+ E E111 1111 1113 1115 E1 sex 10 1.1.4.6 Ảnh hưởng đến trí nhớ và hệ thần kinh . + 2 2 + 2 £+EE£E+E+E£Ezxrkeeeesree 10

Các nghiên cứu đã chứng minh rang tỏi den có tác dụng chống dị ứng và tác dụng chống ung thư thông qua sự điều chỉnh chức năng miễn dịch trực tiếp hoặc gián tiếp, kích thích sự phát triển của các tế bào Iympho, kháng thể, sản xuất kháng thể và nhiều cơ chế khác [59].

Tác dụng kích thích miễn dịch của tỏi và các thành phan chế phẩm của nó bao gồm tăng tổng số tế bào bạch cầu và tăng cường tế bào tủy xương [16] cũng như trạng thái cân bằng nội môi [13] Sử dụng tỏi có thé làm tăng sản xuất và giải phóng oxit nito (NO), nó còn chịu trách nhiệm cho sự phóng thích IFN-a ở người, có thể có lợi trong các bệnh do virus hoặc tăng sinh quá mức.

Một số nghiên cứu cho thấy tỏi có thể có hiệu quả để ngăn ngừa sự ức chế miễn dịch bởi các tác nhân khác nhau, như hóa tri liệu, tia cực tím, căng thăng tâm lý và thể chất [13] Việc duy trì kích thích miễn dịch giúp bảo vệ chống lại bệnh ung thư và làm Suy giam miễn dịch như với hội chứng suy giảm miễn dịch (AIDS) và cải thiện sự suy giảm nhận thức liên quan đền lão hóa.

M6 máu là căn bệnh rất phố biến trong cuộc sống ngày nay và là một trong các yếu tố nguy cơ của các bệnh lý nghiêm trọng như nhỏi máu cơ tim, tai biến mạch máu não. Thông thường trước khi áp dụng bat cứ biện pháp điều trị nào, điều chỉnh chế độ ăn luôn là lời khuyên hàng đầu của các bác sĩ Bên cạnh đó, những thực phẩm có tác dụng giúp giảm mỡ máu cũng được nghiên cứu để bồ sung vào chế độ ăn hằng ngày của người bệnh Tỏi đen là một trong những thực phẩm chức năng đầu bảng được các nhà khoa học đánh giá về khả năng giảm mỡ máu trên lâm sàng.

Thu nghiệm trên chuột cái được cho ăn với chế độ thức ăn giàu béo có hàm lượng

45%/kcal trong 28 ngày va sau đó chuột được cho ăn 100 mg/kg, 200 mg/kg, va 400 mg/kg tỏi den đã lên men trong 63 ngày Kết quả cho thay, tỏi den đã làm giảm đáng kể khối lượng cơ thể, trọng lượng mỡ bụng, đường kính mỡ bụng và độ dày mỡ vùng bụng so với nhóm đối chứng Tỏi đen cũng làm giảm mức triacylglycerol và LDL (low-density lipoprotein) trong máu, và tăng mức HDL (high-density lipoprotein) so với nhóm đối chứng [8].

1.1.4.6 Anh hưởng đến trí nhớ và hệ thần kinh

Bột ngọt được biết đến nhiều và được sử dụng như loại gia vi trên toàn thế giới [13] Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu cho thay răng, bột ngọt có thé có ảnh hưởng bat lợi đến các cơ quan khác nhau bao gém các tế bào Purkinje trong tiểu não (đóng vai trò quan trọng trong hệ thông than kinh) và vùng hippocampus (đóng vai trò quan trọng trong hệ thống bộ nhớ) [3].

Tỏi đã được biết đến không chỉ như là một chất tăng cường hương vị, mà còn là một loại thực phẩm có khả năng chống oxy hóa cao Đặc biệt, hoạt tính chong oxy hoá của tỏi den cao hơn đáng ké so với tỏi tươi do hàm lượng polyphenol cao hơn va khả năng bắt gốc tự do [34] Một số nhà nghiên cứu điều tra tác động của chiết xuất ethanol của tỏi đen trên hệ thống thần kinh và trí nhớ sử dụng mô hình chuột Wistar với bột ngọt. Theo Hermawati et al., những con chuột được điều trị bang tỏi đen có thời gian tron thoát và độ dài lối thoát ngắn hơn đáng kế so với những con chuột đối chứng, ở cả hai trường

10 hợp có hoặc không có sử dụng bột ngọt Hơn nữa, mặc dù liều bột ngọt có thể không đủ dé cho thay sự giảm đáng kề số lượng tế bào Purkinje, sự kết hợp của chiết xuất tỏi den và bột ngọt cải thiện việc giảm SỐ lượng tế bào Purkinje so với chỉ sử dụng bột ngọt. [12] Tóm lại, tỏi đen có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc cải thiện một số bệnh cũng như các chức năng của bộ nhớ và hệ thông thần kinh do hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng của nó.

Qua nhiễu nghiên cứu khoa học trên thể giới tỏi đen không những là một thực phẩm quý bởi thành phần cũng như hàm lượng các chất dinh dưỡng tăng cao mà nó còn chứa nhiều hoạt chất có công dụng phòng và chữa bệnh có hiệu quả.

1.1.5 Cơ sở khoa học của quá trình lên men toi den

Phan ứng Maillard hay còn gọi là phản ứng ozamin, carbonyl amine, amiloza, melanoidin Chất tham gia phan ứng là các protein hoặc các sản phẩm phân giải của chúng với các glucide qua nhiều giai đoạn trung gian phức tạp cuối cùng tạo thành các melanoidin Khi lên men tỏi đen, ngoài phản ứng caramen hóa còn có phản ứng tạo màu rat quan trọng, đó là phản ứng Maillard xảy ra giữa các phan tử đường don và hệ protein thấp phân tử Đây là phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao, giữa các đường đơn ở bề mặt với các acid amin thu được từ quá trình thủy phân ở nhiệt độ cao Cuối cùng tạo thành chuỗi các sản pham bậc cao phức tạp, các hợp chất nito dị vòng, sự trùng hợp hóa va oxy hóa đồng thời các aldehyde tạo thành các sản phẩm có màu vàng hơi nhạt và mùi vị dễ chịu (như lactone, pyrazin ) Các chất này còn có tác dụng kích thích tiêu hóa [68].

Phản ứng Maillard gồm có 3 giai đoạn, đây là phản ứng giữa protein và glucide hay nói rõ hơn là phản ứng giữa đường khử và acid amin (phản ứng xảy ra giữa nhóm carbonyl của đường và nhóm amin của acid amin) Các chất làm tăng tốc độ phản ứng melanoidin là: acid lactic, muối acid lactic, đệm phosphate Phản ứng diễn ra qua ba giai đoạn kế tiếp nhau:

- Giai đoạn 1: tạo các sản phẩm không màu va không hấp thu ánh sáng cực tím, các acid amin có vai trò cơ chất Trong giai đoạn này hình thành phản ứng ngưng tụ carbonyl

- Giai đoạn 2: tạo các sản phẩm không màu hoặc màu vàng nhạt, hap thu mạnh ánh sáng cực tím với phản ứng khử nước của đường và phản ứng phân huỷ đường, hợp chất amin.

- Giai đoạn 3: tao sản phẩm có mau đậm bởi phan ứng ngưng tu aldol, phan ứng trùng hợp hoá aldehyde amine và tạo thành hợp chất dị vòng chứa nitơ [68].

Các acid amin tham gia phản ứng khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ, pH, lượng nước trong nguyên liệu Kha năng phản ứng của acid amin phụ thuộc nhiều vao độ dài mach carbon và vi trí nhóm amin so với carboxyl, nhóm amin càng xa nhóm carboxyl thì phản ứng càng mạnh Tốc độ phản ứng phụ thuộc vào tỉ lệ acid và đường Ảnh hưởng của nước là điều kiện cần thiết tiễn hành phản ứng, để phản ứng đạt hiệu suất cao thì xung quanh mỗi phân tử protein cần lớp đơn phân của nước, nên trong quá trình lên men tỏi đen cần chú ý nhiều đến độ 4m môi trường khi tác dụng nhiệt lên nguyên liệu [68].

Hình 1.4 Các hop chất hình thành trong phan ứng Maillard 1.1.5.2 Sự tạo màu từ phản ứng oxy hóa phenol

Co sở khoa học của quỏ trỡnh lờn men tỏi den - - - 5 <5 ô<< +2 II [.I.5.1 Phản ứng Maillard - <1 111999000 ng ng II

Cơ chế hoạt động chống oxy hóa của SAC -¿-¿-c- + S+2e2x+Ecxcrererrrerered 14 1.2 Tong quan về enzyme pectinase -5-< 5 5 5 5 << << ssseseseSeEeEesesssee 16 1.2.1 PRA 10a oo

Hoạt tính chống oxy hoá của tỏi đen bị ảnh hưởng bởi phương pháp chế biến Alliin là một hợp chất không ôn định trong tỏi tươi, được chuyển đối thành hợp chất 6n định và có hoạt tính chống oxy hóa như: S-allyl-cysteine (SAC).

S-allyl-cysteine (SAC) có kha năng loại bỏ superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl (-OH) va peroxynitrite Ngoài ra, S-allyl-cysteine (SAC) còn ngăn ngừa sự oxy hóa lipid, oxy hóa protein và nitrat hóa Cơ chế hoạt động của SAC trong co thé được biéu diễn như trong hình 1.9.

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động chéng oxy hóa của SAC

Chú thích: COX-2: cyclooxygenase-2, NOX: NADPH oxidase, nNOS: neuronal nitric oxide synthase, SOD: superoxide dismutase, XO: xanthine oxidase.

SAC có thé thu don anion superoxide (O27), hydrogen peroxide (H202), gốc hydroxyl (sOH), gốc peroxynitrite (ONOO’) va gốc peroxyl (ROO) được sản sinh trong tế bào thần kinh, cũng như hypochlorous acid (HCIO) va oxy đơn (O2) được sản xuất trong các tế bào (đường màu xanh) Hơn nữa, SAC cũng có khả năng tạo phức với các ion Fe?† và Cu”* (đường màu đỏ), do đó ngăn được phản ứng Fenton tạo gốc tự do hoạt động OH SAC cũng ức chế chuyên vi NF-kB vào trong nhân (đường màu xanh lá cay), do đó ngăn chặn quá trình chết tế bào [2].

1.2 Tổng quan về enzyme pectinase

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là galacturonic acid, galactose, methanol Day là nhóm enzyme thứ ba được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật sau amylase va protease [62].

Dựa vào đặc điểm cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme pectinase được chia thành 3 nhóm chính: [11]

- Cac enzyme khu mach polymer.

1.2.2 Co chế hoạt động của enzyme pectinase

Pectinesterase còn được gọi là pectin methyl hydrolase, xúc tac su khử ester hóa nhóm methoxyl cua pectin, tao thành pectic acid Enzyme nay hoạt động đặc hiệu với nhóm methyl ester của galacturonic acid, nam bên cạnh galacturonic acid không bi ester hóa [11].

| O -O |- O —— © LAH A AH Hi ASH xH x4⁄⁄h H

NOH n/t NOH H⁄1⁄° NOH H/VY on H⁄ˆ

Hình 1.10 Cơ chế hoạt động của pectinesterase (PE)

Protopectinase hòa tan protopectin, tạo thành các pectin hòa tan có mức độ polymer hóa cao [11].

1.2.2.3 Các enzyme khứ mạch polymer

Chia làm hai nhóm: e Enzyme thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase)

- Polymethyl galacturonase (PMG): xúc tác thủy phân liên kết a-1.4-glycoside, đặc hiệu với pectin có mức độ ester hóa cao Polymethylgalacturonase gồm hai loại: l6

+ Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết ơ-1 4-glycoside của pectin [11].

Endo-PMG COOCH; COOCH; COOCH; COOCH; fk Ms Áp iS = L1 O ¡ b ụ o% H H % 4: No’

“ NOH H JV “4< H⁄ K OH Die 1 NOH 1L

Hình 1.11 Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG) + Exo-PMG: phân cat lần lượt liên kết a-1.4-glycoside của pectin từ đầu không khử của mạch pectin.

Exo-PMG COOCH; | COOCH;, COOCH;: COOCH;

Q N ‘ < Q z n OH 2 oe H 1° K OH Lf Dy Ves H⁄1⁄

Hình 1.12 Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG) [65]

- Polygalacturonase (PG): xúc tác thủy phân liên kết a-1.4-glycoside của pectic acid (polygalacturonic acid), gồm hai loại:

+ Endo-PG: còn gọi là poly(1 4-a-D-galacturonide) glucanohydrolase, xúc tác thủy phân ngẫu nhiên liên kết a-1.4-glycoside trong phân tử pectic acid.

Endo-PG COOH Lo | COOH COOH

+ oy s ẹh NI ACH Ni ASH NH z z2 hon 1⁄⁄ N\ H1⁄9 K oS IN W/V x H VĐ INon OH H⁄1⁄Đ on

Hình 1.13 Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG) [65]

+ Exo-PG: còn gọi là poly(1 4-a-D-galacturonide) galacturonohydrolase, xúc tác thủy phân lần lượt liên kết a-1.4-glycoside của pectic acid từ đầu không khử.

Exo-PG COOH ow COOH COOH mm! —————O mm) ———OQ

ASH © H ASH \H AS wu éNH „

““ II NỌH AYP H OH HS Y H NOH Hs Y H NOH H⁄t!

Hình 1.14 Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG) e Enzyme cat (lyase)

Các enzyme nay phân cắt liên kết a-1.4-glycoside va tạo ra galacturonic acid có liên kết không bão hòa giữa C4 và C5 tại đầu không khử của galacturonic acid được tạo thành.

2” NOH H⁄1⁄” NOH nA” =o Ion uA + Kon ‘AO OH a

Hình 1.15 Cơ chế hoạt động của các enzyme lyase phân cắt pectin [65]

Các enzyme lyase phân cắt pectin bao gồm:

- Polymethylgalacturonase Iyase (PMGL): xúc tác phá vỡ pectin bằng cách trans- eliminative cleavage, có hai loại:

+ Endo-PMGL: còn gọi là poly (methoxy galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết a-1.4-glycoside của pectin.

+ Exo-PMGL: xúc tác phá vỡ từng nắc phân tử pectin bằng cách trans-eliminative cleavage.

- Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phân cat liên kết a-1.4-glycoside của pectin acid bang cách trans-elimination Có hai loại:

+ Endo-PGL: còn gọi là poly(1.4-a-D-galacturonide) lyase, xúc tác phân cat ngẫu nhiên liên kết a-1.4-glycoside của pectic acid.

+ Exo-PGL: cũn gọi là poly(1 4-ứ-D-galacturonide) exolyase, xỳc tỏc phõn cat lần lượt liên kết a-1.4-glycoside của pectic acid từ đầu không khử.

1.2.3 Ứng dung enzyme pectinase trong sản xuất nước qua

Các pectin hòa tan được tìm thay trong nước ép là kết qua của quá trình phá vỡ vật lý các tế bào quả do hệ enzyme pectolytic Pectin là thành phần chủ yếu để kết dính các thịt quả lại với nhau Các pectin hòa tan này làm tăng độ nhớt dịch quả là nguyên nhân gây ra nhiều khó khăn trong quá trình trích ly Nhờ pectinase mà nước quả trong suốt, dê lọc, hiệu suât tăng Pectinase còn góp phân chiét rút các chat mau, tannin và các chat

18 hòa tan khác, do đó làm tăng chất lượng thành phẩm Thông thường thịt quả được xử lý với enzyme pectinase băng cách gia nhiệt từ 45-50°C, thời gian xử lý từ 1 đến 2 giờ. Điều kiện xử lý enzyme phụ thuộc vào bản chat, hàm lượng chế phâm enzyme sử dụng, nhiệt độ phản ứng, thành phân hóa học của quả.

Tóm lại trong phạm vi dé tài này, enzyme pectinase được sử dụng dé phá vỡ cầu trúc của cellulose và pectin trong tế bào, nhằm hỗ trợ cho quá trình trích ly các chất hòa tan trong dịch chiết tỏi đen dễ dàng hơn.

1.3 Đa dạng hóa các sản phẩm từ tói đen

Hiện nay, tỏi den được sử dụng khá phố biến không chỉ làm thức ăn mà còn được sử dung trong ngành dược phẩm, thực phẩm chức năng, làm thuốc chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư Trong ngành thực phẩm, nước ép tỏi đen va các dạng chế phẩm khác như cao tỏi đen, viên nang mém tỏi đen đang lưu hành rộng rãi tại thị trường châu Á như: Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Singapore và được mọi người ưa thích nhờ có thêm tác dụng bảo vệ sức khoẻ.

Hình 1.16 Một số sản phẩm từ tỏi den

Tại Việt Nam, các sản phâm từ tỏi đen ngày càng được ưa chuộng trong những năm gân đây như: tỏi đen nguyên củ/ bóc vỏ, rượu tỏi đen, viên nang tỏi đen, bột tỏi đen,nước côt tỏi đen Tuy nhiên, các sản phâm tỏi đen sản xuât ở trong nước từ tỏi Lý Sơn và tỏi đen nhập khẩu déu có giá thành rất cao Vì vậy, cần phải đa dạng hóa các dòng sản phẩm từ tỏi đen nhằm hạ giá thành sản phẩm.

1.4 Tình hình nghiên cứu về tỏi đen trong và ngoài nước

1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Nhiều nghiên cứu về quy trình sản xuất tỏi đen đã được cấp bản quyên (Patent). Quy trình sản xuất tỏi đen lên men (Pub.No.: US 2007/0031574 A1) năm 2007 của nhóm nghiên cứu Gyu-Bae Han et al., đã cung cấp phương pháp lên men tỏi đen với hàm lượng các hợp chất chống oxy hóa tăng nhiều so với tỏi tươi Tuy nhiên, điều kiện sản xuất với các thông số chưa cụ thé cho từng quy mô sản xuất, nguyên liệu và điều kiện sản xuất khác nhiều so với Việt Nam [19].

Cùng năm 2007, nhóm nghiên cứu Jin-ichi Sasaki et al., nghiên cứu về chiết xuất tỏi đen tăng khả năng chống khối u ở chuột, kết quả thu được là tỏi đen có chứa một lượng axid amin và chất hữu co sulfuric, S-allyl-cysteine (SAC) làm tăng khả năng chống lại khối u ở chuột Ngược lại, chiết xuất tỏi tươi chỉ làm giảm kích thước khối u xuống 60% so với khối u chuột khi không điều trị Ngoài ra, chiết xuất tỏi đen còn cho thấy hoạt động chống vi khuẩn đối với các vi khuẩn quan trọng như: MRSA (Staphylococcus aureus khang methicillin), Escherichia coli O157:H7, Pseudomonas aeruginosa va

Candida albicans, tuy nhiên hiệu lực của nó thấp hơn chiết xuất tỏi tươi [27].

Năm 2009, nghiên cứu cua Robert et al., đã khảo sát hàm lượng allicin, S-allyl- cysteine và các hợp chất dễ bay hơi của tỏi băng HPLC Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định băng phương pháp sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [24].

Năm 2011, phương pháp lên men tỏi đen (Pub, No.: US 2011/0129580 AI) cua

Nghiên cứu của Young-Duck và cộng sự đã chỉ ra các bước trong quy trình chế tạo, khối lượng tỏi được ghi nhận nhưng quá trình sản xuất chưa theo dõi được hàm lượng các hợp chất chống oxy hóa Các đặc điểm vật lý và hóa học của sản phẩm như độ ẩm, độ pH, độ chua, trọng lượng và độ cứng cũng không được tổng hợp đầy đủ trong nghiên cứu.