Nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá của các loài Đại diện thuộc nhóm loài thằn lằn ngón cyrtodactylus angularis tại lào, thái lan và việt nam

Nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá của các loài Đại diện thuộc nhóm loài thằn lằn ngón cyrtodactylus angularis tại lào, thái lan và việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--

HỒ THỊ NGỌC ÁNH

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ TIẾN HOÁ CỦA CÁC LOÀI ĐẠI

DIỆN THUỘC NHÓM LOÀI THẰN LẰN NGÓN CYRTODACTYLUS

ANGULARIS TẠI LÀO, THÁI LAN VÀ VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--

HỒ THỊ NGỌC ÁNH

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ TIẾN HOÁ CỦA CÁC LOÀI ĐẠI

DIỆN THUỘC NHÓM LOÀI THẰN LẰN NGÓN CYRTODACTYLUS

ANGULARIS TẠI LÀO, THÁI LAN VÀ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ ĐỨC MINH

PGS TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Hà Nội – 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bảo vệ trước bất kỳ hội đồng nào trước đây

Tác giả

Hồ Thị Ngọc Ánh

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS Lê Đức Minh (Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ dạy tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô và anh chị Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam đã tham gia khảo sát thực địa và cung cấp mẫu vật

Và tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS Ngô Thị Hạnh, NCS Nguyễn Thị Thắm, CN Lê Huyền Mai cùng toàn thể anh chị học viên cao học, bạn bè, trong phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hướng dẫn, truyền đạt, giúp đỡ tôi về những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình tôi và tất cả các anh chị, bạn bè thân thiết, những người đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Nghiên cứu được hỗ trợ bởi đề tài Nafosted mã số 106.05-2020.24 Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2023

Học viên

Hồ Thị Ngọc Ánh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về giống Cyrtodactylus tại Lào, Thái Lan và Việt Nam 3

1.1.1 Đa dạng loài Cyrtodactylus tại Lào, Thái Lan và Việt Nam 3

1.1.2 Một số nghiên cứu về quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Cyrtodactylus ở Lào, Thái Lan, Việt Nam 10

1.2 Tổng quan về nhóm Cyrtodactylus angularis 12

1.3 Chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loại 15

CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp thu mẫu thực địa 22

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 24

2.2.3 Phản ứng PCR 25

2.2.4 Tinh sạch và giải trình tự 26

2.2.5 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 27

CHƯƠNG III- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 29

3.2 Kết quả PCR 29

3.3 Kết quả giải trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại 32

CHƯƠNG IV- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Vùng phân bố của các loài Cyrtodactylus [13] 3

Hình 2 Số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus tại Lào qua từng năm [42] 5

Hình 3 Số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus tại Thái Lan qua từng năm [42] 7

Hình 4 Số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus tại Việt Nam qua từng năm [42] 9

Hình 5 Cyrtodactylus bansocensis [8] 13

Hình 6 Cyrtodactylus chanhomeae [37] 13

Hình 7 Một số loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis [13] 14

Hình 8 Bản đồ vị trí các khu vực thu mẫu 23

Hình 9 Kết quả điện di ADN tổng số từ một số mẫu mô 29

Hình 10 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu khuếch đại đoạn gen COI 30

Hình 11 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu khuếch đại đoạn gen Cytb 30

Hình 12 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu khuếch đại đoạn gen ND2 30

Hình 13 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu khuếch đại đoạn gen Cmos 31

Hình 14 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu khuếch đại đoạn gen PDC 31

Hình 15 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu khuếch đại đoạn gen Rag1 32

Hình 16 Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu khuếch đại đoạn gen Rpl35 32

Hình 17 Kết quả giải trình tự hai chiều đoạn gen cmos của mẫu CtL60 33

Hình 18 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên tập dữ liệu gen ty thể 38

Hình 19 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên tập dữ liệu gen nhân 39

Hình 20 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên tập dữ liệu kết hợp gen ty thể và gen nhân 40

Hình 21 Sự phân nhánh của các loài trong nhóm C angularis 41 Hình 22 Bản đồ phân bố các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis 42

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Thông tin mẫu vật được sử dụng trong nghiên cứu 18 Bảng 2 Các cặp mồi cho các phản ứng PCR 20 Bảng 3 Các trình tự được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại 34 Bảng 4 Khoảng cách di truyền giữa một số mẫu trong nghiên cứu dựa trên đoạn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp base pair – cặp bazơ

COI Gen Cytochrome c oxidase I

DNA Deoxyribonucleic Acid kb Kilobase (1Kb = 1000bp) ML Maximum Likelihood (hợp lý tối đa)

MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài

Giống thằn lằn ngón, Cyrtodactylus, thuộc họ Tắc kè Gekkonidae, là một

trong những giống có độ đa dạng cao nhất [42] Tính đến năm 2023, có 354 loài

thuộc giống Cyrtodactylus được mô tả và ghi nhận trên thế giới [42] Các loài của

giống này có vùng phân bố rộng kéo dài từ Nam Á, Đông Nam Á, Phi-lip-pin, quần đảo Indo - Australia tới phía Đông đảo Solomon [4] Lào, Thái Lan và Việt Nam được đánh giá là những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới [35] Trong những năm gần đây, một số loài mới thuộc giống này đã được phát hiện và mô tả ở Lào, Thái Lan và Việt Nam [42]

Thằn lằn ngón là nhóm thằn lằn rất đặc thù với nhiều loài ẩn sinh chỉ mới được phát hiện trong thời gian gần đây [42] Các loài thuộc giống này có thể thích nghi với nhiều loài sinh cảnh sống khác nhau, trong đó có rừng trên núi đá vôi, đá granit và rừng thường xanh vùng đất thấp [24, 31, 38] Đây là một trong số rất ít nhóm động vật có xương sống phân bố trên nhiều hệ sinh thái khác nhau và có mức độ đa dạng cao [42] Các loài thuộc giống thằn lằn ngón rất giống nhau về mặt hình thái nhưng lại có sự phân tách khá rõ ràng về mặt di truyền gây ra những khó khăn trong việc phân loại chỉ dựa trên các đặc điểm về hình thái [13] Do đó, khi nghiên cứu về phân loại học các loài thuộc giống này thường phải sử dụng kết hợp kết hợp giữa chỉ thị di truyền và hình thái

Nhóm thằn lằn ngón Cyrtodactylus angularis là một trong số 31 nhóm loài

đơn ngành được phân tích trong nghiên cứu của Grismer và cs 2021 [13] Nhóm này có số lượng các loài tương đối lớn so với các nhóm còn lại [13] Các loài thuộc

nhóm Cyrtodactylus angularis có vùng phân bố khác nhau thích nghi với núi đá vôi

từ miền Trung Việt Nam, miền Trung và Bắc Lào, phía Đông và miền Trung Thái Lan, và có thể là phía Nam Trung Quốc [19, 23, 25, 29, 45] Ngoại lệ duy nhất là

loài Сyrtodactylus nigriocularis, xuất hiện xa hơn về phía Nam của Việt Nam ở núi

Bà Đen, tỉnh Tây Ninh và sống ở các hang đá granit [13]

Những nghiên cứu về giống thằn lằn ngón hiện nay nói chung và nhóm

Cyrtodactylus angularis nói riêng hầu hết đều tập trung vào đa dạng di truyền và sử

dụng chỉ thị sinh học phân tử trong mô tả các loài mới Tuy nhiên, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc nhóm này chưa được đánh giá một cách chi tiết Ngoài ra, mặc dù một số nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài của các thành

viên thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis đã được thực hiện, các nghiên cứu về mối

quan hệ phát sinh loài của nhóm này tại Việt Nam chỉ sử dụng số liệu sinh học phân tử ở mức độ hạn chế dựa trên một hoặc hai đoạn gen Vì vậy, đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá của các loài đại diện thuộc nhóm loài thằn

lằn ngón Cyrtodactylus angularis tại Lào, Thái Lan và Việt Nam” sử dụng trình

tự ba đoạn gen ty thể (COI, ND2, Cytb) và bốn đoạn gen nhân (Cmos, PDC, Rag1,

Rpl35) nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại có độ tin cậy cao và từ đó có thể

đưa ra các kết luận về quan hệ di truyền của các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus

angularis một cách đầy đủ và chính xác hơn Ngoài ra, kết quả phân tích sinh học

phân tử trong nghiên cứu này có thể giúp phát hiện các loài mới loài mới thuộc nhóm thằn lằn ngón này tại Lào, Thái Lan và Việt Nam

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được mối quan hệ di truyền của các loài thằn lằn ngón thuộc nhóm

Cyrtodactylus angularis ở Lào, Thái Lan và Việt Nam sử dụng trình tự của ba đoạn

gen ty thể (COI, ND2, Cytb) và bốn đoạn gen nhân (Cmos, PDC, Rag1, Rpl35)

- Phát hiện được các loài thằn lằn chân ngón dựa trên các phân tích di truyền nhằm giúp đánh giá mức độ đa dạng của nhóm loài này

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về giống Cyrtodactylus tại Lào, Thái Lan và Việt Nam 1.1.1 Đa dạng loài Cyrtodactylus tại Lào, Thái Lan và Việt Nam

Thằn lằn chân ngón thuộc giống Cyrtodactylus Gray, 1827 là nhóm có mức

độ đa dạng cao nhất trong họ Tắc kè (Gekkonidae) với 354 loài đã được mô tả [42] Nhóm này có phân bố rộng từ Đông Nam Á, Đông Dương, Philippin, quần đảo Indo-Australia cho tới đảo Solomon (Hình 1) [4, 30, 31, 45] Trong mười năm trở lại đây, có tới 175 loài mới được phát hiện trên thế giới [42]

Hình 1 Vùng phân bố của các loài Cyrtodactylus [13] Lào

Hai loài thằn lằn chân ngón đầu tiên của Lào được ghi nhận và mô tả vào

năm 1993, bao gồm: Thằn lằn chân ngón rừng (C interdigitalis) Ulber, 1993 và Thằn lằn chân ngón ja-ru-ji (C jarujini) Ulber, 1993 [42]

Từ năm 2004 đến năm 2014, 13 loài mới thuộc giống này được mô tả, bao

gồm: Thằn lằn chân ngón buchard (C buchardi) David và cs, 2004; Thằn lằn chân

ngón ẩn (C cryptus) Heidrich và cs, 2007; Thằn lằn chân ngón roesler (C roesleri) Ziegler và cs, 2010; Thằn lằn chân ngón wayakone (C wayakonei) Nguyễn và cs, 2010; Thằn lằn chân ngón lõm yên (C lomyenensis) Ngo & Pauwels, 2010; Thằn lằn chân ngón teynié (C teyniei) David và cs, 2011; Thằn lằn chân ngón pagel (C

pageli) Schneider và cs, 2011; Thằn lằn chân ngón darevsky (C darevskii) Nazarov

và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón ja-ge-ri (C jaegeri) Lưu và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón khammouane (C khammouanensis) Nazarov và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón multipored (C multiporus) Nazarov và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón spe-la-us (C spelaeus) Nazarov và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón vi-la-phong (C vilaphongi)

Schneider và cs, 2014; nâng tổng số loài thuộc giống thằn lằn ngón được ghi nhận ở Lào lên đến 15 loài [42]

Từ năm 2015 đến 2020, 10 loài mới thuộc giống thằn lằn ngón Cyrtodactylus được phát hiện và mô tả, bao gồm: Thằn lằn chân ngón soudthichak (C

soudthichaki) Lưu và cs, 2015; Thằn lằn chân ngón bản sóc (C bansocensis) Lưu

và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón calame (C calamei) Lưu và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón hin-nậm-no (C hinnamnoensis) Lưu và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón rufford (C rufford) Lưu và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón sommerlad (C

sommerladi) Lưu và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón thathom (C thathomensis)

Nazarov và cs, 2018; Thằn lằn chân ngón muang fuang (C muangfuangensis) Sitthivong và cs, 2019; Thằn lằn chân ngón houaphan (C houaphanensis) Schneider và cs, 2020; Thằn lằn chân ngón ngòi (C ngoiensis) Schneider và cs,

2020 [42]

Hình 2 Số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus tại Lào qua từng năm [42]

Trong 3 năm trở lại đây (từ năm 2021 đến năm 2023), số lượng loài mới

thuộc giống Cyrtodactylus được phát hiện tại Lào có dấu hiệu giảm xuống, chưa ghi nhận thêm loài mới nào thuộc giống Cyrtodactylus tại đây [42] (Hình 2)

Các loài thuộc giống thằn lằn ngón Cyrtodactylus ở Lào thường được tìm thấy ở độ cao từ 150m (C lomyenensis) cho tới 730m (C wayakonei) so với mực

nước biển [30, 43] Sinh cảnh sống của các loài thuộc giống thằn lằn ngón ở Lào

không quá đa dạng, chủ yếu là rừng thường xanh (C cryptus, C

pseudoquadrivirgatus,…) [16] và rừng núi đá vôi (C bansocensis, C calamei, C darevskii, C hinnamnoensis, C jaegeri, C khammouanensis, C lomyenensis,…)

[19, 21, 23, 43, 45]

Thái Lan

Các loài thuộc giống thằn lằn ngón được mô tả và phát hiện ở Thái Lan từ khá sớm [42] Năm 1827, loài thằn lằn chân ngón đầu tiên được ghi nhận ở Thái

Lan là Thằn lằn chân ngón có dải (C pulchellus) Gray, 1827 [42] Tiếp theo sau đó

là 3 loài được ghi nhận và mô tả, bao gồm: Thằn lằn chân ngón moulmein (C

và Thằn lằn chân ngón pegu (C peguensis) Boulenger, 1893 [42]

27

915 16

21 22

23

051015202530

1993 2010 2011 2014 2015 2016 2018 2019 2020 2021 2022 2023

Từ năm 1893 đến năm 1916, không có ghi nhận thêm loài mới nào thuộc giống thằn lằn ngón tại Thái Lan [42] Cho đến năm 1917, ghi nhận thêm loài Thằn

lằn chân ngón trung gian (C intermedius) Smith, 1917 [40] Từ năm 1921 đến năm

2010, đã có 17 loài thuộc giống thằn lằn ngón được ghi nhận tại Thái Lan, bao gồm:

Thằn lằn chân ngón góc cạnh (C angularis) Smith, 1921; Thằn lằn chân ngón campuchea (C brevipalmatus) Smith, 1923; Thằn lằn chân ngón bốn sọc (C

quadrivirgatus) và Thằn lằn chân ngón thái (C zebraicus) Taylor, 1962; Thằn lằn

chân ngón mắt trắng (C elok) Dring và cs, 1979; Thằn lằn chân ngón bướm (C

và Thằn lằn chân ngón jarujin (C jarujini) Ulber, 1993; Thằn lằn chân ngón sumontha (C sumonthai) Bauer và cs, 2002; Thằn lằn chân ngón chanhomea (C

chanhomeae) và thằn lằn chân ngón hổ (C tigroides) Bauer và cs, 2003; Thằn lằn

chân ngón Thirakhupt (C thirakhupti) Pauwels và cs, 2004; Thằn lằn chân ngón lớn (C macrotuberculatus) Grismer và cs, 2008; Thằn lằn chân ngón mắt đỏ (C

erythrops) Bauer và cs, 2009; Thằn lằn chân ngón thắt lưng vàng (C auribalteatus)

Sumontha và cs, 2010; Thằn lằn chân ngón dumnui (C dumnuii) Bauer và cs, 2010; Thằn lằn chân ngón tenggol (C leegrismeri) Chan và cs, 2010 [42]

Từ năm 2011 đến nay, số lượng các loài thuộc giống thằn lằn ngón được ghi nhận tại Thái Lan tương đối ổn định, trung bình 2 loài mới được mô tả mỗi năm (Hình 4) [42] Tổng cộng có thêm 26 loài mới được phát hiện và mô tả, bao gồm:

Thằn lằn chân ngón surin (C surin) Chan và cs, 2011; Thằn lằn chân ngón nhiều đốm (C astrum), Thằn lằn chân ngón bintangtingg (C bintangtinggi) và Thằn lằn chân ngón lekagul (C lekaguli) Grismer và cs, 2012; Thằn lằn chân ngón sanook

(C sanook) Pauwels và cs, 2013; Thằn lằn chân ngón doisuthep (C doisuthep) Kunya và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón khelang (C khelangensis), Thằn lằn chân ngón sam-roi-yot (C samroiyot) và Thằn lằn chân ngón kunya (C kunyai) Pauwels và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón saiyok (C saiyok) Panitvong và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón wangkulangkul (C wangkulangkulae) Sumontha và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón doi-inthanon (C inthanon) Kunya và cs, 2015; Thằn lằn chân ngón

ranong C ranongensis Sumontha và cs, 2015; Thằn lằn chân ngón phetchaburi (C

phetchaburiensis) Pauwels và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón maelano (C maelanoi)

Grismer và cs, 2020; Thằn lằn chân ngón tak (C amphipetraeus) Chomdej và cs, 2020; Thằn lằn chân ngón thần cây (C rukhadeva) Grismer và cs, 2021; Thằn lằn chân ngón stelatus (C stellatus) Termprayoon và cs, 2021; Thằn lằn chân ngón fluvicavus (C fluvicavus), thằn lằn chân ngón pa-la-u (C rivularis), Thằn lằn chân ngón uthai (C uthaiensis) và Thằn lằn chân ngón ko-chang (C kochangensis) Grismer và cs, 2022; Thằn lằn chân ngón monilatus (C monilatus) Yodthong và cs, 2022; Thằn lằn chân ngón phu-kha (C phukhaensis) Chomdej và cs, 2022; Thằn lằn chân ngón đuôi gai (C denticulatus) Chomdej và cs, 2023; Thằn lằn chân ngón thông-pha-phum (C thongphaphumensis) Grismer và cs, 2023 [42]

Hình 3 Số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus tại Thái Lan qua từng năm

[42] Các loài thuộc giống thằn lằn ngón ở Thái Lan thường sống chủ yếu ở các

khu vực rừng núi đá vôi với rừng cây rụng lá hỗn hợp (C monilatus, C uthaiensis,

C fluvicavus,…) [9, 44] và khu vực rừng thường xanh (C thongphaphumensis, C kochangensis,…) [10, 44] Ngoài ra, còn có một số loài sống ở các khu vực khác

như: rừng tre gần suối đá (C denticulatus) [8] hay trong các hang động (C

26 273335 36

38404648

0102030405060

182718591876189319171921192319621979199119932002200320042008200920102011201220132014201520162020202120222023

khelangensis) [33]… Các loài này được tìm thấy ở các độ cao khác nhau từ 82m (C monilatus) cho tới 914m (C thongphaphumensis) so với mực nước biển [10, 44]

Việt Nam

Tính đến năm 2000, chỉ có 3 loài thuộc giống Cyrtodactylus được ghi nhận tại Việt Nam bao gồm: Thằn lằn chân ngón trung gian (C intermedius) Smith, 1917; Thằn lằn chân ngón côn đảo (C condorensis) Smith, 1921; Thằn lằn chân ngón vằn lưng (C irregularis) Smith, 1921 [42] Kể từ năm 2007, số lượng các loài

thuộc giống này tại Việt Nam tăng lên với tốc độ trung bình trên 3 loài mới mỗi năm [42]

Từ năm 2003 đến năm 2008, 13 loài mới được phát hiện và mô tả với bộ

mẫu chuẩn thu tại Việt Nam, bao gồm: Thằn lằn chân ngón phong nha kẻ bàng (C

phongnhakebangensis) Ziegler và cs, 2003; Thằn lằn chân ngón mắt đen (C nigriocularis) Nguyễn Ngọc Sang và cs, 2006; Thằn lằn chân ngón bà đen (C badenensis) Nguyễn Ngọc Sang và cs, 2006; Thằn lằn chân ngón cao văn sung (C caovansungi) Orlov và cs, 2007; Thằn lằn chân ngón châu quang (C chauquangensis) Hoàng Xuân Quang và cs, 2007; Thằn lằn ngón ẩn (C cryptus)

Heidrich và cs, 2007; Thằn lằn chân ngón ai–xen–man (C eisenmanae) Ngô Văn Trí, 2008; Thằn lằn chân ngón g–ri–x–mer (C grismeri) Ngô Văn Trí, 2008; Thằn lằn chân ngón hòn tre (C hontreensis) Ngô Văn Trí và cs, 2008; Thằn lằn ngón huỳnh (C huynhi) Ngô Văn Trí và cs, 2008; Thằn lằn chân ngón giả bốn vạch (C

pseudoquadrivirgatus) Rösler và cs, 2008; Thằn lằn chân ngón tà kú (C takouensis)

Ngô Văn Trí và Bauer, 2008; Thằn lằn chân ngón ziegler (C ziegleri) Nazarov và

cs, 2008 [42]

Từ năm 2009 đến 2018, 23 loài mới thuộc giống này được ghi nhận và mô tả

tại Việt Nam, bao gồm: Thằn lằn chân ngón cát tiên (C cattienensis) Geissler và cs, 2009; Thằn lằn chân ngón bích ngân (C bichnganae) Ngô & Grismer, 2010; Thằn lằn chân ngón phú quốc (C phuquocensis) Ngô & Grismer, 2010; Thằn lằn chân ngón ro-x-lo (C roesleri) Ziegler và cs, 2010; Thằn lằn chân ngón yang bay (C

yangbayensis) Ngô & Onn, 2010; Thằn lằn chân ngón cúc phương (C cucphuongensis) Ngô & Onn, 2011; Thằn lằn chân ngón hương sơn (C huongsonensis) Lưu và cs, 2011; Thằn lằn chân ngón martin (C martini) Ngô Văn

Trí, 2011; Thằn lằn chân ngón bi đúp (C bidoupimontis) Nazarov và cs, 2012; Thằn lằn chân ngón bù gia mập (C bugiamapensis) Nazarov và cs, 2011; Thằn lằn chân ngón hoàng đức đạt (C dati) Ngô Văn Trí, 2013; Thằn lằn chân ngón king sa da (C

kingsadai) Ziegler và cs, 2013; Thằn lằn chân ngón phước bình (C phuocbinhensis)

Nguyễn và cs, 2013; Thằn lằn chân ngón tây nguyên (C taynguyenensis) Nguyễn và cs, 2013; Thằn lằn chân ngón cực đông (C cucdongensis) Schneider và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón pù hu (C puhuensis) Nguyễn và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón thương (C thuongae) Phùng và cs, 2014; Thằn lằn chân ngón bô-b-rốp (C bobrovi) Nguyễn và cs, 2015; Thằn lằn chân ngón ô ta (C otai) Nguyễn và cs, 2015; Thằn lằn chân ngón sơn (C soni) Lê và cs, 2016; Thằn lằn chân ngón gia lai (C

gialaiensis) Lưu và cs, 2017; Thằn lằn chân ngón sơn la (C sonlaensis) Nguyễn và

cs, 2017; Thằn lằn chân ngón sang (C sangi) Pauwels và cs, 2018 [42]

Hình 4 Số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus tại Việt Nam qua từng năm

[42] Trong 5 năm trở lại đây (từ năm 2019 đến năm 2023), một loạt các cuộc khảo sát được tiến hành tại các khu vực phân bố tiềm năng ở Việt Nam dẫn tới ghi

1 3 4

5 710

17 1822 25

2832 35

37 38 40 41

43 4549 52

0102030405060

191719211997200320062007200820092010201120122013201420152016201720182019202020212023

nhận và mô tả 11 loài mới thuộc giống này, bao gồm: Thằn lằn chân ngón bảy núi

(C septimontium) Murdoch và cs, 2019; Thằn lằn chân ngón tây bắc (C

taybacensis) Phạm và cs, 2019; Thằn lằn chân ngón cù lao chàm (C culaochamensis) Ngô và cs, 2020; Thằn lằn chân ngón phù mỹ (C phumyensis)

Ostrowski và cs, 2020; Thằn lằn chân ngón chứng (C chungi) Ostrowski, 2021; Thằn lằn chân ngón ngật (C ngati) Lê và cs, 2021; Thằn lằn chân ngón orlovi (C

orlovi) Đỗ và cs, 2021 và Thằn lằn chân ngón ra glai (C raglai) Nguyễn và cs,

2021; Thằn lằn chân ngón arndt (C arndti) Ngô và cs, 2023; Thằn lằn chân ngón chư mư (C chumuensisi) Ngô và cs, 2023 và thằn lằn chân ngón tây hòa (C

badenensis, C nigriocularis, C thuongae,…) [28, 34] Ngoài ra, một số loài còn

thích nghi với các loại sinh cảnh đặc biệt khác như: thảm thực vật cây bụi ven biển

xen lẫn với đá cuội, đá granit (C kingsadai) [46], trên đá granit, môi trường sống xung quanh là rừng thứ sinh hỗn giao của cây bụi gai nhỏ (C cucdongnensis) [38], rừng nhiệt đới gió mùa (C bugiamapensis) [24] hoặc trên cây cà phê (C

gialaiensis) [20] Các loài này thường được tìm thấy ở nhiều độ cao khác nhau kéo

dài từ 5m (C cucdongensis) cho tới 1700m (C bidoupimontis) so với mực nước

biển [24, 38]

1.1.2 Một số nghiên cứu về quan hệ di truyền của các loài thuộc giống

Cyrtodactylus ở Lào, Thái Lan, Việt Nam

Hiện nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về phát hiện và mô tả các loài mới thuộc giống thằn lằn ngón tại nhiều tỉnh của Lào, Thái Lan và Việt Nam Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh và địa sinh học của các loài thuộc giống thằn lằn ngón ở ba nước này cũng đã được thực hiện Ví dụ như:

Nghiên cứu của Ngô Thị Hạnh và cs, (2023) về sự phân bố của tất cả các loài

trong nhóm Cyrtodactylus irregularis tại khu vực Đông Dương và mô tả 2 loài mới ở Việt Nam là C chumuensis và C arndti [27] Ngoài ra, nghiên cứu còn nhấn

mạnh tiềm năng có nhiều loài mới được mô tả dựa trên các mẫu của nhóm loài phức

tạp (C pseudoquadrivirgatus) và các khu vực tiềm năng chưa được nghiên cứu kỹ ở

Việt Nam [27]

Nghiên cứu của Ngô Thị Hạnh và cs, (2022) đã chỉ ra tổng cộng 68 loài được mô tả và ghi nhận phân bố ở Lào và Việt Nam dựa vào các bằng chứng về phân tử và hình thái học [26] Mặt khác, các phân tích phân tử cho thấy có ít nhất 7 loài

chưa được mô tả ở Việt Nam và Lào, trong đó: một loài thuộc nhóm C angularis, một loài thuộc nhóm C chauquangensis và 5 loài thuộc nhóm C irregularis [26]

Từ đó, nghiên cứu nhấn mạnh rằng sẽ có thêm nhiều loài mới được phát hiện ở các khu vực chưa được nghiên cứu chi tiết ở miền Trung Việt Nam và miền Bắc và

miền Nam Lào [26] Mặt khác, nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng loài C thuongae là loài đồng danh với loài C dati và loài C rufford loài đồng danh với loài C

Lomyenensis [26]

Nghiên cứu của Nicole Schneider và cs, (2020) đã mô tả loài C

houaphanensis ở tỉnh Houaphan (Lào) và C ngoiensis ở tỉnh Luang Prabang (Lào)

[37] Trong đó, loài C houaphanensis có hình thái giống với C chauquangensis; loài C ngoiensis được cho là thành viên của nhóm loài C chauquangensis, nhưng có hình thái giống với loài C dumnuii ở Thái Lan [37] Theo các phân tích phát sinh loài, loài C ngoiensis là đơn vị phân loại cơ bản của một nhánh bao gồm C

spelaeus, C chauquangensis, C vilaphongi, C cucphuongensis, C puhuensis, C houaphanensis, C otai và C bobrovi [37] Mặt khác, nghiên cứu cũng mô tả lại về

loài C bansocensis dựa vào các mẫu vật mới được thu từ miền Trung Lào [37]

Nghiên cứu của Chomdej và cs, (2021) dựa trên các loài thuộc giống

Cyrtodactylus được tìm thấy ở miền Bắc và miền Tây Thái Lan đã làm sáng tỏ mối

quan hệ phát sinh loài và xác định mô hình phân bố của chúng tại đây [7] Nghiên

cứu cho thấy các loài phân bố ở miền Bắc và miền Tây Thái Lan chia làm 4 nhánh: một nhánh bao gồm các loài phân bố ở Tây Bắc (A), Bắc (B), Tây (C) và một nhánh đặc biệt được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái cụ thể (D) [7] Ngoài ra, nghiên

cứu này cung cấp bằng chứng về tính đa dạng sinh học tiềm ẩn của Cyrtodactylus ở

những khu vực này [7]

Nghiên cứu của Lee Grismer và cs, (2021) đã phân tích phát sinh chủng loại

của 310 loài thuộc giống Cyrtodactylus bao gồm hàng chục loài chưa bao giờ được

đưa vào phân tích dựa vào dữ liệu từ cả gen ty thể và gen nhân [13] Nghiên cứu đã

chỉ ra rằng, các loài thuộc giống Cyrtodactylus thuộc 31 nhóm loài đơn ngành [13] Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng số lượng các loài thuộc giống Cyrtodactylus

trong nghiên cứu vẫn chưa đại diện đầy đủ cho các loài đã được mô tả [13]

Nghiên cứu của Lee Grismer và cs, (2020) đã phân tích tiến hóa môi trường

sống của 243 loài thuộc giống Cyrtodactylus [12] Kết quả chỉ ra rằng các loài thằn

lằn ngón tổ tiên có sinh cảnh sống tự do và tần suất chuyển đổi từ sinh cảnh sống tự do sang sinh cảnh sống chuyên biệt xảy ra thường xuyên hơn khoảng bốn lần so với chiều ngược lại và quá trình chuyển đổi này có thể không phức tạp về mặt sinh thái [12] Ngoài ra, hai nhánh lớn không liên quan đến các loài liên quan đến sinh cảnh núi đá vôi tập trung ở phía Bắc Đông Dương và nhánh lớn nhất gồm các loài liên quan đến đá granit phân bố ở bán đảo Thái-Malay [12] Ngoại trừ sở thích về sinh cảnh sống tự do, dữ liệu cho thấy các loài có sinh cảnh sống núi đá vôi vượt xa tất cả các loài khác (lần lượt là 29,6% so với 0,4%–10,2%) [12]

1.2 Tổng quan về nhóm Cyrtodactylus angularis

Nhóm Cyrtodactylus angularis là một trong số 31 nhóm loài đơn ngành được

phân tích trong nghiên cứu của Grismer và cs, (2021) [13] Nhóm này có số lượng

các loài tương đối lớn (chỉ sau nhóm irregularis) so với các nhóm còn lại [13] Các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis có vùng phân bố khác nhau, thích nghi với

núi đá vôi từ miền Trung Việt Nam, miền Trung và Bắc Lào, phía Đông và miền Trung Thái Lan, và có thể là cực Nam Trung Quốc [21, 23, 25, 29, 45] Ngoại lệ

duy nhất là loài Сyrtodactylus nigriocularis, xuất hiện xa hơn về phía Nam của Việt

Nam ở núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh và sống ở các hang đá granit [13] Nhóm

Cyrtodactylus angularis bao gồm 17 loài đã được mô tả và hơn 80% số loài trong

nhóm được mô tả trong vòng 15 năm qua [13]

Hình 5 Cyrtodactylus bansocensis [8]

Hình 6 Cyrtodactylus chanhomeae [37]

Về hình thái, để phân biệt các loài thuộc nhóm này người ta thường dựa vào các đặc điểm khác nhau như: hoa văn trên thân, chiều dài cơ thể tính từ đầu tới lỗ hậu môn, số lượng vảy ngang thân, số lượng vảy ở đốt ngón tay và ngón chân số 4,

kiểu vảy mở rộng hoặc không mở rộng ở đuôi [24] Ví dụ như: Loài C bansocensis (Hình 5) khác với loài C chanhomeae (Hình 6) ở chỗ có ít vảy bụng hơn (30–35 so

với 36–38), ít nốt sần lưng hơn (14–15 so với 16–18), quai gáy màu nâu có viền sẫm màu (so với rìa màu vàng) và các dải cơ thể màu trắng xám giữa các chi (so với

màu vàng) [21] Các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis tuy rất giống nhau

về mặt hình thái nhưng lại có sự phân tách khá rõ ràng về mặt di truyền gây ra những khó khăn trong việc phân loại chỉ dựa trên các đặc điểm về hình thái (Hình 7) [11] Do đó, cần kết hợp giữa chỉ thị di truyền và hình thái trong các nghiên cứu

về phân loại các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis [13]

Hình 7 Một số loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis [13]

(Hình 8A: С sommerladi ở tỉnh Khammouan, Lào Hình 8B: С nigriocularis ở tỉnh Tây Ninh, Việt Nam Hình 8С: С soudthichaki ở tỉnh Khammouan, Lào Hình 8D: С

phongnhakebangensis (con non) ở tỉnh Quảng Bình, Việt Nam)

Theo Lee và cs, (2021), các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis được

tập hợp thành ba phân nhóm chính Trong đó, phân nhóm đầu tiên gồm ba loài có

phân bố ở miền Đông Thái Lan và miền Bắc Lào (С angularis, С chanhomeae, và

С pageli); phân nhóm thứ hai là các loài phân bố ở khu vực núi đá vôi miền Trung

Trường Sơn thuộc miền Đông Lào và miền Trung Việt Nam (С roesleri, С

sommerladi, С bansocensis, С lomyenensis, С jaegeri và С soudthichaki), và

phân nhóm cuối cùng bao gồm các loài có phân bố rộng và thích nghi với sinh cảnh

sống trên núi đá vôi từ miền Đông Thái Lan (С jarujini), Lào (С multiporus, С

teyniei, С.hinnamnoensis, С.darevskii, và С.calamei), và Việt Nam (С phongnhakebangensis) [13] Ngoài ra, loài С nigricularis là loài chị em với tất cả

các loài khác trong nhóm loài này [11] Do môi trường sống núi đá vôi ở Lào và miền Trung Việt Nam thuộc về một trong những vùng đá vôi lớn nhất thế giới – nhiều khu vực trong khối núi đá vui này vẫn chưa được khám phá Vì vậy, các cuộc khảo sát thực địa bổ sung kết hợp với các nghiên cứu phân loại tổng hợp chắc chắn sẽ phát hiện thêm các loài đặc hữu phạm vi hẹp mới thuộc nhóm này [13]

1.3 Chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loại

Trong những năm gần đây, việc sử dụng trình tự ADN trong các nghiên cứu phát sinh chủng loại đã trở nên ngày càng phổ biến Hệ gen ty thể và hệ gen nhân bao gồm các đặc điểm và phương thức di truyền khác biệt nên được sử dụng phổ biến làm công cụ sinh học phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loại [6]

Gen ty thể

ADN ty thể là cấu trúc ADN hầu hết là mạch vòng kép nằm trong ty thể Hai loại sợi phân biệt nhau bởi thành phần nucleotit: sợi nặng (H-strand) giàu Guanine và sợi nhẹ (L-strand) giàu Cytosine nên phiên mã và sao chép ADN ty thể được diễn ra đồng thời [43] Chúng chiếm một lượng rất nhỏ so với lượng lớn vật chất di truyền của một tế bào nhân chuẩn (nằm chủ yếu trong nhân tế bào) [6] Mỗi ty thể chứa từ khoảng 2-10 bản sao của hệ gen ty thể [6] Số lượng ty thể là khác nhau giữa các loại tế bào dựa theo nhu cầu năng lượng của mỗi loại tế bào và số lượng bản sao ADN ty thể trong mỗi tế bào vào khoảng 100-10000 [6] Chiều dài của toàn bộ hệ gen ty thể là khác nhau giữa các loài khác nhau và có độ dài vào vào khoảng

15000-17000bp [6] ADN ty thể mã hoá cho 37 gen (28 gen trên sợi nặng và 9 gen trên sợi nhẹ), 13 gen trong đó mã hoá cho chuỗi polypeptit trong chuỗi truyền điện tử (trên tổng số 92 thành phần của chuỗi, phần còn lại được mã hoá bởi hệ gen nhân), 22 tRNAs và hai rRNAs [15] Bốn phần chính của ADN ty thể bao gồm: D-loop, rRNA, tRNA và đoạn gen mã hoá cho protein [15] Bởi vậy, ADN ty thể sở hữu những lợi thế như: trật tự các gen có tính bảo thủ, không có các vùng intron, di truyền theo dòng mẹ nên không có sự tái tổ hợp do trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể, tỷ lệ đột biến cao (5,7 x 108 – gấp 10 lần so với hệ gen nhân), có rất nhiều bản sao trong tế bào [2] Những ưu điểm này biến gen ty thể trở thành công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền và phát sinh chủng loại giữa các loài và quần thể [2]

Gen nhân

ADN nhân là tập hợp tất cả các ADN nằm trong nhân tế bào và chứa thông tin di truyền của hầu hết bộ gen tế bào nhân thực Các phân tử ADN nhân mang thông tin di truyền, kết hợp với prôtêin, được đóng gói trong nhiễm sắc thể Mỗi phân tử ADN nhân là ADN ở dạng tuyến tính mạch thẳng có đầu mút với chiều dài khoảng 3x109 bp Khác với ADN ty thể, mỗi ADN nhân chỉ chứa một bản sao trong tế bào và ADN nhân di truyền nghiêm ngặt theo các quy luật di truyền nhiễm sắc thể [41]

Mặc dù cả gen nhân và gen ty thể đều cung cấp cấu trúc di truyền của một sinh vật, nhưng có những đặc điểm khác biệt có thể được quan sát rõ hơn khi so sánh giữa các loài khác nhau ADN ty thể rất hữu ích trong nghiên cứu về sự hình thành loài vì nó có xu hướng tiến hóa đầu tiên trong sự phát triển của một loài mới, ngược lại nhiễm sắc thể của các gen hạt nhân có thể được kiểm tra và phân tích riêng lẻ, mỗi gen sẽ đưa ra sự khác nhau về mặt di truyền của các sinh vật [41] Từ đó việc kết hợp giữa ADN ty thể và ADN nhân để phân tích phát sinh chủng loại có thể cho ra kết quả có tính tổng quan hơn, đặc biệt đối với những loài mới được hình thành

Những nghiên cứu về các loài thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis vẫn còn

rất hạn chế và mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc nhóm này chưa được đánh giá một cách chi tiết Một số nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài

của các thành viên thuộc nhóm Cyrtodactylus angularis đã được thực hiện, tuy

nhiên các nghiên cứu này chỉ sử dụng số liệu sinh học phân tử ở mức độ hạn chế

dựa trên một hoặc hai đoạn gen Vì vậy, đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu mối quan

hệ tiến hoá của các loài đại diện thuộc nhóm loài thằn lằn ngón Cyrtodactylus angularis tại Lào, Thái Lan và Việt Nam” được thực hiện sử dụng trình tự ba

đoạn gen ty thể (COI, ND2, Cytb) và bốn đoạn gen nhân (Cmos, PDC, Rag1, Rpl35)

với mục tiêu: - Xác định được mối quan hệ di truyền của các loài thằn lằn ngón thuộc nhóm

Cyrtodactylus angularis ở Lào, Thái Lan và Việt Nam sử dụng trình tự của ba đoạn

gen ty thể (COI, ND2, Cytb) và bốn đoạn gen nhân (Cmos, PDC, Rag1, Rpl35)

- Phát hiện được các loài thằn lằn chân ngón dựa trên các phân tích di truyền nhằm giúp đánh giá mức độ đa dạng của nhóm loài này

Nghiên cứu này là tiền đề phân tích sâu hơn về tiến hóa (thời gian phân tách) và địa sinh học của nhóm loài này Vì vậy, nghiên cứu cần dựa trên cả gen ty thể và

gen nhân Các đoạn gen được lựa chọn trong nghiên cứu này (COI, ND2, Cytb,

Cmos, PDC, Rag1, Rpl35) đều là các đoạn gen đã có dữ liệu một phần ở Ngân hàng

gen Do vậy, sử dụng các đoạn gen này sẽ dễ dàng hơn trong việc so sánh, đối chiếu mẫu vật

CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu vật nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, 36 mẫu vật (một phần mẫu mô đuôi các cá thể còn sống) được thu ở nhiều địa điểm khác nhau tại Việt Nam và Lào bao gồm các địa

điểm có ghi nhận phân bố của các loài thằn lằn chân ngón nhóm Cyrtodactylus

angularis và một số địa điểm có tiềm năng phân bố của các loài thằn lằn chân ngón

thuộc nhóm này Thông tin chi tiết về các mẫu được thể hiện trong Bảng 1

Bảng 1 Thông tin mẫu vật được sử dụng trong nghiên cứu

STT Kí hiệu

mẫu

Bình

Bình

STT Kí hiệu

mẫu

Borikhamxay, Lào

2.1.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo theo các nghiên cứu trước đây Trình tự mồi được thể hiện trong Bảng 2 Các mồi được tổng hợp bởi công ty IDT, Mỹ

Bảng 2 Các cặp mồi cho các phản ứng PCR

cs, 2012 [24]

Cytb

L14910 GACCTGTGATMTGAAAACCAYCGTTGT Burbrink và

cs, 2000 [5] H16064 CTTTGGTTTACAAGAACAATGCTTTA Burbrink và

2007 [3] PHOR1 TCCACATCCACAGCAAAAAACTCCT Bauer và cs,

2007 [3]

Rag1

1999 [14] R18 GATGCTGCCTCGGTCGGCCACCTTT Groth và cs,

1999 [14]

Rpl35

N66F GCTAAACAAGCACAGAGTTGATCC Siler và cs,

2010 [39] N67R TCAGGCTCAGAAAGRACTATTATGG Siler và cs,

Phản ứng PCR thực hiện sử dụng hỗn hợp HotStarTaq mastermix (Qiagen, CHLB Đức) và hỗn hợp DreamTaq Mastermix (Thermo Fisher Scientific, Lithuania)

Sản phẩm phản ứng PCR được hiển thị bằng phương pháp điện di, sử dụng các hóa chất sau: agarose (1st_Base, Malaysia), ethidium bromide, tris base (Merck, CHLB Đức), EDTA (Merck, CHLB Đức), Boric Acid (Merck, CHLB Đức), marker 1kb, marker 100bp (ThermoFisher Scientific, Lithuania) và TriTrack 6X (ThermoFisher Scientific, Lithuania)

Sản phẩm PCR thành công được tinh sạch sử dụng bộ kit GeneJET PCR Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania)

2.1.4 Phần mềm tin sinh

Các phần mềm tin sinh được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Công cụ BLAST trên Ngân hàng Gen (GenBank), Sequencher v5.4, Bioedit v7.1, ClustalW v2.1, jModeltest v2.1.4, MrBayes v3.2.7, IQ-TREE v1.6.7, Figtree v1.3.1

2.1.5 Thiết bị

Các thiết bị, máy móc để phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu mẫu thực địa

Khu vực khảo sát thực địa: Mẫu vật được thu ở hai tỉnh của Việt Nam: Tây Ninh, Quảng Bình và ba tỉnh của Lào: Borikhamxay, Khammouane, Viêng Chăn Các mẫu vật thu ở Lào được tiếp nhận từ các chuyên gia của Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam

Thời gian khảo sát và thu mẫu thực địa: Thời gian nghiên cứu khảo sát và thu mẫu thực địa được tiến hành trong 3 tháng (Từ tháng 5/2022-7/2022) Thời điểm khảo sát tiến hành vào ban đêm từ 17h – 23h

Dụng cụ khảo sát thực địa: Các dụng cụ phục vụ cho công tác điều tra thực địa gồm có: máy định vị GPS, thước đo điện tử độ chính xác 0,01 mm, phiếu giám sát, máy đo nhiệt độ, độ ẩm, máy ảnh, đèn đội đầu, thước dây, bông tăm, dao lam, bật lửa, bút đánh dấu, cồn, kẹp, tube đựng mẫu ADN, găng tay

Hình 8 Bản đồ vị trí các khu vực thu mẫu

Phương pháp thu mẫu: Mẫu vật được thu bằng tay và các dụng cụ chuyên dụng như kẹp có bọc cao su để tránh gây tổn thương đến con vật Mẫu vật sau khi đo đếm, chụp ảnh được thả lại đúng điểm đã thu thập Một số mẫu sẽ được thu để phục vụ nghiên cứu hình thái và sinh học phân tử

Thu mẫu để tách ADN: Các mẫu mô cơ, gan hoặc mô đuôi được thu thập, lưu trữ riêng trong cồn 70% (Merk, CHLB Đức) và vận chuyển đến phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

Các mẫu được tách chiết ADN tổng số sử dụng 2 bộ kit: GeneJET Genomic ADN Purification Kit (ThermoFisher Scientific, Lithuania) đối với các mẫu tươi và QIAamp ADN Mini Kit (Qiagen, CHLB Đức) đối với các mẫu mô đã thu từ lâu và bảo quản trong điều kiện không đảm bảo Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có chỉnh lý một số thể tích hóa chất khi sử dụng

a Kit GenJet Genomic ADN Purification (ThermoFisherScientific, Lithuania)

Quy trình được áp dụng với những mẫu tươi, mới thu, có nồng độ cao được bảo quản trong cồn 70%

Quy trình tách chiết được thực hiện theo các bước cụ thể như sau: phá màng tế bào và loại bỏ protein (cắt mẫu thành những mảnh nhỏ, để khô, cho vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung 180 µl dung dịch Digestion Solution và 20 µl Proteinase K, trộn đều hỗn hợp, ủ mẫu ở 56°C trong 4 giờ, trong quá trình ủ thường xuyên trộn đều hỗn hợp); loại bỏ RNA (bổ sung 20 µl Rnase A Solution, trộn đều hỗn hợp, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, bổ sung 200 µl Lysis solution, trộn đều hỗn hợp cho đến khi dung dịch đồng nhất); kết tủa ADN (bổ sung 400 µl cồn 50%, trộn nhẹ hỗn hợp); thu ADN trên cột (chuyển toàn bộ hỗn hợp sang cột lọc GeneJET Genomic ADN Purification Column, ly tâm vận tốc 6000 x rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng); làm sạch ADN (bổ sung 500 Wash Buffer I, ly tâm vận tốc 8000 x rcf trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc, bổ sung 500 µl Wash Buffer II, ly tâm vận tốc 13000 x rcf trong 3 phút, loại bỏ dịch lọc); làm khô màng lọc (ly tâm vận tốc 8000 x rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng); hòa tan ADN (chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5 ml, bổ sung 60 µl đệm Elution, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm vận tốc 8000 x rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng); thu mẫu và bảo quản ở 4°C

b QIAamp ADN Mini Kit (Qiagen, CHLB Đức)

Quy trình được áp dụng với những mẫu mô đã thu từ lâu, lượng mẫu ít được bảo quản trong cồn 70%

Quy trình tách chiết được thực hiện theo các bước cụ thể như sau: tiền xử lý mẫu (cắt mẫu thành những mảnh nhỏ, để khô, cho vào ống eppendorf 1,5 ml); phá màng tế bào và loại bỏ protein (bổ sung 180 µl dung dịch ATL và 20 µl Proteinase K, trộn đều hỗn hợp, ủ mẫu ở 56°C trong 4 giờ, trong quá trình ủ thường xuyên trộn đều hỗn hợp); kết tủa ADN (bổ sung 200 µl AL, trộn đều hỗn hợp, ủ mẫu ở 70°C trong 10 phút, bổ sung 200 µl cồn 100%, trộn nhẹ hỗn hợp); thu ADN trên cột (chuyển toàn bộ hỗn hợp sang cột lọc DNeasy MiniSpin Column, ly tâm vận tốc 6000 x rcf trong 1 phút 30 giây ở nhiệt độ phòng); làm sạch ADN (bổ sung 500 µl đệm AW1, ly tâm vận tốc 6000 x rcf trong 1 phút 30 giây, loại bỏ dịch lọc, bổ sung 500 µl đệm AW2, ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 3 phút 30 giây, loại bỏ dịch lọc); làm khô màng lọc (ly tâm vận tốc 6000 x rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng); hòa tan ADN (chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5 ml, bổ sung 60 µl đệm AE, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm vận tốc 6000 x rcf trong 1phút 30 giây ở nhiệt độ phòng); thu mẫu và bảo quản ở 4°C

Sau khi tách chiết ADN tổng số, nồng độ ADN tổng số thu được, được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%, đệm TBE 1X (Tris base, Boric acid, EDTA pH 8) ở 100V trong vòng 25 phút ADN tổng số được so sánh với marker 1kb và sau đó được hiển thị bằng tia cực tím trên máy Alphamager MINI (Protein Simple, Mỹ)

2.2.3 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR được thực hiện để nhân bản 3 đoạn gen ty thể (COI kích thước ~ 750bp, Cytb kích thước ~ 1141bp, ND2 kích thước ~ 1444bp) và 4 đoạn gen nhân (Cmos kích thước ~ 417bp, PDC kích thước ~ 470bp, Rag1 kích thước ~ 1300bp,

Rpl35 kích thước ~ 500bp) với các cặp mồi như đã trình bày trong Bảng 2 Nghiên

cứu này ưu tiên sử dụng mastermix thành phẩm nhằm bỏ qua thời gian tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR và tiết kiệm nguồn mẫu vốn ít ỏi để có thể tiến hành nhân bản các đoạn gen khác, phục vụ mở rộng nghiên cứu về tiến hóa trong tương lai Hai mastermix thành phẩm được sử dụng trong nghiên cứu gồm HotStarTaq Mastermix dùng để nhân bản mẫu có nồng độ ADN thấp và DreamTaq MasterMix

dùng để nhân bản mẫu có nồng độ ADN cao

Tổng thể tích của mỗi phản ứng PCR là 21 µl, bao gồm 1-2 µl ADN khuôn (tùy theo nồng độ ADN tổng số), 2 µl mỗi mồi (10 µM/L), 5 µl nước, 10 µl Dream Taq Mastermix hoặc HotStar Taq Mastermix Chu trình nhiệt của phản ứng PCR là 95°C ở 15’ đối với mastermix của Qiagen và 5’ đối với mastermix của ThermoFisher để hoạt hóa Taq; 35 chu kỳ phản ứng ở 95°C trong 30’’, 48°C – 56°C trong 45’’, 72°C trong 1’; bước kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 10’ Đối chứng âm được tiến hành song song trong mỗi lần tách chiết cũng như trong mỗi lần PCR

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%, 2pg/ml ethidium-bromide, trong đệm TBE 1X (Tris base, Boric acid, EDTA pH 8) ở 100V trong 25 phút Kích thước tương đối của sản phẩm được so sánh với marker 100bp hoặc 1kb và quan sát dưới tia cực tím trên máy Alphamager MINI (Protein Simple, Mỹ)

2.2.4 Tinh sạch và giải trình tự

Các sản phẩm PCR thành công sau đó được tinh sạch sử dụng kit GeneJET PCR Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania) để loại bỏ các yếu tố gây ảnh hưởng đến phản ứng giải trình tự Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bao gồm các bước: gắn ADN lên màng (bổ sung 15 µl Binding Buffer, trộn đều hỗn hợp, chuyển toàn bộ dịch sang cột lọc GeneJET Purification Column, ly tâm vận tốc 13000 rpm trong 1 phút 30 giây ở nhiệt độ phòng); làm sạch ADN (bổ sung 400 µl Wash Buffer, ly tâm vận tốc 13000 rpm trong 1 phút 30 giây ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch lọc); làm khô màng lọc (ly tâm vận tốc 13000 rpm trong 1 phút