nguyễn thị thơm nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số hợp chất terpenoid từ lá ổi

Trong đó, các hợp chất terpenoid phân lập từ lá ổi dành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học, với nhiều hợp chất như meroterpen, triterpen, sesquiterpen thuộc nhóm terpenoid đã đư

TỔNG QUAN

Tổng quan về dược liệu

Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae)

Tên khoa học: Psidium guajava L

Hình 1.1 Hình ảnh cây ổi [7]

Cây ổi là một cây nhỡ, cao chừng 3-5m, cành nhỏ thì vuông cạnh Lá mọc đối có cuống ngắn, hình bầu dục, nhẵn hoặc hơi có lông ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn, phiến nguyên, khi soi lên có thấy túi tinh dầu trong Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá Quả là một quả mọng có vỏ quả giữa dày, hình dáng thay đổi tùy theo loài; ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại Rất nhiều hạt, hình thận, không đều, màu hơi hung [1]

Psidium guajava L là loại cây có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới như Châu Phi, Ấn Độ, Đông Nam Á và Nam Mỹ Cây ổi được trồng khắp Việt Nam cả đồng bằng lẫn miền núi, ngoài ra, ở vùng trung du và núi thấp xuất hiện quần thể ổi mọc hoang dại Một số nước có lượng ổi trồng lớn nhất thế giới như Braxin, Mexico, Thái Lan, Indonesia [4], [24]

Lá và búp non, vỏ rễ, thân rễ, quả ổi [1].

Thành phần terpenoid của lá ổi (Psidium guajava L.)

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, lá ổi chứa catecol, tanin, tinh dầu, thành phần tinh dầu lá ổi gồm limonem, sesquiterpen alcol bậc 2 và sesquiterpen alcol bậc 4 [4]

Lá ổi còn chứa flavonid, saponin, polyphenol, terpenoid và một số triterpen quan trọng như acid ursolic, oleanolic, cratagolic và guaijavolic, và amritosid [4], [17]

Trong đó terpenoid là một trong những thành phần chính của lá ổi Terpenoid, hay isoprenoid, là các sản phẩm tự nhiên dựa trên isopren có vai trò cơ bản trong quá

3 trình trao đổi chất của mọi sinh vật Dựa vào số đơn vị isopren có thể chia terpenoid thành các nhóm như sau: hemiterpenoid, monoterpenoid, sesquiterpen, diterpenoid, sesterterpenoid, triterpenoid, tetraterpenoid và polyterpenoid [10], [34] Trong lá ổi, các nhóm hợp chất terpenoid chính đã được phân lập bao gồm monoterpen, meroterpen, sesquiterpen và triterpenoid [19]

Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần terpenoid của lá ổi

Các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất terpeniod từ lá ổi được nhiều tác giả trên thế giới tiến hành, nhiều hợp chất terpenoid có hoạt tính sinh học cũng đã được tìm ra Điển hình là nghiên cứu của Ying Wang và cộng sự, nhóm nghiên cứu đã tìm ra được bốn hợp chất triterpenoid mới psiguanin A-D cùng với 13 hợp chất đã biết là acid jacoumaric; acid 3β-O-trans-p-coumaroylmaslinic; acid 3β-O-trans-ferulyl-2α- hydroxy-urs-12-en-28-oic; acid eucalyptolic; acid 3β-O-cis-coumaroyl-2α-hydroxy- urs-12- en-28-oic; acid 3β-O-cis-p-coumaroylmaslinic; acid 3β-O-cis-ferulyl-2α- hydroxy-urs-12-en-28-oic; acid 6β-hydroxymaslinic; acid asiatic; acid urjinolic; acid 3β-acetylursolic; acid 3β,13β-dihydroxyurs-11-en-28-oic và 3β-hydroxyurs-11-en- 28,13β-olid [25]

Bên cạnh các hợp chất triterpenoid, các hợp chất monoterpen và sesquiterpen cũng đã được phân lập qua các nghiên cứu của Arain cùng các cộng sự năm 2019 và nghiên cứu của Silva cùng các cộng sự năm 2021 Các chất tìm được chủ yếu có khung cấu trúc caryphyllan, aromadendren đối với sesquiterpen và khung p-methan, pinan đối với monoterpen Điển hình là β-caryophyllen - hợp chất sesquiterpen được hai nhóm nghiên cứu trên tìm ra có tác dụng dược lí đã được chứng minh và công nhận [6], [33] Kokilananthan S và các cộng sự cũng đã tìm ra được các hợp chất monoterpen và sesquiterpen trong nghiên cứu của mình Cụ thể, các monoterpen tìm được là α-pinen, β-myrcen, crithmen, β-ocimen, terpilen; các sesquiterpen như là β- farnesen, γ-muurolen, valencen, β-panasinsen, cis-α-bisabolen và một số sesquiterpen khác [23]

Meroterpenoid phân lập từ lá ổi cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và tiến hành phân lập Có đến 75 hợp chất meroterpen đã được phân lập từ lá ổi từ năm

2007 đến năm 2022, việc phân lập được tiến hành thông qua các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký cột (cột silca gel, cột polyamit hay cột flash), TLC và HPLC Sử dụng HPLC kết hợp với phương pháp khối phổ cũng được sử dụng để so sánh sự khác biệt về cấu trúc hóa học giữa các terpenoid với nhau [37]

Trong đó, 75 hợp chất meroterpenoid thu được chia làm ba nhóm: nhóm 1 dựa trên cấu trúc sesquiterpenoid, nhóm 2 dựa trên cấu trúc monoterpen và nhóm 3 các meroterpenoid khác Với nhóm 1 người ta đã phân 60 meroterpenoid trong đó lại được

4 chia làm các nhóm nhỏ dựa vào khung cấu trúc Cụ thể như guajavadial B-C, psiguadial C-D, psiguamer C, guajamer A, psiguadiol J, psidiguajadiol A-C dựa trên bicyclogermacran của sesquiterpen Psiguadiol A-C, guapsidial A, guajamer I, psiguajadial D dựa trên caryophylen Hay guajadial E-F, psiguajadial, guajamer B, có cấu trúc dựa trên cadinan của sesquiterpen Nhóm 2 gồm các meroterpenoid dựa trên monoterpen có 12 chất đã phân lập được và chia làm 2 loại nhỏ là dựa trên thujan và pinna Nhóm 2 gồm các chất như guajadial A, guadial A-C, guajamer E-F hay guajamer G Còn lại, guajavadimer A và psidguajon A-B có cấu trúc phức tạp nên được xếp vào nhóm các meroterpenoid khác [37]

Bảng 1.1: Cấu trúc một số terpenoid phân lập từ lá ổi

STT Hoạt chất Nhóm hoạt chất Cấu trúc hóa học TL

Các Nghiên cứu trong nước về thành phần terpenoid của lá ổi

Một số nghiên cứu trong nước đã được thực hiện, chủ yếu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lí của lá ổi [2], [3].Tuy nhiên hiện nay, các nghiên cứu liên quan đến chiết xuất các hợp chất terpenoid từ cao chiết lá ổi vẫn còn đang hạn chế.

Tác dụng sinh học của terpenoid từ lá ổi

1.3.1 Tác dụng chống ung thư

Nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới chỉ ra tác dụng chống ung thư của cao chiết lá ổi đối với ung thư đường tiêu hóa, ung thư phổi, ung thư phụ khoa (ung thư cổ tử cung và ung thư buồng trứng), ung thư da và ung thư tiền liệt tuyến [19] Một trong số đó là nghiên cứu chống ung thư bao gồm in vitro và in vivo về dịch chiết diclomethan và ethanol của lá ổi trên chín dòng tế bào ung thư- ung thư phổi (NCI- H460), ung thư vú (MCF-7), ung thư ruột (HT-29), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), bệnh bạch cầu (K562), ung thư thận (786-0), ung thư buồng trứng (OVCAR-3), ung thư buồng trứng kháng (NCI/ADR-RES) và các dòng tế bào u ác tính (UACC-62) Guajadial, một meroterpenoid phân lập từ lá ổi đã được chứng minh là có hoạt tính chống lại ung thư biểu mô phổi (A549) và (H1650) Nghiên cứu cũng chỉ ra guajadial ngăn chặn sự phát triển khối u (A549) ở chuột xenogaft [32], [39] Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng guajadial chiết xuất từ lá ổi có hoạt tính chống tăng sinh chọn lọc đáng kể các tế bào ung thư vú (MCF-7) và (MCF-7 BUS), với giá trị TGI lần lượt là 5,59 và 2,27 àg/mL, được đỏnh giỏ bằng xột nghiệm SRB [8]

Bên cạnh guajadial, β-caryophyllen- hợp chất sesquiterpenoid cũng được báo cáo là hợp chất có thể làm tăng sự tích tụ nội bào của các chất chống ung thư, do đó làm tăng khả năng gây độc tế bào của chúng do sự hấp thụ 5-fluorouracil qua da người β-Caryophyllen tạo điều kiện cho paclitaxel đi qua màng và do đó tăng cường hoạt động chống ung thư của nó [6] Các hợp chất meroterpenoid gồm guajavadial A, guajavadial B và guajavadial C cho thấy hoạt tính gây độc tế bào vừa phải trong khoảng từ 22,28 đến 3,38 μM, trong đó guajavadial C là hiệu quả nhất với giá trị

IC50 là 3,54 μM đối với các dòng tế bào (SMMC-7721) so với cisplatin đối chứng dương tính (IC50 19,82 μM) Những kết quả này cho thấy lá Psidium guajava L có thể

10 cung cấp một nguồn hợp chất trị liệu tiềm năng cho cả việc phòng ngừa và điều trị ung thư [38]

Rizzo và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm in vitro, in vivo và in silico của dịch chiết lá ổi Kết quả chỉ ra rằng guajadial, psidial A, psiguadial A và psiguadial B có cơ chế chống estrogen tác dụng tương tự như tamoxifen -thuốc điều trị ung thu vú Một nghiên cứu khác đã điều tra hoạt động chống estrogen trong cơ thể của guajadial, chứng minh rằng meterpenoid được làm giàu theo tỷ lệ đã ức chế tác dụng tăng sinh của estradiol trên tử cung của chuột trước tuổi dậy thì Những kết quả này cho thấy guajadial có tác dụng ức chế khối u thông qua các thụ thể estrogen và có cơ chế hoạt động tương tự như tamoxifen [37]

Dịch chiết nước lá ổi đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn, do tác dụng ức chế các chủng tụ cầu vàng kháng kháng sinh trên lâm sàng Ngoài ra, dịch chiết metanol còn có tác dụng ngăn chặn phát triển của các chủng khác nhau từ một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp., Proteus spp Hơn nữa, dịch chiết của lá trong các dung môi như là aceton, methanol còn cho thấy hoạt động ức chế tiềm năng chống lại vi khuẩn gram (+), vi khuẩn gram (-) và vi nấm Lá ổi cũng được khuyên dùng để điều trị bệnh tiêu chảy truyền nhiễm vì chúng ngăn chặn sự xâm nhập của Citrobacter Rodentium vào đường ruột ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ Ở chuột, sự cải thiện các triệu chứng bệnh tả do Vibrio cholerae Ở gà con, chiết xuất lá ổi giúp kiểm soát bệnh tiêu chảy do

Escherichia coli gây ra và làm giảm mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng của nó

[14] β-Caryophyllen (trans-caryophyllen) là một sesquiterpen hoạt động như một bộ điều biến thụ thể cannabinoid, có đặc tính chống viêm và giảm đau và có thể có những ứng dụng tiềm năng trong việc kiểm soát cơn đau và điều trị chống lo âu α-Humulen là một loại sesquiterpen khác, α-humulen, đã được nghiên cứu về tác dụng chống viêm và giảm đau, nó cũng có thể có những ứng dụng tiềm năng trong việc kiểm soát cơn đau và như một chất chống ung thư [21]

Mụn trứng cá là một bệnh viêm mãn tính liên quan đến sự xâm chiếm của

Propionibacterium Acness- vi khuẩn có ở nang lông, cộng với việc kích hoạt bạch cầu trung tính và tế bào lympho Dịch chiết từ lá ổi có tác dụng kháng khuẩn mạnh hoạt động chống lại vi khuẩn này ngoài ra còn có hoạt tính chống viêm, do vậy rất có lợi trong việc điều trị mụn trứng cá [18] γ-terpinen và γ-pinen được báo cáo rằng có hoạt tính kháng khuẩn chống lại Propionibacterium Acness Nồng độ ức chế tối thiểu được

11 tỡm thấy ở dịch chiết lỏ ổi trong metanol là 526 àg/ml và dịch chiết nước là 7,5 mg/ml đối với Propionibacterium Acness [5]

1.3.4 Tác dụng hạ đường huyết

Enzym protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) là enzym đóng vai trò quan trọng bằng cách ức chế con đường truyền tín hiệu thông qua các thụ thể insulin và leptin (điều hòa ngược insulin và tập hợp các tín hiệu liên quan tới leptin) Cho đến nay, nhiều sản phẩm tự nhiên đã được phân lập từ thực vật có hoạt tính ức chế PTP1B như triterpen, sesquiterpen, alkaloid, flavonoid và meroterpenoid [37] Lá ổi theo truyền thống được biết đến là loại thảo dược cho bệnh nhân tiểu đường ở phương Đông, có khả năng điều chỉnh đường huyết bằng cách điều chỉnh tín hiệu liên quan đến insulin [11] Hiệu quả hạ đường huyết khi sử dụng nước sắc lá ổi đã được nhiều nghiên cứu chứng minh trên chuột, có ý nghĩa thống kê [17], [40] Các báo cáo khác cũng chỉ ra tác dụng ức chế của psidiguajadiols A-F đối với PTP1B, kết quả cho thấy psidiguajadiols C, D và F thể hiện hoạt động ức chế PTP1B với giá trị IC50 lần lượt là 9,83, 18,52 và 16,87 μmol/L [37]

Nước sắc lá ổi (0,01-0,625 mg/ml) cũng cho thấy sự ức chế đáng kể quá trình đường hóa LDL [37] Do đó, Psidium guajava L được coi là một tác nhân tốt chống lại quá trình glycat hóa LDL Tác dụng này có thể được mở rộng để ngăn ngừa nhiều loại bệnh tim mạch và thoái hóa thần kinh liên quan đến quá trình đường hóa [17]

1.3.5 Tác dụng chống oxy hóa

Acid uvaol, oleanolic và ursolic: Đây là những triterpen có nhiều lợi ích sức khỏe tiềm năng, bao gồm các đặc tính chống viêm và chống oxy [21] Các triterpen này đều đã được phân lập trong lá ổi trong những nghiên cứu trước đấy [9] Acid ursolic có thể làm tăng lượng chất chống oxy hóa, chẳng hạn như tỷ lệ glutathion/ glutathion bị oxy hóa; làm tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa như là superoxid dismutase ( SOD), catalase (CAT), glutathion reductase và glutathion peroxidase [13] Acid oleanic là chất loại bỏ gốc tự do hoạt động thông qua các phản ứng hóa học trực tiếp với các loại oxy phản ứng, hoạt động chống oxy hóa chính của phân tử là do sự biểu hiện tăng lên của các enzyme chống oxy hóa chẳng hạn như catalase và thioredoxin peroxidase, và tăng cường sinh tổng hợp glutathion chống oxy hóa [28]

Rishika và cộng sự chỉ ra rằng Psidium guajava thể hiện tác dụng chống oxy hóa của nó thông qua việc ức chế hoạt hóa yếu tố hạt nhân- kappa B (NF-κB) và phục hồi các chất chống oxy hóa [31]

1.3.6 Tác dụng bảo vệ gan

12 Theo Yuanyan và các cộng sự, chiết xuất lá ổi giàu các triglycerid có tác dụng trong việc bảo vệ gan Tác dụng này được đánh giá thông qua mô hình chuột đực tổn thương gan do dùng quá liều acetaminophen (APAP) (APAP là thuốc giảm đau hạ sốt thông thường, khi dùng quá liều dẫn đến dư thừa chất chuyển hóa gây độc gan từ đó làm cạn kiệt lượng glutathion dự trữ trong gan và có thể gây ra hoại tử gan) Kết quả của nghiên cứu cho thấy các triglycerid phân lập được từ lá ổi bao gồm acid ursolic, acidoleanolic, acid corosolic, acid maslinic và các triglycerid khác cải thiện đáng kể chức năng gan ở chuột thí nghiệm Đánh giá mô học của nghiên cứu trên cho thấy các triglycerid phân lập được từ lá ổi cải thiện cấu trúc gan do acetaminophen gây ra, cải thiện nồng độ AST và ALT trong huyết thanh chuột [41]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Mẫu nghiên cứu lá ổi thuộc về đề tài Nafosted mã số 108.06-2021.31 Lá ổi được thu hái ở xã Đông Hải, huyện Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình có tọa độ là

20 o 35ꞌ52.7ꞌꞌN 106 o 21ꞌ49.5ꞌꞌE, thu lá bánh tẻ của cây ổi trồng được 5 năm tuổi trở lên, không phun thuốc bảo vệ thực vật trong 1 năm trước khi thu hái Lá ổi được thu hái vào thời điểm 7- 9 giờ buổi sáng, vào tháng 9-10 dương lịch

Hình 2.1: Hình ảnh lá ổi

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

• Cân phân tích Sartorius TE214S

• Máy cô quay chân không BUCHI R-210

• Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam: Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ)

• Bản mỏng TLC Slica gel 60 F254

• Chất hấp phụ silica gel, RP-18

• Cột sắc kí, bình chạy sắc kí

• Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, bình gạn, ống đong 50 ml, ống đong 500 ml, ống nghiệm, bình cầu 1 cổ 1000 ml, bình cầu 1 cổ 100 ml, bình nón, quả bóp cao su, phễu, đũa thủy tinh, pipet thường 1 ml, 5ml, 10ml

Bảng 2.1: Danh sách các hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn CH2Cl2 từ lá ổi

- Phân lập một số hợp chất terpenoid từ phân đoạn CH2Cl2 của lá ổi

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng 2kg lá ổi chiết xuất bằng phương pháp ngâm nóng ở 60℃ với dung môi ethanol 96% tiến hành chiết xuất 3 lần sau đó cất thu hồi dung môi thu cắn chiết Tiến hành chiết 3 lần tỷ lệ DM/DL lần lượt là 10:1; 6:1 và 4:1 thể tích/ khối lượng Lần 1, tiến hành ngâm với 20 lít ethanol 96% trong vào 12 giờ Lần 2, tiến hành ngâm bã dược liệu ở lần 1 với 12 lít ethanol 96% trong vòng 8 giờ Lần 3 ngâm với 8 lít dung môi trong 8 giờ Đem cắn chiết thu được phân tán vào nước rồi chiết lần lượt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần, sử dụng phân đoạn CH2Cl2 để phân lập các hợp chất terpenoid

2.3.2 Phân lập các hợp chất terpenoid

Sử dụng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng

❖ Sắc kí lớp mỏng (TLC)

15 Dùng TLC để khảo sát hệ dung môi pha động và tỉ lệ dung môi tìm được để cho hiệu quả phân giải tối ưu nhất TLC còn được sử dụng để theo dõi quá trình rửa giải

Pha động di chuyển qua pha tĩnh đã được chấm hỗn hợp chất cần tách Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần thích hợp Pha tĩnh là chất hấp phụ được trải thành lớp đồng nhất trên bề mặt tấm kim loại

Chuẩn bị bình triển khai sắc ký và bản mỏng Bình triển khai là bình thủy tinh hình trụ cao 7 cm đường kính miệng 3 cm, có nắp đậy kín Bão hòa bằng cách đưa dung môi vào bình đậy kín đợi 5-10 phút Sử dụng bản mỏng TLC silica gel 60 F254

(Merck) đối với TLC pha thuận và RP-18 F254S với TLC pha đảo

Tiếp theo đưa mẫu lên bản mỏng Dùng ống mao quản thủy tinh để đưa mẫu lên bản, thể tích dung dịch khoảng 0,003 ml, đường xuất phát cách mép dưới 1 cm Sau khi mẫu đã được đưa lên, tiến hành chuẩn bị dung môi pha động, sử dụng hệ dung môi đơn hay đa thành phần theo tỉ lệ thích hợp

Triển khai sắc kí, đặt bản mỏng gần như thẳng đứng vào bình chạy sắc kí, đậy kín nắp, để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi trên bản mỏng chạy đến tiền tuyến dung môi, lấy bản mỏng ra và làm bay hơi dung môi còn đọng trên bản Xác định vết bằng bức xạ UV 254 nm và hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%

Sử dụng sắc kí cột pha đảo và pha thuận để phân lập các hợp chất terpenoid

Sắc kí cột được tiến hành dựa trên nguyên tắc phân cực Gồm có 2 pha là pha động và pha tĩnh Với pha tĩnh là chất hấp phụ điển hình như là silica gel và pha động là dung môi rửa giải chảy qua cột chất hấp phụ

Bước đầu tiên, tiến hành chuẩn bị cột Các cột thủy tinh với đường kính và độ dài thích hợp được rửa sạch treo trên giá đặt thẳng đứng Sử dụng EtOH tráng lại thật sạch và để khô tự nhiên

Tiếp theo tiến hành nhồi cột, cho lượng silica gel cần dùng lên cột (ước lượng khoảng 2/3 chiều dài cột) Sau đó đổ ra cốc có mỏ có dung tích phù hợp Phân tán lượng silica gel trên vào dung môi pha động trong cốc cỏ mỏ, dùng đũa thủy tinh khuấy đều Dùng ít bông gòn nhồi vào đáy cột để chặn silica gel Sau đó, nhồi silica

16 gel lên cột để cột ổn định thì tiến hành nạp mẫu Trong quá trình nhồi cột dùng quả bóp cao su gõ nhẹ vào cột nhồi để đuổi bọt khí, tránh gây tắc cột khi chạy

Nạp mẫu, có 2 cách là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt Nạp mẫu khô đối với mẫu không tan trong dung môi pha động, cần hòa tan trong dung môi gián tiếp khác, sau đó tiến hành hấp phụ bằng silica gel và cô quay đến khô tơi Nạp hết mẫu lên cột rồi tiến hành chạy Nạp mẫu ướt đối với mẫu tan trong dung môi pha động, tiến hành hòa tan mẫu bằng dung môi pha động Sau đó nạp chất lên cột và tiến hành chạy

Tiến hành rửa giải và thu dịch rửa giải Đưa dung môi pha động đã lựa chọn vào cột nạp mẫu, thêm bông gòn để tránh lớp mẫu bị xáo trộn và chạy ngược lên trên Rửa giải với tốc độ thích hợp Hứng dịch rửa vào ống nghiệm với thể tích thích hợp, kết hợp chấm sắc kí lớp mỏng để kiểm tra dịch hứng và gom chất Chất sau khi được gom được loại dung môi và cho vào các vial bảo quản trong tủ lạnh và tiến hành xác định cấu trúc

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc hợp chất đã phân lập được xác định dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, HMBC, HSQC ) kết hợp so sánh với các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố trước đó

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chiết xuất dịch chiết lá ổi

3.1.1 Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần

Quá trình chiết xuất để thu dịch chiết lá ổi được thể hiện trong sơ đồ dưới đây:

Cô thu hồi dung môi

Phân tán cao tổng vào nước

Chiết phân bố với n-Hexan

Chiết phân bố với CH2Cl2

Cô thu hồi dung môi

Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất lá ổi

Lá ổi sau khi thu hái, được rửa sạch, phơi khô Cân 2,0 kg lá ổi đã rửa sạch và phơi khô tiến hành ngâm nóng với ethanol 96% ở 60℃ Tiến hành chiết 3 lần tỷ lệ DM/DL lần lượt là 10:1; 6:1 và 4:1 thể tích/ khối lượng Lần 1, tiến hành ngâm với 20

Dịch chiết phân đoạn CH2Cl2

Bã dược liệu Ethanol 96% n-Hexan

18 lít ethanol 96% trong vào 12 giờ, sau đó thu dịch chiết giữ lại bã dược liệu Lần 2, tiến hành ngâm bã dược liệu ở lần 1 với 12 lít ethanol 96% trong vòng 8 giờ, sau đó thu dịch chiết Lần 3 ngâm với 8 lít dung môi trong 8 giờ và thu dịch chiết Tiến hành gộp các dịch chiết thu được ở cả ba lần chiết Lọc qua bằng vải lọc sau đó cô dịch gộp thu được bằng máy cất quay chân không đến cắn thu được 220 g cao đặc EtOH

Chia cao đặc EtOH làm hai phần, phần 1 có khối lượng 100 g và phần 2 có khối lượng 110 g Phần 1 cho hết vào cốc có mỏ dung tích 500 ml sau đó thêm khoảng 300 ml nước cất vào để phân tán hoàn toàn lượng cắn Tiến hành chiết phân bố với n-hexan ba lần mỗi lần 1,5 lít dung môi, tiến hành trong bình gạn 2 lít và lắc đều tay trong vòng

15 phút Trong quá trình chiết, mở nắp bình gạn để tránh tăng áp suất trong bình gạn Sau khi chiết phân bố, lắp bình gạn lên giá đỡ, thu lớp nước để tiếp tục tiến hành thí nghiệm Lớp nước thu được sau ba lần chiết phân bố đem cô quay dưới áp suất giảm đến thể thích khoảng 500 ml, sau đó tiến hành chiết phân bố với diclomethan ba lần, mỗi lần với 1000 ml dung môi Dịch chiết diclomethan được gộp lại và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Tiến hành tương tự với phần 2- phần cao đặc EtOH còn lại, thu được tổng cộng

52 g cao chiết của phân đoạn diclomethan Sử dụng cao này để tiến hành phân lập các hợp chất terpenoid

3.1.2 Phân lập các chất từ phân đoạn diclomethan

Dùng 52 g cao chiết phân đoạn diclomethan được phân lập bằng phương pháp sắc kí cột Sử dụng cột sắc kí thủy tinh đường kính 5 cm, chất hấp phụ là silica gel Tiến hành rửa giải lần lượt với hệ dung môi n-hexan: aceton (10:1, 5:1 v/v), CH2Cl2: MeOH (10:1, 5:1,2:1,1:1, 0:1 v/v), mỗi phân đoạn thu 500 ml dịch rửa giải ta thu được bảy phân đoạn lần lượt theo thứ tự là A, B, C, D, E, F, G Tiến hành cô thu hồi dung môi bằng áp suất giảm dịch rửa giải của các phân đoạn trên, để chuẩn bị mẫu cho những lần chạy sắc kỷ tiếp

Phân đoạn A (600,0 mg) cho chạy tiếp qua cột silica gel pha thuận, dùng dung môi rửa giải là n-hexan: CH2Cl2: MeOH (10:1:0,1 v/v/v), sử dụng các ống nghiệm đường kính 1 cm để hứng dịch rửa giải Trong quá trình hứng dịch rửa giải, tiến hành chạy TLC để gộp các ống nghiệm chứa cùng các chất lại với nhau Sau khi rửa giải xomg ta thu được 4 phân đoạn nhỏ A1-A4 Từ phân đoạn A3 cất thu hồi dung môi thu được 140,2 mg cắn Tiếp tục sử dụng cắn đó chạy sắc kí cột pha đảo, sử dụng chất hấp phụ RP-C18, dung môi rửa giải là MeOH: aceton: H2O ( 10:1:0,1 v/v/v) thu được 2 phân đoạn A3a, A3b Tiến hành tinh chế bằng sắc kí cột pha thuận, silica gel là chất hấp phụ đối với phân đoạn A3b (50,7 mg), dung môi rửa giải là n-hexan: CH2Cl2: MeOH (5:1:0,05 v/v) ta thu được hợp chất TO1 với khối lượng 6,3 mg

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập hợp chất TO1

Phân đoạn đoạn C (832,0 mg) cho chạy tiếp qua cột silica gel pha thuận, dùng dung môi rửa giải là n-hexan: aceton (3:1 v/v), sử dụng các ống nghiệm đường kính 1 cm để hứng dịch rửa giải Trong quá trình hứng dịch rửa giải, tiến hành chạy TLC để gộp các ống nghiệm chứa cùng các chất lại với nhau Sau khi rửa giải xomg ta thu được 3 phân đoạn nhỏ C1-C3 Từ phân đoạn C3 cất thu hồi dung môi thu được 260,5 mg cắn Tiếp tục sử dụng cắn đó chạy sắc kí cột pha thuận, sử dụng chất hấp phụ là silica gel, dung môi rửa giải là CH2Cl2: EtOAc ( 5:1 v/v) thu được 3 phân đoạn C3a, C3b và C3c Tiến hành tinh chế bằng sắc kí cột pha thuận, silica gel là chất hấp phụ

CC n-hexan: CH2Cl2: MeOH (10:1:0,1 v/v/v) SiO2

(6,3 mg) n-hexan: CH2Cl2: MeOH (5:1:0,05 v/v/v)

20 đối với phân đoạn C3b (70,2 mg), dung môi rửa giải là n-hexan: EtOAc: aceton (5:1:1 v/v/v) ta thu được hợp chất TO4 với khối lượng 17,5 mg

Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập hợp chất TO4

Cấu trúc các hợp chất phân lập được

Hợp chất TO1 thu được dưới dạng bột màu trắng

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất TO1 thu được 21 tín hiệu hấp thụ của proton Trong đó, dễ dàng nhận thấy 4 tín hiệu proton nhóm methyl tại δ H [0,57 (3H, d, J = 6,6

Hz, H-12);0,91 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-13); 0,97 (3H, d, J = 7,2 Hz, H-14); 1,54 (3H, s, H-15)]; 6 tín hiệu proton nhóm methin tại δ H [2,76 (1H, m, H-1); 2,22 (1H, m, H-3); 1,64 (1H, m, H-7); 2,03 (1H, m, H-10); 1,80 (1H, m, H-11); 3,72 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-1')]; 2 tín hiệu proton nhóm methylen tại δ H [1,81 (1H, m, H-2), 1,93 (1H, m, H-2); 1,45 (1H, dd, J 1= 3 Hz, J 2 = 13,2 Hz, H-9), 1,94 (1H, m, H-9)] và 1 tín hiệu proton nhóm olefin tại δ H 5,41 (1H, s, H-5) Ngoài ra, sự có mặt của 5 tín hiệu proton ở trường thấp tại δ H [7,16 (2H, d, J = 7,2 Hz, H-9'); 7,26 (2H, t, J = 7,8 Hz, H-10'); 7,18 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-11'); 7,26 (2H, t, J = 7,8 Hz, H-12'); 7,16 (2H, d, J = 7,2 Hz, H- 13')] cho thấy sự hiện diện của cấu trúc nhân thơm thế ở một vị trí và 2 proton nhóm aldehyd tại δ H [ 10,19 (1H, s, H-14'); 10,09 (1H, s, H-15')] (Xem hình 3.4; bảng 3.1)

Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất TO1

22 Trên phổ 13 C-NMR kết hợp với phân tích phổ hai chiều HSQC của hợp chất TO1 thu được 19 tín hiệu cacbon, trong đó nhận thấy hai nhóm aldehyd tại δ C [193,7 (C-14'); 192,8 (C-15')]; một liên kết đôi tại δ C 128,2 (C-5), δ C 145,6 (C-6) ; một vòng benzen tại δ C [ 128,9 (C-9', C-13'); 129,3 (C-10', C-12'); 127,2 (C-11')]; năm cacbon methin tại δ C [35,5 (C-1); 46,4 (C-3); 34,9 (C-10); 27,8 (C-11); 40,0 (C-1')]; hai cacbon methylen tại δ C [27,7 (C-2); 30,1 (C-9)]; bốn nhóm methyl tại δ C [21,7 (C-12); 21,4 (C-13); 14,7 (C-14); 28,5 (C-15)] (Xem hình 3.5; bảng 3.1)

Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất TO1

Khung cấu trúc của TO1 được xác định dựa trên phân tích phổ tương tác HMBC Tương tác HMBC thu được giữa H-1ꞌ (δ H 3,72) và C-2ꞌ (δ C 105,6); C-3ꞌ (δ C

164,9); C-7ꞌ (δ C 170,5); C-8ꞌ (δ C 146,2); C-9ꞌ (δ C 128,9) và C-13ꞌ (δ C 128,9) xác định cho sự có mặt của cấu trúc benzyldiformylphloroglucinol (Xem hình 3.6; hình 3.7; hình 3.9)

Hình 3.6: Tương tác HMBC của hợp chất TO1

Hình 3.7: Tương tác HSQC của hợp chất TO1

Bên cạnh đó có sự có mặt của 4 nhóm methyl, 3 nhóm methylen, 5 nhóm methin, 1 nhóm cacbon bậc 4 liên kết với oxy và 1 liên kết đôi xác định cho khung cấu trúc sesquiterpenoid của hợp chất TO1 Điều này được khẳng định qua các tương tác HMBC của H-7 (δ H 1,64) với C-1 (δ C 35,3), C-5 (δ C 128,2), C-6 (δ C 145,6), C-8 (δ C

30,1) và đã xác định mạch cacbon C-3 (δ C 46,4), C-4 (δ C 81,6), C-5 (δ C 128,2), C-6 (δ C

145,6), C-7 (δ C 52,4); C-1 (δ C 35,3), C-6 (δ C 145,6); C-8 (δ C 23,7), C-9 (δ C 30,1), C-10 (δ C 34,9), C-2 (δ C 27,7) và C-15 (δ C 28,5), C-4 (δ C 81,6) Vị trí của 3 nhóm methyl khác được xác định thông qua tương tác HMBC của Me-14 (δ H 0,97) với C-1 (δ C

Khung cấu trúc benzyldiformylphloroglucinol và sesquiterpenoid được liên kết với nhau qua vị trí của C-3 (δ C 46,4) và C-4 (δ C 81,6) và được xác định dựa trên tương tác HMBC của H-1ꞌ (δ H 3,72) và C-3 (δ C 46,4); C-2 (δ C 27,7); C-4 (δ C 81,6); H-3 (δ H

Cấu trúc của TO1 được xác định dựa trên kết quả phân tích phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất là một meroterpenoid, nhóm hợp chất phổ biến trong lá ổi Các dữ liệu đều cho thấy TO1 là guajadial E hoặc guajadial F, hai hợp chất là đồng phân epimer của nhau, chỉ khác nhau về cấu hình tại C-1ꞌ So sánh dịch chuyển cacbon tại C-1ꞌ (δ C 40,0), C-2ꞌ (δ C 105,6), C-3 (δ C 46,4), C-4 (δ C 81,6) và C-15 (δ C 28,5) của TO1 với các vị trí cacbon tương ứng của guajadial E [C-1ꞌ (δ C

38,6), C-2ꞌ (δ C 104,3), C-3 (δ C 44,4), C-4 (δ C 80,0) và C-15 (δ C 28,1)] và guajadial F [C-1ꞌ (δ C 38,2), C-2ꞌ (δ C 100,5), C-3 (δ C 38,1), C-4 (δ C 78,0) và C-15 (δ C 24,3)] cho thấy sự tương đồng về các tín hiệu hấp thụ của TO1 với hợp chất guajadial E Vậy cấu trúc hóa học của TO1 được xác định là guajadial E [15]

Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất TO1

Hình 3.9 Tương tác HMBC của hợp chất TO1

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C -NMR của TO1 đo được và tài liệu tham khảo

Vị trí δ H a,b (ppm) (số proton, độ bội, J (Hz)) δ C a,c

(ppm) Tài liệu tham khảo đo trong CDCl 3 [15]

Chú thích: a) Đo trong Methanol-d 4 b) 600 MHz c) 150 MHz 3.2.2 Hợp chất TO4

Hợp chất TO4 thu được dưới dạng bột màu trắng

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất TO4 thu được 10 tín hiệu hấp thụ của proton là δ H[5,26 (1H, m, H-12); 3,21 (1H, br.dd, J 1 = 6,6Hz, J 2 = 9,6Hz, H-3); 2,22 (1H, d, J11,4 Hz, H-18); 1,12 (3H, s, H-27); 1,00 (3H, s, H-23); 0,80 (3H, s, H-24); 0,85 (3H, s, H-26); 0,95 (3H, s, H-25); 0,92 (3H, d, J=4,8 Hz , H-29); 0,89 (3H, d, J= 6,6 Hz H-30)] Trong đó, sự có mặt của một proton nhóm olefin tại δ H 5,26 (1H, m, H-12), một proton có độ bội đôi tại δ H 2,22 (1H, d, J = 11,4 Hz, H-18) và một proton cacbinol

28 cũng được ghi nhận tại δ H 3,21 (1H, br.dd, J 1 = 6,6Hz, J 2 = 9,6Hz, H-3) Ngoài ra, dễ dàng nhận thấy 7 tín hiệu proton nhóm methyl tại δ H [1,12 (3H, s, H-27); 1,00 (3H, s, H-23); 0,80 (3H, s, H-24); 0,85 (3H, s, H-26); 0,95 (3H, s, H-25); 0,92 (3H, d, J=4,8

Hz , H-29); 0,89 (3H, d, J= 6,6 Hz H-30)]; với hai nhóm methyl độ bội đôi (methyl bậc 2) tại δ H [0,92 (3H, d, J=4,8 Hz , H-29); 0,89 (3H, d, J= 6,6 Hz H-30)] và năm nhóm metyl độ bội đơn (methyl bậc 3) tại δ H [1,12 (3H, s, H-27); 1,00 (3H, s, H-23); 0,80 (3H, s, H-24); 0,85 (3H, s, H-26); 0,95 (3H, s, H-25)] ( Xem hình 3.10; bảng 3.2) cho thấy sự hiện hiện của khung cấu trúc ursan trong hợp chất TO4

Hình 3.10: Phổ 1 H-NMR của hợp chất TO4

Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất TO4 thu được 29 tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học δ C là 38,9 (C-1); 27,1 (C-2); 79,1 (C-3); 39,0 (C-4); 55,6 (C-5); 18,6 (C-6); 33,4 (C-7); 39,8 (C-8); 47,9 (C-9); 37,2 (C-10); 23,6 (C-11); 125,7 (C-12); 138,7 (C-13); 42,4 (C-14); 29,9 (C-15); 24,6 (C-16); 47,9 (C-17); 53,3 (C-18); 39,5 (C-19); 39,3 (C-20); 31,0 (C-21); 37,3 (C-22); 28,3 (C-23); 15,6 (C-24); 15,8 (C-25); 17,2 (C-26); 23,7 (C-27); 17,1 (C-29); 21,3 (C-30) kết hợp với các tín hiệu trên phổ

1H-NMR thì hợp chất TO4 là một triterpen có khung ursan ( Xem hình 3.11; bảng 3.2) Các tín hiệu cộng hưởng của 7 nhóm methyl đã được xác định tại δ C [28,3 (C-23); 15,6

29 (C-24); 15,8 (C-25); 17,2 (C-26); 23,7 (C-27); 17,1 (C-29); 21,3 (C-30)] và một nhóm oxymethin tại δ C 79,1 (C-3) Ngoài ra, tín hiệu cộng hưởng của nhóm olefin tại δ C

[125,7 (C-12); 138,7 (C-13)] Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp so sánh đối chiếu với tài liệu tham khảo, hợp chất TO4 được xác định là ursolic acid [35].

Hình 3.11 : Phổ 13 C-NMR của hợp chất TO4

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất TO4

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR của TO4 đo được và tài liệu tham khảo

Vị trí δ H a,b (ppm) (số proton, độ bội, J

(ppm) Tài liệu tham khảo đo trong DMSO-d 6 [35]

Chú thích: a) Đo trong Methanol-d 4 + CDCl 3 b) 600 MHz c) 150 MHz

Bàn luận

3.3.1 Về phương pháp chiết xuất lá ổi

Phương pháp sử dụng là phương pháp ngâm nóng (phương pháp hầm), ngâm ở 60℃ trên nhiệt độ phòng và dưới nhiệt độ sôi của dung môi Đây là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, quá trình ngâm tiến hành ba lần do vậy chiết kiệt được dược liệu hơn Tuy nhiên, phương pháp này còn hạn chế là năng suất thấp, thao tác thủ công, do quá trình tiến hành ngâm nhiều lần do vậy nguy cơ lẫn nhiều tạp

Về dung môi sử dụng là ethanol, đây là một dung môi dễ kiếm, tiết kiệm chi phí, ít độc hại đến môi trường Ngoài ra, có khả năng hòa tan nhiều loại hoạt chất với độ phân cực khác nhau và có nhiệt độ sôi thấp hơn nước nên thuận lợi khi cô thu hồi dung môi

3.3.2 Về phương pháp phân lập terpenoid từ lá ổi

Sử dụng sắc kí cột và TLC phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm, tách được các đơn chất ra khỏi hỗn hợp dựa vào độ phân cực khác nhau Phương pháp phân lập này tiến hành đơn giản, tiết kiệm chi phí và giúp tiết kiệm thời gian nghiên cứu

3.3.3 Về các hợp chất phân lập được

Hợp chất TO1 phân lập được là guajadial E đây là một meroterpenoid dựa trên cấu trúc của sesquiterpen [37] Hợp chất này được phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký khác nhau Đây là một hợp chất được phân lập gần đây trong lá ổi Việt Nam bởi Gao Yuan và cộng sự Bên cạnh đó cũng có con đường tổng hợp khác như đi từ hợp chất 3,5-dimethyl-2,4,6-trihydroxy benzophen [15]

Các nghiên cứu và guajadial E trên thế giới cũng như ở Việt Nam còn rất hạn chế Tuy nhiên đã có nghiên cứu chứng minh về tác dụng ức chế chống lại năm dòng tế bào ung thư ở người (MCF-7, A-549, SMMC-7721, SW480 và HL-60) của

32 guajadial E Kết quả của nghiên cứu đó đã chỉ ra rằng guajadial E thể hiện hoạt tính tích cực đối với cả năm dòng tết bào ung thư trên [15]

Dù chưa có nhiều nghiên cứu về phương pháp phân lập guajadial E từ dịch chiết lá ổi, cũng như về tác dụng dược lí của guajadial E Nhưng guajadial E vẫn là một giải pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh ung thư trong tương lai

Hợp chất TO4 phân lập được là acid ursolic Acid ursolic tên theo danh pháp là acid 3β-hydroxyurs-12-en-28-oic, là một triterpenoid ngũ vòng, tan được trong acid acetic nóng Hợp chất này đã từng được phân lập từ lá ổi trong nhiều nghiên cứu trước đó Ngoài lá ổi, acid ursolic còn có mặt trong các thực vật đa dạng khác như là hương thảo, kinh giới, hoa oải hương hay húng tây [13] Hiện nay, phương pháp phân lập acid ursolic chủ yếu vẫn là tiến hành chiết xuất bằng dung môi hữu cơ và chạy sắc ký cột, sau đó xác định cấu trúc bằng phổ NMR kết hợp sử dụng HPLC [9], [26]

Về tác dụng dược lý, các nghiên cứu chỉ ra rằng acid ursolic có nhiều tác dụng khác nhau, bao gồm chống viêm, bảo vệ gan, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh, kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống tiểu đường [13]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cơ chế tác dụng chống ung thư của acid ursolic được báo cáo là ức chế hình thành khối u và tăng sinh tế bào ung thư, ngăn chặn chu kỳ tế bào và thúc đẩy quá trình tự thực Các tế bào ung thư bị tác động bởi acid ursolic gồm có tế bào ung thư vú, ung thư bàng quang (T24), ung thư tuyến tụy, ung thư cổ tử cung và đại trực tràng (HCT15) Về tác dụng chống tiểu đường, acid ursolic có tác dụng ức chế hoạt động của α-amylase tuyến tụy và giảm mức đường huyết trong cơ thể Bên cạnh đó, các báo cáo cũng chỉ ra rằng sử dụng acid ursolic giúp giảm trọng lượng cơ thể và cải thiện đáng kể độ nhạy insulin Tác dụng bảo vệ tim mạch của acid ursolic là do nó làm tăng sinh nội mạc, khôi phục hoạt động enzym bảo vệ tim, chống lại tình trạng thiếu máu cục bộ cơ tim và ức chế các cơ chế thông số liên quan đến xơ vữa động mạch Đối với gan, acid ursolic được chứng minh đã có tác dụng chống lại các bệnh như là gan nhiễm mỡ, xơ gan, ung thư biểu mô và ung thư gan [13]

Tuy nhiên, nó được phân loại là thuốc loại IV trong “Hệ thống phân loại dược phẩm sinh học” do độ hòa tan trong nước thấp và khó thấm qua màng sinh học [27]

Vì vậy, đây là một hợp chất cần tiếp tục nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp mới để nâng cao các đặc tính sinh dược học Hơn hết đây là hợp chất terpenoid lần đầu phân lập được trong lá ổi Việt Nam

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Trải qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã chiết xuất được dịch chiết ethanol toàn phần và dịch chiết phân đoạn diclomethan lá ổi Thông qua quá trình khảo sát bằng TLC, sau đó tiến hành chạy sắc ký cột silicagel pha thuận và pha đảo với dung môi thích hợp Khóa luận này đã thu được kết quả sau:

1 Đã phân lập thành công hai hợp chất terpenoid từ cao chiết phân đoạn lá ổi

2 Đã xác định được cấu trúc của hai hợp chất phân lập được là guajadial E và acid ursolic

Do thời gian nghiên cứu có hạn, vì vậy kết quả thu được còn khiêm tốn, tôi xin phép đề xuất thực hiện thêm các nội dung sau:

1 Tiếp tục tiến hành phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất trong các phân đoạn còn lại ( phân đoạn B, D, E, F, G)

2 Tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được, đặc biệt là hoạt tính chống ung thư của guajadia E.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,

2 Huỳnh Thị Mỹ Duyên, Lê Thị Minh Ngọc, Bùi Kim Ngân (2023), "Xây dựng công thức bào chế kem hỗ trợ kháng viêm từ dược liệu trà xanh (Camellia sinensis L.Theaceae ), ổi (Psidium guajava L Mytaceae) và rau má (Centalla asiatica L Apiaceae)", Tạp chí Y Dược học Cần Thơ, 62, tr 57-64

3 Trương Quỳnh Như, Bùi Thị Bích Hằng, Nguyễn Phương Thanh (2018), "Ảnh hưởng của chiết xuất ổi (Psidium guajava) và diệp hạ châu (Phylanthus amarus) lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)", Tạp chí Khoa học Đại học cần Thơ, 54, tr 135-142

4 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 499-504

5 Anand Vijaya, et al (2016), "Phytopharmacological overview of Psidium guajava Linn", Pharmacognosy Journal, 8(4), pp.314-320

6 Arain Anam, et al (2019), "Essential Oil From Psidium guajava Leaves: An

Excellent Source of β-Caryophyllene", Natural Product Communications,

7 Arevalo-Marin E., et al (2021), "The Taming of Psidium guajava: Natural and

Cultural History of a Neotropical Fruit", Frontiers in plant science, 12, p

8 Bazioli J M., et al (2020), "Anti-Estrogenic Activity of Guajadial Fraction, from Guava Leaves (Psidium guajava L.)", Molecules, 25(7), p 1525

9 Begum, S., et al (2002), "Triterpenoids from the leaves of Psidium guajava",

10 Bergman M E., Davis B., Phillips M A (2019), "Medically Useful Plant

Terpenoids: Biosynthesis, Occurrence, and Mechanism of Action", Molecules,

11 Ching-Wen Liu, et al (2015), "Guava (Psidium guajava Linn.) leaf extract promotes glucose uptake and glycogen accumulation by modulating the insulin signaling pathway in high-glucose-induced insulin-resistant mouse FL83B cells", Process Biochemistry, 50(7), pp 1128-1135

12 Correa M G., Couto J S., Teodoro A J (2016), "Anticancer Properties of

Psidium guajava - a Mini-Review", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 17(9), pp 4199-4204

13 Dae Yun Seo, et al (2018), "Ursolic acid in health and disease", The Korean journal of physiology and Pharmacology, 22(3), p 235

14 Diaz-de-Cerio E., et al (2017), "Health Effects of Psidium guajava L Leaves:

An Overview of the Last Decade", International Journal of molecular sciences, 18(4), p.897

15 Gao Yuan, et al (2013), "Guajadials CF, four unusual meroterpenoids from

Psidium guajava", Natural products and bioprospecting, 3, pp 14-19

16 Gosh P., et al (2010), "Triterpenoids from Psidium guajava with Biocidal

Activity", Indian journal of pharmaceutical sciences, 72(4), p 504

17 Gupta G.K, Chahal J., Arora D (2011), "Psidium guajava Linn.: Current research and future prospects", Journal of Pharmacy Research, 4(1), pp 42-46

18 Gutierrez R M., Mitchell S., Solis R V (2008), "Psidium guajava: a review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology", Journal of ethnopharmacology, 117(1), pp 1-27

19 Jamieson S., et al (2023), "Guava (Psidium guajava L.): a glorious plant with cancer preventive and therapeutic potential", Critical reviews in food science and nutrition, 63(2), pp 192-223

20 Joseph B., Priya M (2011), "Review on nutritional, medicinal and pharmacological properties of guava (Psidium guajava Linn.)", International Journal of pharma and bio sciences, 2(1), pp 53-69

21 Joshi D M., et al (2023), "Review of Phytochemicals Present in Psidium guajava Plant and Its Mechanism of Action on Medicinal Activities", Cureus,

22 Kamran S., et al (2022), "Therapeutic potential of certain terpenoids as anticancer agents: a scoping review", Cancers, 14(5), pp 1100

23 Kokilananthan Shanthirasekaram, et al (2022), "Sesquiterpenes and monoterpenes from different varieties of guava leaf essential oils and their antioxidant potential", Heliyon, 8(12), pp.12104

24 Meckes Mariana, et al (1996), "Terpenoids isolated from Psidium guajava hexane extract with depressant activity on central nervous system",

25 Meng S., et al (2012), "Four new triterpenoids from the leaves of Psidium guajava", Journal of Asian natural products research, 14(4), pp 348-54

26 Min-Hye Kim, et al (2015), "Ursolic acid isolated from guava leaves inhibits inflammatory mediators and reactive oxygen species in LPS-stimulated macrophages", Immunopharmacology and immunotoxicology, 37(3), pp 228-

27 Pironi A M., et al (2018), "Characteristics, Biological Properties and

Analytical Methods of Ursolic Acid: A Review", Critical Reviews in Analytical

28 Pollier J., Goossens A (2012), "Oleanolic acid", Phytochemistry, 77, pp 10-15

29 Qin Xu-Jie, et al (2017), "Meroterpenoids with antitumor activities from guava

(Psidium guajava)", Journal of agricultural and food chemistry, 65(24), pp 4993-4999

30 Ran Yin, et al (2018), "Ursolic acid, a potential anticancer compound for breast cancer therapy", Critical reviews in food science and nutrition, 58(4), pp 568-

31 Rishika Dev., et al (2012), "An update of pharmacological activity of Psidium guajava in the management of various disorders", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 3(10), p 3577

32 Rizzo L Y., et al (2014), "In vitro, in vivo and in silico analysis of the anticancer and estrogen-like activity of guava leaf extracts", Current medicinal chemistry, 21(20), pp 2322-2330

33 Silva R.C., Costa J.S., et al (2021), "Monoterpenes and Sesquiterpenes of

Essential Oils from Psidium Species and Their Biological Properties",

34 Singh B , Sharma R A (2015), "Plant terpenes: defense responses, phylogenetic analysis, regulation and clinical applications", 3 Biotech, 5(2), pp 129-151

35 Thanakijcharoenpath W., Theanphong O (2007), "Triterpenoids from the stem of Diospyros glandulosa", The Thai Journal of Pharmaceutical Sciences, 31, pp 1-8

36 Tousif M I., et al (2022), "Psidium guajava L An Incalculable but

Underexplored Food Crop: Its Phytochemistry, Ethnopharmacology, and Industrial Applications", Molecules, 27(20), p.7016

37 Xinfeng Zou, Haiyang Liu (2023), "A review of meroterpenoids and of their bioactivity from guava (Psidium guajava L.)", Journal of Future Foods, 3(2), pp 142-154

38 Xu-Jie Qin, et al (2016), "Cytotoxic meroterpenoids with rare skeletons from

Psidium guajava cultivated in temperate zone", Scientific Reports, 6(1), p

39 Yongfeng Wang, et al (2018), "Guajadial inhibits NSCLC growth and migration following activation of the VEGF receptor-2", Fitoterapia, 129, pp

40 You L., et al (2019), "Antioxidant and Anti-Diabetic Activities of

Polysaccharides from Guava Leaves", Molecules, 24(7), p.1343

41 Yuanyuan L., et al (2021), "Chemical characterization and hepatoprotective effects of a standardized triterpenoid-enriched guava leaf extract", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 69(12), pp 3626-3637

Phụ lục 1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất TO1 Phụ lục 2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất TO1 Phụ lục 3: HBMC của hợp chất TO1

Phụ lục 4: HSQC của hợp chất TO1

Phụ lục 5: Phổ 1 H-NMR của hợp chất TO4 Phụ lục 6: Phổ 13 C-NMR của hợp chất TO4

Phụ lục 1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất TO1

Phụ lục 2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất TO1

Phụ lục 3: HMBC của hợp chất TO1

Phụ lục 4: HSQC của hợp chất TO1

Phụ lục 5: Phổ 1 H-NMR của hợp chất TO4

Phụ lục 6: Phổ 13 C-NMR của hợp chất TO4