Bệnh nhân đái tháo đường cần được điều trị suốt đời, trong khi các thuốc điều trị ĐTĐ hiện nay đều có giá thành cao và mỗi nhóm đều có những tác dụng không mong muốn nhất định gây ra khó
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
Theo Hiệp hội Đái tháo đường Mỹ (American Diabetes Association) [2]: “Đái tháo đường (ĐTĐ) là một nhóm bệnh chuyển hóa, có đặc điểm là tăng glucose máu, là hậu quả của sự thiếu hụt insulin hoặc khiếm khuyết trong các hoạt động của insulin hoặc cả hai Tăng glucose máu mạn tính thường dẫn đến sự hủy hoại, rối loạn chức năng và suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, tim và mạch máu”
1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường
Theo ADA, bệnh đái tháo đường được phân ra các loại sau đây [2]:
• Đái tháo đường týp 1 qua trung gian miễn dịch (đái tháo đường phụ thuộc insulin): nguyên nhân do sự phá hủy tế bào β của đảo tụy tự miễn dẫn đến sự thiếu hụt insulin tuyệt đối
• Đái tháo đường týp 1 vô căn: một số dạng ĐTĐ tuýp 1 không rõ nguyên nhân Nồng độ insulin trong cơ thể thấp trường diễn và có nguy cơ nhiễm toan ceton nhưng không có bằng chứng về sự tự miễn
❖ Đái tháo đường týp 2 (đái tháo đường không phụ thuộc insulin) Chiếm khoảng 90-95% tổng số bệnh nhân mắc bệnh với nguyên nhân là do mất khả năng sản xuất insulin của tế bào β thường xuyên trên nền tảng của tình trạng kháng insulin
❖ Đái tháo đường thai kì (GDM): là bất cứ rối loạn dung nạp glucose huyết nào khởi phát hoặc lần đầu tiên được chẩn đoán phát hiện trong thời kỳ mang thai, gặp khi có thai lần đầu và thường mất đi sau khi sinh con
❖ Đái tháo đường do các nguyên nhân khác:
• Giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen MODY (Maturity Onset Diabetes of the young – ĐTĐ khởi phát trên bệnh nhân trẻ tuổi, thường trước 25 tuổi)
• Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen INSR
• Bệnh nội tiết (to đầu chi, hội chứng cushing, u tiết glucagon, u tủy thượng thận tăng tiết catecholamin, cường giáp, u tiết aldosteron)
• Bệnh của tuyến tụy ngoại tiết (xơ hóa tuyến tụy)
• Tăng đường huyết do hóa chất hoặc thuốc (thường gặp ở đối tượng có đề kháng insulin, một số hoạt chất làm giảm sự tiết insulin bởi tế bào β như glucocorticoid, hormon tuyến giáp, )
1.1.3 Hậu quả và biến chứng của bệnh đái tháo đường
❖ Hậu quả của bệnh đái tháo đường [2]
- Nồng độ glucose máu tăng cao làm tăng áp lực thẩm thấu, bệnh nhân khát và uống nhiều nước, đồng thời cản trợ sự hấp thu nước ở ống thận gây nên tình trạng đa niệu thẩm thấu
- Tế bào thiếu năng lượng do glucose ít vào tế bào làm giảm G6P dẫn đến trung tâm đói bị kích thích dẫn đến cảm giác đói thường xuyên
- Gan tăng cường thoái hóa glycogen và acetyl CoA dẫn đến ứ đọng thể cetonic trong máu gây toan máu Đồng thời, cholesterol được tăng cường tổng hợp tại gan, đây là yếu tố nguy cơ rất lớn gây xơ vữa động mạch, gây phù gai mắt, nhồi máu cơ tim,
- Giảm tổng hợp và tăng cường thoái hóa protein nên người bệnh mau gầy và suy kiệt Đối với bệnh nhân đái tháo đường do thiếu hụt insulin tuyệt đối nếu không được điều trị bằng insulin đủ liều lượng thì diễn biến của bệnh nhanh với nhiều biến chứng nặng nề Với bệnh nhân thiếu hụt insulin tương đối thì diễn biến chậm hơn do ở giai đoạn đầu có sự tăng đề kháng insulin nhưng tế bào β đảo tụy tăng tiết nên dung nạp glucose không đổi, glucose vẫn có thể vào được trong tế bào nên chưa có rối loạn chuyển hóa và ứ động thể ceton
❖ Biến chứng của bệnh đái tháo đường [30]
- Nhiễm khuẩn: glucose máu cao và suy giảm đề kháng là biểu hiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển: liên cầu, trực khuẩn lao, Bệnh nhân thường bị lở loét, mụn nhọt, lao phổi,
- Biến chứng mạch máu lớn: bệnh lý thường gặp: bệnh lý mạch vành, bệnh mạch máu ngoại biên, tăng huyết áp,
- Biến chứng vi mạch: tổn thương nội mạch vi mạch, tổn thương màng đáy các vi mạch và gây dễ vỡ các thành mao mạch Ba biến chứng vi mạch chính do đái tháo đường gồm: biến chứng võng mạc, biến chứng thận và biến chứng thần kinh
- Cuối cùng dẫn đến suy kiệt toàn thân, nhiễm toan, nhiễm độc, nhiễm toan chuyển hóa, nhiễm độc, giảm kali máu, mất nước, bệnh nhân có thể hôn mê và tử vong
❖ Tình hình ĐTĐ trên thế giới ĐTĐ là bệnh đã có từ lâu, nhưng đặc biệt phát triển trong những năm gần đây, bệnh tăng nhanh theo tốc độ phát triển của nền kinh tế - xã hội Năm 1994, toàn thế giới có 110 triệu người ĐTĐ, năm 1995 tăng lên 135 triệu (4% dân số thế giới) Ước tính của Liên đoàn ĐTĐ Quốc tế (IDF) số người mắc bệnh ĐTĐ năm 2010 là 246
4 triệu người, năm 2021 là 537 triệu người, tốc độ gia tăng của bệnh ĐTĐ là 55% mỗi năm Dự kiến số người ĐTĐ sẽ tăng lên 642 triệu người vào năm 2030 [23]
Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn sự tăng nhanh của bệnh Đái tháo đường gây ra gánh nặng khổng lồ về chi phí điều trị cho người bệnh, tạo ra áp lực to lớn đối với nền y tế các nước
❖ Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam
Nước ta nằm trong khu vực Tây Thái Bình Dương - Khu vực bị ảnh hưởng nặng nề nhất của đại dịch thế kỷ “Bệnh đái tháo đường” Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường của Việt Nam đang gia tăng nhanh Bệnh không chỉ xuất hiện ở khu vực đô thị mà còn xuất hiện ở hầu khắp các khu vực từ miền núi, trung du đến đồng bằng Bệnh gây nên nhiều tác hại cho sức khỏe, tàn phế, thậm chí tử vong bởi thường được chẩn đoán, điều trị muộn
TỔNG QUAN VỀ ENZYM
1.2.1 Giới thiệu về enzym α-glucosidase
Alpha glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzym xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycosid bao gồm một số loại như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, alpha-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucosid glucohydrolase
Enzym α-glucosidase thuộc họ exohydrolysis, lớp glycoside hydrolase (GH), có hoạt tính thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrat giải phóng các phân tử α-D-glucose Cơ chất phổ biến của enzym alpha glucosidase là oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside,….[19] Tốc độ phân cắt các liên kết glycoside được tăng lên gấp 1017 lần so với phản ứng thông thường không có enzym xúc tác [29]
Alpha glucosidase (E.C.3.2.1.20) có trên màng bàn chải ruột non và chiếm khoảng 2% tổng số protein [27] và phân bố trên toàn bộ chiều dài ruột non [1] Ngoài ra, α- glucosidase còn được tìm thấy ở biểu mô thận [27]
Enzym α-glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần C tận [18] ( hình 1.2) Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lượng phân tử từ ~100 kDa và thuộc nhóm GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [22].
CHẤT ỨC CHẾ ENZYM
Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3D của enzym α-glucosidase [19]
A Mô hình cấu trúc của NtMGAM B Vùng hoạt động của NtMGAM
1.2.4 Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase trong cơ thể
Enzym α-glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứng phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào hệ tuần hoàn Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử [19]
Cụ thể, thành phần carbohydrat trong thức ăn khi vào cơ thể, dưới tác dụng của các enzym trong hệ tiêu hóa với α-amylase tuyến nước bọt và tuyến tụy, carbohydrat được thủy phân thành các phân tử đường nhỏ hơn như dextrin, maltotriose, maltose [19] Hỗn hợp này sau đó được thủy phân bởi cái enzym α-glucosidase ở màng ruột non (EC.3.2.1.20), enzym α-glucosidase trong lysosym (E.C.3.2.1.3) và sucrase-isomaltase (EC.3.2.148, EC.3.2.10) thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào hệ tuần hoàn [19] Như vậy, bằng cách ức chế hoạt tính của enzym α-glucosidase có thể làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrat Kết quả là glucose máu tăng chậm hơn sau khi ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu sau ăn, và nồng độ glucose máu ban ngày dao động ít hơn, làm chậm quá trình hấp thu glucose vào máu do đó giúp kiểm soát lượng đường huyết sau ăn
1.3 Chất ước chế enzym α-glucosidase
1.3.1 Cơ chế tác dụng của chất ức chế α-glucosidase
Chất ức chế enzym α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors - AGIs) là các chất làm giảm hoạt tính của enzym α-glucosidase dẫn đến làm giảm, làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrat thành đường đơn ở ruột non, từ đó ngăn hiện tượng tăng đường huyết sau ăn
7 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzym α-glucosidase
AG: α-glucosidase; AGI: chất ức chế enzym α-glucosidase
Cơ chế: Phần lớn AGIs có khả năng gắn vào vùng liên kết với carbohydrat của enzym α-glucosidase vì chúng có cấu trúc tương tự với các disaccharide hoặc oligosaccharide Các phức hợp này có ái lực lớn hơn phức hợp thông thường carbohydrat-glucosidase vì vậy hình thành cơ chế ức chế cạnh tranh hoạt động của enzym α-glucosidase Do vậy, hoạt động của α-glucosidase trong màng nhầy của ruột non bị ức chế Khi carbohydrat không được hấp thụ qua các lớp niêm mạc đường ruột và bị thủy phân dần dần ở tá tràng, hỗng tràng và hồi tràng, làm giảm sự hấp thu đường tại niêm mạc ruột non [14] ( Hình 1.3 )
Theo nhiều nghiên cứu, các loại thuốc AGIs điển hình, chẳng hạn như miglitol và acarbose, còn có thể tăng cường bài tiết GLP-1 (glucagonlike peptide-1), làm giảm cơn đói cũng như giảm nhu cầu ăn [15] Bên cạnh đó, cũng có bằng chứng cho thấy rằng AGIs không ảnh hưởng đến bài tiết insulin Ngày nay, có bốn loại thuốc AGIs trên thị trường: acarbose, miglitol, voglibose và DNJ
Hình 1.4 Cấu trúc của acarbose, miglitol, voglibose và DNJ
Các nghiên cứu lâm sàng về acarbose và miglitol chỉ ra rằng AGIs có nhiều ưu điểm hơn các loại thuốc điều trị ĐTĐ dùng đường uống khác Chúng không có tác dụng đối với những kênh vận chuyển glucose phụ thuộc natri hay sự tăng tiết insulin của tế bào β của đảo tụy, do đó không ảnh hưởng đến việc tiêu thụ glucose cũng như gây hạ đường huyết Hơn nữa, AGIs không có ảnh hưởng đáng kể đến trọng lượng cơ thể Tác dụng không mong muốn của các thuốc AGIs chủ yếu trên đường tiêu hóa, chẳng hạn như đầy hơi, co thắt ruột và đau bụng
Tuy nhiên, từ năm 2000, thì không có thuốc AGI mới nào được chấp thuận sử dụng trên lâm sàng [9] Trong phác đồ điều trị đái tháo đường týp II, nhóm thuốc AGIs không phải lựa chọn hàng đầu như Metformin hay nhóm Sulfonylure, tuy nhiên với cơ chế tác dụng của các thuốc AGIs và của thuốc hạ glucose máu thuộc nhóm sulfonylurê, nhóm biguanid khác nhau, chúng giúp cộng hợp tác dụng khi dùng phối hợp đặc biệt với nhóm bệnh nhân tăng glucose máu (đặc biệt tăng glucose máu sau khi ăn) không kiểm soát được chỉ bằng chế độ ăn và tập luyện [17]
1.3.2 Phân loại chất ức chế enzym α-glucosidase
Dựa vào cấu trúc cấu tạo của các AGIs, chúng được chia thành 2 loại chính là các hợp chất mang cấu trúc “bắt chước đường” (carbohydrate mimics) và các hợp chất không mang cấu trúc carbohydrat
1.3.2.1 Các hợp chất mang cấu trúc “bắt chước đường”
Các chất ức chế enzym α-glucosidase đang được sử dụng trên lâm sàng là acarbose, miglitol và voglibose (Hình 1.4) Hiện nay, các nhà hóa dược học tiếp tục nghiên cứu và phát triển các nhóm thuốc AGIs mới an toàn và hiệu quả hơn
Với các hợp chất là các dẫn xuất của monosaccharid có nhiều phương pháp để thiết kế các dẫn chất mới của monosaccharid như biến đổi cấu trúc tại vị trí C1 hay gốc C1-
OH, mở vòng monosaccharid hoặc sự tái cấu trúc của glucose Năm 2013, Bian cùng cộng sự đã thiết kế một chuỗi các dẫn xuất của β-D-glucopyranosid (hợp chất A) Trong số đó, hợp chất 1 ( hình 1.5 ) được xác định là chất ức chế enzym tiềm năng nhất (IC50 2.3 μmol) so với đối chứng là acarbose (IC50 = 235,1 μmol) [7]
Hình 1.5 Cấu trúc của dẫn chất monosaccharid
Azasugar có cấu trúc và đặc tính lý hóa học tương tự như glucose, cho phép chúng tương tác với các vị trí liên kết carbohydrate Tương tác này là cơ sở giải thích cho tác dụng ức chế enzym của azasugar.
Năm 2013, S.F.Jenkinson cùng với các cộng sự đã công bố một dãy dẫn chất azasugar Nghiên cứu có đề cập tới hợp chất số 2 (hình 1.6) có khả năng ức chế tốt nhất với giỏ trị IC50 = 0,15àM Tuy nhiờn, hợp chất số 3 ( đối quang của số 2) cho thấy khả năng ức chế enzym thấp hơn nhiều lần với IC50 = 70 àM [11]
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của hợp chất 2 và 3
Năm 1997, salacinol được phân lập từ dược liệu Ayurvedic của cây Salacia có lưới Hợp chất này đã sớm được chứng minh là một chất có tác dụng tốt trong ức chế enzym α-glucosidase
Hình 1.7 AGIs muối thiosugar phân lập từ thực vật loài Salacia
10 Ngay sau đó nhiều muối thiosugar được phân lập từ cây thuộc chi Salacia đều cho thấy hoạt động ức chế chống lại α-glucosidase ở nhiều mức độ khác nhau Vì vậy, các nhà khoa học đã tiến hành sửa đổi cấu trúc các hợp chất đó với mong muốn tìm ra một AGI có tác dụng mạnh và chọn lọc
1.3.2.2 Nhóm các chất không mang cấu trúc carbohydrat
CÁC DẪN CHẤT MANG KHUNG INDOLIN-2-ON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYM
1.4.1 Tổng quan về các dẫn chất mang khung indolin-2-on
Hình 1.9 Công thức cấu tạo của indolin-2-on
Khung cấu trúc của indolin-2-on được chứng minh là cấu trúc cốt lõi của nhiều hợp chất có hoạt tinh sinh học bao gồm chống viêm, chống đông máu, chống ung thư, rối loạn thần kinh, chất chống oxy hóa , kháng khuẩn và hoạt động chống co giật Trong số đó, các dẫn xuất indolin-2-one đã gây được sự chú ý lớn với tác dụng chống ung thư và được phát triển dưới dạng thuốc chống ung thư Điển hình như sunitinib ( Hình 1.12 ), một chất ức chế tyrosine kinase đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa
Kỳ (FDA) phê duyệt và đưa ra thị trường để điều trị ung thư mô đệm đường tiêu hóa và ung thư biểu mô tế bào thận Một dẫn chất khác có khung indolin-2-on là nintedanib (
11 hình 1.10 ) được phát triển thành thuốc điều trị ung thu phổi với hai biệt dược nổi tiếng là “ Ofev” và “ Vergatel” đã được FDA phê duyệt vào năm 2020 [28]
Hình 1.10 Công thức cấu tạo của sunitinib (A) và nintedanib (B)
1.4.2 Các dẫn chất mang khung indolin-2-on có khả năng ức chế enzym α- glucosidase
Năm 2018, M Taha cùng với các cộng sự đã công bố 20 dẫn chất indolin -2-on lai hóa oxadiazol Kết quả cho thấy hợp chất 6 ( hình 1.11 ) ức chế α-glucosidase với giá trị
IC50 = 1,25 μM Nghiên cứu chỉ ra nhóm carbonyl của khung indolin-2-on tạo liên kết hydro với Lys233 là acid amin quan trọng trong cấu trúc protein [24]
Hình 1.11 Công thức cấu tạo của hợp chất 6
Năm 2022, một nhóm nghiên cứu của J.Lin và các cộng sự đã công bố dẫn chất của 5-fluoro-indolin-2-on có khả năng ức chế enzym α-glucosidase Trong số 22 dẫn chất, có 3 dẫn chất thể hiện hoạt tính tốt hơn cả, đặc biệt, đặc biệt là hợp chất 7 ( hình
1.12 ) với IC50 = 35,83 μM Nghiên cứu động học cũng chỉ ra hợp chất này ức chế thuận nghịch enzym α-glucosidase [16]
Hình 1.12 Công thức cấu tạo của hợp chất 7 (A) và hợp chất 8 (B) Cũng trong năm 2022, nhóm nghiên cứu khác của V.G.Klochkov và các cộng sự công bố một dãy dẫn chất của indolin-2-on có tiềm năng trong điều trị ĐTĐ trong đó hợp chất 8 ( hình 1.12 ) thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 6,78 μM Đáng chú ý, thông qua thử nghiệm in vivo ức chế dung nạp các loại đường cho thấy hợp chất số 8 có tiềm năng để tối ưu hóa trở thành một thuốc điều trị ĐTĐ [13]
1.4.3 Vai trò của nhóm sulfonamid trong phát triển thuốc
Sulfonamid thuộc một nhóm hợp chất quan trọng có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, lợi tiểu, hạ đường huyết, chống ung thư, chống viêm, Trong vài thập kỷ qua, nhiều tác dụng dược lý khác nhau của nhóm sulfonamid đã được công bố Tuy nhiên, số lượng công bố về vai trò của của sulfonamid trong đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase khá hạn chế
Năm 2005, nhóm nghiên cứu từ Đại học quốc gia Gyeongsang đã công bố dãy dẫn chất sulfonamid chalcone mới có tiềm năng, trong đó nổi bật với hợp chất 9 ( hình 1.13 ) có IC50 = 0,40 μM Cũng trong nghiên cứu này chỉ ra, vào năm 2008, đã thực hiện nghiên cứu nhằm tìm hiểu khả năng liên kết với protein đích của hợp chất 9 Kết quả đã cho thấy NH của nhóm sulfonamid tương tác thông qua liên kết hydro với Asp 349 ( acid amin quan trọng trong vùng hoạt tính của protein) và hai nguyên tử oxy của nhóm SO2 tạo liên kết hydro với His348 và Arg 212 [5]
Hình 1.13 Công thức cấu tạo của hợp chất 9
1.4.4 Lựa chọn hướng nghiên cứu cho đề tài
Từ kết quả của các nghiên cứu trên, cùng với việc các nghiên cứu về sự kết hợp giữa khung indolin-2-on và nhóm sulfonamid chưa từng được công bố về khả năng ức chế enzym α- glucodase, nghiên cứu của chúng tôi tiến hành tổng hợp dẫn chất indolin-2- on và đánh giá tác dụng ức chế enzym α- glucosidase nhằm tìm ra các dẫn chất mới có hoạt tính, từ đó đánh giá ảnh hưởng của nhóm sulfonamid đến hoạt tính sinh học
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chúng tôi tiến hành các phản ứng tổng hợp các chất từ nguyên liệu indolin-2-on qua các giai đoạn sau (xem Sơ đồ 2.1 ):
- Tổng hợp H1 từ indolin-2-on bằng phản ứng sulfo hóa
- Tổng hợp H2 từ H1 bằng phản ứng tạo sulfonamid với morpholin
- Tổng hợp H3 từ H2 bằng phản ứng ngưng tụ Knoevenagel
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng hợp các chất
- Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với các hệ dung môi khai triển khác nhau, quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại Các hệ dung môi khai triển được sử dụng:
- Tiến hành khảo sát một số thông số cơ bản ảnh hưởng đến phản ứng như: tỉ lệ mol giữa các chất, chất xúc tác, dung môi tinh chế, từ đó lựa chọn điều kiện để phản ứng tối ưu
- Sử dụng các phương pháp: chiết phân bố lỏng – lỏng, lọc, kết tinh để tinh chế sản phẩm
- Đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM (với các hệ dung môi ở trên) và khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy (được tiến hành trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt) trước khi đo các loại phổ để khẳng định cấu trúc của chất đó
2.2.2 Khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp được bằng phương pháp phổ
Cấu trúc của các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối được khẳng định bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và Carbon-13 ( 13 C-NMR)
Phổ hồng ngoại (IR): Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén kali bromid trong vùng 4000 – 400 cm -1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1: 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm -1
Phổ khối lượng được tiến hành ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) tại phòng phân tích cấu trúc Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Máy LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử (ESI) Đặc điểm của loại phổ này là tùy theo phương thức bẫy ion (ESI + hoặc ESI - ) mà ion ghi nhận được là dương (ESI + ) hay âm (ESI - )
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và 13 C ( 13 C-NMR):
Phổ NMR được ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker tại Viện Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi CDCl3 Phổ 1 H-NMR đo ở tần số 500 hoặc 600 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số 125 MHz hoặc 150 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm) được tính theo chất chuẩn nội tetramethylsilan, nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K
Phổ 1 H-NMR cung cấp các dữ liệu về tỷ lệ cường độ giữa các pic, độ bội của từng pic, dạng vân phổ, từ đó xác định được hằng số tương tác Ј H–H, tương quan giữa các hằng số này để góp phần khẳng định khung cấu trúc, vị trí các nhóm thế Độ dịch chuyển hóa học của proton (δ 1H) được lấy tới số thập phân thứ 2
Phổ 13 C-NMR cho biết số carbon có trong phân tử hợp chất, độ dịch chuyển hóa học và bậc của các carbon, từ đó cũng góp phần xác định cấu tạo của hợp chất cũng như vị trí các nhóm thế Độ dịch chuyển hóa học của carbon (δ 13C) được lấy tới số thập phân thứ 2
2.2.3 Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase Được tiến hành tại Phòng hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [8], [10], [12], [26]
❖ Nguyên lí của phép thử
18 Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside nhờ tác động của enzym α - glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-Nitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng Lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra phản ánh hoạt độ của enzym α - glucosidase
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO và nước deion thành 1 dãy các nồng độ, nồng độ lần lượt trong phản ứng là 256; 64; 16 và 4 àg/ml hoặc pha loóng tiếp với mẫu có hoạt tính nhỏ hơn Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo
Các thành phần phản ứng bao gồm: Phosphate buffer 100 mM pH 6,8; α- glucosidase 0,2 U/ml, mẫu thử và p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 2,5 mM Ở mẫu đối chứng, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng Thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37º
C Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng Na2CO3 Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A)
Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức: Độ ức chế (%) = [A(đối chứng) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng) x 100%
IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của enzym α-glucosidase, được tính bằng phần mềm Tablecurve
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
3.1.1 Tổng hợp 2-oxoindolin-5-sulfonyl chlorid (H1)
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp H1
Trong bình cầu một cổ 50 ml, thêm vào 12,0 ml acid clorosulfonic, sau đó làm lạnh acid trong bình cầu xuống 0 -5 ºC bằng đá lạnh Thêm từ từ 1,00 g (7,51 mmol) indolin- 2-on vào bình cầu Hỗn hợp được trộn đều bằng máy khuấy từ và duy trì khuấy trộn phản ứng ở nhiệt độ lạnh trong 30 phút Tiếp theo, đun nóng từ từ hỗn hợp phản ứng đến 70º C Duy trì khuấy trộn phản ứng trong 3 giờ ở nhiệt độ 70º C để phản ứng diễn ra hoàn toàn
❖ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng:
Giai đoạn 1: Sau khi phản ứng kết thúc, làm nguội phản ứng về nhiệt độ phòng Tiến hành nhỏ từ từ dịch phản ứng vào nước đá lạnh thì tủa màu hồng nhạt xuất hiện, trong quá trình nhỏ phải khuấy liên tục Lọc, rửa tủa bằng nước cất lạnh và sấy khô dưới đèn hồng ngoại
Kết quả: - Cảm quan: chất rắn có màu hồng nhạt
- SKLM: Xuất hiện 2 vết trên TLC với R f1 = 0,81 và R f2 = 0
Giai đoạn 2: Hòa tan 1,50g khối sản phẩm thu được với 30,0 ml THF trong cốc có mỏ, rồi thêm 150,0 ml dicloromethan (DCM) vào, chuyển hỗn hợp vào bình chiết Tiến hành chiết với pha nước là dung dịch đệm có pH = 8~9 ( 200,0ml/lần x 2 lần), tách lấy pha hữu cơ Rửa pha dung môi hữu cơ với dung dịch NaCl bão hòa và làm khan bằng
Na2SO4, cất quay loại dung môi thu được nguyên liệu H1
- Cảm quan: chất rắn màu cam
- Nhiệt độ nóng chảy: 200,2 -203,4 ºC
- SKLM: R f = 0,81 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)
❖ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới hiệu suất phản ứng
Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ
STT Nhiệt độ Thời gian gia nhiệt Hiệu suất
* Kết quả được lấy trên thực nghiệm với quy mô mỗi mẻ là 0,50g nguyên liệu
Nhận xét: Dựa trên số liệu khảo sát được, điều kiện được lựa chọn để tiến hành phản ứng là nhiệt độ 70ºC trong 3 giờ
❖ Khảo sát dung môi để hòa tan hỗn hợp các chất trong giai đoạn 1
Bảng 3.2 Khảo sát dung môi để hòa tan hỗn hợp các chất
STT Dung môi Độ tan
Nhận xét: Ba dung môi là THF, 1,4 -dioxan và aceton đều có khả năng hòa tan hoàn toàn khối hỗn hợp các chất ở giai đoạn 1 Tuy nhiên, cần thực hiện chiết loại tạp với pha nước ở giai đoạn sau nên không dùng dung môi aceton Với 1,4 – dioxan là dung môi có nhiệt độ sôi cao nên khó khăn trong quá trình cô loại bỏ dung môi sau khi chiết, còn THF khả năng hút ẩm cao, thường nhiễm nước, nên làm khan trước khi sử dụng Với những cơ sở đó, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn dung môi THF trong quá trình xử lý phản ứng
❖ Lựa chọn dung môi trong quá trình chiết
Bảng 3.3 Kết quả thu được trong quá trình chiết
STT Dung môi Hiệu quả tách pha
1 Ethyl acetat - Thời gian tách pha chậm
- Bề mặt phân cách hai pha khó quan sát
- Pha hữu cơ kéo thêm nhiều nước
- Pha nước có chứa sản phẩm
2 Dicloromethan - Thời gian tách pha nhanh
- Bề mặt phân cách hai pha rõ ràng
- Hạn chế nước ở pha hữu cơ
- Pha nước không chứa sản phẩm
Nhân xét: Ethyl acetat và dicloromethan là hai dung môi thường được sử dụng trong quá trình chiết phân bố lỏng – lỏng Với cơ sở lý thuyết và dựa trên thực nghiệm, trong trường hợp này thì sử dụng dung môi DCM là lựa chọn tối ưu
3.1.2 Tổng hợp 5-(morpholinosulfonyl) indolin-2-on (H2)
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp H2 từ H1
Cân 0,50 g (2,15 mmol) H1 cho vào bình cầu một cổ dung tích 100 ml Bổ sung thêm 30,0 ml dicloromethan (DCM) Hút 0,4 ml morpholin (5,00 mmol) hòa trong 5,0 ml dicloromethan rồi thêm từ từ vào bình phản ứng Hỗn hợp được trộn đều bằng máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 2 giờ để phản ứng diễn ra hoàn toàn Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi A (n-hexan: ethyl acetat = 3: 7)
❖ Xử lý hỗn hợp phản ứng
Sau khi phản ứng kết thúc, thêm 50,0 ml dicloromethan (DCM) vào bình cầu, chuyển hỗn hợp vào bình chiết Tiến hành, chiết với pha nước là dung dịch đệm có pH
= 2 (200ml/lần x 2 lần), tách lấy pha hữu cơ Sau đó, tiếp tục chiết lần 2 với pha nước là dung dịch đệm có ph= 8~9 (200ml/lần x 1 lần), thu lấy pha hữu cơ Rửa pha dung môi hữu cơ với dung dịch NaCl bão hòa và làm khan bằng Na2SO4, cất quay loại dung
22 môi thu được nguyên liệu H2
- Cảm quan: chất rắn màu trắng sữa
- Nhiệt độ nóng chảy: 216,0 – 218,2 ºC
- SKLM: R f = 0,59 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)
❖ Khảo sát lựa chọn điều kiện phản ứng tối ưu
Bảng 3.4 Khảo sát các điều kiện phản ứng
STT Dung môi Điều kiện phản ứng Thời gian theo dõi phản ứng
Sắc ký lớp mỏng theo dõi phản ứng
Nhiệt độ phòng (có thêm pyridin trong khối phản ứng)
6 giờ Vết nguyên liệu rất mờ
80 ºC ( đun hồi lưu) 6 giờ Vết nguyên liệu còn đậm
(DCM) Nhiệt độ phòng 2 giờ Hết vết nguyên liệu
Nhận xét: Thực hiện phản ứng với dung môi dicloromethan (DCM) tại nhiệt độ phòng là phương pháp thực hiện tối ưu với điều kiện đơn giản, thời gian phản ứng ngắn
3.1.3 Tổng hợp 5-(morpholinosulfonyl)-3-(2-nitrobenzylidene) indolin-2-on (H3)
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp H3 từ H2
Cân 0,15g (0,53 mmol) H2 và 0,12g (0,8 mmol) 2-nitrobenzaldehyd cho vào bình cầu một cổ dung tích 50 ml và bổ sung thêm 5,0 ml ethanol tuyệt đối và 0,5ml (0,053 mmol) dung dịch piperidin 1% (tt/tt) pha trong ethanol tuyệt đối Lắp sinh hàn thẳng rồi đun nóng từ từ hỗn hợp phản ứng đến 80º C Duy trì hỗn hợp phản ứng trong 8 giờ ở nhiệt độ 80 - 90ºC, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi A (n-hexan: ethyl acetat = 3: 7) cho tới khi hết nguyên liệu H2
❖ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng:
Khi phản ứng kết thúc, làm nguội phản ứng về nhiệt độ phòng và để kết tinh qua đêm Sau đó, lọc và rửa tủa với ethanol tuyệt đối đến khi loại hết lượng aldehyd bám trên tủa Xác định bằng SKLM với hệ dung môi A (n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7) Tủa sau khi sấy khô dưới đèn hồng ngoại được hòa tan trong 20,0 ml dicloromethan (DCM) rồi tiến hành chiết với pha nước có pH = 2 (30,0 ml/lần x 1 lần), thu lấy pha hữu cơ Rửa pha dung môi hữu cơ với dung dịch NaCl bão hòa và làm khan bằng Na2SO4, cất quay loại dung môi thu thu được sản phẩm
- Cảm quan: chất rắn màu vàng nâu
- Nhiệt độ nóng chảy: 230,2 – 231,9 ºC
- SKLM: R f = 0,67 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7).
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC
Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)
Chất Công thức phân tử m/z lý thuyết m/z (ESI + MS) Phụ lục
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Chất Công thức cấu tạo Đỉnh hấp thụ ν max (cm -1 ) Nhóm chức Phụ lục
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR
Chất Công thức cấu tạo Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
J = 0,6 Hz, H-6b); 7,79 – 7,71 (2H, m, H-5b, H-4b); 7,63 (1H, d, J = 8,4Hz, H-6); 7,16 (1H, s, H-4); 7,07 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-7); 3,71(2H, t, J = 4,5 Hz, H- 2a); 2,84 (2H, t, J = 4,2 Hz, H- 3a)
Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR
Chất Công thức cấu tạo Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
BÀN LUẬN
3.3.1 Bàn luận về các phản ứng tổng hợp hóa học
3.3.1.1 Phản ứng sulfo hóa tổng hợp H1
Phản ứng sulfo hóa xảy ra theo cơ chế thế ái điện tử SE, gồm 3 giai đoạn chính như sau: đầu tiên, tác nhân E + tấn công vào nhân thơm tạo ra phức không bền gọi là phức π
Sau đó tác nhân E + liên kết với một carbon của nhân thơm bằng cách mượn 2 điện tử của vòng 6 điện tử π của nhân thơm, tạo ra phức σ Phức σ này chỉ còn 4 điện tử π phân bố trên 5 nguyên tử carbon sp 2 và là một carbocation Cuối cùng một proton ở carbon lai sp 3 được loại ra và trả 2 điện tử để tái lập vòng 6 điện tử π của dẫn xuất thế một lần
C6H5-E Cơ chế phản ứng được minh họa bằng sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.4 Cơ chế phản ứng sulfo hóa tạo nguyên liệu H1
Sơ đồ 3.5 Cơ chế phản ứng tạo tạp
❖ Về xử lý phản ứng:
Nhóm nghiên cứu [20] xử lý phản ứng: làm nguội hỗn hợp về nhiệt độ phòng rồi đổ vào đá nghiền, lọc chất rắn kết tủa và rửa tủa bằng nước, tiến hành sấy khô và thu được sản phẩm Tuy nhiên, nếu dừng lại tại bước này thì sản phẩm thu được không tinh khiết, có lẫn tạp ( sơ đồ 3.5 ) do cấu trúc sulfonyl chlorid nhạy cảm với độ ẩm nhưng quá trình xử lý phản ứng ( đổ vào nước đá lạnh) và rửa tủa ( sử dụng nước cất lạnh), sản phẩm tiếp xúc nhiều với nước Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh chế sản phẩm bằng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng giữa hai pha với pha hữu cơ là hỗn hợp hai dung môi THF và DCM với pha nước có tính kiềm để lấy sản phẩm H1 sang pha hữu cơ, đồng thời loại tạp trong pha nước có tính kiềm nhẹ
❖ Về lựa chọn dung môi làm pha hữu cơ trong quá trình chiết loại tạp
Tới giai đoạn này, các chất đã được hòa tan trong THF nên để thực hiện chiết phân bố lỏng-lỏng với pha nước thì cần bổ sung thêm dung môi để tạo pha hữu cơ Ethyl acetat và dicloromethan là hai dung môi thường được sử dụng, tuy nhiên khi so sánh tỷ trọng của hai dung môi với nước: DEtOAc = 0,897- 0,902 g/cm³ và DDCM= 1,33 g/cm³, có thể thấy DCM là dung môi là tạo sự tách pha tốt hơn Đặc biệt, trong trường hợp này, tại pha hữu cơ vẫn còn một lượng tương đối nhiều THF và độ tan của EtOAC trong nước khoảng 8,3g/L ở 20 ºC, vậy nên khi sử dụng một thể tích ethyl acetat tương tự dicloromethan thì quá trình tách pha chậm, khó quan sát và kéo theo nhiều nước vào pha dung môi hữu cơ Với những cơ sở đó và dựa trên thực nghiệm quan sát được, chúng tôi đã lựa chọn dung môi DCM trong quá trình xử lý phản ứng
Lưu ý: Sản phẩm H1 không ổn định, dễ bị thủy phân thành tạp nên sử dụng làm nguyên liệu đặt phản ứng tiếp theo ngay sau khi tổng hợp được
3.2.1.2 Phản ứng sulfonamid hóa tổng hợp H2
Phản ứng được thực hiện giữa hợp chất H1 và morpholin xảy ra theo cơ chế thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2), đi qua trung gian chuyển tiếp dạng lưỡng chóp tam giác như sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng được minh họa bằng sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng tạo thành sulfonamid
❖ Về quy trình thực hiện phản ứng:
Tài liệu [20] đã công bố tổng hợp H2 với điều kiện ở nhiệt độ phòng và dung môi là 1,4- dioxan, đặc biệt có sử dụng thêm pyridin Cụ thể, hỗn hợp các chất gồm: nguyên liệu H1, morpholin, pyridin và dung môi 1,4-dioxan được khuấy trộn tại nhiệt độ phòng Trong thực nghiệm, nhận thấy H1 ít tan trong dung môi 1,4- dioxan nhưng tan tốt trong môi trường kiềm nên vai trò của pyridin được dự đoán là làm tăng độ tan của nguyên liệu H1 Tuy nhiên, thêm pyridin là thêm một vấn đề cần lưu ý khi xử lý phản ứng Một nghiên cứu khác [28] tiến hành quy trình khác với dung môi là THF, cụ thể : hỗn hợp nguyên liệu H1 và morpholin trong dung môi THF được đun hồi lưu ở nhiệt độ
80 ºC Tuy nhiên, khi theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng ở cùng thời gian như các quy trình khác thì vết nguyên liệu vẫn còn đậm
Nhược điểm của dung môi THF ảnh hưởng tới khả năng phản ứng:
THF tương tác với nước thông qua liên kết hydro ( hình 3.1 ) của nguyên tử O trong cấu trúc nên dễ nhiễm nước Khi dung môi THF được sử dụng đặt phản ứng bị nhiễm nước thì có thể gây thủy phân nguyên liệu là H1, đồng thời quá trình phản ứng tạo ra acid HCl gây ảnh hưởng tới độ ổn định của sulfonamid tạo ra Đây có thể là một trong những nguyên nhân khiến phản ứng chưa tối ưu
30 Hình 3.1 Liên kết hydro giữa THF và nước
Dựa trên các tài liệu và kết quả thực nghiệm, chúng tôi xây dựng quy trình tổng hợp H2 với điều kiện phản ứng đơn giản hơn ( mục 3.1.2 ) Nguyên liệu H1 ít tan trong DCM nhưng tan tốt trong môi trường kiềm, nên khi thêm dung dịch morpholin đã pha loãng từ từ vào bình phản ứng thì H1 tan dần, đồng thời phản ứng xảy ra nhanh chóng (
2 giờ) Đặc biệt, sulfonamid tạo thành tan tốt trong DCM
❖ Về xử lý phản ứng: Để loại lượng morpholin dư thì phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất được áp dụng là thực hiện chiết phân bố lỏng – lỏng với pha nước có tính acid
Tài liệu [20] đề cập tới việc xử lý hỗn hợp phản ứng (với môi trường phản ứng là dung môi 1,4-dioxan) bằng việc thêm một lượng nhỏ nước cất vào bình phản ứng rồi nhỏ từ từ dung dịch acid HCl 10% cho tới pH=2 thì tiến hành chiết với EtOAc, thu được sản phẩm là sulfonamid ở pha hữu cơ Tuy nhiên, trong quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy quá trình chiết với EtOAc có nhiều khó khăn như:
- Thời gian tách pha chậm
- Bề mặt phân cách hai pha khó quan sát
- Pha hữu cơ kéo thêm nhiều nước
- Pha nước có chứa sản phẩm Đồng thời là xuất hiện vết tạp trên bản SKLM, do sulfonamid đã bị thủy phân khi tiếp xúc với môi trường acid Do đó, độ ổn định của sulfonamid cần được chú ý và tối ưu nhất là phải bảo vệ nhóm sulfonamid trong quá trình chiết khi sử dụng pha nước có tính acid
Về độ ổn định của sulfonamid: trong nghiên cứu [6], độ ổn định của 12 sulphonamid đã được phân tích theo quy trình được FDA và OECD 111 khuyến nghị và cho kết luận sau: dung dịch acid là môi trường thuận lợi nhất cho quá trình thủy phân, tiếp theo là môi trường trung tính và kiềm
Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm sơ bộ xác định độ ổn định thủy phân của 12 sulfonamid
Như vậy, DCM trong quy trình này được sử dụng vừa là dung môi phản ứng vừa có tác dụng bảo vệ cấu trúc sulfonamid tạo thành tránh bị thủy phân trong quá trình chiết với pha nước acid sau đó
❖ Ưu điểm của phản ứng
- Điều kiện phản ứng đơn giản
- Thời gian phản ứng ngắn ( 2 giờ )
- Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, thân thiện với môi trường hơn so với quy trình sử dụng dung môi 1,4-dioxan và pyridin của tài liệu [20]
3.2.1.3 Phản ứng ngưng tụ Knoevenagel tổng hợp H3
Ngưng tụ Knoevenagel là phản ứng của aldehyd hoặc keton với các hợp chất có nhóm methylen hoạt động khi có sự hiện diện của các base yêu như amoniac hoặc amin Một số amin bậc 1 và bậc 2 thường sử dụng để xúc tác cho phản ứng như triethylamin, pyrrolidin, piperidin, piperazin nhưng các amin vòng no được sử dụng phổ biến nhất Dung môi cho hiệu suất tốt và được sử dụng chủ yếu trong các quy trình ngưng tụ Knoevenagel là ethanol tuyệt đối Sản phẩm sau khi tạo thành thường ít tan trong ethanol ở nhiệt độ phòng, do đó kết tinh lại sau phản ứng, thuận lợi cho quá trình thu sản phẩm Bên cạnh đó, phản ứng xảy ra tốt hơn trong điều kiện đun hồi lưu ở nhiệt độ cao khi nhanh chóng tách loại nước để tạo thành sản phẩm Cơ chế của phản ứng được thể hiện như sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.7 Cơ chế của phản ứng Knoevenagel
Khi phản ứng kết thúc, để kết tinh qua đêm, sản phẩm ít tan trong ethanol ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ đun hồi lưu ( T< 80 ºC) sau đó tiến hành lọc và rửa tủa với ethanol Việc rửa tủa với ethanol giúp loại đi lượng aldehyd dư sau phản ứng