hà thu huyền tổng hợp và thử hoạt tính ức chế enzym α glucosidase một số dẫn chất mới của indolin

Bệnh nhân đái tháo đường cần được điều trị suốt đời, trong khi các thuốc điều trị ĐTĐ hiện nay đều có giá thành cao và mỗi nhóm đều có những tác dụng không mong muốn nhất định gây ra khó

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

SỐ DẪN CHẤT MỚI CỦA INDOLIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Nguyễn Văn Giang

Nơi thực hiện: Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất Khoa Công nghệ Hóa Dược

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Nguyễn Văn Giang – người thầy đã luôn đồng hành cùng tôi vượt qua bao khó

khăn, luôn quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi vô cùng biết ơn và xin chân thành cảm ơn thầy GS.TS Nguyễn Đình Luyện, thầy PGS.TS Nguyễn Văn Hải, cô TS Đào Nguyệt Sương Huyền, chị NCS Bùi Thị Thanh Châm, chị NCS Lương Thị Thanh, và chị DS Từ Thị Thu Trang đã luôn quan

tâm, động viên, hướng dẫn, cho tôi những kinh nghiệm quý báu cả trong công việc và cuộc sống

Tôi xin trân trọng cảm ơn các đơn vị: Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết Xuất – Khoa Công nghệ Hóa Dược, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận

Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn và các em đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và

Chiết xuất (đặc biệt là bạn Nguyễn Trường Giang, và các em Lê Thị Liên, em Nguyễn Phúc Chung) Cảm ơn vì đã đồng hành cùng tôi trên con đường học hỏi, tìm kiếm kiến

thức mới và hoàn hiện khóa luận

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Vũ Văn Phùng, bạn Phạm Thùy Trang và bạn Nguyễn Thị Thu Hương đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt

quá trình thực hiện khóa luận này Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ và gia đình thân yêu Cảm ơn gia đình vì đã luôn bên tôi, yêu thương, ủng hộ tôi đến ngày hôm nay và cả mai sau

Mặc dù đã cố gắng hết sức cũng như được tạo mọi điều kiện, song do thời gian nghiên cứu chưa nhiều, kiến thức bản thân còn hạn chế nên chắc chắn khóa luận này còn nhiều thiếu sót Rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Hà Thu Huyền

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼDANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.TỔNGQUANVỀBỆNHĐÁITHÁOĐƯỜNG 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 2

1.1.3 Hậu quả và biến chứng của bệnh đái tháo đường 3

1.3.1 Cơ chế tác dụng của chất ức chế α-glucosidase 6

1.3.2 Phân loại chất ức chế enzym α-glucosidase 8

1.4.CÁCDẪNCHẤTMANGKHUNGINDOLIN-2-ONCÓKHẢNĂNGỨCCHẾENZYM 10

1.4.1 Tổng quan về các dẫn chất mang khung indolin-2-on 10

1.4.2 Các dẫn chất mang khung indolin-2-on có khả năng ức chế enzym glucosidase 11

α-1.4.3 Vai trò của nhóm sulfonamid trong phát triển thuốc 12

1.4.4 Lựa chọn hướng nghiên cứu cho đề tài 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.NGUYÊNLIỆUVÀTHIẾTBỊ 14

2.2.NỘIDUNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 15

2.2.1 Tổng hợp hóa học 15

2.2.2 Khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp được bằng phương pháp phổ 17

2.2.3 Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1.THỰCNGHIỆM,KẾTQUẢ 19

3.1.1 Tổng hợp 2-oxoindolin-5-sulfonyl chlorid (H1) 19

3.1.2 Tổng hợp 5-(morpholinosulfonyl) indolin-2-on (H2) 21

3.1.3 Tổng hợp 5-(morpholinosulfonyl)-3-(2-nitrobenzylidene) indolin-2-on (H3) 22

3.2.XÁCĐỊNHCẤUTRÚCHÓAHỌC 23

3.3.BÀNLUẬN 27

3.3.1 Bàn luận về các phản ứng tổng hợp hóa học 27

3.3.2 Bàn luận về kết quả phân tích phổ và cấu trúc của sản phẩm 33

3.2.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon 13

(Carbon 13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance)

Doublet of doublets Triplet

Multiplet

(Electrospray ionization)

( Glucagon -like- peptide 1)

HbA1c % hemoglobin bị glycosyl trong tổng số hemoglobin

( The half maximal inhibitory concentration)

(Nuclear magnetic resonance)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất 14

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị 15

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ 20

Bảng 3.2 Khảo sát dung môi để hòa tan hỗn hợp các chất 20

Bảng 3.3 Kết quả thu được trong quá trình chiết 21

Bảng 3.4 Khảo sát các điều kiện phản ứng 22

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 23

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 24

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR 25

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR 26

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn sự tăng nhanh của bệnh 4

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3D của enzym α-glucosidase 6

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzym α-glucosidase 7

Hình 1.4 Cấu trúc của acarbose, miglitol, voglibose và DNJ 8

Hình 1.5 Cấu trúc của dẫn chất monosaccharid 9

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của hợp chất 2 và 3 9

Hình 1.7 AGIs muối thiosugar phân lập từ thực vật loài Salacia 9

Hình 1.8 Cấu trúc chung của các dẫn chất 5-bromo-2-aryl benzimidazole (A), 10

cấu trúc của hợp chất 17 (B) 10

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của indolin-2-on 10

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của sunitinib (A) và nintedanib (B) 11

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của hợp chất 6 11

Hình 1.12 Công thức cấu tạo của hợp chất 7 (A) và hợp chất 8 (B) 12

Hình 1.13 Công thức cấu tạo của hợp chất 9 12

Hình 3.1 Liên kết hydro giữa THF và nước 30

Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm sơ bộ xác định độ ổn định thủy phân của 12 sulfonamid 31

Sơ đồ 3.4 Cơ chế phản ứng sulfo hóa tạo nguyên liệu H1 27

Sơ đồ 3.5 Cơ chế phản ứng tạo tạp 27

Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng tạo thành sulfonamid 29

Sơ đồ 3.7 Cơ chế của phản ứng Knoevenagel 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

“Thế kỷ 21 này là thế kỷ của bệnh nội tiết và chuyển hóa Những gì đại dịch HIV/AIDS gây ra cuối thế kỷ 20 là những điều bệnh đái tháo đường sẽ gây ra trong thế kỷ 21" – dự báo này của các chuyên gia y tế đã và đang trở thành hiện thực Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh không lây nhiễm gây tử vong đứng hàng thứ ba, sau tim mạch và ung thư Thống kê từ Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế (IDF), năm 2021 số bệnh nhân mắc đái tháo đường (ĐTĐ) là 537 triệu người và tổng chi phí y tế đã được chi trả lên tới 966 triệu đô [23] Bệnh nhân đái tháo đường cần được điều trị suốt đời, trong khi các thuốc điều trị ĐTĐ hiện nay đều có giá thành cao và mỗi nhóm đều có những tác dụng không mong muốn nhất định gây ra khó khăn trong quá trình điều trị và chăm sóc bệnh nhân Do vậy, việc nghiên cứu các thuốc mới có tác dụng trong điều trị bệnh này là việc làm cần thiết

Mục tiêu trong điều trị đái tháo đường là phải duy trì được nồng độ glucose máu khi đói, glucose máu sau ăn gần như mức độ sinh lý, từ đó đạt được mức HbA1c lý tưởng giúp phòng tránh các biến chứng nặng nề của bệnh [25] Một trong những biện pháp có hiệu quả trong việc hạn chế sự tăng glucose máu sau bữa ăn là ức chế enzym α-glucosidase Enzym này có vai trò xúc tác cho phản ứng phân hóa các carbohydrat thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào hệ tuần hoàn [19] Các thuốc ức chế enzym α-glucosidase được sử dụng để điều trị ĐTĐ bao gồm acarbose, miglitol và voglibose Tuy nhiên, nhóm thuốc này vẫn còn tồn tại nhiều tác dụng không mong muốn kèm theo trên đường tiêu hóa Do đó, việc nghiên cứu các hợp chất có tiềm năng trong việc ức chế enzym α-glucosidase là một hướng nghiên cứu triển vọng Bên cạnh đó, các công bố gần đây về dẫn chất có khung indolin-2-on có tiềm năng trong khả năng ức chế enzym α-glucosidase cho thấy mức độ thu hút nhất định đối với các nhà phát triển thuốc[13], [16], [24]

Từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tổng hợp và thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase một số dẫn chất mới của indolin” với hai mục tiêu chính:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất mới của indolin-2-on 2 Đánh giá được tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường

1.1.1 Định nghĩa

Theo Hiệp hội Đái tháo đường Mỹ (American Diabetes Association) [2]: “Đái tháo đường (ĐTĐ) là một nhóm bệnh chuyển hóa, có đặc điểm là tăng glucose máu, là hậu quả của sự thiếu hụt insulin hoặc khiếm khuyết trong các hoạt động của insulin hoặc cả hai Tăng glucose máu mạn tính thường dẫn đến sự hủy hoại, rối loạn chức năng và suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, tim và mạch máu”

1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường

Theo ADA, bệnh đái tháo đường được phân ra các loại sau đây [2]: ❖ Đái tháo đường týp 1:

• Đái tháo đường týp 1 qua trung gian miễn dịch (đái tháo đường phụ thuộc insulin): nguyên nhân do sự phá hủy tế bào β của đảo tụy tự miễn dẫn đến sự thiếu hụt insulin tuyệt đối

• Đái tháo đường týp 1 vô căn: một số dạng ĐTĐ tuýp 1 không rõ nguyên nhân Nồng độ insulin trong cơ thể thấp trường diễn và có nguy cơ nhiễm toan ceton nhưng không có bằng chứng về sự tự miễn

❖ Đái tháo đường týp 2 (đái tháo đường không phụ thuộc insulin) Chiếm khoảng 90-95% tổng số bệnh nhân mắc bệnh với nguyên nhân là do mất khả năng sản xuất insulin của tế bào β thường xuyên trên nền tảng của tình trạng kháng insulin ❖ Đái tháo đường thai kì (GDM): là bất cứ rối loạn dung nạp glucose huyết nào khởi phát hoặc lần đầu tiên được chẩn đoán phát hiện trong thời kỳ mang thai, gặp khi có thai lần đầu và thường mất đi sau khi sinh con

❖ Đái tháo đường do các nguyên nhân khác:

• Giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen MODY (Maturity Onset Diabetes of the young – ĐTĐ khởi phát trên bệnh nhân trẻ tuổi, thường trước 25 tuổi)

• Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen INSR • Bệnh nội tiết (to đầu chi, hội chứng cushing, u tiết glucagon, u tủy thượng

thận tăng tiết catecholamin, cường giáp, u tiết aldosteron) • Bệnh của tuyến tụy ngoại tiết (xơ hóa tuyến tụy)

• Tăng đường huyết do hóa chất hoặc thuốc (thường gặp ở đối tượng có đề kháng insulin, một số hoạt chất làm giảm sự tiết insulin bởi tế bào β như glucocorticoid, hormon tuyến giáp, )

1.1.3 Hậu quả và biến chứng của bệnh đái tháo đường

❖ Hậu quả của bệnh đái tháo đường [2]

- Nồng độ glucose máu tăng cao làm tăng áp lực thẩm thấu, bệnh nhân khát và uống nhiều nước, đồng thời cản trợ sự hấp thu nước ở ống thận gây nên tình trạng đa niệu thẩm thấu

- Tế bào thiếu năng lượng do glucose ít vào tế bào làm giảm G6P dẫn đến trung tâm đói bị kích thích dẫn đến cảm giác đói thường xuyên

- Gan tăng cường thoái hóa glycogen và acetyl CoA dẫn đến ứ đọng thể cetonic trong máu gây toan máu Đồng thời, cholesterol được tăng cường tổng hợp tại gan, đây là yếu tố nguy cơ rất lớn gây xơ vữa động mạch, gây phù gai mắt, nhồi máu cơ tim,

- Giảm tổng hợp và tăng cường thoái hóa protein nên người bệnh mau gầy và suy kiệt

Đối với bệnh nhân đái tháo đường do thiếu hụt insulin tuyệt đối nếu không được điều trị bằng insulin đủ liều lượng thì diễn biến của bệnh nhanh với nhiều biến chứng nặng nề Với bệnh nhân thiếu hụt insulin tương đối thì diễn biến chậm hơn do ở giai đoạn đầu có sự tăng đề kháng insulin nhưng tế bào β đảo tụy tăng tiết nên dung nạp glucose không đổi, glucose vẫn có thể vào được trong tế bào nên chưa có rối loạn chuyển hóa và ứ động thể ceton

❖ Biến chứng của bệnh đái tháo đường [30]

- Nhiễm khuẩn: glucose máu cao và suy giảm đề kháng là biểu hiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển: liên cầu, trực khuẩn lao, Bệnh nhân thường bị lở loét, mụn nhọt, lao phổi,

- Biến chứng mạch máu lớn: bệnh lý thường gặp: bệnh lý mạch vành, bệnh mạch máu ngoại biên, tăng huyết áp,

- Biến chứng vi mạch: tổn thương nội mạch vi mạch, tổn thương màng đáy các vi mạch và gây dễ vỡ các thành mao mạch Ba biến chứng vi mạch chính do đái tháo đường gồm: biến chứng võng mạc, biến chứng thận và biến chứng thần kinh - Cuối cùng dẫn đến suy kiệt toàn thân, nhiễm toan, nhiễm độc, nhiễm toan chuyển hóa, nhiễm độc, giảm kali máu, mất nước, bệnh nhân có thể hôn mê và tử vong

1.1.4 Dịch tễ ❖ Tình hình ĐTĐ trên thế giới

ĐTĐ là bệnh đã có từ lâu, nhưng đặc biệt phát triển trong những năm gần đây, bệnh tăng nhanh theo tốc độ phát triển của nền kinh tế - xã hội Năm 1994, toàn thế giới có 110 triệu người ĐTĐ, năm 1995 tăng lên 135 triệu (4% dân số thế giới) Ước tính của Liên đoàn ĐTĐ Quốc tế (IDF) số người mắc bệnh ĐTĐ năm 2010 là 246

triệu người, năm 2021 là 537 triệu người, tốc độ gia tăng của bệnh ĐTĐ là 55% mỗi năm Dự kiến số người ĐTĐ sẽ tăng lên 642 triệu người vào năm 2030 [23]

Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn sự tăng nhanh của bệnh

Đái tháo đường gây ra gánh nặng khổng lồ về chi phí điều trị cho người bệnh, tạo ra áp lực to lớn đối với nền y tế các nước

❖ Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam

Nước ta nằm trong khu vực Tây Thái Bình Dương - Khu vực bị ảnh hưởng nặng nề nhất của đại dịch thế kỷ “Bệnh đái tháo đường” Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường của Việt Nam đang gia tăng nhanh Bệnh không chỉ xuất hiện ở khu vực đô thị mà còn xuất hiện ở hầu khắp các khu vực từ miền núi, trung du đến đồng bằng Bệnh gây nên nhiều tác hại cho sức khỏe, tàn phế, thậm chí tử vong bởi thường được chẩn đoán, điều trị muộn

Theo báo cáo của Bệnh viện Nội tiết Trung ương năm 2023 cho biết hiện nay [33], Việt Nam có khoảng 7 triệu người mắc đái tháo đường Đáng chú ý, trong đó hơn 55% bệnh nhân đã có biến chứng, trong đó 34% là biến chứng về tim mạch; 39,5 có biến chứng về mắt và biến chứng về thần kinh; 24% biến chứng về thận Bệnh nhân đái tháo đường bị biến chứng không chỉ làm gia tăng chi phí y tế mà còn làm giảm chất lượng cuộc sống

1.1.5 Các thuốc điều trị bệnh đái tháo đường

❖ Các thuốc điều trị ĐTĐ týp 1: Insulin là chỉ định bắt buộc đối với bệnh nhân do

sự thiếu hụt insulin tuyệt đối

❖ Các thuốc điều trị ĐTĐ týp 2 [3]: Bên cạnh việc phối hợp với các biện pháp khác

như kiểm soát chặt chẽ chế đô ăn uống, vận động thể lực hợp lý, tùy thuộc vào tình trạng của bệnh nhân có thể sử dụng thêm một hoặc một số loại thuốc điều trị đặc hiệu khác Các thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 bằng đường uống với các đích tác dụng khác nhau đã được đưa vào sử dụng trên lâm sàng và được phân loại như sau [21]:

• Thuốc làm tăng tiết insulin: các sulfonylure, meglitinid • Thuốc làm tăng độ nhạy cảm của insulin ở mô đích: các biguanid

(metformin), thiazolidinedion • Thuốc làm chậm hấp thu carbohydrat ở ruột: các chất ức chế enzym α-

glucosidase • Thuốc có tác dụng incretin: nhóm ức chế DPP-4 và nhóm đồng vận thụ

thể GLP-1 • Nhóm ức chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose 2 ( SGLT2i)

1.2 Tổng quan về enzym α-glucosidase

1.2.1 Giới thiệu về enzym α-glucosidase

Alpha glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzym xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycosid bao gồm một số loại như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, alpha-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucosid glucohydrolase

Enzym α-glucosidase thuộc họ exohydrolysis, lớp glycoside hydrolase (GH), có hoạt tính thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrat giải phóng các phân tử α-D-glucose Cơ chất phổ biến của enzym alpha glucosidase là oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside,….[19] Tốc độ phân cắt các liên kết glycoside được tăng lên gấp 1017 lần so với phản ứng thông thường không có enzym xúc tác [29]

1.2.2 Phân bố

Alpha glucosidase (E.C.3.2.1.20) có trên màng bàn chải ruột non và chiếm khoảng 2% tổng số protein [27] và phân bố trên toàn bộ chiều dài ruột non [1] Ngoài ra, α-glucosidase còn được tìm thấy ở biểu mô thận [27]

1.2.3 Cấu trúc

Enzym α-glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần C tận [18] ( hình 1.2) Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lượng phân tử từ ~100 kDa và thuộc nhóm GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [22]

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3D của enzym α-glucosidase [19]

A Mô hình cấu trúc của NtMGAM B Vùng hoạt động của NtMGAM 1.2.4 Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase trong cơ thể

Enzym α-glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứng phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào hệ tuần hoàn Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử [19]

Cụ thể, thành phần carbohydrat trong thức ăn khi vào cơ thể, dưới tác dụng của các enzym trong hệ tiêu hóa với α-amylase tuyến nước bọt và tuyến tụy, carbohydrat được thủy phân thành các phân tử đường nhỏ hơn như dextrin, maltotriose, maltose [19] Hỗn hợp này sau đó được thủy phân bởi cái enzym α-glucosidase ở màng ruột non (EC.3.2.1.20), enzym α-glucosidase trong lysosym (E.C.3.2.1.3) và sucrase-isomaltase (EC.3.2.148, EC.3.2.10) thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào hệ tuần hoàn [19] Như vậy, bằng cách ức chế hoạt tính của enzym α-glucosidase có thể làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrat Kết quả là glucose máu tăng chậm hơn sau khi ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu sau ăn, và nồng độ glucose máu ban ngày dao động ít hơn, làm chậm quá trình hấp thu glucose vào máu do đó giúp kiểm soát lượng đường huyết sau ăn

1.3 Chất ước chế enzym α-glucosidase

1.3.1 Cơ chế tác dụng của chất ức chế α-glucosidase

Chất ức chế enzym α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors - AGIs) là các chất làm giảm hoạt tính của enzym α-glucosidase dẫn đến làm giảm, làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrat thành đường đơn ở ruột non, từ đó ngăn hiện tượng tăng đường huyết sau ăn

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzym α-glucosidase

AG: α-glucosidase; AGI: chất ức chế enzym α-glucosidase

Cơ chế: Phần lớn AGIs có khả năng gắn vào vùng liên kết với carbohydrat của enzym α-glucosidase vì chúng có cấu trúc tương tự với các disaccharide hoặc oligosaccharide Các phức hợp này có ái lực lớn hơn phức hợp thông thường carbohydrat-glucosidase vì vậy hình thành cơ chế ức chế cạnh tranh hoạt động của enzym α-glucosidase Do vậy, hoạt động của α-glucosidase trong màng nhầy của ruột non bị ức chế Khi carbohydrat không được hấp thụ qua các lớp niêm mạc đường ruột và bị thủy phân dần dần ở tá tràng, hỗng tràng và hồi tràng, làm giảm sự hấp thu đường

tại niêm mạc ruột non [14] (Hình 1.3)

Theo nhiều nghiên cứu, các loại thuốc AGIs điển hình, chẳng hạn như miglitol và acarbose, còn có thể tăng cường bài tiết GLP-1 (glucagonlike peptide-1), làm giảm cơn đói cũng như giảm nhu cầu ăn [15] Bên cạnh đó, cũng có bằng chứng cho thấy rằng AGIs không ảnh hưởng đến bài tiết insulin Ngày nay, có bốn loại thuốc AGIs trên thị trường: acarbose, miglitol, voglibose và DNJ

Acarbose

miglitol voglibose DNJ

Hình 1.4 Cấu trúc của acarbose, miglitol, voglibose và DNJ

Các nghiên cứu lâm sàng về acarbose và miglitol chỉ ra rằng AGIs có nhiều ưu điểm hơn các loại thuốc điều trị ĐTĐ dùng đường uống khác Chúng không có tác dụng đối với những kênh vận chuyển glucose phụ thuộc natri hay sự tăng tiết insulin của tế bào β của đảo tụy, do đó không ảnh hưởng đến việc tiêu thụ glucose cũng như gây hạ đường huyết Hơn nữa, AGIs không có ảnh hưởng đáng kể đến trọng lượng cơ thể Tác dụng không mong muốn của các thuốc AGIs chủ yếu trên đường tiêu hóa, chẳng hạn như đầy hơi, co thắt ruột và đau bụng

Tuy nhiên, từ năm 2000, thì không có thuốc AGI mới nào được chấp thuận sử dụng trên lâm sàng [9] Trong phác đồ điều trị đái tháo đường týp II, nhóm thuốc AGIs không phải lựa chọn hàng đầu như Metformin hay nhóm Sulfonylure, tuy nhiên với cơ chế tác dụng của các thuốc AGIs và của thuốc hạ glucose máu thuộc nhóm sulfonylurê, nhóm biguanid khác nhau, chúng giúp cộng hợp tác dụng khi dùng phối hợp đặc biệt với nhóm bệnh nhân tăng glucose máu (đặc biệt tăng glucose máu sau khi ăn) không kiểm soát được chỉ bằng chế độ ăn và tập luyện [17]

1.3.2 Phân loại chất ức chế enzym α-glucosidase

Dựa vào cấu trúc cấu tạo của các AGIs, chúng được chia thành 2 loại chính là các hợp chất mang cấu trúc “bắt chước đường” (carbohydrate mimics) và các hợp chất không mang cấu trúc carbohydrat

1.3.2.1 Các hợp chất mang cấu trúc “bắt chước đường” 1.3.2.1.1 Dẫn xuất monosacarit

Các chất ức chế enzym α-glucosidase đang được sử dụng trên lâm sàng là acarbose,

miglitol và voglibose (Hình 1.4) Hiện nay, các nhà hóa dược học tiếp tục nghiên cứu

và phát triển các nhóm thuốc AGIs mới an toàn và hiệu quả hơn Với các hợp chất là các dẫn xuất của monosaccharid có nhiều phương pháp để thiết kế các dẫn chất mới của monosaccharid như biến đổi cấu trúc tại vị trí C1 hay gốc C1-OH, mở vòng monosaccharid hoặc sự tái cấu trúc của glucose Năm 2013, Bian cùng cộng sự đã thiết kế một chuỗi các dẫn xuất của β-D-glucopyranosid (hợp chất A) Trong

số đó, hợp chất 1 (hình 1.5) được xác định là chất ức chế enzym tiềm năng nhất (IC50 = 2.3 μmol) so với đối chứng là acarbose (IC50 = 235,1 μmol) [7]

Năm 2013, S.F.Jenkinson cùng với các cộng sự đã công bố một dãy dẫn chất

azasugar Nghiên cứu có đề cập tới hợp chất số 2 (hình 1.6) có khả năng ức chế tốt nhất

với giá trị IC50 = 0,15µM Tuy nhiên, hợp chất số 3 ( đối quang của số 2) cho thấy khả năng ức chế enzym thấp hơn nhiều lần với IC50 = 70 µM [11]

Salaprinol Saclacinol

Hình 1.7 AGIs muối thiosugar phân lập từ thực vật loài Salacia

Ngay sau đó nhiều muối thiosugar được phân lập từ cây thuộc chi Salacia đều cho thấy hoạt động ức chế chống lại α-glucosidase ở nhiều mức độ khác nhau Vì vậy, các nhà khoa học đã tiến hành sửa đổi cấu trúc các hợp chất đó với mong muốn tìm ra một AGI có tác dụng mạnh và chọn lọc

1.3.2.2 Nhóm các chất không mang cấu trúc carbohydrat

Ngoài các hợp chất có có cấu trúc glycosyl thì các nghiên cứu cũng tìm ra nhiều hợp chất khác thể hiện khả năng ức chế enzym α-glucosidase hiệu quả Các hợp chất này được phân loại thành các nhóm nổi bật: imidazoles và pyrazole, chromones và hợp chất vòng lớn

Với khung cấu trúc imidazoles, năm 2016, Tanzila Arshad cùng các cộng sự đã công bố một dãy gồm 25 dẫn chất của 5-bromo-2-aryl benzimidazole Trong đó, 23/25 hợp chất có hoạt tính ức chế enzym và 05 hợp chất có hoạt tính mạnh hơn so với

acarbose Hợp chất 17 (hình 1.8) thể hiện khả năng ức chế tốt nhất với giá trị IC50 = 8,34 ± 0,02 μM so với acarbose có IC50= 38,25 ± 0,12 µM [4]

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của indolin-2-on

Khung cấu trúc của indolin-2-on được chứng minh là cấu trúc cốt lõi của nhiều hợp chất có hoạt tinh sinh học bao gồm chống viêm, chống đông máu, chống ung thư, rối loạn thần kinh, chất chống oxy hóa , kháng khuẩn và hoạt động chống co giật Trong số đó, các dẫn xuất indolin-2-one đã gây được sự chú ý lớn với tác dụng chống ung thư

và được phát triển dưới dạng thuốc chống ung thư Điển hình như sunitinib (Hình 1.12

), một chất ức chế tyrosine kinase đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt và đưa ra thị trường để điều trị ung thư mô đệm đường tiêu hóa và ung thư biểu mô tế bào thận Một dẫn chất khác có khung indolin-2-on là nintedanib (

hình 1.10) được phát triển thành thuốc điều trị ung thu phổi với hai biệt dược nổi tiếng

là “ Ofev” và “ Vergatel” đã được FDA phê duyệt vào năm 2020 [28]

A B

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của sunitinib (A) và nintedanib (B)

1.4.2 Các dẫn chất mang khung indolin-2-on có khả năng ức chế enzym glucosidase

α-Năm 2018, M Taha cùng với các cộng sự đã công bố 20 dẫn chất indolin -2-on lai

hóa oxadiazol Kết quả cho thấy hợp chất 6 (hình 1.11) ức chế α-glucosidase với giá trị

IC50 = 1,25 μM Nghiên cứu chỉ ra nhóm carbonyl của khung indolin-2-on tạo liên kết hydro với Lys233 là acid amin quan trọng trong cấu trúc protein [24]

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của hợp chất 6

Năm 2022, một nhóm nghiên cứu của J.Lin và các cộng sự đã công bố dẫn chất của 5-fluoro-indolin-2-on có khả năng ức chế enzym α-glucosidase Trong số 22 dẫn

chất, có 3 dẫn chất thể hiện hoạt tính tốt hơn cả, đặc biệt, đặc biệt là hợp chất 7 (hình 1.12) với IC50 = 35,83 μM Nghiên cứu động học cũng chỉ ra hợp chất này ức chế thuận nghịch enzym α-glucosidase [16]

(A) (B)

Hình 1.12 Công thức cấu tạo của hợp chất 7 (A) và hợp chất 8 (B)

Cũng trong năm 2022, nhóm nghiên cứu khác của V.G.Klochkov và các cộng sự công bố một dãy dẫn chất của indolin-2-on có tiềm năng trong điều trị ĐTĐ trong đó

hợp chất 8 (hình 1.12) thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 6,78 μM Đáng chú ý, thông qua thử nghiệm in vivo ức chế dung nạp các loại đường cho thấy hợp chất số 8 có tiềm năng để tối ưu hóa trở thành một thuốc điều trị ĐTĐ [13]

1.4.3 Vai trò của nhóm sulfonamid trong phát triển thuốc

Sulfonamid thuộc một nhóm hợp chất quan trọng có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, lợi tiểu, hạ đường huyết, chống ung thư, chống viêm, Trong vài thập kỷ qua, nhiều tác dụng dược lý khác nhau của nhóm sulfonamid đã được công bố Tuy nhiên, số lượng công bố về vai trò của của sulfonamid trong đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase khá hạn chế

Năm 2005, nhóm nghiên cứu từ Đại học quốc gia Gyeongsang đã công bố dãy dẫn

chất sulfonamid chalcone mới có tiềm năng, trong đó nổi bật với hợp chất 9 (hình 1.13)

có IC50 = 0,40 μM Cũng trong nghiên cứu này chỉ ra, vào năm 2008, đã thực hiện nghiên cứu nhằm tìm hiểu khả năng liên kết với protein đích của hợp chất 9 Kết quả đã cho thấy NH của nhóm sulfonamid tương tác thông qua liên kết hydro với Asp 349 ( acid amin quan trọng trong vùng hoạt tính của protein) và hai nguyên tử oxy của nhóm SO2

tạo liên kết hydro với His348 và Arg 212 [5]

Hình 1.13 Công thức cấu tạo của hợp chất 9

1.4.4 Lựa chọn hướng nghiên cứu cho đề tài

Từ kết quả của các nghiên cứu trên, cùng với việc các nghiên cứu về sự kết hợp giữa khung indolin-2-on và nhóm sulfonamid chưa từng được công bố về khả năng ức chế enzym α- glucodase, nghiên cứu của chúng tôi tiến hành tổng hợp dẫn chất indolin-2-on và đánh giá tác dụng ức chế enzym α- glucosidase nhằm tìm ra các dẫn chất mới có hoạt tính, từ đó đánh giá ảnh hưởng của nhóm sulfonamid đến hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi và hóa chất của phòng thí nghiệm tại bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất,

Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (xem Bảng 2.1 và Bảng 2.2)

Ngoài ra, một số trang thiết bị để xác định cấu trúc sẽ được đề cập ở phần phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

STT Dung môi, hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc

9 Ống đong dung tích 50 ml, 100ml Bomex, Trung Quốc

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tổng hợp hóa học

Chúng tôi tiến hành các phản ứng tổng hợp các chất từ nguyên liệu indolin-2-on

qua các giai đoạn sau (xem Sơ đồ 2.1):

- Tổng hợp H1 từ indolin-2-on bằng phản ứng sulfo hóa

- Tổng hợp H2 từ H1 bằng phản ứng tạo sulfonamid với morpholin - Tổng hợp H3 từ H2 bằng phản ứng ngưng tụ Knoevenagel

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng hợp các chất

Trong đó: - Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với các hệ dung môi khai triển khác nhau, quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại Các hệ dung môi khai triển được sử dụng:

• Hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7 • Hệ B: dicloromethan : methanol = 9 : 1 - Tiến hành khảo sát một số thông số cơ bản ảnh hưởng đến phản ứng như: tỉ lệ mol giữa các chất, chất xúc tác, dung môi tinh chế, từ đó lựa chọn điều kiện để phản ứng tối ưu

- Sử dụng các phương pháp: chiết phân bố lỏng – lỏng, lọc, kết tinh để tinh chế sản phẩm

- Đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM (với các hệ dung môi ở trên) và khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy (được tiến hành trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt) trước khi đo các loại phổ để khẳng định cấu trúc của chất đó

2.2.2 Khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp được bằng phương pháp phổ

Cấu trúc của các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối được khẳng định bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và Carbon-13 (13C-NMR)

Phổ hồng ngoại (IR):

Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén kali bromid trong vùng 4000 – 400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1: 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1

Phổ khối lượng (MS):

Phổ khối lượng được tiến hành ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) tại phòng phân tích cấu trúc Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử (ESI) Đặc điểm của loại phổ này là tùy theo phương thức bẫy ion (ESI+ hoặc ESI-) mà ion ghi nhận được là dương (ESI+) hay âm (ESI-)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và 13C (13C-NMR):

Phổ NMR được ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker tại Viện Hoá học –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi CDCl3 Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 hoặc 600 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz hoặc 150 MHz Độ dịch

chuyển hóa học (δ, ppm) được tính theo chất chuẩn nội tetramethylsilan, nhiệt độ ghi

phổ khoảng 300 K Phổ 1H-NMR cung cấp các dữ liệu về tỷ lệ cường độ giữa các pic, độ bội của từng

pic, dạng vân phổ, từ đó xác định được hằng số tương tác ЈH–H, tương quan giữa các hằng số này để góp phần khẳng định khung cấu trúc, vị trí các nhóm thế Độ dịch chuyển

hóa học của proton (δ1H) được lấy tới số thập phân thứ 2 Phổ 13C-NMR cho biết số carbon có trong phân tử hợp chất, độ dịch chuyển hóa học và bậc của các carbon, từ đó cũng góp phần xác định cấu tạo của hợp chất cũng như

vị trí các nhóm thế Độ dịch chuyển hóa học của carbon (δ13C) được lấy tới số thập phân thứ 2

2.2.3 Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

Được tiến hành tại Phòng hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [8], [10], [12], [26]

❖ Nguyên lí của phép thử

Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside nhờ tác động của enzym α - glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-Nitrophenol có màu vàng

Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng Lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra phản ánh hoạt độ của enzym α - glucosidase

❖ Phương pháp

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO và nước deion thành 1 dãy các nồng độ, nồng độ lần lượt trong phản ứng là 256; 64; 16 và 4 µg/ml hoặc pha loãng tiếp với mẫu có hoạt tính nhỏ hơn Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo

Các thành phần phản ứng bao gồm: Phosphate buffer 100 mM pH 6,8; glucosidase 0,2 U/ml, mẫu thử và p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 2,5 mM Ở mẫu đối chứng, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng Thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37º C Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng Na2CO3 Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A)

α-Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức: Độ ức chế (%) = [A(đối chứng) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng) x 100% IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của enzym α-glucosidase, được tính bằng phần mềm Tablecurve

𝒑 − 𝑵𝒊𝒕𝒓𝒐𝒑𝒉𝒆𝒏𝒚𝒍 𝜶 − 𝑫 − 𝑮𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒊𝒅𝒆

𝜶−𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒊𝒅𝒂𝒔𝒆 𝜶 − 𝑫 − 𝑮𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒆 + 𝒑 − 𝑵𝒊𝒕𝒓𝒐𝒑𝒉𝒆𝒏𝒐𝒍

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thực nghiệm, kết quả

❖ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Giai đoạn 1: Sau khi phản ứng kết thúc, làm nguội phản ứng về nhiệt độ phòng

Tiến hành nhỏ từ từ dịch phản ứng vào nước đá lạnh thì tủa màu hồng nhạt xuất hiện, trong quá trình nhỏ phải khuấy liên tục Lọc, rửa tủa bằng nước cất lạnh và sấy khô dưới đèn hồng ngoại

Kết quả: - Cảm quan: chất rắn có màu hồng nhạt - Khối lượng tủa: 1,50 g

- SKLM: Xuất hiện 2 vết trên TLC với Rf1 = 0,81 và Rf2 = 0 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)

Giai đoạn 2: Hòa tan 1,50g khối sản phẩm thu được với 30,0 ml THF trong cốc có

mỏ, rồi thêm 150,0 ml dicloromethan (DCM) vào, chuyển hỗn hợp vào bình chiết Tiến hành chiết với pha nước là dung dịch đệm có pH = 8~9 ( 200,0ml/lần x 2 lần), tách lấy pha hữu cơ Rửa pha dung môi hữu cơ với dung dịch NaCl bão hòa và làm khan bằng Na2SO4, cất quay loại dung môi thu được nguyên liệu H1

❖ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu cam - Khối lượng sản phẩm: 1,00 g - Hiệu suất: 57,48%

- Nhiệt độ nóng chảy: 200,2 -203,4 ºC

- SKLM: Rf = 0,81 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)

❖ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới hiệu suất phản ứng

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ

STT Nhiệt độ Thời gian gia nhiệt Hiệu suất

* Kết quả được lấy trên thực nghiệm với quy mô mỗi mẻ là 0,50g nguyên liệu

Nhận xét: Dựa trên số liệu khảo sát được, điều kiện được lựa chọn để tiến hành

phản ứng là nhiệt độ 70ºC trong 3 giờ ❖ Khảo sát dung môi để hòa tan hỗn hợp các chất trong giai đoạn 1

Bảng 3.2 Khảo sát dung môi để hòa tan hỗn hợp các chất

Nhận xét: Ba dung môi là THF, 1,4 -dioxan và aceton đều có khả năng hòa tan

hoàn toàn khối hỗn hợp các chất ở giai đoạn 1 Tuy nhiên, cần thực hiện chiết loại tạp với pha nước ở giai đoạn sau nên không dùng dung môi aceton Với 1,4 – dioxan là dung môi có nhiệt độ sôi cao nên khó khăn trong quá trình cô loại bỏ dung môi sau khi chiết, còn THF khả năng hút ẩm cao, thường nhiễm nước, nên làm khan trước khi sử dụng Với những cơ sở đó, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn dung môi THF trong quá trình xử lý phản ứng

❖ Lựa chọn dung môi trong quá trình chiết

Bảng 3.3 Kết quả thu được trong quá trình chiết

1 Ethyl acetat - Thời gian tách pha chậm

- Bề mặt phân cách hai pha khó quan sát - Pha hữu cơ kéo thêm nhiều nước

- Pha nước có chứa sản phẩm 2 Dicloromethan - Thời gian tách pha nhanh

- Bề mặt phân cách hai pha rõ ràng - Hạn chế nước ở pha hữu cơ - Pha nước không chứa sản phẩm

Nhân xét: Ethyl acetat và dicloromethan là hai dung môi thường được sử dụng trong

quá trình chiết phân bố lỏng – lỏng Với cơ sở lý thuyết và dựa trên thực nghiệm, trong trường hợp này thì sử dụng dung môi DCM là lựa chọn tối ưu

phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi A (n-hexan: ethyl acetat = 3: 7)

❖ Xử lý hỗn hợp phản ứng Sau khi phản ứng kết thúc, thêm 50,0 ml dicloromethan (DCM) vào bình cầu, chuyển hỗn hợp vào bình chiết Tiến hành, chiết với pha nước là dung dịch đệm có pH = 2 (200ml/lần x 2 lần), tách lấy pha hữu cơ Sau đó, tiếp tục chiết lần 2 với pha nước là dung dịch đệm có ph= 8~9 (200ml/lần x 1 lần), thu lấy pha hữu cơ Rửa pha dung môi hữu cơ với dung dịch NaCl bão hòa và làm khan bằng Na2SO4, cất quay loại dung

môi thu được nguyên liệu H2

❖ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu trắng sữa - Khối lượng sản phẩm: 0,45 g - Hiệu suất: 73,14%

- Nhiệt độ nóng chảy: 216,0 – 218,2 ºC - SKLM: Rf = 0,59 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)

Rf = 0,49 (hệ B: dicloromethan : methanol = 9 : 1)

❖ Khảo sát lựa chọn điều kiện phản ứng tối ưu

Bảng 3.4 Khảo sát các điều kiện phản ứng

STT Dung môi Điều kiện phản ứng Thời gian theo

dõi phản ứng

Sắc ký lớp mỏng theo dõi

phản ứng 1 1,4 – dioxan

Nhiệt độ phòng (có thêm pyridin trong khối phản ứng)

6 giờ Vết nguyên liệu

rất mờ

2 Tetrahydrofuran

(THF)

80 ºC ( đun hồi lưu) 6 giờ

Vết nguyên liệu còn đậm 3 Dicloromethan

Hết vết nguyên liệu

Nhận xét: Thực hiện phản ứng với dung môi dicloromethan (DCM) tại nhiệt độ

phòng là phương pháp thực hiện tối ưu với điều kiện đơn giản, thời gian phản ứng ngắn

3.1.3 Tổng hợp 5-(morpholinosulfonyl)-3-(2-nitrobenzylidene) indolin-2-on (H3)

❖ Sơ đồ phản ứng:

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp H3 từ H2

❖ Cách tiến hành:

Cân 0,15g (0,53 mmol) H2 và 0,12g (0,8 mmol) 2-nitrobenzaldehyd cho vào bình cầu một cổ dung tích 50 ml và bổ sung thêm 5,0 ml ethanol tuyệt đối và 0,5ml (0,053 mmol) dung dịch piperidin 1% (tt/tt) pha trong ethanol tuyệt đối Lắp sinh hàn thẳng rồi đun nóng từ từ hỗn hợp phản ứng đến 80º C Duy trì hỗn hợp phản ứng trong 8 giờ ở nhiệt độ 80 - 90ºC, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi A (n-hexan: ethyl acetat = 3: 7) cho tới khi hết nguyên liệu H2

❖ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng:

Khi phản ứng kết thúc, làm nguội phản ứng về nhiệt độ phòng và để kết tinh qua đêm Sau đó, lọc và rửa tủa với ethanol tuyệt đối đến khi loại hết lượng aldehyd bám trên tủa Xác định bằng SKLM với hệ dung môi A (n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7) Tủa sau khi sấy khô dưới đèn hồng ngoại được hòa tan trong 20,0 ml dicloromethan (DCM) rồi tiến hành chiết với pha nước có pH = 2 (30,0 ml/lần x 1 lần), thu lấy pha hữu cơ Rửa pha dung môi hữu cơ với dung dịch NaCl bão hòa và làm khan bằng Na2SO4, cất quay loại dung môi thu thu được sản phẩm

❖ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu vàng nâu - Khối lượng sản phẩm: 0,11 g - Hiệu suất: 49,96 %

- Nhiệt độ nóng chảy: 230,2 – 231,9 ºC - SKLM: Rf = 0,67 (hệ A: n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)

3.2 Xác định cấu trúc hóa học

Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)

Chất Công thức phân tử m/z lý thuyết m/z (ESI + MS) Phụ lục

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Chất Công thức cấu tạo Đỉnh hấp thụ

νmax (cm-1) Nhóm chức

Phụ lục

1520

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ 1H-NMR:

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR

Chất Công thức cấu tạo Dữ liệu phổ cộng hưởng từ

hạt nhân proton

Phụ lục

H2

1H-NMR (600 MHz, CDCl3

-d), δ (ppm): 8,31 (1H, s, H-1); 7,68 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-6); 7,63 (1H, s, H-4); 7,02 (1H, d, J= 8,4 Hz, H-7); 3,76 (2H, t, J = 4,8 Hz, H-2a); 3,63 (2H, s, H-3); 3,01 (2H, J = 4,5 Hz, H-

3a)

7