nghiên cứu phân lập một vài polyphenol và khảo sát hàm lượng cynarin trong chế phẩm có actisô cynara scolymus l khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE ĐẠI HỌC Y DƯỢC THANH PHO HO CHi MINH

NGUYEN THI THANH TRA

NGHIEN CUU PHAN LAP MOT VAI POLYPHENOL VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG CYNARIN TRONG CHE PHAM CÓ ACTISÔ (CYN4RA SCOLYMUS L.)

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hỗ Chí Minh - ố011

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE DAI HOC Y DUOC THANH PHO HO CHi MINH

NGUYEN TH] THANH TRA

NGHIEN CUU PHAN LAP MOT VAI POLYPHENOL VA KHAO SÁT HÀM LƯỢNG CYNARIN TRONG CHE PHAM CÓ ACTISÔ (CYN4RA SCOLYMUS L.)

KHÓA LUẬN TOT NGHIEP DUGC SI DAI HOC Gido vién huéng dina TS PHAM DONG PHUONG

DS NGUYEN TH] ANH NGUYEET

Thanh phé Hé Chi Minh - 6011

LOI CAM ON

Khóa luận tốt nghiệp được thực hiện tại khoa Dược — Đại học Y Dược TP Hỗ Chi Minh trong thời gian từ 01/04/2011 đến ngày 25/07/2011 dưới sự hướng d5n của th7y TSà Phạm Đông Phương và DSà Nguyễn Thị Ánh Nguyệtà

Với lCng biết ơn sâu sắc em xin gHi lời chân thành cảm ơn đến th7y TSà Phạm

Đông Phương, th7y đK quan tâm, hướng dãn, truyMn đạt nhNng kinh nghiệm quy

bPu giúp em thực hiện và hoàn thành khóa luậnà

ắm xin chân thành cảm ơn chi DSA Nguyễn Thị Ánh Nguyệt là người đK hướng dõn, chS bảo và giúp đT tận tình trong suốt thời gian em thực hiện khóa luậnà Xin trân trọng cảm ơn th7y PGSàTS Tr7n Hùng và cPc th7y cô trong hội đồng phản biện đK dành thời gian quy bPu để nhận xét, góp y cho khóa luận thêm hoàn chSnhà Cảm ơn cPc th7y cô trong bộ môn dược liệu: TSà Nguyễn Viết Kình, TSà Võ Văn Lẹo, ThSà Huỳnh lời đK giúp đT, giải đPp nhNng thắc mắc và tạo điMu kiện thuận

lợi cho em hoàn thành khóa luậnà

Con xin gHi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình đK luôn khuyến khich và động viên conà

Mình cảm ơn sự động viên và giúp đT nhiệt tình của cPc anh chị cao học, cPc bạn cùng làm khóa luận tại bộ môn dược liệu, cPc bạn lớp Dược K0ủ và cPc bạn cùng

phOng trong suốt 4 thPng làm khoP luậnà

1H

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN Q 220222212 21222112 2222222221222 re ii MỤC LỤC 52 22221221122222222221212222222222222222 22222 rre ii DANH MUC CAC CHU VIET TẮTT 5 2221221222212121212211221222 22 re ii DANH MUC CAC BANG

ĐẶT VẤN ĐÊ Q.0 2212222222222 2212 ree CHƯƠNG1 TÔNGQUAN 2 2 eree 2 1.1 TÔNG QUAN VỀ THIC VẬT HỌC 52222 22222212222211222.2 re 2

IIN (in on s 2

1.1.2 Đặc điểm chỉ 2 25 2222221221222 esteneesteseseterietensteetetesesensseetes 2 1.1 Phân bó, sinh thải -2- 222 212221127112221217221122222222212222222 ca 2 1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 2s S212 rrryg 2 1.2 TÔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 0 H22 reg 2

1.2.1 Dẫn xuất caffeoylquinic ss sa ra rao 2 IS ào co 8n 5 2

1.2 Inulin - c5

1.2.4 Các thành phần khác

1.2.5 Một số hợp chất trong actisô - n1 1111 gen rườn 2

1 TÔNG QUAN VỀ TÁC DUNG DƯỢC La VÀ CÔNG DỰNG 2

In so e.a 2

II oi săncc:đaađađađdđadđadđdđdiiđiddiiiiadẢaỶŸỶŸẢÕẢẮẼÝÝẼÝ 2

1 Định lượng các hợp chất trong actisô bằng HPLC 5 nc nen 2

CHƯƠNG2 _ ĐÓI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ¿ 2 2.1 ĐÔI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2252 22122212221221122122222222 re 2

2.2 Phân lập - 25-222 222212221222222112122122122222222 2222 re 2 2.2.4 Xác định cầu trúc 22s 2122211271222221222112222222122222 re 2 2.2.5 Phương pháp định tính cynarin bằng HPLC 2 St re rrrrườn 2

2.2.6 Phương pháp định lượng cynarin trong các chế phẩm nhe 2 2.2.7 Định lượng và tính kết quả hàm lượng cynarin trong các chế phẩm 2

CHƯƠNG KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 2c c nung 2 1 ĐỊNH TÍNH -222 2212212221122 treo 2 _ 1.1 Dinh tính bằng sắc ky lớp mỏng - 2s n2 1g re ree 2 1⁄2 Định tính bằng HPLC à 2s 2n nh a2 221gr roe 2 2 ĐỊNH LƯỢNG 2222222222222 erre 2 2.1 Khảo sát số lần chiẾt 2s 2122211221222 re 2 _“x“ua.huaIẬPId 2

2.4 Kiêm tra độ tỉnh khiết của cynarin chuẩn - 2s ng dc 2

2.5 Thâm định quy trình định lượng cynarin bằng phương pháp HPLC 2 2.6 Định lượng cynarin trong các chế phẩm 20 2s 21211 re 2

CHIẾT XUẤT VÀ PHẦN LẬP -222222221221122112271211222.21222 eeg 2 l, ChiẾT Xuất 20 2212222211222 re 2 2 Phân lập 222 2212221221122 ea 2 CHƯƠNG 4

DDVN HPLC SKD

SKC

SKLM EtOAc

CHCl

MeOH TT PDA CTCPDP

V

PD a.formic

Chloroform Methanol

Thuốc thử

Photodiod Array (dãy diod quang) Công ty cổ phần được phẩm Thê tích

Phân đoạn acid formic Cynarin Acid chlorogenic Acetonitril

Nuclear magnetic resonance (Phé céng hung ti hat nhan)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình I.1 Lá và hoa của Cynara cardunculus .à 2 SG S2 H1 HH HH1 HH HH Hình 1.2 Lá và hoa của Cnard lHHHÏi§ .à ác SH H1 H1 HH HH1 1111111111 1H12, Hình | Lá và hoa của Ca sCOlUHHHS Ì, ác H121 HH 1112111111111 11111111 t2 2

Hình 1.4 Các hợp chất nhóm flavon trong actisô 22-522 222122122121122122121122122212226 Hinh 1.5 Cau trúc chung của cdc anthocyanin trong actisô 222222 22122122221221221222222 Hình 2.6 Các cao và chế phâm có chứa actisô trên thị trường 22 22222222225222222222

Hình 24 SKĐÐ khảo sát tính chọn lọc của các chế phẩm 22 S22 2222212122212221222 2222 2

Hình 25 Sơ đồ quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cao BV -22 222222222 221222 2222 2

Hình 26 SKB cdc cao chiết xuất từ cao BV 0 S111 1121111111111211212112122 22222212 2 Hình 27 SKĐÐ các PÐ của tủa E¡ trên cộ t Sephadex 2 2 S2 SS2222212 2m

Hình 28 SKĐ cao B khai triển lần 2222222222222221222.222221,.222222222 226 2

Hình 29 SKÐ các phân đoạn cao B trên cộ t cố điễn 2022221222222 2 Hình 0 SKĐ phân lập chất C từ tủa E¿ và E trên cộ t cỗ điễn -S22222222222xe Hình 1 SKĐ phân lập các chất từ PÐ 6 từ cột 2 trên Sephadex s22 22s 2222 2

Hinh, SKD chat C trên HPLC 22 S1 S11 111111111211 211111111111111111111211212121212 x2 2 Hình 4 SKĐ cynarin chuẩn trên HPLC 522 52221 221221221122112212121211212222222 2x6

Hinh,.5 SKD chat C thêm cynarin chuẩn trên HPLC 22 S22 S22221212221212212212 222222

VI

DANH MỤC CAC 4ANG

Bảng 1.1 Một số hợp chat trong 2 loài aetisô nhe 2tr run 2

Bảng 1.2 Một số điều kiện định lượng các polyphenol trong actisô bằng HPLC 2

Bảng 2 Các chế phẩm có actisô trên thị trường s 2s 2n ng dưa 2 Bảng 4 Khối lượng các chế phẩm -2- s22 g2 reo 2

Bảng 5 Kết quả định tinh cynarin và acid chlorogenic bằng HPLC 2

Bảng 6 Tương quan giữa số lần chiết và diện tích đỉnh sen eruo 2

Bảng 7 Các thông số sắc ky của cynarin chuân cscnnnnrtnntrruya 2 Bảng § Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh cynarin -2- s2 2ssssec 2 Bảng 9 Tính tương thích hệ thống của mẫu thử 22 s2 rre 2

Bảng 10 Kết quả độ lặp lại của cynarm

Bảng 11 Kết quả khảo sát độ đúng cynarin

Bảng 12 Hàm lượng cynarin trong các chế phẩm 2s 2s na na 2

Bảng 1 Kết quả thăm đò hệ dung môi cho cột cỗ điễn à eeeeeeeereeee 2

Bảng 14 Kết quả phân lap polyphenol bằng sắc ky cột cô điển 1 2

DAT VAN DE

Ngày nay, actisô được xem như là thực phẩm chức năng cũng như là thuốc rất tốt

cho sức khỏe nhờ những hợp chất phenolie có hoạt tính sinh học như các dẫn xuất

cua caffeoylquinic, đặc biệt là cynarin, các sản phẩm phân hủy của cynarin và các flavonoid cũng như inulin, chất xơ và chất khoáng Nhiều bộ phận như lá, hoa, rễ

của actisô từ lâu đã được sử deng để điều trị nhiều bệnh, đặc biệt là trong điều trị

các chứng bệnh về gan mật và tiêu hóa Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây, dịch chiết lá actisô có tác dcng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng u, kháng HIV, lợi tiêu cũng như khả năng ngăn cản quá trình tổng hợp cholesterol và oxy hóa LDL [12] Nhờ những lợi ích trên, actisô ngày càng được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới và ngành sản xuất actisô càng phát triển đã đóng góp rất lớn cho

nên kinh tế các nước, đặc biệt là ở Italia (sản lượng đứng đầu thế giới với 474.000 tấn/năm), Tây Ban Nha (215.000 tắn/năm), Pháp (55.000 tấn/năm), Hy Lạp ( 25.000 tan/nam) [12]

Những năm gần đây, Việt Nam đã quan tâm đến những lợi ích mà cây actisô đem

lại, việc trồng và sản xuất actisô đã được triển khai ở nhiều nơi có khí hậu lạnh phù

hợp với sự phát triển của cây như Đà Lạt, Sapa Một số công ty dược phâm đã nghiên cứu và sản xuất nhiều chế phẩm có chứa actisô đa dạng cả về số lượng, chất lượng và dạng bào chế như viên nén, viên nang cứng, viên nang mềm, viên sủi, dạng ống uống, trà actisô túi lọc Tuy nhiên, cho đến nay việc kiểm nghiệm chất lượng các chế phẩm này chỉ dựa trên các phương pháp có độ chính xác và độ tin cậy thấp như UV-Vis Do đó, việc xây dựng phương pháp định tính định lượng giúp cho việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, kiểm nghiệm ban thành pham và thành phẩm với đệ chính xác cao như phương pháp định lượng bang HPLC dé

nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị của thuốc là một nhu cau cấp thiết và

có y nghĩa thiết thực

Đề tài “Nghiên cứu phân lập một vài polyphenol và khảo sát hàm lượng cynarin trong chế phâm có actisô (Cynara scolymus L., Asterceaey” voi mec tiêu sau đây:

-_ Khảo sát sơ bộ hàm lượng cynarin trong các chế phẩm

- _ Nghiên cứu phân lập một vài hợp chất polyphenol mà đề tài trước đây chưa

phân lập được

- Xác định cấu trúc các chất phân lập.

CHUONG 1 TONG QUAN 1.1 TONG QUAN VE THQC VAET HOC

1.1.1 Vị trí phân loại Chỉ Cynara được phân loại như sau [19]

Thực vật bậc cao Vv Ngành ngọc lan (Magnoliophyta)

Vv Lớp Ngọc Lan (Magnoliosida)

Vv Bộ Cúc (Asterales)

V _ Ho Cúc (Astersceace)

1à Cynara alba 5à Cynara hystrix 2a Cynara algarbiensis ua Cynara kurdica đà Cynara auranitica 7a Cynara pygmaea

10à Cynara cornigera 14a Cynara sibthorpiana 11à Cynara cyrenaica 15a Cynara syriaca 12a Cynara humilis

Một số loai thuéng dugc sw dungé Loai Cynara scolymus duoc str deng phd bién nhất trong thực phâm cũng như trong dược phẩm và thực phâm chức năng Ngoài ra, một số loài sau đây cũng được sử đeng chủ yếu trong thực phẩm:

Cynara cardunculus: Loai này còn cô tên khác như Cardoon hay Actisô dại, được sử đeng phô biến như nguồn cung cấp chất làm đông thay thế cho men dịch vi lay ở đạ dày bò (rennet) trong sản xuất pho mát Với ưu thế là pho mát sử đeng chat

làm đông thực vật nên rất thích hợp cho những người ăn kiêng, nhiều loại pho mát ở

miễn nam châu Âu theo truyền thống được làm theo cách này

Cynara humilisá Cây mọc dạt ở Nam Âu và Bắc Phi, được người Berber dùng làm

rau ăn và cũng dùng trong sản xuất pho mát giống như loài Cynara carduneulus Cynara cornigeraa loai này có rất nhiều gai, phát triển mạnh ở đảo Crete thuộc Hy Lạp, nơi nó được gọi là agriagginara, lá và hoa được ăn sống, luộc, hấp, hay nấu

nhừ Ở Hy Lạp từ thời cô đại đã sử dcng để trị bệnh gan và dùng như chất kích

thích tinh đcc Theo người Athenaeus của vùng Naukratis thuộc Hy Lạp cô đại vốn rất sành ăn thì lá của loài này có thể lột vỏ và ăn sống nhưng vị đẳng của nó ngon hơn khi ngâm trong muối [19]

Hình 1.1à LP và hoa của Cynara cardunculus Làà

1.1.ồ Phân bố, sinh thái

Phân bố: Actisô là giống cây tự nhiên của lưu vực Địa Trung Hải và được biết đến

từ thế ký thứ tư trước công nguyên như thức ăn và còn được sử đeng làm thuốc Người Á Âập đóng vai trò quan trong trong việc di thực loài này đến vùng Nam Địa Trung Hải vào thời Trung Cô Actisô có vị trí quan trọng trong ngành nông nghiệp

của vùng Địa Trung Hải với hơn 800.000 ha đất trồng trọt và sản lượng thu họach hàng năm lên đến khoảng 770.000 tan (chiếm 70% sản lượng toàn cầu) Italia dẫn đầu thế giới về sản lượng actisô (474.000 tấn/năm), tiếp đến là Tây Ban Nha

(215.000 tan/nam), Phap (55.000 tan/nam), Hy Lap (25.000 tan/nam) Actisé ciing được trồng ở vùng Cận Đông (Thé Nhi Ky va Iran), Bac Phi (Ai Cap, Morocco,

Algeria, Tunisia), Nam My (Argentina, Chilé va Péru), Hoa Kỳ (chủ yếu là ở vùng California) và còn được trồng ở Trung Quốc [12] Ở Việt Nam, actisô được người

Pháp di thực vào thế ký thứ 19 và được trồng ở Sapa (Lào Cai), Tam Dao (Vinh Phúc) và Đà Lạt (Lâm Đồng)

Tréng trot: Actisô ưa khí hậu âm mát quanh năm Nhiệt độ thích hợp khoảng 15-18 °C Ở Việt nam, thường trồng ở độ cao 1000 — 1500 m so với mặt biên Actisô là cây sinh

trưởng mạnh, cho nên cân chọn đất dày màu, thoát nước và bón nhiều phân

Actisô có thể nhân giống bằng hạt, bằng mâm nhánh hoặc bằng nuôi cấy mô Ở miễn núi phía bắc, có thể gieo hạt vào tháng 1, 2 hoặc tháng 9, 10 Ở đồng bằng và

trung du Bắc Bộ nên gieo hạt vào đầu tháng 10 Thời gian ở vườn ươm là 45-50

ngày Ngoài ra còn có thê tách mầm nhánh và cây con từ đốt, đính chồi hoặc đỉnh

sinh trưởng để trồng Từ đỉnh sinh trưởng có thé tao than con sach virus Sau khi làm đất nhỏ, lên luéng cao 20-25 cm, mat luéng rong 40 cm, bễ hốc cách

nhau 70-80 cm thành một hàng giữa luống Dùng 10-15 tấn phân chuồng mee dé bón lót cho 1 ha, thúc bằng nước phân chuồng hoặc phân đạm 2- lần tùy tình hình sinh trưởng của cây Tưới thúc lần thứ nhất 15 ngày sau khi trồng, lần thứ hai cách lần

trước khoảng 20 ngày Nếu tưới thúc bằng đạm thì dùng 80-100 kg urêha pha thành

dung dịch 2%, tưới vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát Cần làm cỏ vun xới kết hợp khi tưới thúc [9]

1.1.í 46 phan ding, thu hái, chế biến

1.1.í.1 Bộ phận dùng

DPVN II, quy định dùng lá đã phơi hay sấy khô Âễ và thân cũng được dùng làm thuốc Cem hoa có lá bắc thường được dùng làm thực phẩm [9]

1.1.4.6 Thu hai

Lá có thê thu hai quanh nam, hé la già bat dau héo úa thì người ta cắt đem phơi khô

hay sấy khô Thường người ta thu hai vào lúc cây sắp hoặc đang ra hoa, rọc bỏ sống

lá rồi đem sấy hay phơi khô

Thân rễ được thái mỏng 1-2 mm rồi đem phơi khô Hoa tự cũng được thái mỏng từ 1-2 mm rồi đem phơi khô [9].

1.1.1.6 Ché biến

Trong lá, hoa, thân và rễ của cây actisô chứa nhiều enzyme oxy hóa Sau khi hái, các enzyme sẽ hoạt động mạnh, phá hủy các hoạt chất có trong được liệu Vì vậy phải nhanh chóng diệt men đề ôn định hoạt chất bằng các phương pháp sau: - Hấp 5 phút trong hơi cồn sôi rồi phơi hay sấy khô

- Ngâm trong dung dịch NaCI 5% rồi phơi và sây khô ngay [10]

1.6 TONG QUAN VE THANH PHgN HOA HỌC

1.ỗ.1 Dẫn xuất caffeoylquinic

Dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất trong actisô là cynarin (1,-

dicaffeylquinic acid) dù không phải là chất chiếm ham lượng cao nhất Hợp chất này được phân lap tir dich chiết lá actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi va

Scarpati (1954) [12]

Cynarin: Phan tir cynarin la diester caffeic cua acid quinic Trong la tuoi cynarin tồn tại dang dicaffeoyl 1,-quinic Trong qua trinh chiét bằng cách sắc với nước sẽ chuyên thành acid dicaffeoyl 1,5-quinic [2]

Cynarin là chất kết tỉnh không màu, quay trái, hơi tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, tan trong cồn [2] Cynarin là một acid yếu, không bền và trở nên sim màu trong môi trường kiểm, khử AgNO ở môi trường NH và khử fericyanid Khi phan tng voi natri nitrit, natri molybdat cho mau do 2]

Bên cạnh đó còn có những sản phẩm phân hủy của cynarin như acid caffeic (,4 dihydroxy cinnamic acid), acid chlorogenic (5-O-caffeylquinic acid) va acid neo- chlorogenic (-O- caffeylquinic acid) [2]

Trong những dẫn xuất của caffeoylquinic, acid chlorogenie là chất có hàm lượng

cao nhất (9%), tiếp đến là 1,5-O- dicaffeoylquinic acid (21%) va, ,4-O-

dicaffeoylquinic acid (11%) tinh trén téng ham lượng caffeoylquinic acid Hàm

lượng cynarin trong dich chiét methanol la rat thap, chi khoang 1,5% [12]

Dưới đây là công thức các dẫn xuất của cafeoylquinic:

R H H H Pseudochlorogenic acid H H H R Neochlorogenic acid H R H H Chlorogenic acid H H R H Cryptochlorogenic acid R H H R Cynarin

H H R R ớ,4édié Oécaffeoylquinic acid R R H H 1,5édiế Oécaffeoylquinic acid H R H R ớ,5édié Oécaffeoylquinic acid H R R H 4,5êdiéOécaffeoylquinic acid

6.6.6, Flavonoid

Trong actisô có chứa các flavon như apigenin, luteolin và các anthocyanidin như cyanidin, peonidin va delphinidin Apigenin va luteolin glyeosid được tìm thay 6 ca lá và hoa trong khi đó các sắc tố anthocyanidin chỉ tìm thấy ở hoa Những chất này được xem là thành phần chính trong tông lượng các chất phenolic (khoảng 10% hoặc ít hơn) trong mô actisô Luteolin là chất chống oxy hóa mạnh có tác deng bảo vệ các lipoprotein trọng lượng phân tử thấp khỏi các tác nhân oxy hóa trong khi đó các sắc tố anthocyanin ngoài tác deng cai thiện sức khỏe còn đóng vai trò quan

trọng trong các thực vật dùng làm thức ăn do đó được chấp nhận làm màu thực

phẩm bởi người tiêu đùng [12] Các dẫn chất của luteolin bao gồm:

Cynarosid (luteolin 7-O-B-glycopyranosid) Scolymosid (luteolin-7- rutinosid) Cynarotriosid (luteolin-7- rutinosid, ’-glucose)

Ngoai ra, con cO apigenin 7-O-rutinosid, apigenin 7-O-glucosid, narirutin, narigenin 7-O- glucosid [24].

Luteolin 7éOếrutinosid : R;=rut Rạ=OH

Luteolin 7éOếglucosid : R;=glc Rạ= OH

Ápigenin 7éOếrutinosid :R; =rut R;ạ=H Ápigenin 7éOếglucosid :R:;=glc R¿=H

Cynarotriosid :R:=rut Ra =glc Narirutin: R; =rut Naringenin 7&Oéglucosid: R; = glc Hình 1.4 CPc hợp chất nhóm flavon trong actisô

Peonidin: += OCH¿ R2=H

Hình 1.5 Cấu trúc chung của cPc anthocyanin trong actisô

Các hợp chất nhóm anthocyanin được phát hiện đầu tiên bởi Foury và Aubert

(1977), Piferi và Vaccari (1978) Aubert và Foury (1981) Anthocyanm gặp trong hoa actisô thường có màu từ xanh lá cây đến tím và ở dạng glycosid, bao gồm: cyanidin -O-B-glucosid, cyanidin, -O-B-sophorosid, cyanidin caffeoylglucosid, cyanidin- -caffeoyl sophorosid, cyanidin -dicaffeoyl sophorosid va cyanidin- ,5- diglucosid

Gan day Schiitz et al (2006) da tim thay nhimg anthocyanin chinh trong ccm hoa actis6 là cyanidin ,5-diglucosid, cyanidin , -O-f-glucosid, cyanidin , ,5- malonyldiglucosid, cyanidin, -("-malonyl) glucosid, va cyanidin, -(6”-malonyl) glucosid Trong những chất này, hai dẫn xuất của peonidin và một dẫn xuất của delphinidim đã được mô tả bằng HPLC- MS: peonidin -O-f-glucosid và peonidin - (6”-malonyl) glycosid Dưới đây là cau trúc của một vài anthocyanin điển hình [12]

Cyanidin 3-(6”-malonyl)glucosid Peonidin 3-O-f-glucosid

Peonidin 3-(6”-malonyl)glycosid

1.2.2 Sesquiterpenlacton

Sesquiterpen lacton có vị đắng, hàm lượng tối đa không quá 4%, trong đó thành phần chủ yếu là cynaropicrin (47-83%) Cynaropicrin là ester của acid a-hdroxy methylacrylic với hydroxylacton sesquiterpenoid thuộc nhóm guanolid Cynaropienn có hàm lượng lớn ở lá non nhưng không có ở rễ, quả và hoa [6] Ngoài ra còn có các thành phần khác thuộc nhóm guanolid và cynarolid như dehydrocynaropierin, grossheimin, grosulfeimin, aguerin, 11ƒ,13-dihydrodessasylcynaropicrin cũng đã được bảo cáo [16]

Cynaropicrin: R =

Grosheimin

1.6.6 Inulin

Inulin chu yéu duoc tim thay trong cây hai lá mâm thuộc họ Asteraceae gồm những loài phô biến như rau diễp xoăn (Cichorim intybus L.), actisô (C scolymus), bồ céng anh (Zuraxacum officinale), thuoe duge (Dalia variabilis ), 18 dat (Polymia sonchifolia) Inulin hiện diện trong actisô với chiều dài chuỗi lên đến 200 phân tử

fructose (thuộc nhóm #uctan) liên kết với nhau theo liên kết B-2,1 va B-2,6 dudi

dạng mạch thẳng hoặc mạch nhánh Inulin trong actisô được xem là chất có mức độ

trùng hợp phân tử cao nhất trong giới thực vật [12]

anulin

Các dược liệu giàu inulin đang trở thành loại thực phâm chức năng được ưa thích nhờ những lợi ích tiềm năng đối với sức khỏe con người Ý con người không có enzym tiêu hóa fructan nên khi xuống đại tràng, chất này đóng vai trò như chất nền

cho sự phát triển của hệ vi khuân Chế độ ăn giàu fructan có tác deng kích thích

biñdobacteria một cách chọn lọc, giúp chúng phát triển và nhờ đó làm giảm sự tạo

thành những chất gây khối u Một lí đo khác khiến inulin được ưa dùng là nhờ có ảnh hưởng nhất định đến thành phân quân thể vi sinh vật trong ruột và có hiệu quả

tốt đối với việc hấp the chất khoáng, lipid trong máu và ngăn ngừa ung thư đại trang Ngoai ra, inulin là chất có lượng calori thấp nên còn được sử dcng để sản

xuất thực phẩm giảm béo [12]

1.6.1 Các thành phần khác

Về mặt dinh đưỡng, 100 g lá tươi actisô chứa 8 calo, 1 g chất béo; 5,8 g đường: ,4

g chat dam, trong đó có các acid amin phenylalanin, tyrosin, histidin, alanin, glycin, aspartic va glutamic

Actisô cũng có chứa chất xo, calcium, phosphor, kali, acid folic, vitamin C, niacin, thiamin, nguyên tố vi lượng và carrotenoid.

Trong actisô còn có một số loại enzyme như oxidase, peroxidase, cynarase, ascorbinase và ribulose-I,5-điphosphate carboxylase Đặc biệt, actisô có chứa nhiều polyphenol oxidase Các enzyme hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và đễ phá hủy hoạt chất trong quá trình phơi, say va chế biến

Tỉnh dầu với các thành phân như beta-selinen, caryophyllen, eugenol, phenylacetaldehyd và decanal

Acid béo no và không no nhu acid stearic, acid palmitic, acid oleic va acid linoleic 1.6.5 Một số hợp chất trong actisô

Trong sô các loài actisô đã nêu ở mcc l.1.2, chỉ có một sô loài được nghiên cứu

nhiều, đưới đây là một số hợp chất đã được tìm thay trong 2 loài actisô

Bảng 1.1 Một số hợp chất trong 2 loài actisô

Loài Hợp chất đã công bố TLTK

D5n xuất caffeoylquinic

Cynara scolymus Áàchlorogenic, cynarin, cryptochlorogenic

acid, neochlorogenic acid, cynaratriol

620]

Flavonoid Luteolin glycosid, cyanidin ớ,5é diglucosid,

cyanidin đếsophorosid, cyanidin malonyldiglucosid, cyanidin ớế(ớ ế malonyl) glucosid, delphinidin glycosid, cyanidin malonylglucosid, peonidin ếglucosid, cyanidin malonylsophorosid, cyanidin pentosid, cyanidin ớế(ủ malonyl) glucosid, peonidin ớê(ủ malonyl) glycosid, narirutin, narigenin 7éOéglucosid

620], 621], 624]

Sesquiterpenlacton Cynaropicrin, grosheimin, 8 deoxyé11é

hydroxyế1ớếchlorogrosheimin, 8 deoxyế 11,1ớê dihydroxy chlorogrosheimin

620]

D5n xuất caffeoylquinic

Cynara syriaca Caffeic acid, chlorogenic acid, 1,54

dicafffeoylquinic acid, cynarina 625]

Flavonoid Apigenin, chrysoeriol, luteolin, apigenin 7608

glucosid, luteolin 760€glucosid, chrysoeriol 76 O églucosida

625]

Sesquiterpenlacton 11,16édihydroxyé8édesoxygrosheimin, 11,166 625]

dihydrodeacylcynaropicrin, solstitialina

1.46 TONG QUAN VE TAC DUNG DUOC Lu VA CONG DUNG

1.ồ.1 Tác dvng dược ly

Actisô đã được người dân châu Âu sử deng từ lâu để chữa các bệnh sỏi bàng quang, phù thũng và các bệnh về gan mật Cynarin là hoạt chất quan trọng nhưng các chất khác như flavonoid, acid chlorogenic, acid caffeic cũng có tác dcng hiệp đồng Dưới đây là một số tác đeng chính của actisô

1.6.1.1 Tac deng chéng oxy hoa

Những phenolic đóng vai trò tác nhân lọc giúp chống lại tác nhân oxy hóa và gốc tự

do, hoạt động như nơi chống lại tác nhân oxy hóa làm tốn hại đến các phân tử sinh

học như protein, lipid và DNA [17] 1.6.1.6 Tác deng trên gan mật

Các hợp chất polyphenol như cynarin, isochlorogenic acid, cac flavonoid (luteolin 7-O-glucosid, scolymosid) va cac acid hitu co (chlorogenic, caffeic va quinic acid) trong actisô đã được ghi nhận có tác deng bảo vệ tế bào gan qua thử nghiệm gây

sau khi uống liều cấp tính và lặp lại Lượng mật tiết ra tăng đáng kế sau khi điều trị cấp tính với địch chiết actisô cũng như liều lặp lại [12]

1.6.1.6 Tac deng lam giam cholesterol

Dịch chiét 1a actis6 cé tac deng ngan can sinh tông hợp cholesterol ở gan Tac deng nay là nhờ luteolin làm giảm đặc tính của HMG-CoA (enzym xúc tác quá trình sinh tổng hợp cholesterol) Hơn nữa, acid chlorogenie và luteolin có thể ngăn cản quả trình gây xơ cứng động mạch nhờ ngăn can su oxy hoa LDL Noi chung, actisô làm giảm cholesterol theo 2 cơ chế song song là giảm sinh tông hợp cholesterol và ngăn chặn sự oxy hoá LDL [17]

1.6.1.4 Tác dcng kháng khuẩn — kháng nắm

Dịch chiết lá actisô có tác đeng trên 4 vi khuẩn gram duong (B subtilis, S aureus, A tumefaciens, M luteus), 2 vi khuan gram am (E coli va S typhimurium), loai

nam men (C albicans, S cerevisiae, S Carlsbergensis) va 2 loai nam méc (4 niger, P Oxalicum) [18]

1.6.1.5, Tac deng trén tim mach

Aossoni et al (2005) da chimg minh Cynara cardunculus cé thé làm tăng sự sản

xuất nitric oxid nên làm giãn mạch máu ở các tế bào nội mô động mạch chủ của thú

vật thí nghiệm Các tác giả cũng chứng minh được rằng luteolin và apigenin có tác deng trên sự giãn động mạch chủ khi thêm vào thành phần đề tắm xông hơi Li et al (2004) đã nghiên cứu và chứng minh được sở dĩ có sự tăng hàm hrong nitric oxid la do enzyme téng hop nitric oxid (nitric oxide synthase: eNOS) Cac flavonoid trong actisô đã làm tăng hoạt tính của eNOS Thử nghiệm cũng đã chứng minh rằng chỉ cé luteolin va cynarosid co tac deng lam tang hoạt tính của eNOS nhưng cynarin và acid chlorogenic lai khéng co tac deng nay

Tac deng lam ha lipid huyét, chống oxy hóa và làm tăng quá trình sao chép của các gen

tông hợp nitric-oxid của actisô giúp ich cho việc điều trị các bệnh về tim mạch [12] 1.6.1.6 Tac deng trên hệ tiêu hóa

Dịch chiết lá actisô được sử dcng để điều trị các bệnh đạ dày - ruột chủ yếu đựa vào

tác động chống lại chứng khó tiêu mà gián tiếp thông qua đặc tính tây xô Tac deng tay xô của actisô tương tự các hop chat acid dehydrocholic [12]

1.6.1.7 Tac deng khang viém

Luteolin có tính kháng viêm và kháng đị ứng do có tác đeng ức chế sự thành lập COX-2, PGE; và lipopolysaccaride (LPS) Luteolin còn ức chế xanthin oxidase ở liều 100 mol/L, tte ché lipoxygenase, tre ché su san sinh qua mire của ơ-TNF là

những chất gây viêm và gây chết tế bào [19]

1.6.1.8 Tac dcng kháng ung thư

Acid chlorogenic cé tác deng ức chế mạnh glueose-6-phosphattranslocase (một yếu tố liên quan đến kiêu hình xâm lắn của các tế bào u não) Hơn nữa, acid chlorogenic còn có tác dcng ức chế sự di căn của tế bào gay ra béi sphingosin-1 phosphat (S1P)- chất gây gián phân cho tế bào u nguyên bào xốp [2]

1.6.1.9 Tac deng khang HIV

Cynarin citing nhu cac acid dicafeoylquinic khac c6 tac deng manh va chon lọc trên HIVI do ức chế sự phiên bản của HTV-I trong tế bào MT-2 ở nồng độ không gây độc [22].

1.6.6 Céng dvng

Hoa Actisô rất tốt cho sức khỏe, có thê cung cap khoang 9,% carbohydrat (chủ yếu là inulin), 1,5% chất xơ, rất ít chất béo và protein Năng lượng cung cấp rất thấp, chỉ khoảng 40 đến 50 kcal nhưng lại rất giàu vitamin và chất khoáng như potassium, phosphorus, calcium, sodium, sulphor va magnesium Hoa dac biệt thích hợp cho người bị đái tháo đường [19, 10]

Lá có vị đẳng, có tác deng lợi tiểu và được dùng trong điều trị bệnh phù và thấp khớp Ngoài việc dùng để hoa và lá bắc để ăn, Actisô còn được dùng làm thuốc thông tiêu

tiện, thông mật, chữa các bệnh suy gan, thận, viêm thận cấp và mạn, sưng khớp xương Actisô còn có tác deng nhuận tràng và lọc máu nhẹ đối với trẻ em [8]

1.6.6 Định lượng các hợp chất trong actisô bằng HPLC

Bảng 1.2 Tóm tắt một số điMu kiện định lượng cPc polyphenol trong actisô bằng HPLC

Máy Cot sac ky Pha động Chế độ chạy Tốc độ Bước Tai

DÁD 5um,100A°) aaformic/H2O (18:60:12:40) 8%A— 48%A(o5’)— mi/phit aes

Agilent Zorbax aclipse Dung môi Á: Gradient: 1,0

5ym) (25°C) Dung môi B: ÁCN — ớ0% B (10)

CHUONG 6 DOI TUONG -PHUONG PHAP NGHIEN CUU

6.1 BOI TUONG NGHIÊN CỨU

6.1.1 Nguyén liệu

- Cynarin chuan, số lô 89179, Phytolab, Cộng hòa Liên bang Đức

- Các cao và chế phẩm đang lưu thông phân phối trên thị trường trong nước hiện nay được trình bày tóm tắt trong Bảng 2 và Hình 2.6

Bang 2.3à CPc chế phẩm có actisô trên thị trường

phẩm Don vi SX Déng goi Thanh phan Ngay SX Số lô Hạn dùng

200 mg ế TP dược vữ

TP duoc: vd

TP duoc: vd

TP duoc: vd

TP dược vd

TP duoc: vd

TP duoc: vd

® i i

DAR Cao đặc actisô BÁR

Hình 2.6à CPc cao và chế phẩm có chứa actisô trên thị trường

2.1.2 Dung môi, hóa chất

Dung môi: Chloroform, methanol, cồn tuyệt đối, ethyl acetat, toluen, aceton, ether, n-butanol, nude cat, acid acetic, a formic, natri hydroxyd 2%, acetonitril (Merck), Methanol (Merck), a formic (Merck), nudc cat 2 lần

Ban méng silica gel F 254 (day 0,25 mm, Merck, Art 1.05554) tráng sẵn Silica gel 60 (cỡ hạt 0,015-0,04 mm, Merck, Art.1.0985)

Sephadex LH-20

Thuốc thử: FeC110%/methanol, natri nitrit 10%/MeOH, natri hydroxyd 10%/MeQOH, vanilin- sulfuric (VS)

ố.1.ồ Dvng cv trang thiết bị - _ Cân phân tích Sartorrus BP-221§

- Máy đo độ Am Sartorius

- May cé quay Buchi A00 (Nhat Ban)

- Bén siéu 4m Ultrasonic Bath (Đức)

- Tu say Gallentkamp (Anh) - _ Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức)

- Máy sắc ky lỏng hiệu nang cao (HPLC) Waters 6695-6996 (My), detector PDA Waters 0996 (Mỹ)

- May céng huéng tir hat nhdan (NMR) BAUKEA-AVANCE-500, Vién Hoa hoc

thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam— Hà Nội

- May LC-MS/MS Alliance 2695 XE, Labo Hoa hợp chất tự nhiên -Trung tâm Đào tạo và Nghiên cứu phat trién thuoc nguon gốc tự nhién—Dai hoc Y Duge TP HCM

- Cột sắc ky: Cột cổ điển, cột sephadex LH-20

-_ Các dcng cc thí nghiệm thông thường trong phòng thí nghiệm ố.ố PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

6.6.1 Dinh tính bằng SKLM

Cao actisô được chiết bằng MeOH, sau do duoc lắc phân bế với các dung môi có độ

phân cực khác nhau (chloroform, cthyl acetat va n-butanol) Cae phan doan nay

được kiểm tra trên SKLM với hệ dung môi thích hợp

6.6.6.6 Chuan bi m4u chuan

Can 0,5 mg méi chat chuan vao binh dinh mire 5 ml, hoa tan bằng cách thêm MeOH 60% cho đủ thể tích bình, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml.

6.6.6.6, Điều kiện sac ky HPLC

Tỉ lệ pha động: Triên khai mẫu trong pha động có tỉ lệ thích hợp đề tách rõ các đỉnh

cần định tính

Dạng phổ: Đo mẫu chuẩn ở bước sóng trong vùng từ 200-600 nm, xác định các cực đại

hap thu và dạng phô, từ đó xác định bước sóng sir deng cho dinh lượng

6.6.6.1 Dinh tinh cynarin va acid chlorogenic tir cac ché pham

Tiến hành khai triển các mẫu thử đã được chuẩn bị ở trên so với mỗi chất cần định tính trên máy Máy sắc ky lỏng cao áp (HPLC) Waters 2695-2996 (Mỹ) theo điều

kiện đã lựa chọn và so với peak chuẩn về các thông số như ta, bước sóng hấp thu

A

6.6.6 Phương pháp định lượng cynarin trong các chế phẩm

6.6.6.1 Khảo sát số lần chiết

Đối với các cao chiết: Cân chính xác 0,2 g cao, chiết 4 lan, mdi lan 10 ml MeOH

60%, lọc vào binh định mức 10 ml, thêm dung môi cho đủ thể tích Tiến hành khai triển trên HPLC theo phương pháp đã lựa chọn, tính toán nồng độ cynarin trong mỗi

lần chiết So sánh sự thay đôi nồng độ để từ đó lựa chọn số lần chiết thích hợp

Đối với các chế phẩm: Cân lượng chễ phâm tương đương 0,2 g cao actisô phi trên

nhãn và tiền hành chiết xuất như trên

6.6.6.6 Kiém tra độ tính khiết của cynarin chuẩn

Các mẫu chuẩn được kiểm tra độ tinh khiết trên HPLC, bộ phận phát hiện UV

(Detector PDA 2996) Dựa vào các thông số sắc ky như purity, phan trăm điện tích

đính và sac ky dé

6.6.6.6 Thâm định quy trình định lượng cynarin bằng phương pháp

HPLC

Khoảng tuyến tính: Cân chính xác 0,5 mg cynarin chuẩn cho vào bình ðịnh mức 5

ml, thêm dung môi cho đủ thê tích bình, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml Tir dé pha loãng thành ít nhất 5-6 giai mẫu có nồng độ chất chuẩn khác

nhau để xác lập đường hồi quy có phương trình y = ax + b và hệ số hồi quy tuyến

tính Â? giữa độ hấp thu và nồng độ Sử đeng các trắc nghiệm thống kê để kiểm tra

tính thích hợp của phương trình hồi quy

Tính tương thích hệ thống: Khai triển trên HPLC với việc bơm 6 lần liên tcc một mẫu thử hoặc một mẫu chuẩn với điều kiện sắc ky đã được khảo sát Xác định các thông số ta, S, As, k, N Tinh toan thống kê để có ÂSD của các thông số trên và biện

20

luận kết quả

Tính đặc hiệu: Khai triển trên HPLC với mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuân Quan sát và so sánh thời gian lưu, phô UV của peak cynarin trong các dung dịch

Độ lặp lại: Chuẩn bị ít nhất 6 mẫu định lượng khác nhau, tiễn hành định lượng, lay kết quả trung bình, sau đó xác định độ lệch chuẩn tương đối

Độ đứng: Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử bằng phương pháp đã khảo sát Thêm một lượng chất chuân vào mẫu thử với mức 80%, 100%, 120% so với

nông độ định lượng Tìm tỷ lệ phcc hồi Y

Trong đó: X.: Lượng tìm thấy

Ty X:: Lượng thêm vào

phâm

Từ quy trình xây dựng được, tiễn hành định lượng cynarin bằng HPLC trong các

mẫu cao và các chế phẩm trên thị trường đã thu thập được

6.6.5 Chiét xuất

- Khao sat mét s6 dung méi chiét xuat cac hop chat polyphenol: ethyl acetat, n- butanol, cén (ndng dé khac nhau), nước

-_ Khảo sát các phương pháp chiết thích hợp

- Tiến hành chiết xuất được liệu bằng phương pháp và dung môi đã khảo sat

6.6.6 Phan lập

- Phan tach cac phan doan:

+ Phan bé léng — léng véi cac dung méi cé dé phan cue khae nhau + Phuong phap sac ky: ray phan tir, sac ky cét silica gel

- Phan lap chất tỉnh khiết:

+ Phuong phap sac ky: Sac ky cét cé điển, sắc ky cột ray phan tử

+ Tinh ché cac hop chat phan lap duge bang phuong pháp kết tỉnh trong

dung môi thích hợp và phương pháp kết tinh phân đoạn.

21

6.6.7 Xdc định cấu trúc

Chat tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), HPLC- PDA,

NMA, so sánh đối chiếu với các đữ liệu về phô NMÂ, MS của các chất tương tự đã công bố trong tài liệu

Trong đó: X.: Lượng tìm thấy Xa: Lượng thêm vào

22

CHUONG 6 KET QUA VA 4AN LUẬN

6.1 DINH TINH

6.1.1 Dinh tính bằng sắc ky lớp mỏng

Chiết xuất: Cao actisô (0,5 ø) của CTCP BV Pharma được chiết siêu âm với MeOH

ở nhiệt độ 50 °C trong 5 phút, dịch chiết MeOH được dùng để định tính các nhóm

hợp chất flavonoid và các polyphenol khác bằng sắc ky lớp mỏng với hệ đung môi phan tich EtOAc — HO — a.formic (8:0,5:0,5) đã được khảo sát bởi khóa luận dược sỹ đại học (Tran Thi Thanh Ha — 2010)

Dieu kiện sắc ky:

- Bản mỏng: Silicagel F254 trắng sẵn

- Dung dich thr Dich chiét MeOH

- Phát hiện: Dưới ánh sáng thuong, UV 254 nm, UV 65 nm, TT FeCl 10%/MeOH

Kết quả định tính trên sắc ky lớp mỏng được trình bày ở Hình 7

XD TT)

iV 254 iV ou5 TT FeCls 10%

Hình 3.7à SKĐÐ định tính cao actisô

Nhận xét: Trên sắc ky đồ cho thấy cao actisô của CTCP BV Pharma có ít nhất 10

vết khi phát hiện bằng UV 254 và ít nhất 7 vết khi phát hién bang FeCl, trong đó 2

vết có màu sắc và Â; tương đương với cynarin va acid chlorogenic chuan

Các chế phẩm còn lại do hàm lượng thấp nên không thê định tính bằng SKLM mà phải định tính bằng HPLC.

6.1.6 Dinh tinh bang HPLC 6.1.6.1 Diéu kiện trién khai HPLC [5]

May HPLC Waters 2695 (Alliance) Detector PDA 2996

Pha tinh: Cét Sunfire Cis (4,6 x 250 mm, 5 jm) Pha d6ng: H20 (0,1% acid formic) — ACN (85:15) [5]

Tốc độ dòng: 1 ml/phút Lượng mẫu tiêm: 10 ul

Bước sóng phát hiện; 25 nm Nhiệt độ cột: 25°C Thời gian phân tích: 20 phút

6.1.6.6 Chuan bi mau

Cao PB va CL: Can khoang 0,2 g cao vào bình non nut mai 100 ml, thém MeOH 60%, siêu âm 15 phut, loc vao binh dinh mức 25 ml và thêm MeOH 60% đến vạch, lọc qua màng lọc milipore 0,45 um, địch lọc được triển khai trên HPLC theo điều

kiện sắc ky đã được khảo sát

Các chế phẩm CD, CÂ, CE, BT, CP, BP, DD, CH đều có chứa các cao được liệu khác

ngoài cao actisô nên phải cân một lượng chế phẩm (đã được nghiền mịn) tương ứng với khoảng 0,2 g cao actisô tưỳ theo hàm lượng cao actisô ghi trên nhãn của mỗi chế pham (Bang 4) Tiên hành chiết xuất đê định tính tương tự cao PB và CL và triên

khai sắc ky theo điều kiện đã lựa chọn Kết quả được trình bày ở Bảng 6.5

24

Mẫu Ac (tr) Cy (tr) Ghi cha

| DD 7,80 Không có peak Tăng lượng chiết 20 l7n— không có peak cynarin

CH 7,51 Không có peak Tăng lượng chiết 10 l7n—› có peak cynarin

Dé dam bảo các peak cần định tính là chính xác, cần làm độ đặc hiệu (thực hiện

ở Mec 4.1 7)

Nhận xétá Qua sắc ky đồ HPLC của các chế phẩm cho thấy với phương pháp chiết

và điều kiện triển khai HPLC như trên:

| - Tất cả các chế phẩm đều có peak của acid chlorogenic va kha cao - Các chế phẩm Pã, CL, CD, CR, CE,ẤT đều có peak cynarin còn CP, ẤP, CH sau khi tăng lượng chiết đã xuất hiện peak cynarin