Nghiên cứu vai trò của phức hợp nlrp3 inflammasomes trong tăng sinh nguyên bào sợi phổi khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PHỨC HỢP NLRP3 INFLAMMASOMES TRONG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI PHỔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ QUỲNH MÃ SINH VIÊN: 1801590 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PHỨC HỢP NLRP3 INFLAMMASOMES TRONG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI PHỔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Phạm Đức Vịnh ThS Trần Thị Hồng Vân Nơi thực hiện: Bộ môn Dược Lý Viện Dược Liệu HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng, ngưỡng mộ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Đức Vịnh, người thầy quan tâm, giúp đỡ động viên em suốt trình thực đề tài Với lòng nhiệt huyết đam mê với khoa học, thầy tận tình dạy cho em khơng q trình nghiên cứu mà học sống để em hồn thành đề tài nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trần Thị Hồng Vân - Khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu DS Nguyễn Hồng Hạnh Nhân, học viên cao học Khóa 27, nhờ có giúp đỡ, bảo tận tình lời động viên, khích lệ chị mà em có thêm động lực để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, em xin cảm ơn thầy cô, anh chị Bộ môn Dược lý, trường Đại học Dược Hà Nội khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu bạn Hoàng Thị Vân Anh giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện cho em thực nghiên cứu cách thuận lợi Em xin thể lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè, người động viên hỗ trợ em suốt thời gian học tập Nhờ có động viên khích lệ lớn lao mà em ln có động lực để cố gắng sống Cuối cùng, em xin cảm ơn thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội ln nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt cho em học quý báu suốt năm học tập rèn luyện Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Đặng Thị Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh xơ hóa phổi 1.1.1 Định nghĩa .2 1.1.2 Dịch tễ .2 1.1.3 Sinh lý bệnh 1.1.4 Yếu tố nguy 1.1.5 Triệu chứng .4 1.1.6 Chẩn đoán .5 1.1.7 Phương pháp điều trị .7 1.2 Phức hợp NLRP3 inflammasomes 1.2.1 Cấu trúc 1.2.2 Phân loại .10 1.2.3 Cơ chế hoạt hóa 10 1.2.4 Vai trò sinh lý bệnh học 12 1.3 Vai trò phức hợp NLRP3 inflammasomes sinh bệnh học xơ hóa phổi .13 1.3.1 Vai trò NLRP3 inflammasomes viêm tổn thương phổi 13 1.3.2 Vai trò NLRP3 inflammasomes chuyển dạng biểu mô-trung mô 14 1.3.3 Vai trị NLRP3 inflammasomes hoạt hóa ngun bào sợi phổi 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Hóa chất, thuốc thử .17 2.1.2 Dụng cụ 18 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu .18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Nuôi cấy tế bào .20 2.3.2 Hoạt hóa nguyên bào sợi phổi 20 2.3.3 Knockdown gen NLRP3 .20 2.3.4 Đánh giá số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi .21 2.3.5 Phân tích western blot 22 2.3.6 Hóa tế bào miễn dịch (ICC) 22 2.3.7 Đánh giá phân bố chu kỳ tế bào 23 2.3.8 Phương pháp phân tích số liệu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Ảnh hưởng TGF-β đến hoạt hóa phức hợp NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi 25 3.2 Ảnh hưởng chất ức chế NLRP3 (MCC950) đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β 28 3.2.1 Ảnh hưởng MCC950 đến số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi 28 3.2.2 Ảnh hưởng MCC950 đến phân bố chu kỳ tế bào nguyên bào sợi phổi 29 3.2.3 Ảnh hưởng MCC950 đến biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi 30 3.3 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β .32 3.3.1 Hiệu suất knockdown gen NLRP3 .32 3.3.2 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi 33 3.3.3 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến phân bố chu kỳ tế bào nguyên bào sợi phổi 33 3.3.4 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi 35 CHƯƠNG BÀN LUẬN 37 4.1 Về mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β 38 4.2 Về vai trò ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β .40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên viết đầy đủ ALRs ASC Absent in melanoma (AIM2)-like receptors Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain Rửa phế quản phế nang (Bronchoalveolar lavage) Caspase-activation and recruitment domain Tín hiệu nguy có nguồn gốc ngoại sinh (Damage-associated molecular patterns) Phức hợp ngoại bào (Extracellular matrix) Q trình chuyển dạng biểu mơ – trung mơ (Epithelial to mesenchymal transition) Dung tích sống gắng sức (Forced Vital Capacity) Hình kính mờ (ground glass opacity) Gasdermin D Nguyên bào sợi phổi người (Human lung fibroblasts) Chụp cắt lớp vi tính độ phân giải cao (High-resolution computed tomography) Bệnh xơ hóa phổi vơ (Idiopathic Pulmonary Fibrosis) Leucine-rich repeat Hội chẩn đa chuyên khoa (Multidisciplinary discussion) Q trình chuyển dạng trung mơ – biểu mơ (Mesenchymal to epithelial transition) NOD-like receptor Tín hiệu nguy có nguồn gốc nội sinh (Pathogen-associated molecular patterns) Pyrin domain Nhóm oxy hoạt động (Reactive oxygen species) RNA can thiệp sợi ngắn (Small interfering RNA) Toll-like receptors Viêm phổi kẽ thông thường (Usual interstitial pneumonia) Phẫu thuật nội soi lồng ngực hỗ trợ video (Video-assisted thoracoscopic surgery) BAL CARD DAMPs ECM EMT FVC GGO GSDMD HLFs HRCT IPF LRR MDD MET NLR PAMPs PYD ROS SiRNA TLRs UIP VATS DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Trang 1.1 Phân loại tổn thương UIP HRCT 1.2 Chẩn đoán IPF dựa vào kết hợp HRCT mô bệnh học 2.1 Trình tự nucleotid NLRP3 siRNA scramble siRNA 18 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên Trang 1.1 Lưu đồ tiếp cận chẩn đoán IPF 1.2 Cấu trúc phức hợp NLRP3 inflammasomes 10 1.3 Cơ chế hoạt hóa phức hợp NLRP3 inflammasomes 12 1.4 Các đường phụ thuộc/không phụ thuộc vào phức hợp inflammasomes EMT 15 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 19 3.1 Ảnh hưởng TGF-β đến mức độ biểu protein NLRP3 ASC nguyên bào sợi phổi 25 3.2 3.3 3.4 Ảnh hưởng TGF-β đến mức độ biểu protein pro-caspase1, p20 caspase-1, pro-IL-1β IL-1β nguyên bào sợi phổi Ảnh hưởng TGF-β đến tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với ASC speck nguyên bào sợi phổi Ảnh hưởng MCC950 đến số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β 26 27 28 3.5 Ảnh hưởng MCC950 đến phân bố chu kỳ tế bào nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β 29 3.6 Ảnh hưởng MCC950 đến biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β 31 3.7 Hiệu suất knockdown gen NLRP3 32 3.8 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β 33 3.9 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến phân bố chu kỳ tế bào nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β 34 3.10 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β 35 4.1 Cơ chế hoạt hóa phức hợp NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Xơ hóa phổi vơ (Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF) bệnh lý nghiêm trọng, thường có tiên lượng xấu tỷ lệ tử vong cao Bệnh tiến triển qua nhiều giai đoạn với thời gian sống trung bình từ – năm sau chẩn đoán [12] Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh thấp, với chị phí điều trị cao, IPF gây gánh nặng bệnh tật đáng kể toàn xã hội Hiện nay, chế bệnh sinh IPF chưa làm sáng tỏ hoàn toàn Hai thuốc Pirfenidone Nintedanib thuốc chống xơ hóa phê duyệt để điều trị IPF Hoa Kỳ Châu Âu [37] Tuy nhiên, thực tế lâm sàng, hai thuốc khơng thể đảo ngược tình trạng xơ hóa phổi khơng cải thiện đáng kể tiên lượng bệnh nhân [12] Những hạn chế điều trị IPF đặt yêu cầu tiếp tục nghiên cứu phát triển thuốc chống xơ hóa dựa hiểu biết sâu sinh bệnh học rối loạn Trong năm trở lại đây, đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes lên đích phân tử hấp dẫn điều trị bệnh lý khác nhau, bao gồm xơ hóa phổi Trong nghiên cứu vai trò phức hợp NLRP3 inflammasomes IPF, người ta quan sát thấy mức độ biểu phức hợp IL-1β tăng lên đáng kể dịch rửa phế quản bệnh nhân IPF không điều trị [24] Một số nghiên cứu khác rằng, NLRP3 điều hịa q trình chuyển dạng biểu môtrung mô (EMT) thông qua TGF-β xơ hóa gan thận [42], [45] Tuy nhiên, vai trò cụ thể phức hợp phát triển kiểu hình gây xơ hóa ngun bào sợi phổi, tế bào đóng vai trị trung tâm bệnh học xơ hóa phổi vơ căn, chưa báo cáo nghiên cứu trước Nhằm đánh giá mức độ hoạt hóa NLRP3 inflammasomes vai trị phức hợp nguyên bào sợi phổi liên quan đến xơ hóa, nhóm nghiên cứu thực đề tài “Nghiên cứu vai trò phức hợp NLRP3 inflammasomes tăng sinh nguyên bào sợi phổi” với mục tiêu sau:  Đánh giá mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β  Đánh giá vai trị hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β Những kết thu từ nghiên cứu cung cấp chứng ban đầu vai trò phức hợp NLRP3 inflammasomes tăng sinh nguyên bào sợi phổi kỳ vọng hỗ trợ việc tìm kiếm thuốc chống xơ hóa phổi có chế tác dụng tương lai CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh xơ hóa phổi 1.1.1 Định nghĩa Xơ hóa phổi vơ (IPF) dạng bệnh phổi kẽ mạn tính, xơ hóa lan tỏa khơng rõ nguyên nhân, xảy chủ yếu người lớn tuổi có tổn thương giới hạn phổi [34] Bệnh đặc trưng chức phổi không hồi phục với triệu chứng ho khó thở tăng dần, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sống người bệnh Theo giả thuyết chấp nhận rộng rãi nhất, IPF khởi phát từ tổn thương lặp lại tế bào biểu mô phế nang, dẫn đến rối loạn chế sửa chữa làm lành tổn thương [12], [28] Hệ trình tăng sinh hoạt hóa nguyên bào sợi phổi (lung fibroblasts) – tế bào phụ trách sản xuất phức hợp ngoại bào (ECM), gây tái thiết lập lại cấu trúc phổi [28] IPF tiến triển qua nhiều giai đoạn với thời gian sống trung bình từ – năm sau chẩn đoán [12] Bệnh ảnh hưởng đến triệu người toàn giới với tỷ lệ mắc tăng dần theo độ tuổi [28] Đặc biệt, bệnh hay gặp nam giới 65 tuổi có tiền sử hút thuốc [34] 1.1.2 Dịch tễ IPF chiếm 17-37% trường hợp chẩn đốn mắc bệnh phổi mơ kẽ [40] Tuy nhiên, tỷ lệ mắc tỷ lệ mắc công bố nghiên cứu khác nhau, nguyên nhân trước chưa có định nghĩa thống xơ hóa phổi lựa chọn đối tượng nghiên cứu khác [18] Theo nghiên cứu quan sát dựa dân số báo cáo tỷ lệ mắc IPF từ tháng 1/2009 đến tháng 4/2020 toàn cầu, tỷ lệ mắc (Incidence) điều chỉnh ước tính (trên 10.000 người) dao động từ 0,35 đến 1,30 quốc gia Châu Á – Thái Bình Dương; 0,09 đến 0,49 châu Âu 0,75 đến 0,93 Bắc Mỹ Tỷ lệ mắc (Prevalence) điều chỉnh ước tính dao động từ 0,57 đến 4,51 nước Châu Á – Thái Bình Dương; 0,33 đến 2,51 Châu Âu 2,40 đến 2,98 Bắc Mỹ Hàn Quốc nước có tỷ lệ mắc tỷ lệ mắc ước tính cao Nhìn chung, dựa liệu thu thập từ quốc gia, tỷ lệ mắc tỷ lệ mắc IPF điều chỉnh ước tính nằm khoảng 0,09 – 1,30 0,33 – 4,51 10.000 người [27] Độ tuổi trung bình bệnh nhân IPF từ 65 – 70 tuổi [27] Ở bệnh nhân 65 tuổi, tỷ lệ mắc IPF ước tính lên đến 400 trường hợp 100.000 người [28] Khoảng 70% bệnh nhân nam giới có tiền sử hút thuốc [12] Tiên lượng cho bệnh nhân IPF dè dặt với khả sống sót sau năm kể từ thời điểm chẩn đoán IPF dao động từ 20 – 40% [12] Trong năm 2014, ước tính có khoảng 28.000 đến 65.000 ca tử vong Châu Âu từ 13.000 đến 17.000 ca tử vong Hoa Kỳ Mặc dù 3.3.2 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích tế bào sống Số lượng viability Cell so với nhóm chứng) đốicontrol) lệ tương to (Tỷ(Relative thích với TGF-β đánh giá thơng qua số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi thể hình 3.8 ✱ ✱ 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 TGF-β TGF scrb siRNA scramble siRNA NLRP3 siRNA NLRP3 siRNA - + - + + - + + Hình 3.8 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β Tế bào transfect với phức hợp transfection chứa NLRP3 siRNA hoạt hóa TGF-β 48 Số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi đánh giá qua thử nghiệm MTS miêu tả phần phương pháp nghiên cứu Kết thể thông qua tỷ lệ tế bào sống tương đối so với nhóm chứng Dữ liệu biểu diễn dạng 𝑋̅ ± SE, n = 3; *p < 0,05 Kết thu từ hình 3.8 cho thấy, TGF-β làm tăng số lượng tế bào sống nguyên bào sợi phổi so với nhóm tế bào khơng kích thích (p < 0,05) Trong đó, nguyên bào sợi phổi transfect với NLRP3 siRNA hoạt hóa TGFβ sau có tỷ lệ tế bào sống giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm hoạt hóa TGF-β (p < 0,05) Như vậy, nguyên bào sợi phổi kích thích TGF-β bị ức chế trình tăng sinh sau knockdown gen NLRP3 3.3.3 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến phân bố chu kỳ tế bào nguyên bào sợi phổi Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến tăng sinh HLFs kích thích với TGFβ đánh giá thông qua phân bố chu kỳ tế bào thể hình 3.9 33 A NLRP3 siRNA - - - + Scramble siRNA - - + - - + + + TGF-β B Nhóm chứng Control TGF-β TGF TGF + scrb siRNA siRNA TGF-β + scramble TGF-β + NLRP3 siRNA TGF + NLRP3 siRNA ✱ Tỷ lệ tế (%) cells(%) of bào Proportion 100 ✱ 80 60 ✱ 40 ✱ ✱ ✱ 20 G0/G1 G0/G1 SS G2/M G2/M Hình 3.9 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến phân bố chu kỳ tế bào nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β Tế bào transfect với phức hợp transfection chứa NLRP3 siRNA hoạt hóa TGF-β 48 Sau đó, tế bào phân tích kỹ thuật dịng chảy tế bào (A) Hình ảnh đại diện cho quần thể tế bào pha khác chu kỳ tế bào (B) Tỷ lệ phần trăm tế bào pha G0/G1, S, G2/M Dữ liệu biểu diễn dạng 𝑋̅ ± SE, n = 3; *p < 0,05 Kết thu từ hình 3.9 cho thấy, sau kích thích với TGF-β, nguyên bào sợi phổi có mức độ tăng sinh cao so với nhóm chứng, thể tỷ lệ tế bào pha G0/G1 thấp so với nhóm chứng (p < 0,05) Trong đó, tỷ lệ tế bào pha S pha G2/M tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm tế bào khơng kích thích (p < 0,05) Nguyên bào sợi phổi transfect với NLRP3 siRNA kích thích TGF-β sau gây ức chế trình tăng sinh tế bào, thể tỷ lệ tế bào pha 34 S pha G2/M giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm kích thích với TGF-β (p < 0,05) Ngược lại, tỷ lệ tế bào pha G0/G1 tăng so với nhóm kích thích TGF-β đơn độc (p < 0,05) Kết vai trị quan trọng gen NLRP3 kích thích tiến triển chu kỳ tế bào TGF-β nguyên bào sợi phổi 3.3.4 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β đánh giá thông qua biểu cyclin D1 p27 phân tích western blot thể hình 3.10 A Cyclin D1 p27 Kip1 β-actin TGF-β Scramble siRNA NLRP3 siRNA - + - + + - + + (Relative to control) Mức độ biểu protein level chứng) expression so với nhóm tương đối (Tỷ lệ Protein B Nhóm Controlchứng TGF-β TGF 8h TGF-β scramble TGF + + scrb siRNA siRNA TGF + + NLRP3 siRNA TGF-β NLRP3 siRNA ✱ ✱ ✱ ✱ Cyclin CyclinD1/ D1/ -actin p27/ p27/ -actin β-actin β-actin Hình 3.10 Ảnh hưởng knockdown gen NLRP3 đến biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β Tế bào transfect với phức hợp transfection chứa NLRP3 siRNA hoạt hóa TGF-β 48 Sau đó, tế bào tách chiết protein sử dụng phân tích western blot, β-actin sử dụng làm chứng nội (A) Hình ảnh đại diện cho mức độ biểu protein cyclin D1 p27 (B) 35 Mức độ biểu protein tương đối thể thông qua định lượng mật độ điểm ảnh Dữ liệu biểu diễn dạng 𝑋̅ ± SE, n = 3; *p < 0,05 Kết thu từ hình 3.10 cho thấy, sau kích thích với TGF-β, nguyên bào sợi phổi có mức độ biểu marker tăng sinh (cyclin D1) tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) Trong đó, mức độ biểu marker ức chế tăng sinh (p27) giảm so với nhóm chứng (p < 0,05) Như vậy, sau hoạt hóa TGF-β, nguyên bào sợi phổi thể mức độ tăng sinh mạnh so với tế bào khơng hoạt hóa Ngun bào sợi phổi transfect với NLRP3 siRNA kích thích TGF-β sau có mức độ biểu cyclin D1 giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm kích thích với TGF-β (p < 0,05) Bên cạnh đó, knockdown gen NLRP3 dẫn đến làm tăng mức độ biểu p27 so với kích thích TGF-β (p < 0,05) Bằng chứng từ kết cho ta thấy, gen NLRP3 có ảnh hưởng đến trình tăng sinh HLFs sau kích thích với TGF-β 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN Xơ hóa phổi vơ dạng bệnh phổi kẽ xơ hóa với tỷ lệ tử vong cao Cùng với phát triển xã hội, tỷ lệ mắc IPF ngày gia tăng để lại gánh nặng bệnh tật lớn người bệnh, gia đình tồn xã hội Tiên lượng bệnh xấu với thời gian sống trung bình sau chẩn đốn năm [12], [24] Hiện nay, chế bệnh sinh IPF chưa làm sáng tỏ hoàn toàn Nintedanib Pirfenidone thuốc chống xơ hóa phê duyệt để điều trị IPF Hoa Kỳ châu Âu Tuy nhiên, Nintedanib Pirfenidone làm chậm tiến triển bệnh mà khơng thể đảo ngược tình trạng xơ hóa [30] Do vậy, để tìm phương pháp điều trị hiệu quả, vấn đề đặt cần tìm hiểu sâu sinh bệnh học rối loạn Trong thập kỷ vừa qua, hiểu biết chế bệnh sinh IPF ngày mở rộng, phức hợp NLRP3 inflammasomes nhiều nghiên cứu chứng minh có vai trị quan trọng q trình xơ hóa NLRP3 inflammasomes loại phức hợp tập trung nghiên cứu nhiều tế bào miễn dịch loại tế bào khác Phức hợp NLRP3 đóng vai trị quan trọng đáp ứng miễn dịch tự nhiên cách kích thích hoạt hóa caspase-1, hình thành cytokin gây viêm IL-1β/ IL-18 gây chết tế bào theo chương trình phụ thuộc đáp ứng viêm (pyroptosis) Hoạt hóa NLRP3 inflammasomes có liên quan chặt chẽ đến xơ hóa thúc đẩy biệt hóa nguyên bào sợi cách hoạt hóa mạn tính cytokin gây viêm IL-1β/IL-18 [4] Gasse cộng chứng minh mối liên hệ quan trọng NLRP3, đường truyền tín hiệu IL-1R-MyD88 xơ hóa phổi chuột Nghiên cứu vai trị trung tâm IL-1β thơng qua việc tương tác với receptor IL-1R thúc đẩy trình xơ hóa phổi Đồng thời, sử dụng chất đối kháng thụ thể IL-1RA, q trình xơ hóa bị ức chế Đặc biệt là, sản xuất IL-1β phụ thuộc vào phức hợp inflammasomes [11] Trong nghiên cứu vai trò phức hợp NLRP3 inflammasomes IPF, người ta quan sát thấy mức độ biểu phức hợp IL-1β tăng lên đáng kể dịch rửa phế quản bệnh nhân IPF không điều trị [24] Các chứng gần chứng minh rằng, hoạt hóa phức hợp NLRP3 thuốc – yếu tố nguy quan trọng IPF, tăng cường thêm chứng NLRP3 inflammasomes có liên quan đến xơ hóa [24] Một số nghiên cứu khác rằng, NLRP3 điều hịa q trình chuyển dạng biểu mô-trung mô (EMT) thông qua TGF-β xơ hóa gan thận [42], [45] TGF-β cytokin chứng minh y văn có khả gây xơ hóa đích điều trị hấp dẫn bệnh lý khác nhau, bao gồm xơ hóa phổi [20] Tuy nhiên, chế gây xơ hóa TGF-β chưa làm sáng tỏ Những gợi ý đặt câu hỏi liệu TGF-β có gây xơ hóa phổi thơng qua đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi (tế bào đóng vai trò trung tâm sinh lý 37 bệnh IPF) hay khơng Do đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài để đánh giá mức độ hoạt hóa NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β làm sáng tỏ mối liên quan tình trạng hoạt hóa NLRP3 inflammasomes điều hịa sống sót tăng sinh ngun bào sợi phổi Để thực đề tài này, hướng đến nội dung chính, thứ mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích TGF-β Kết mục tiêu gợi ý vai trò NLRP3 inflammasomes liên quan đến xơ hóa Để xác nhận vai trị phức hợp này, tiến hành đánh giá ảnh hưởng việc ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh, sống sót nguyên bào sợi phổi kích thích TGF-β Kết hai mục tiêu bàn luận cụ thể 4.1 Về mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β TGF-β yếu tố tăng trưởng chuyển dạng chứng minh chất trung gian quan trọng trình xơ hóa thơng qua nghiên cứu sinh học tế bào, mơ hình động vật chứng lâm sàng TGF-β tác động chủ yếu nguyên bào sợi thường trú đóng vai trị trung tâm q trình tăng sinh biệt hóa ngun bào sợi Ngồi ra, TGF-β cịn đóng vai trị chủ chốt q trình EMT thơng qua hoạt hóa đường tín hiệu Smad [7], [10] Do vậy, nguyên bào sợi phổi hoạt hóa TGF-β thể mức độ tăng sinh mạnh gia tăng biểu gen/protein liên quan đến xơ hóa Sau nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β, chúng tơi tiến hành đánh giá mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes thông qua việc đo mức độ biểu protein NLRP3, ASC, pro-caspase-1, p20 caspase-1, pro-IL-1β, IL-1β phương pháp western blot, đồng thời xác định tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với ASC speck nguyên bào sợi phổi phương pháp hóa tế bào miễn dịch (ICC) Từ kết này, kết luận xu hướng thay đổi biểu và/hoặc hoạt hóa đường NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi Bằng chứng thu cho thấy, nguyên bào sợi phổi sau hoạt hóa TGFβ có mức độ biểu protein NLRP3, p20 caspase-1, pro-IL-1β IL-1β tăng lên đáng kể Ngoài ra, từ kết ta nhận thấy mức độ biểu protein ASC pro-caspase1 khác biệt so với nhóm chứng Tuy nhiên, sau kích thích TGF-β, nguyên bào sợi phổi có tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với ASC speck tăng lên đáng kể Do phức hợp đa phân tử ASC speck hình thành giai đoạn hoạt hóa NLRP3 inflammasomes nên giám sát hình thành phức hợp ASC speck cho phép đánh giá trình hoạt hóa NLRP3 inflammasomes cách tin cậy so với đo mức độ biểu ASC đơn phân 38 Những kết cho thấy TGF-β tăng cường đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi thông qua ảnh hưởng đồng thời đến bước khởi phát (priming signal) bước hoạt hóa (activation signal) dịng thác hoạt hóa inflammasomes Cụ thể, TGF-β làm tăng mức độ biểu protein pro-IL-1β NLRP3, protein then chốt đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes Biểu hai protein kiểm soát yếu tố mã NF-κB Mặc dù nghiên cứu không tiến hành kiểm tra ảnh hưởng TGF-β đến hoạt hóa NF-κB, nghiên cứu trước chứng minh TGF-β thúc đẩy hoạt hóa NF-κB loại tế bào khác [6], [20] Bên cạnh việc tăng mức độ biểu pro-IL-1β NLRP3, TGF-β làm tăng biểu p20 caspase-1, IL-1β dạng trưởng thành tăng tỷ lệ tế bào dương tính với ASC speck, tác động TGF-β đến trình hình thành hoạt hóa inflammasomes Mặc dù chế liên quan đến tác dụng TGF-β đến trình hoạt hóa NLRP3 inflammasomes ngun bào sợi phổi chưa làm sáng tỏ Tuy nhiên, ảnh hưởng TGF-β đến hoạt hóa phức hợp NLRP3 inflammasomes tế bào khác chứng minh Kang H., Seo E cộng chứng minh rằng, đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes hình thành hoạt hóa tế bào gan hình (Hepatic stellate cells, HSCs) sau kích thích với TGF-β Cụ thể, TGF-β hoạt hóa bước khởi phát inflammasomes thơng qua việc kích hoạt đường tín hiệu TAK1NF-κB dẫn đến làm tăng mức độ biểu protein NLRP3 pro-IL-1β Hơn nữa, TGF-β làm tăng mức độ biểu p-Smad2/3-NOX4 HSCs, dẫn đến làm tăng nồng độ ROS nội bào – yếu tố kích hoạt q trình hình thành phức hợp inflammasomes Kết làm tăng mức độ biểu caspase-1 dạng hoạt hóa IL-1β trưởng thành HSCs [20] Tương tự với kết nghiên cứu này, TGF-β gây hoạt hóa NLRP3 inflammasomes tế bào thận chuột dẫn đến xơ hóa [44] Như vậy, với tất chứng có được, xác nhận đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes hoạt hóa sau nguyên bào sợi phổi kích thích với TGFβ Tuy nhiên, chế liên quan đến tác dụng TGF-β đến q trình hoạt hóa NLRP3 inflammasomes HLFs cần nghiên cứu thêm Tổng kết lại, nguyên bào sợi phổi sau kích thích với TGF-β gây hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes Bằng chứng có ý nghĩa gợi ý vai trị sinh lý bệnh phức hợp NLRP3 inflammasomes xơ hóa phổi Tuy nhiên, để xác nhận lại vai trò quan trọng này, cần phải tiếp tục nghiên cứu vai trò điều hòa phức hợp NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh, sống sót biểu gen/protein liên quan đến xơ hóa nguyên bào sợi kích thích với TGF-β 39 4.2 Về vai trị ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β Hoạt hóa inflammasomes q trình oligomer hóa protein NLRP3 NLRP3 sau liên kết với phân tử ASC pro-caspase-1 để hình thành phức hợp inflammasomes Do đó, để nghiên cứu vai trị việc hình thành đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh HLFs, sử dụng chất ức chế phức hợp inflammasomes với chế khác nhau, cụ thể sử dụng chất ức chế dược lý NLRP3 MCC950 kỹ thuật knockdown gen NLRP3 MCC950 chất ức chế mạnh protein tiếp nhận tín hiệu NLRP3 MCC950 gắn trực tiếp vào miền NATCH protein NLRP3, ngăn chặn trình oligomer hóa hình thành phức hợp inflammasomes Mặc dù chất ức chế mạnh phức hợp NLRP3, nhiên để loại trừ khả liên kết không đặc hiệu MCC950, tiếp tục tiến hành kỹ thuật knockdown gen NLRP3 nguyên bào sợi phổi để xác nhận lại vai trò việc ức chế NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh HLFs hoạt hóa với TGF-β Knockdown gen NLRP3 kỹ thuật sử dụng NLRP3 siRNA để làm bất hoạt chức gen, từ làm giảm biểu protein gen đích Vai trị việc ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh HLFs kích thích với TGF-β nghiên cứu qua thử nghiệm đánh giá số lượng tế bào sống (MTS), phân bố chu kỳ tế bào biểu cyclin D1 p27 nguyên bào sợi phổi Trong đó, cyclin D1 p27 protein liên quan đến điều hòa chu kỳ tế bào Cụ thể, cyclin D1 protein nhân có tác dụng hoạt hóa CDKs (Cyclin-dependent kinases) dẫn đến giải phóng yếu tố phiên mã E2F kích hoạt protein liên quan đến việc qua điểm kiểm soát G1/S tiến triển vào pha S Ngược lại, p27 protein ức chế CDKs đóng vai trị kìm hãm chu kỳ tế bào qua điểm kiểm sốt G1/S Do đó, sử dụng cyclin D1 p27 marker để đánh giá mức độ tăng sinh nguyên bào sợi phổi sau điều trị MCC950 [32] Các chứng thu cho thấy, nguyên bào sợi phổi điều trị chất ức chế dược lý NLRP3 MCC950 giảm số lượng tế bào tăng sinh, giảm tiến triển chu kỳ tế bào, giảm biểu marker tăng sinh (cyclin D1) tăng biểu marker ức chế tăng sinh (p27) Bên cạnh đó, sử dụng kỹ thuật knockdown gen NLRP3 thu kết tương tự, cho thấy nguyên bào sợi phổi thiếu gen NLRP3 giảm đáp ứng với TGF-β Những kết rằng, ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes ảnh hưởng trực tiếp đến q trình tăng sinh HLFs kích thích TGF-β Tuy nhiên, chế liên quan đến vai trò NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi xơ hóa cần nghiên cứu thêm 40 Hình 4.1 Cơ chế hoạt hóa phức hợp NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β Sau TGF-β gắn với receptor màng tế bào, hoạt hóa yếu tố phiên mã NF-κB, làm tăng trình tổng hợp NLRP3, pro-IL-1β pro-IL18 (giai đoạn khởi phát) Giai đoạn hoạt hóa diễn kích thích TGFβ với chế chưa rõ ràng, NLRP3 oligomer hóa liên kết với ASC procaspase-1 để hình thành NLRP3 inflammasomes Quá trình hình thành phức hợp inflammasomes hoạt hóa caspase-1 để chuyển pro-IL-1β khơng có hoạt tính sinh học thành dạng IL-1β trưởng thành – yếu tố quan trọng đóng vai trị hoạt hóa tăng sinh nguyên bào sợi phổi gây xơ hóa Đồng thời, caspase-1 phân cắt Gasdermin D thành tiểu đơn vị tạo lỗ màng tế bào, gây trình chết tế bào theo chương trình phụ thuộc vào đáp ứng viêm (pyroptosis) Đây nghiên cứu cho thấy rằng, ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes dẫn đến đảo ngược tình trạng xơ hóa nguyên bào sợi phổi Kết gợi ý câu hỏi liệu chất ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes khác có ảnh hưởng đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi hay không Để trả lời cho câu hỏi nghiên cứu này, cần kiểm chứng cách sử dụng chất ức chế thành phần khác đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes caspase-1, interleukin-1β,… Mặc dù gợi ý vai trị phức hợp NLRP3 xơ hóa nghiên cứu chưa thể tìm chế gây bệnh NLRP3 inflammasomes IPF Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu vai trò NLRP3 inflammasomes đến sản xuất phức hợp ngoại bào (ECM) 41 kiểm chứng tác dụng chống xơ hóa phổi chất điều hịa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes sử dụng mơ hình động vật thích hợp Tuy nhiên, giới hạn mặt thời gian, nội dung nghiên cứu chưa bao gồm khn khổ khóa luận tốt nghiệp Trong tương lai, nhóm nghiên cứu thực tiếp thí nghiệm nhằm cung cấp sở vững để chứng minh vai trị NLRP3 inflammasomes hoạt hóa kiểu hình gây xơ hóa nguyên bào sợi phổi nghiên cứu tiềm liệu pháp ức chế NLRP3 inflammasomes điều trị xơ hóa phổi vơ Mặc dù có nhiều nghiên cứu nhấn mạnh vai trị phức hợp NLRP3 inflammasomes xơ hóa, tính đến thời điểm (2023) chưa có thuốc chống xơ hóa phổi có đích điều trị đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes Những phát nghiên cứu gợi ý việc ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes chế đầy tiềm q trình điều trị xơ hóa phổi Ngồi việc ức chế vào thành phần khác phức hợp NLRP3 inflammasomes, nghiên cứu thuốc điều trị xơ hóa có đích điều trị cytokin gây viêm IL-1β – thành phần quan trọng dịng thác hoạt hóa inflammasomes, liệu pháp điều trị đầy hứa hẹn điều trị xơ hóa phổi vơ 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, xin đưa số kết luận sau: Về mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi liên quan đến xơ hóa - Kích thích TGF-β làm tăng mức độ hoạt hóa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes nguyên bào sợi phổi, thể thông qua việc tăng biểu protein NLRP3, caspase-1 dạng hoạt hóa, IL-1β dạng trưởng thành tăng tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với ASC speck Về vai trị hoạt hóa NLRP3 inflammasomes đến tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích TGF-β - Chất ức chế dược lý NLRP3 MCC950 ức chế tăng sinh nguyên bào sợi phổi kích thích TGF-β - Nguyên bào sợi phổi thiếu gen NLRP3 giảm đáp ứng với TGF-β, thể thông qua giảm số lượng tế bào tăng sinh, giảm tiến triển chu kỳ tế bào, giảm biểu marker tăng sinh tăng biểu marker ức chế tăng sinh KIẾN NGHỊ Từ kết q trình thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đưa đề xuất sau: Nghiên cứu ảnh hưởng chất ức chế đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes khác đến tăng sinh hoạt hóa nguyên bào sợi phổi, bao gồm chất ức chế caspase-1 (Ac-YVAD-cmk), chất ức chế interleukin-1β (IL-1RA),… Nghiên cứu vai trị đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes đến sản xuất phức hợp ngoại bào nguyên bào sợi phổi kích thích với TGF-β Nghiên cứu tác dụng chống xơ hóa phổi chất điều hịa đường tín hiệu NLRP3 inflammasomes sử dụng mơ hình động vật thích hợp 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y Tế (2023), "Hướng dẫn chẩn đốn điều trị Bệnh phổi mơ kẽ", Quyết định số 1005/QĐ-BYT ngày 22 tháng 02 năm 2023 Bộ trưởng Bộ Y tế, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Allen Richard J, Porte Joanne, et al (2017), "Genetic variants associated with susceptibility to idiopathic pulmonary fibrosis in people of European ancestry: a genome-wide association study", The Lancet respiratory medicine, 5(11), pp 869-880 Alyaseer A A A., de Lima M H S., et al (2020), "The Role of NLRP3 Inflammasome Activation in the Epithelial to Mesenchymal Transition Process During the Fibrosis", Front Immunol, 11, pp 883 Artlett C M (2022), "The Mechanism and Regulation of the NLRP3 Inflammasome during Fibrosis", Biomolecules, 12(5), pp Artlett Carol M (2012), "The role of the NLRP3 inflammasome in fibrosis", The open rheumatology journal, 6(1), pp Baba A B., Rah B., et al (2022), "Transforming Growth Factor-Beta (TGF-beta) Signaling in Cancer-A Betrayal Within", Front Pharmacol, 13, pp 791272 Biernacka A., Dobaczewski M., et al (2011), "TGF-beta signaling in fibrosis", Growth Factors, 29(5), pp 196-202 Blevins H M., Xu Y., et al (2022), "The NLRP3 Inflammasome Pathway: A Review of Mechanisms and Inhibitors for the Treatment of Inflammatory Diseases", Front Aging Neurosci, 14, pp 879021 Di Sario A., Bendia E., et al (2002), "Effect of pirfenidone on rat hepatic stellate cell proliferation and collagen production", J Hepatol, 37(5), pp 584-91 10 Frangogiannis N (2020), "Transforming growth factor-beta in tissue fibrosis", J Exp Med, 217(3), pp e20190103 11 Gasse P., Mary C., et al (2007), "IL-1R1/MyD88 signaling and the inflammasome are essential in pulmonary inflammation and fibrosis in mice", J Clin Invest, 117(12), pp 3786-99 12 Glass D S., Grossfeld D., et al (2022), "Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment", Clin Respir J, 16(2), pp 84-96 13 Guo H., Callaway J B., et al (2015), "Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics", Nat Med, 21(7), pp 677-87 14 Han H (2018), "RNA Interference to Knock Down Gene Expression", Methods Mol Biol, 1706, pp 293-302 15 Hasan M., Paul N C., et al (2022), "Natural Product-Based Potential Therapeutic Interventions of Pulmonary Fibrosis", Molecules, 27(5), pp 16 Hewitson T D., Kelynack K J., et al (2001), "Pirfenidone reduces in vitro rat renal fibroblast activation and mitogenesis", J Nephrol, 14(6), pp 453-60 17 Hosseinian N., Cho Y., et al (2015), "The role of the NLRP3 inflammasome in pulmonary diseases", Ther Adv Respir Dis, 9(4), pp 188-97 18 Idiopathic Pulmonary Fibrosis (2000), "Diagnosis and Treatment-International Consensus Statement", Am J Respir Crit Care Med, 161, pp 646-664 19 Jager B., Seeliger B., et al (2021), "The NLRP3-Inflammasome-Caspase-1 Pathway Is Upregulated in Idiopathic Pulmonary Fibrosis and Acute Exacerbations and Is Inducible by Apoptotic A549 Cells", Front Immunol, 12, pp 642855 20 Kang H., Seo E., et al (2022), "TGF-beta activates NLRP3 inflammasome by an autocrine production of TGF-beta in LX-2 human hepatic stellate cells", Mol Cell Biochem, 477(5), pp 1329-1338 21 Kelley N., Jeltema D., et al (2019), "The NLRP3 Inflammasome: An Overview of Mechanisms of Activation and Regulation", Int J Mol Sci, 20(13), pp 22 King Jr Talmadge E (2000), "Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment International consensus statement", Am J Respir Crit Care Med, 161, pp 646-664 23 King Jr Talmadge E, Bradford Williamson Z, et al (2014), "A phase trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis", New England Journal of Medicine, 370(22), pp 2083-2092 24 Lasithiotaki I., Giannarakis I., et al (2016), "NLRP3 inflammasome expression in idiopathic pulmonary fibrosis and rheumatoid lung", Eur Respir J, 47(3), pp 910-8 25 Lee Joyce S, Collard Harold R, et al (2013), "Anti-acid treatment and disease progression in idiopathic pulmonary fibrosis: an analysis of data from three randomised controlled trials", The Lancet Respiratory Medicine, 1(5), pp 369376 26 Lin X., Yu M., et al (2009), "Effects of pirfenidone on proliferation, migration, and collagen contraction of human Tenon's fibroblasts in vitro", Invest Ophthalmol Vis Sci, 50(8), pp 3763-70 27 Maher T M., Bendstrup E., et al (2021), "Global incidence and prevalence of idiopathic pulmonary fibrosis", Respir Res, 22(1), pp 197 28 Martinez F J., Collard H R., et al (2017), "Idiopathic pulmonary fibrosis", Nat Rev Dis Primers, 3, pp 17074 29 McKee C M., Coll R C (2020), "NLRP3 inflammasome priming: A riddle wrapped in a mystery inside an enigma", J Leukoc Biol, 108(3), pp 937-952 30 Mei Q., Liu Z., et al (2021), "Idiopathic Pulmonary Fibrosis: An Update on Pathogenesis", Front Pharmacol, 12, pp 797292 31 MY ARMANIOS (2007), "Telomerase mutations in families with idiopathic pulmonary fibrosis", N Engl J Med, 356, pp 1317-1326 32 Quintanilla-Martinez L., Davies-Hill T., et al (2003), "Sequestration of p27Kip1 protein by cyclin D1 in typical and blastic variants of mantle cell lymphoma (MCL): implications for pathogenesis", Blood, 101(8), pp 3181-7 33 Raghu G, Meyer KC, Silent gastro-oesophageal reflux and microaspiration in IPF: mounting evidence for anti-reflux therapy? 2012, Eur Respiratory Soc p 242-245 34 Raghu G., Collard H R., et al (2011), "An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management", Am J Respir Crit Care Med, 183(6), pp 788-824 35 Raghu Ganesh, Remy-Jardin Martine, et al (2018), "Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline", American journal of respiratory and critical care medicine, 198(5), pp e44-e68 36 Richeldi Luca, Costabel Ulrich, et al (2011), "Efficacy of a tyrosine kinase inhibitor in idiopathic pulmonary fibrosis", New England Journal of Medicine, 365(12), pp 1079-1087 37 Sathiyamoorthy Gayathri, Sehgal Sameep, et al (2017), "Pirfenidone and Nintedanib for Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis", Southern Medical Journal, 110(6), pp 393-398 38 Sauleda J., Nunez B., et al (2018), "Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Epidemiology, Natural History, Phenotypes", Med Sci (Basel), 6(4), pp 39 Sharma M., de Alba E (2021), "Structure, Activation and Regulation of NLRP3 and AIM2 Inflammasomes", Int J Mol Sci, 22(2), pp 40 Thomeer M, Demedts M, et al (2001), "Registration of interstitial lung diseases by 20 centres of respiratory medicine in Flanders", Acta Clinica Belgica, 56(3), pp 163-172 41 Tobin Richard W, POPE CHARLES E, et al (1998), "Increased prevalence of gastroesophageal reflux in patients with idiopathic pulmonary fibrosis", American journal of respiratory and critical care medicine, 158(6), pp 18041808 42 Wang W., Wang X., et al (2013), "Inflammasome-independent NLRP3 augments TGF-beta signaling in kidney epithelium", J Immunol, 190(3), pp 1239-49 43 Wollin L., Wex E., et al (2015), "Mode of action of nintedanib in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis", Eur Respir J, 45(5), pp 1434-45 44 Zhang K., Fan C., et al (2020), "Contribution of TGF-Beta-Mediated NLRP3HMGB1 Activation to Tubulointerstitial Fibrosis in Rat With Angiotensin IIInduced Chronic Kidney Disease", Front Cell Dev Biol, 8, pp 45 Zhang Li-Li, Huang Shan, et al (2016), "Angiotensin (1–7) attenuated Angiotensin II-induced hepatocyte EMT by inhibiting NOX-derived H2O2activated NLRP3 inflammasome/IL-1β/Smad circuit", Free Radical Biology and Medicine, 97, pp 531-543