VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
5 chuûng naám men (Rhodosporidium fluviable, Rhodotorula sp CBS 8885,
3 chuỷng Rhodotorula sp.), 7 chuỷng vi khuaồn (Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Bacillus licherniformis, Bacillus laterosporus, Nitrosomonas sp Nitrobacter sp.), 10 chuûng naám moác (Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
NRRL B-3, Aspergillus ficuum, Aspergillus aculeatus, Mucor hiemalis, Trichoderma hazianum, Trichoderma longibranchiatum, Trichoderma paracemosus, Trichoderma piluliferum, Trichoderma viride) trong bộ sưu tập giống của Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp HCM
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị Đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm Đèn cồn, que cấy, đũa khuấy
Erlen, becher, oáng ly taâm
Eppendorf (loại 1,5 ml và 2 ml), đầu típ nhỏ và lớn
Pipetman loại 20 – 200 àl, loại 200 – 1000 àl
Tủ lạnh, tủ sấy pH keá
Lò viba, nồi hấp khử trùng
Máy đông khô hiệu Virtis
Máy li tâm Mikro 20 hiệu Hettich Zentrifugen
3.1.3 Vật liệu và hóa chất
Các khoáng vi lượng bổ sung vào môi trường
Dung dịch khoáng vi lượng
KH2PO4 1,0 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4.5H2O 0,01 g Thuốc thử Lugol (2,5 g/l Iodde; Potasium iodur [KI] 5 g/l)
Thuốc nhuộm Coomassie (4 viên Coomassie blue G250 - Merck, 250 ml dd Methanol)
Giải nhuộm (Methanol : A acetic : H2O theo tỉ lệ 3:1:6)
3.1.4.1 Môi trường YMA (Yeast extract – malt extract) [23]
Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
3.1.4.2 Môi trường PGA (hay PDA) [15]
Khoai taây (potatoes) 200 g Glucose (dextrose) 10 g
Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
3.1.4.4 Môi trường thử khả năng phân giải tinh bột [15, 30]
Dung dịch khoáng đủ 1000 ml Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
3.1.4.5 Môi trường thử khả năng phân giải CMC [15, 30]
Dung dịch khoáng đủ 1000 ml Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
3.1.4.6 Môi trường thử khả năng phân giải gelatin [15, 30]
Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
3.1.4.7 Môi trường thử khả năng phân giải nitrat [15, 16]
Hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập và chọn lọc mẫu thuần khiết
Việc phân lập và chọn lọc mẫu là một trong những bước quan trọng đầu tiên của công việc bảo quản giống vi sinh vật do tính quyết định của việc lựa chọn được nguồn nguyên liệu tinh sạch, thuần khiết mang những đặc tính nổi trội nhất nhằm đảm bảo cho việc thực hiện các công đoạn bảo quản sau này
Vi sinh vật được nuôi trong những môi trường thích hợp với điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp nhằm gia tăng số lượng tế bào cũng như phục hồi giống Thông thường, trong nuôi cấy tĩnh vi sinh vật đạt trạng thái động học ở pha logarit (pha lũy tiến) được coi là những “tế bào tiêu chuẩn” [13] Tại thời điểm này, kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý nói chung không đổi theo thời gian
Sử dụng môi trường hoạt hóa LB broth và lắc trong 24 giờ
Sử dụng môi trường hoạt hóa YM broth và lắc trong 24 giờ
Sử dụng môi trường hoạt hóa PG broth và lắc trong 72 giờ
3.2.1.2 Phân lập và làm thuần chủng vi sinh vật [15, 16]
Mục tiêu của quá trình phân lập và làm thuần chủng giống vi sinh vật là tạo ra các loài riêng biệt, không bị tạp nhiễm Mỗi khuẩn lạc đơn lẻ chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống hệt nhau Điều này giúp phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa học và sản xuất, đảm bảo tính chính xác và đồng nhất của các chủng vi sinh vật được sử dụng.
Phân lập và làm thuần vi khuẩn
Dịch hoạt hóa vi khuẩn ở trên được cấy ria trên môi trường thạch đĩa LB, ủ ở nhiệt độ phòng, thời gian 24 – 48 giờ, dùng phương pháp cấy ria và chọn khuẩn lạc riêng rẽ
Tiếp tục làm thuần (khoảng 2 – 3 lần) đến khi các khuẩn lạc xuất hiện là đồng nhất
Giữ giống trong môi trường thạch nghiêng LB
Phân lập và làm thuần nấm men
Dịch hoạt hóa nấm men ở trên được cấy ria trên môi trường thạch đĩa YMA, ủ ở nhiệt độ phòng, thời gian 24 – 48 giờ, dùng phương pháp cấy ria và chọn khuẩn lạc riêng rẽ
Tiếp tục làm thuần (khoảng 2 – 3 lần) đến khi các khuẩn lạc xuất hiện là
Giữ giống trong môi trường thạch nghiêng YMA
Phân lập và làm thuần nấm mốc
Dịch hoạt hóa nấm mốc ở trên được cấy điểm bằng que cấy móc trên môi trường thạch đĩa PGA, ủ nhiệt độ phòng, thời gian 3 – 5 ngày
Tiếp tục làm thuần (khoảng 2 – 3 lần) đến khi các khuẩn lạc xuất hiện là đồng nhất
Giữ giống trong môi trường thạch nghiêng PGA
3.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái [15, 16, 23, 28]
Bên cạnh việc quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên đĩa petri thì việc khảo sát đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật được thực hiện trước và sau khi bảo quản là một trong những bước đi cần thiết của công tác bảo quản giống nhằm kiểm tra tính ổn định của các chủng sau một thời gian bảo quản nhất định Ở đề tài này chúng tôi thực hiện việc kiểm tra hình thái của tất cả các chủng vi sinh vật được bảo quản
Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm Gram cho những tiêu bản cố định mẫu vi khuẩn cần nghiên cứu
- Làm tiêu bản: nhỏ dịch nuôi cấy có chứa vi khuẩn lên lam kính sạch đã chuẩn bị từ trước, để khô trong không khí hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
- Nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 - 2 phút, nhuộm Lugol trong 1 phút, rửa nước và tẩy bằng cồn trong 30 giây. - Tiếp tục rửa nước, nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin, rửa nước, làm khô tiêu bản và soi dưới kính hiển vi vật kính dầu.
3.2.2.2 Naám men [24] Đối với nấm men chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm đơn bằng xanh metylen để quan sát hình thái của chúng dưới kính hiển vi
Do khả năng sinh bào tử và có hệ sợi khá phức tạp nên đối với nấm mốc chúng tôi thực hiện việc kiểm tra hình thái của các chủng nấm mốc qua cách làm phòng ẩm và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học
Chuẩn bị lam, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và một thanh chữ U ở trên đem hấp khử trùng
Hút nước cất đã khử trùng bơm lên giấy lọc để giữ cho môi trường trong ủúa petri khoõng bũ khoõ
Hút môi trường đã hấp khử trùng và làm tan, trãi lên miếng lam một lớp thật mỏng và đặt vào đĩa petri trên thanh chữ U
Chờ cho lớp mỏng môi trường khô, dùng que cấy thẳng cấy một đường lên miếng lam và đặt miếng lamelle lên chỗ vừa cấy cho thật kín
Gói đĩa, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày
3.2.3 Khảo sát mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu trước và sau bảo quản bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [16]
Nhằm xác định số lượng vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu trước và sau khi bảo quản do các tế bào sống có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường thích hợp Từ đó có thể đánh giá một cách cụ thể nhất hiệu quả của phương pháp bảo quản
Trong phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa
3.2.3.1 Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000 v.v… Mỗi bậc pha loãng 1/10 được thực hiện bằng cách lấy 0,1 ml dung dịch mẫu (hay dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 0,9 ml nước cất vô trùng hay môi trường trong một ống nghiệm
Hút 0,1 ml dịch ở các bậc pha loãng phía sau lên bề mặt môi trường rắn (hộp trải) Mỗi tế bào riêng biệt sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức
Mi (CFU/ml) =Ai x Di/V
Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình/đĩa, Di là độ pha loãng và V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau
3.2.4 Khảo sát thời gian lấy mẫu [2, 13]
Dựa trên khả năng sinh trưởng (tăng sinh khối) và phát triển (tăng số lượng) của các chủng vi sinh vật, không phải bao giờ hai quá trình trên diễn ra song song nhau, trường hợp này chỉ gặp trong pha logarit Mặt khác, các chủng vi sinh vật có thời gian sinh trưởng và phát triển khác nhau nên chọn được thời điểm lấy mẫu tối ưu nhất sẽ quyết định đến chất lượng của chủng bảo quản Ở cách thực hiện của đề tài này chúng tôi khảo sát trên 3 thời điểm lấy mẫu khác nhau
- Đối với vi khuẩn và nấm men, chúng tôi thực hiện việc lấy mẫu ở thời điểm sau 1, 2, 3 ngày nuôi cấy
- Đối với nấm mốc, việc lấy mẫu được tiến hành sau 3, 5, 7 ngày nuôi caáy
3.2.5 Cách thực hiện phương pháp đông khô [19, 21, 24, 25, 26, 27]
3.2.5.1 Các bước tiến hành quá trình nuôi cấy
Khử trùng khô ống nghiệm môi trường 170 0 C trong 2 giờ
Cho môi trường vào ống nghiệm (PGA cho nấm mốc, YMA cho nấm men,
Hấp khử trùng môi trường 121 0 C trong 20 phút Ủ trong 2 ngày kiểm tra độ nhiễm
Nuôi cấy giống trên môi trường thạch nghiêng Ủ giống: 25 0 C trong 24 – 48 giờ cho vi khuẩn và nấm men
30 0 C trong 7 – 14 ngày cho vi nấm và nấm sợi
3.2.5.2 Các bước chuẩn bị môi trường dịch huyền phù
Môi trường huyền phù là hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo công thức Dung dòch A Skim milk powder 10 g
Hấp khử trùng 2 lần (cách nhau 2 ngày) ở 110 0 C trong 10 phút
Khử trùng bằng màng lọc
Sau đó trộn dung dịch A và B lại với nhau, và ủ ở nhiệt độ 25 – 30 0 C trong
1 ngày để kiểm tra độ nhiễm
3.2.5.3 Chuaồn bũ oỏng ủoõng khoõ
Tube dùng cho đông khô được ngâm trong dung dịch 2% HCl trong 24 giờ Rửa qua nước cất khử trùng 2 lần
Sau đó đem sấy khô 150 0 C trong 2 giờ
Trên nhãn ghi tên chủng, ngày làm đông khô
3.2.5.5 Tạo dịch huyền phù có chứa bào tử giống
Trong mỗi ống giống thêm vào một thể tích nhất định môi trường dịch huyền phù đã chuẩn bị ở trên sao cho không quá đầy, cũng không quá ít (thường chiếm 4/5 ống giống) Chú ý không để pipet đụng vào bề mặt thạch Trộn đều và nhẹ để cho bào tử (tế bào) tách ra và hòa vào dịch huyền phù
Hút 1 ml dịch huyền phù có chứa bào tử giống ở trên vào ống đông khô đã voõ truứng
Cho vào ống lớn Bảo quản ở nhiệt độ lạnh để dịch đông lại
Mọi thao tác đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối
Bật máy, thao tác theo đúng quy trình sử dụng
Khi máy đông khô đã đạt đến nhiệt độ và áp suất phù hợp, tiến hành đưa mẫu vào máy Nên thao tác nhanh chóng để hạn chế khả năng nhiễm mẫu và tránh tình trạng mẫu rã đông khiến quá trình hút chân không gặp khó khăn.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Kết quả phân lập và chọn lọc mẫu thuần khiết
Sau quá trình phân lập và chọn lọc mẫu gồm các bước hoạt hóa và kiểm tra tính thuần của chủng, chúng tôi nhận thấy “các chủng vi sinh được nghiên cứu đều thuần khiết, không tạp nhiễm đủ tiêu chuẩn làm nguồn nguyên liệu cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo”.
Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái
Kết hợp với việc quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên đĩa petri chúng tôi cũng kiểm tra đặc điểm hình thái tế bào của các chủng nghiên cứu dưới kính hiển vi quang học Tiến hành kiểm tra trước và sau bảo quản chúng tôi nhận được kết quả không thay đổi về đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào theo từng đối tượng
Chúng tôi đã thực hiện việc kiểm tra đại thể bằng mắt thường nhằm so sánh hình dạng của khuẩn lạc của vi khuẩn trên đĩa petri trước và sau bảo quản đồng thời cũng kiểm tra vi thể trên kính hiển vi quang học với mục đích kiểm tra lại hình thái của vi khuẩn với kết quả được trình bày ở Bảng 4.1
Bảng 4.1: kết quả khảo sát hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào vi khuẩn trước và sau bảo quản
Stt Tên Hình dạng khuẩn lạc trên đĩa petri trước và sau bảo quản
Hình thái trên kính hiển vi quang học trước và sau bảo quản
01 Bacillus subtilis Khuẩn lạc không có hình dạng nhất định, màu trắng đục, khuẩn lạc ép sát mặt thạch
02 Bacillus circulans Khuẩn lạc không có hình dạng nhất định, màu trắng đục, khuẩn lạc ép sát mặt thạch
03 Bacillus polymyxa Khuẩn lạc không có hình dạng nhất định, màu trắng đục, khuẩn lạc ép sát mặt thạch
04 Bacillus licheniformis Khuẩn lạc màu trắng tạo nếp nhăn, ép sát mặt thạch
05 Bacillus laterosporus Khuẩn lạc trắng, bề mặt trơn bóng, hơi lồi Hình que, Gram dửụng
06 Nitrosomonas sp Khuẩn lạc ép sát mặt thạch, tạo nếp viền răng cưa vòng quanh khuẩn lạc, bề mặt ướt
Cầu khuẩn, nhỏ, Gram dửụng
07 Nitrobacter sp Khuẩn lạc màu trắng sưã, hơi lồi, tạo nếp nhăn, bề mặt khuẩn lạc khoâ
Hình trứng, nhỏ, Gram dửụng
Hình 4.1: hình dạng khuẩn lạc
Bacillus subtilis treõn ủúa petri trước bảo quản
Hình 4.2: hình dạng khuẩn lạc
Bacillus subtilis treõn ủúa petri sau bảo quản
Như vậy từ kết quả trên cho thấy các chủng vi khuẩn sau một thời gian bảo quản nhất định đã không có sự thay đổi nào về hình dạng khuẩn lạc trên đĩa petri và hình thái của vi khuẩn trên kính hiển vi
4.2.2 Naám men Đối với nấm men chúng tôi cũng thực hiện việc kiểm tra tuần tự như với vi khuẩn Kết quả được trình bày ở Bảng 4.2
Bảng 4.2: kết quả khảo sát hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào nấm men trước và sau bảo quản
Stt Tên Hình dạng khuẩn lạc trên đĩa petri trước và sau bảo quản
Hình thái trên kính hiển vi quang học trước và sau bảo quản
01 Rhodosporidium fluviable Khuẩn lạc to tròn, màu cam đỏ, bề mặt ướt
Tế bào hình bầu dục
8885 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu cam Tế bào hình bầu dục
03 Rhodotorula sp Khuẩn lạc to tròn, màu cam đỏ, bề mặt ướt Tế bào hình tròn
04 Rhodotorula sp Khuẩn lạc to tròn, màu cam đậm, bề mặt ướt
Tế bào hình bầu dục
05 Rhodotorula sp Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu cam, bề mặt ướt
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy tính ổn định bước đầu của các chủng
Hình 4.3: hình dạng khuẩn lạc
Rhodosporidium fluviable treân đĩa petri trước bảo quản
Hình 4.4: hình dạng khuẩn lạc
Rhodosporidium fluviable treân đĩa petri sau bảo quản
Bảng 4.3: kết quả khảo sát hình dạng khuẩn lạc và hình thái khuẩn ty nấm mốc trước và sau bảo quản
Stt Tên Hình dạng khuẩn lạc trên đĩa petri trước và sau bảo quản
Hình thái trên kính hiển vi quang học trước và sau bảo quản
01 Aspergillus ficuum Mặt dưới có nếp nhăn hình rễ cây, bào tử màu đen, tơ bò sát mặt thạch
Theồ bỡnh hai taàng, cuoáng conidi nhaün, không màu
02 Aspergillus oryzae Khuẩn lạc tròn tạo bào tử màu xanh, vàng hoa cau
Hệ sợi mảnh có vách ngăn, cuống đính bào tử
B-3 Mặt dưới có nếp nhăn hình rễ cây, tạo bào tử màu nâu đen
Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính trong bọc
04 Aspergillus aculeatus Mặt dưới có nếp nhăn hình rễ cây, tạo bào tử màu than đen
Thể bình một tầng, connidi có hình elip, có gai
05 Mucor hiemalis Tơ rối bông, xốp, lan đều khắp mặt thạch, màu lông chuột
Bào tử hơi dài, thảm sợi màu trắng, cuống bọc bào tử sơ cấp
06 Trichoderma viride Tơ ép sát mặt thạch, bào tử tạo thành giống như cát có màu xanh
Cuống conidi dài và dày, bào tử chai có vách xù xì
07 Trichoderma piluliferum Tơ sợi nhỏ li ti màu xanh lẫn màu trắng, bào tử màu xanh reâu
Cuống conidi tạo thành búi, bào tử chai hình caàu, trong suoát
08 Trichoderma paracemosus Sinh sắc tố vàng ra môi trường, tơ ép sát mặt thạch, tạo bào tử màu xanh reâu
Cuống conidi tạo thành búi, bào tử chai hình caàu, trong suoát
09 Trichoderma longibranchiatum Sinh sắc tố vàng ra môi trường, tơ ép sát mặt thạch, tạo bào tử màu xanh reâu, to
Cuống conidi dài và mảnh, phân nhánh, bào tử hình chai lớn hơi thon ở đáy
10 Trichoderma hazianum Tơ xốp bông ép sát mặt thạch, tạo bào tử màu xanh, tiết sắc tố vàng
Khuẩn ty có vách ngaờn, theồ bỡnh hỡnh chai, bào tử hình elip
Dựa vào kết quả của Bảng 4.3 bước đầu chúng tôi rút ra kết luận về tính ổn định của các chủng nấm mốc được bảo quản bằng phương pháp đông khô
Kết quả nghiên cứu từ các bảng 4.1, 4.2 và 4.3 cho thấy chủng vi sinh vật bảo quản bằng phương pháp đông khô có độ ổn định cao về hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào trong thời gian bảo quản xác định.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu trước và sau khi bảo quản
So sánh mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu trước và sau khi bảo quản là một trong những tiêu chí quan trọng nhất nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp đông khô
Chúng tôi thực hiện phương pháp đếm khuẩn lạc để có những thông tin về mật độ tế bào (CFU/ml) trước và sau bảo quản các chủng vi khuẩn Kết quả được thể hiện ở Hình 4.7
Hình 4.5: hình dạng khuẩn lạc
Aspergillus oryzae treõn ủúa petri trước bảo quản
Hình 4.6: hình dạng khuẩn lạc
Aspergillus oryzae treõn ủúa petri sau bảo quản
Trước bảo quản Sau bảo quản m ật đ ộ t ế b ào (x 1 0 9 )
Bacillus subtilis Bacillus circulans Bacillus polymyxa Bacillus licheniformis
Bacillus laterosporus Nitrosomonas sp Nitrobacter sp
Mật độ tế bào vi khuẩn không đổi sau bảo quản đông khô là chỉ báo quan trọng cho thấy phương pháp bảo quản này phù hợp Điều này có nghĩa là các chủng vi khuẩn không bị mất khả năng tồn tại sau quá trình đông khô, duy trì mức độ sống ổn định.
Chúng tôi cũng thực hiện phương pháp đếm khuẩn lạc ở trên cho các chủng nấm men Kết quả thu nhận được trình bày ở Hình 4.8
Trước bảo quản Sau bảo quản m ật đ ộ t ế b ào (x 1 0 9 )
Rhodosporidium fluviable Rhodotorular sp CBS 8885
Dựa vào kết quả của Hình 4.8 chúng tôi nhận thấy mật độ tế bào nấm men trước và sau bảo quản đều không đổi
Hình 4.7: mật độ tế bào vi khuẩn trước và sau bảo quản
Hình 4.8: mật độ tế bào nấm men trước và sau bảo quản
4.3.3 Naám moác Đối với nấm mốc chúng tôi cũng thực hiện việc kiểm tra tuần tự như trên Kết quả được trình bày ở Hình 4.9
Trước bảo quản Sau bảo quản m ật đ ộ t ế b ào (x 1 0 9 )
Aspergillus ficuum Aspergillus oryzae Aspergillus niger NRRL B-3 Aspergillus aculeatus
Trichoderma piluliferum Trichoderma paracemosus Trichoderma longibranchiatum Trichoderma hazianum
Dựa vào kết quả của Hình 4.9 chúng tôi nhận thấy mật độ tế bào nấm mốc trước và sau bảo quản đều không đổi
Từ những kết quả ở trên, chúng tôi có thể kết luận bước đầu về hiệu quả tốt hơn của phương pháp đông khô so với các phương pháp khác là có cơ sở.
Thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu
Để đánh giá hiệu quả của phương pháp đông khô, chúng tôi đã kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật trước và sau bảo quản Ngoài ra, nhằm củng cố cơ sở nghiên cứu, chúng tôi còn tiến hành khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng vi sinh vật được bảo quản bằng phương pháp này Kết quả chi tiết được trình bày ở Bảng 4.4, 4.5 và 4.6.
Hình 4.9: mật độ tế bào nấm mốc trước và sau bảo quản
Bảng 4.4: kết quả khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng nấm moác
KT15 KT180 KT15 KT180 KT15 KT180
Ghi chú: + mẫu tinh sạch - mẫu nhiễm
LM3, LM5, LM7 thời gian lấy mẫu sau 3, 5, 7 ngày
KT15, KT180 kiểm tra sau 15, 180 ngày bảo quản
Bảng 4.5: kết quả khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng vi khuaồn
KT15 KT180 KT15 KT180 KT15 KT180
Ghi chú: + mẫu tinh sạch - mẫu nhiễm
LM1, LM2, LM3 thời gian lấy mẫu sau 1, 2, 3 ngày
KT15, KT180 kiểm tra sau 15, 180 ngày bảo quản
Bảng 4.6: kết quả khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng nấm men
KT15 KT180 KT15 KT180 KT15 KT180
Ghi chú: + mẫu tinh sạch - mẫu nhiễm
LM1, LM2, LM3 thời gian lấy mẫu sau 1, 2, 3 ngày
KT15, KT180 kiểm tra sau 15, 180 ngày bảo quản
Từ những kết quả thu nhận được chúng tôi có những nhận xét sau
Dựa vào kết quả nhận được tại các Bảng 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi nhận thấy ở thời gian lấy mẫu sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường LB agar đối với vi khuẩn và YM agar đối với nấm men hay ở thời gian lấy mẫu sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PG agar đối với nấm mốc tức ở lần lấy mẫu 2 thì cho kết quả tốt hơn so vơí lần lấy mẫu 1 và 3 Điều này chứng tỏ lần lấy mẫu này phù hợp với quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và chúng đang ở trạng thái ổn định nhất của quá trình sống của mình
Sau khi thực hiện kiểm tra các chủng vi sinh vật sau 15 ngày và 180 ngày bảo quản, chúng tôi nhận thấy khả năng sống của các chủng sau thời gian bảo quản trên bước đầu không thay đổi nhiều (Bảng 4.4, 4.5 và 4.6) So sánh với khả
Theo Bảng 2.2 do Bộ sưu tập quốc gia về nuôi cấy typ Anh (NCTC) đưa ra, kết quả nghiên cứu này cho thấy tính khả thi của phương pháp liên kết chéo PEP trong điều kiện thiếu thiết bị bảo quản giống vi sinh vật tại Việt Nam.
4.4.3 Độ nhiễm mẫu Ở bảng 4.4: Kết quả khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng nấm mốc Chúng tôi nhận thấy chủng Trichoderma hazianum bị nhiễm ở thời gian lấy mẫu sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PG agar khi thực hiện việc kiểm tra sau 15 ngày bảo quản nhưng kiểm tra lại sau 3 tháng bảo quản thì không bị nhiễm điều này chứng tỏ chủng trên không bị nhiễm ở quá trình lấy mẫu mà do sai xót trong quá trình thao tác Qua đó có thể kết luận “Độ nhiễm mẫu của các chủng nấm mốc trên khi thực hiện phương pháp đông khô là không có, tỷ lệ tinh sạch là 100%” Ở bảng 4.5: Kết quả khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng vi khuẩn
Chúng tôi nhận thấy chủng Nitrosomonas sp bị nhiễm ở thời gian lấy mẫu sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường LB agar khi thực hiện việc kiểm tra sau 15 ngày bảo quản nhưng kiểm tra lại sau 3 tháng bảo quản thì không bị nhiễm điều này chứng tỏ chủng trên không bị nhiễm ở quá trình lấy mẫu mà do sai xót trong quá trình thao tác Qua đó có thể kết luận “Độ nhiễm mẫu của các chủng vi khuẩn trên khi thực hiện phương pháp đông khô là không có, tỷ lệ tinh sạch là 100%”
Tương tự ở bảng 4.6: Kết quả khảo sát thời gian lấy mẫu, thời gian bảo quản và độ nhiễm mẫu của các chủng nấm men Chúng tôi nhận thấy chủng
Rhodotorular sp CBS 8885 bị nhiễm ở thời gian lấy mẫu sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường YM agar khi thực hiện việc kiểm tra sau 15 ngày bảo quản nhưng kiểm tra lại sau 3 tháng bảo quản thì không bị nhiễm điều này chứng tỏ chủng trên không bị nhiễm ở quá trình lấy mẫu mà do sai xót trong quá trình thao tác Qua đó có thể kết luận “Độ nhiễm mẫu của các chủng nấm men trên khi thực hiện phương pháp đông khô là không có, tỷ lệ tinh sạch là 100%”
Từ kết quả ở trên, bước đầu chúng tôi nhận định “độ tinh sạch của sản phẩm sau đông khô là 100%, độ nhiễm của mẫu bằng không”.
Kết quả khảo sát một số tính chất sinh hóa
Chúng tôi cũng tiến hành thực hiện việc khảo sát một số tính chất sinh hóa của các chủng được bảo quản Công việc được thực hiện trước và sau khi bảo quản, kết quả nhận được tại các Bảng 4.7, 4.8 và 4.9
Bảng 4.7: kết quả khảo sát khả năng phân giải CMC, tinh bột và nitrat của các chủng vi khuẩn
Khả năng phân giải CMC (mm)
Khả năng phân giải tinh bột (mm)
Khả năng phân giải nitrat Trước bảo quản
Ghi chú: + có khả năng phân giải nitrat - không có khả năng phân giải nitrat
Bảng 4.8: kết quả định tính khả năng sinh carotene của các chủng nấm men
Tên Định tính khả năng sinh carotene
Trước bảo quản Sau bảo quản
Ghi chuù: + sinh carotene - khoâng sinh carotene
Bảng 4.9: kết quả khảo sát khả năng phân giải CMC, tinh bột và gelatin của các chủng nấm mốc
Khả năng phân giải CMC (mm)
Khả năng phân giải tinh bột (mm)
Khả năng phân giải gelatin (mm) Trước bảo quản Sau bảo quản Trước bảo quản Sau bảo quản Trước bảo quản Sau bảo quản
Ghi chú: - không có khả năng phân giải CMC, tinh bột, Gelatin Ở Bảng 4.7:
- Kết quả khảo sát khả năng phân giải CMC của chủng Bacillus laterosporus sau bảo quản có đường kính vòng phân giải là 28 mm thấp hơn so với trước khi bảo quản là 1 mm (đường kính vòng phân giải CMC trước bảo quản là 29 mm)
- Kết quả khảo sát khả năng phân giải nitrat của chủng Bacillus subtilis sau bảo quản có đường kính vòng phân giải là 19 mm thấp hơn so với trước khi bảo quản là 1 mm (đường kính vòng phân giải CMC trước Ở Bảng 4.9:
Kết quả khảo sát khả năng phân giải CMC của chủng Aspergillus oryzae sau bảo quản có đường kính vòng phân giải là 36 mm thấp hơn so với trước khi bảo quản là 1 mm (đường kính vòng phân giải CMC trước bảo quản là 37 mm)
Từ những kết quả ở trên (Bảng 4.7, 4.8 và 4.9) cho thấy tính chất sinh hóa của đa số các chủng sau một thời gian bảo quản nhất định bước đầu không thay đổi mặc dù có một số chủng có tính chất sinh hóa có thay đổi nhưng không đáng kể từ đó có thể khẳng định được tính khả thi của phương pháp đông khô khi thực hiện trong điều kiện ở các phòng thí nghiệm của Việt Nam
Hình 4.10: khuẩn lạc Aspergillus aculeatus treõn ủúa petri
Hình 4.11: khuẩn lạc Aspergillus niger NRRL B3 treõn ủúa petri
Hình 4.12: khuẩn lạc Trichoderma viride treõn ủúa petri
Hình 4.13: khuẩn lạc Trichoderma hazianum treõn ủúa petri
Hình 4.14: khuẩn lạc Mucor Hình 4.15: khuẩn lạc Trichoderma
Hình 4.16: hình thái Rhodosporidium fluviable treõn kớnh hieồn vi
Hình 4.17: hình thái Rhodotorula sp
CBS 8885 treõn kớnh hieồn vi
Hình 4.18: hình thái Trichoderma viride trên kính hiển vi Hình 4.19: hình thái Trichoderma paracemosus treõn kớnh hieồn vi
Hình 4.20: hình thái Bacillus circulans treõn kớnh hieồn vi
Hình 4.21: hình thái Bacillus subtilis treõn kớnh hieồn vi
Hỡnh 4.23: oỏng nghieọm naỏm men
Hình 4.22: nấm mốc sau hoạt hóa
Hình 4.24: khuẩn lạc Rhodotorular sp treõn ủúa petri
Hình 4.25: khuẩn lạc Bacillus laterosporus treõn ủúa petri
Hình 4.26: kết quả định tính carotene
Hình 4.28: kết quả định tính enzym amylase cuỷa vi khuaồn
Hình 4.27: kết quả định tính enzym amylase cuûa naám moác
Hình 4.30: kết quả định tính enzym cellulase vi khuaồn
Hình 4.29: kết quả định tính enzym cellulase naám moác
Hình 4.32: kết quả khả năng thử
Hỡnh 4.33: quy trỡnh ủoõng khoõ