Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Phát triển phương pháp phân tích xác định đồng thời esomeprazole và naproxen trong thuốc bằng phương pháp HPLC-UV

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

HUỲNH THỊ XUÂN TRANG

PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ESOMEPRAZOLE VÀ NAPROXEN TRONG

THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-UV

Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số: 8520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2022

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHQG –

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Huỳnh Thị Xuân Trang MSHV: 1970653

Ngày, tháng, năm sinh: 03/04/1993 Nơi sinh: Tp HCM

Tiếng Việt: “Phát triển phương pháp phân tích xác định đồng thời esomeprazole và

naproxen trong thuốc bằng phương pháp HPLC-UV”

Tiếng Anh: “Development of a rapid and simple analytical method for simultaneous

determination of esomeprazole and naproxen in binary combination by HPLC – UV”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu cho quá trình phân tích. Khảo sát điều kiện sắc ký.

 Thẩm định quy trình phân tích.

 Ứng dụng quy trình vừa phát triển phân tích một số mẫu thành phẩm.

IV.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Trần Thị Kiều Anh

Tp HCM, ngày tháng năm 20

LỜI CÁM ƠN

Sau một thời gian học tập và nghiên cứu dưới sự định hướng và dẫn dắt của cô TS Trần Thị Kiều Anh, luận văn thạc sĩ với đề tài: “Phát triển phương pháp phân tích xác định đồng thời Esomeprazole và Naproxen trong thuốc bằng phương pháp HPLC-UV” đã được thực hiện và hoàn thành

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Trần Thị Kiều Anh, người cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi những kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận văn

Ban Lãnh đạo Khoa Kỹ thuật Hoá học và Ban Giám Hiệu Trường ĐH Bách Khoa Tp HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận văn đúng thời gian quy định

CN Nguyễn Hữu Gia Bảo, DS Võ Thanh Sơn, DS Hà Thanh Tú và các bạn tại Bộ phận R&D - Trung tâm Ngiên cứu Phát triển Công nghệ cao thuộc Công ty CP Dược phẩm SaViPharm đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại công ty DS Thái Hiền Lương, người em và cũng là người đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ với những khó khăn trong công việc khi tôi thực hiện luận văn

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tp HCM, ngày tháng năm 20

Học viên

HUỲNH THỊ XUÂN TRANG

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Esomeprazole (ESP) là một hợp chất có tác dụng ức chế tiết axit dạ dày, hỗ trợ điều trị bệnh trào ngược dạ dày thực quản hiệu quả Naproxen (NPX) có hoạt tính chống viêm không steroid, thường được sử dụng để giảm nhiều loại đau, sốt, viêm Ngày nay, có nhiều công ty dược phẩm điều chế kết hợp NPX và ESP với liều lượng khác nhau Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp phân tích nhanh chóng, đáng tin cậy, chính xác và đơn giản để xác định đồng thời định tính và định lượng NPX và ESP trong bào chế dược phẩm Sự phân tách đạt được từ cột HPLC C8 (150mm x 4,6 mm, 5 µm), pha động sử dụng gồm Acetonitrile - đệm pH 7,6 có bổ sung chất bắt cặp ion theo tỷ lệ 30:70 (v/v), với tốc độ dòng 1,0 ml / phút, bước sóng phân tích ở 230 nm Thời gian lưu của NPX và ESP lần lượt là 6,950 và 8,949 phút Phương pháp cho thấy độ tuyến tính của đường chuẩn với giá trị hệ số tương quan r2 = 0,9999 đối với NPX và ESP Hiệu suất thu hồi của cả hai loại dược chất nằm trong giới hạn từ 98% đến 102%, chứng tỏ độ đúng của phương pháp này Các nghiên cứu về độ chính xác và độ chính xác trung gian của phương pháp mới có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thấp hơn 2,0%, đạt yêu cầu theo các hướng dẫn của ICH Do đó, phương pháp HPLC - UV thích hợp để xác định hàm lượng của NPX và ESP trong thuốc và nó có thể được áp dụng trong phân tích thông thường để xác định

NPX và ESP trong các công thức dược phẩm

ABSTRACT

Esomeprazole (ESP) is a compound that inhibits gastric acid secretion and effective in the treatment of gastric oesophageal reflux diseases Naproxen (NPX) has non steroidal anti-inflammatory activity, which is commonly used for relief of a wide variety of pain, fever, inflammations Nowadays, there are many pharmaceutical companies prepare NPX and ESP combinations in different dosage strengths Thus, the objective of this study was to develop a rapid, reliable, reproducible, precise and simple analytical method for qualitative and quantitative simultaneous determination of NPX and ESP in pharmaceutical preparation The separation was achieved from HPLC Column C8 (150 mm x 4.6 mm, 5 µm), Acetonitrile - buffer pH 7,6 with the addition of ion pair reagents in the ratio of 30:70 (v/v) as the mobile phase, at a flow rate of 1.0 ml/min with UV detection at 230 nm The retention time of NPX and ESP was found to be 6,950 and 8,949 minutes The method showed linear response with a correlation coefficient value r2= 0,9999 for NPX and ESP The recovery for both drugs was found between 98% and 102% which demonstrated the accuracy of this method Intra- and intermediate precision studies of the studied method were less than 2,0 % relative standard deviation (RSD) according to ICH guidlines Therefore, the RP - HPLC method is suitable for determining the concentration of NPX and ESP in tablets and it can applied for routine analysis for determination of the NPX and ESP in pharmaceutical formulations

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

HUỲNH THỊ XUÂN TRANG

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT VIIIDANH MỤC BẢNG BIỂU XDANH MỤC HÌNH VẼ XII

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẠICƯƠNGVỀNAPROXEN 3

1.1.1Giới thiệu chung 3

1.1.2Cấu trúc và tính chất của Naproxen 3

1.1.3Tác dụng dược lý của Naproxen 3

1.2 ĐẠICƯƠNGVỀESOMEPRAZOLE 4

1.2.1Giới thiệu chung 4

1.2.2Cấu trúc và tính chất của Esomeprazole 5

1.2.3Tác dụng dược lý của Esomeprazole 5

1.3 TỔNGQUANVỀPHƯƠNGPHÁPQUANGPHỔTỬNGOẠIKHẢKIẾN 61.4 TỔNGQUANVỀPHƯƠNGPHÁPSẮCKÝLỎNGHIỆUNĂNGCAO 9

1.4.1Khái niệm 9

1.4.2Phân loại 9

1.4.3Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 10

1.4.4Hệ thống máy HPLC 13

1.5 MỘTSỐPHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCHNPXVÀESP 15

1.6 TỔNGQUANVỀKĨTHUẬTSẮCKÍPHAĐẢOGHÉPCẶPION 18

1.7 TỔNGQUANVỀHƯỚNGNGHIÊNCỨU 20

1.8 TỔNGQUANTHẨMĐỊNHQUYTRÌNHPHÂNTÍCH 21

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 29

2.1.1Đối tượng nghiên cứu và nguyên liệu 29

2.1.2Dung môi - Hoá chất: 29

2.1.3Thiết bị - Dụng cụ 30

2.1.4Chuẩn bị hóa chất – Chất chuẩn 30

2.2 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 31

2.2.1Kiểm tra độ tinh khiết của chuẩn 31

2.2.2Quy trình định lượng NPX và ESP trong thuốc viên ban đầu 31

2.2.3Khảo sát điều kiện sắc ký 32

2.2.4Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 32

2.2.5Ứng dụng quy trình định lượng 33

2.3 QUYTRÌNHXỬLÝMẪU 33

CHƯƠNG 3:THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 34

3.1 KHẢOSÁTĐIỀUKIỆNSẮCKÝ 34

DANH MỤC VIẾT TẮT

Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

for Harmonisation

Hội đồng quốc tế về sự đồng thuận

chromatography Sắc ký ghép cặp ion

11 LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

anti-inflammatory drug

Thuốc chống viêm không steroid

14 NTP Number Theory of Plate Số đĩa lý thuyết

16 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

18 R2 Coefficient of correlation Hệ số tương quan

nhiễu

21 STP Standard testing procedure Chuẩn làm việc

hydroxide

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát pha động hữu cơ 39

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hệ pha động ACN – Đệm pH 7,6 42

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 43

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 44

Bảng 3.6 Kết quả thu được ở 4 điều kiện sắc ký khác nhau 47

Bảng 3.7 Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống 49

Bảng 3.8 Lượng cân chuẩn bị các dung dịch thẩm định tính đặc hiệu 50

Bảng 3.9 Kết quả thẩm định chỉ tiêu tính đặc hiệu 51

Bảng 3.10 Tóm tắt thể tích hút chuẩn gốc dựng đường chuẩn 51

Bảng 3.11 Kết quả thẩm định chỉ tiêu độ lặp lại của NPX 53

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định chỉ tiêu độ lặp lại của ESP 53

Bảng 3.13 Kết quả thẩm định chỉ tiêu độ chính xác trung gian của NPX 54Bảng 3.14 Kết quả thẩm định chỉ tiêu độ chính xác trung gian của ESP 55Bảng 3.15 Kết quả thẩm định chỉ tiêu độ đúng của NPX và ESP 56

Bảng 3.17 Kết quả ứng dụng quy trình phân tích trên một số mẫu thật 57

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo phân tử Naproxen 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo phân tử Esomeprazole 5

Hình 1.3 Sơ đồ nguyên lý đo phổ UV – Vis 7

Hình 1.4 Hình minh họa của một thiết bị UV-vis chùm tia đơn 8

Hình 1.5 Hình minh họa của một thiết bị UV-vis chùm tia kép 8

Hình 1.6 Hình minh họa của một thiết bị UV-vis nhiều chùm tia 8

Hình 1.7 Bề mặt silica đã thủy phân 11

Hình 1.8 Tạo nhánh trên bề mặt silica 11

Hình 1.9 Cấu trúc của cột ODS 12

Hình 1.10 Cấu trúc cột LC-DB 12

Hình 1.11 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 13

Hình 1.12 Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống máy HPLC 13

Hình 1.13 Tương tác giữa tác nhân ion pair và chuỗi C18 19

Hình 1.14 Sơ đồ các bước thực hiện đề tài nghiên cứu 21

Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn đơn NPX 34

Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn đơn ESP 35

Hình 3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn hỗn hợp 35

Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát cột C18 (250mm x 4,6mm, 5𝝁m) 36

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát cột C18 (150mm x 4,6mm, 5𝝁m) 37

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát cột C8 (150mm x 4,6mm, 5𝝁m) 37

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát pha động hữu cơ (ACN – H2O) 38

Hình 3.8 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động ACN – Đệm pH 7,6 (1) 40

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động ACN – Đệm pH 7,6 (3) 41

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động ACN – Đệm pH 7,6 (4) 41

Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu 43

Hình 3.18 Hình ảnh biểu diễn đường chuẩn của ESP 52

Hình 3.19 Hình ảnh biểu diễn đường chuẩn của NPX 52

MỞ ĐẦU

Naproxen (NPX) là loại thuốc kháng viêm không steroid (NSAID), có tác dụng giảm đau cho các tình trạng bệnh như nhức đầu, đau nhức cơ bắp, viêm gân, đau răng và đau bụng kinh Đồng thời, thuốc giúp giảm đau, sưng và cứng khớp do chứng viêm khớp, viêm bao hoạt dịch và bệnh gút Nó hoạt động bằng cách ngăn chặn cơ thể sản xuất một số chất gây viêm [1]

NPX thường được sử dụng phổ biến hơn axit acetylsalicylic (aspirin) vì sự hấp thu tốt hơn của nó sau khi uống và ít gây ra tác dụng phụ hơn Nó hoạt động bằng cách ức chế cả hai enzym CoX-1 và CoX-2 do đó làm giảm nồng độ prostaglandin [1] Tuy nhiên, prostaglandin được sản xuất bởi enzym CoX-1 và CoX-2, cũng có khả năng bảo vệ dạ dày, hỗ trợ tiểu cầu và đông máu Do đó, sử dụng NPX thời gian dài có thể gây loét dạ dày và thúc đẩy chảy máu sau chấn thương hoặc phẫu thuật [2] Để hạn chế tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa, người bệnh có thể được sử dụng NPX với một trong số các thuốc bảo vệ đường tiêu hóa như: misoprostol, các thuốc ức chế tiết acid, thuốc nhóm ức chế bơm proton PPI (omeprazole, esomeprazole, lansoprazole, rabeprazole) hoặc nhóm đối kháng thụ thể H2 (ranitidine, famotidine ) [3]

Trong số các hoạt chất thuộc nhóm ức chế bơm proton PPI, esomeprazole (ESP) - đồng phân (S) của omeprazole là dược chất được sử dụng rộng rãi trong điều trị kết hợp với NPX do ESP kiểm soát axit hiệu quả hơn omeprazole, ít có sự thay đổi giữa các bệnh nhân, do đó có khả năng cải thiện hiệu quả hơn trong điều trị các bệnh có sử dụng NPX [3] Hiện nay, nhiều công ty đã kết hợp NPX và ESP với các liều lượng khác nhau Do đó, chúng ta cần phát triển phương pháp phân tích đáng tin cậy, chính xác và ổn định để định tính và định lượng đồng thời NPX và ESP trong bào chế dược phẩm.

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Hiện nay đã có một số công bố về nghiên cứu phương pháp phân tích đồng thời NPX và ESP trong dược phẩm, tuy nhiên số lượng phương pháp tham khảo còn hạn chế Quy trình xử lý mẫu tham khảo khi áp dụng trên mẫu thực tế không phù hợp do bản chất mẫu khác nhau, điều kiện môi trường và thiết bị phân tích khác nhau dẫn đến kết quả phân tích không chính xác và không ổn định Do đó, trong nghiên cứu này một số vấn đề đã được khảo sát bao gồm:

˗ Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu cho quá trình phân tích ˗ Khảo sát điều kiện sắc ký

˗ Thẩm định quy trình phân tích

˗ Ứng dụng quy trình vừa phát triển vào việc phân tích một số mẫu thành phẩm Mục tiêu của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp phân tích sử dụng kĩ thuật sắc ký pha đảo (RP-HPLC) đầu dò UV để định lượng đồng thời NPX và ESP trong các chế phẩm dược phẩm một cách đơn giản, nhanh chóng, chính xác, có thể giải quyết vấn đề thực tiễn tại công ty CP Dược phẩm SaVi, bên cạnh đó có thể đóng góp thêm tư liệu trong cơ sở dữ liệu về nghiên cứu và xây dựng phương pháp kiểm nghiệm đồng thời NPX và ESP Cuối cùng, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

đó theo hướng dẫn của Hội đồng quốc tế về sự đồng thuận (ICH) và Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (FDA)

1.1.2 Cấu trúc và tính chất của Naproxen

Hình 1.1 Công thức cấu tạo phân tử Naproxen Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của Naproxen

1.1.3 Tác dụng dược lý của Naproxen

Naproxen là một thuốc chống viêm không steroid dẫn xuất từ acid propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm và ức chế tiểu cầu kết dính Nhìn chung tác

dụng chống viêm, giảm đau của narproxen là do ức chế tổng hợp prostaglandin trong các mô của cơ thể bằng cách ức chế cyclooxygenase (CoX), một enzym xúc tác tạo thành các tiền chất prostaglandin (endoperoxid) từ acid arachidonic Do thuốc ức chế lên cả 2 loại cyclooxygenase 1 và 2 (CoX-1 và CoX-2) nên có tác dụng không mong muốn giống aspirin và các thuốc chống viêm không steroid khác [5] Tuy nhiên, mức độ ức chế ưu tiên lên CoX-2 mạnh hơn CoX-1 so với aspirin, indomethacin nên một số tác dụng không mong muốn của thuốc trên đường tiêu hoá ít hơn Để có tác dụng chống viêm hoặc giảm đau, nồng độ naproxen huyết tương cần có 30 - 90 𝜇g/ml Giảm đau có thể bắt đầu trong vòng 1 giờ sau khi uống naproxen (viên thông thường) và trong vòng 30 phút sau khi uống naproxen natri Thời gian tác dụng của cả 2 loại thường là 7 - 12 giờ Do hấp thu chậm, viên bao giải phóng chậm cũng giảm đau chậm hơn

Viên naproxen sodium 220, 275 hoặc 550 mg xấp xỉ tương đương với viên naproxen 200, 250 hoặc 500 mg, tương ứng Liều lượng phải được điều chỉnh cẩn thận tuỳ theo nhu cầu và đáp ứng của từng người bệnh, phải dùng liều thấp nhất mà có hiệu quả Cần phải cân nhắc dùng liều thấp hơn đối với người suy thận, suy gan hoặc người cao tuổi

Người lớn: Liều thông thường naproxen: 250 - 500 mg, ngày uống 2 lần, sáng và chiều Một cách khác, 250 mg uống buổi sáng và 500 mg uống buổi chiều Liều sau phải điều chỉnh tuỳ theo đáp ứng và dung nạp của người bệnh đối với thuốc 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ESOMEPRAZOLE

1.2.1 Giới thiệu chung

Esomeprazole magnesium được biết đến về mặt hóa học là 5-metoxy-2 - {(S) - [(4-metoxy-3,5-đimetyl-2-pyridyl) methyl] sulfinyl} benzimidazole magie trihydrate Đây là chất ức chế bơm proton đầu tiên được phát triển như một đồng phân quang học duy nhất để điều trị các bệnh liên quan đến axit thông qua việc ức chế H + / K + -ATPase trong tế bào thành dạ dày Bằng cách ức chế hoạt động của enzym này, thuốc ngăn ngừa sự hình thành axit dịch vị [9, 10].

1.2.2 Cấu trúc và tính chất của Esomeprazole

Hình 1.2 Công thức cấu tạo phân tử Esomeprazole Bảng 1.2 Một số tính chất vật lý của Esomeprazole

1.2.3 Tác dụng dược lý của Esomeprazole

Esomeprazole được kết hợp với thuốc kháng sinh, clarithromycin và amoxicillin (hoặc metronidazole ở những bệnh nhân quá mẫn cảm với penicillin) trong liệu pháp bộ ba tiệt trừ Helicobacter pylori trong 7-14 ngày [9] Nhiễm H pylori là yếu tố gây bệnh trong phần lớn các trường hợp loét dạ dày tá tràng Các tác dụng phụ thường gặp của Esomeprazole bao gồm nhức đầu, tiêu chảy, buồn nôn, đầy hơi, giảm cảm giác thèm ăn, táo bón, khô miệng và đau bụng Các tác dụng phụ nghiêm trọng hơn là phản ứng dị ứng nghiêm trọng, đau ngực, nước tiểu sẫm màu, tim đập nhanh, sốt, dị cảm, đau họng dai dẳng, đau dạ dày nghiêm trọng, bầm tím hoặc chảy máu bất thường, mệt mỏi bất thường và vàng mắt hoặc làn da Thuốc ức chế bơm proton có thể làm tăng nguy cơ gãy xương hông và tiêu chảy do Clostridium [9, 10]

Esomeprazole có những ưu điểm hơn omeprazole về các đặc điểm dược động học và ức chế axit Thuốc được sử dụng trong quản lý bệnh nhân trào ngược dạ dày

thực quản, viêm thực quản trào ngược ăn mòn và loét dạ dày tá tràng Thuốc là một bazơ yếu tập trung trong ngăn chứa axit của ống tiết của thành tế bào nơi nó trải qua quá trình chuyển đổi có xúc tác axit thành một sulphenamide cation axit tetracyclic achiral Sau đó, chất này phản ứng với các cystein cụ thể dẫn đến sự ức chế enzym H + / K + - ATPase [11]

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

 Phổ UV – Vis

Phổ UV-VIS là phổ sinh ra do vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ [12]

 Nguyên tắc phép đo phổ UV – Vis

Khi chiếu một chùm sáng có bước sóng phù hợp đi qua một dung dịch chứa chất cần phân tích, các phân tử hấp thụ sẽ hấp thụ một phần năng lượng chùm sáng, một phần ánh sáng truyền qua dung dịch Xác định cường độ chùm ánh sáng truyền qua đó ta có thể xác định được nồng độ của dung dịch Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch tuân theo định luật Bughe – Lambert – Beer [12,13]:

A= ε.c.d Trong đó:

 ε là độ hấp thụ mol

 d được biểu thị bằng cm  c được biểu thị bằng mol/ l

Độ hấp thụ của dung dịch chất tan ở nồng độ 1 % (kl/tt) hay 10 g/l trong một cốc đo có chiều dày 1 cm và đo ở một bước sóng xác định là độ hấp thụ riêng của chất tan và được ký hiệu là A (1 %, 1 cm) Độ hấp thụ riêng của chất tan được tính bằng công thức [12,13]:

A (1 %, 1 cm) = (10 x ε)/M Trong đó:

 M là khối lượng phân tử của chất thử Độ hấp thụ riêng của một chất trong một dung môi xác định và đo ở một bước sóng xác định là một đặc tính của chất đó Trừ những chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, người ta đo độ hấp thụ ở độ dài sóng quy định và sử dụng quang trình dài 1 cm ở 19 °C đến 21 °C Các phép đo được tiến hành so sánh với dung môi hoặc với hỗn hợp dung môi đã dùng để chuẩn bị mẫu thử Độ hấp thụ của dung môi hoặc hỗn hợp dung môi đó đối chiếu với không khí không được vượt quá 0,4 và tốt nhất là dưới 0,2 Khi vẽ phổ hấp thụ, đặt độ hấp thụ hoặc hàm so của độ hấp thụ trên trục tung và đặt độ dài sóng hoặc hàm số của độ dài sóng trên trục hoành Khi một chuyên luận riêng đưa ra một trị số riêng lẻ cho vị trí của một cực đại, điều này được hiểu là trị số khảo sát được có thể lệch không quá ± 2 nm

Hình 1.3 Sơ đồ nguyên lý đo phổ UV – Vis

Thiết bị UV – VIS bao gồm nguồn sáng (light source) (thường là đèn đơteri hoặc đèn vonfram), giá giữ mẫu và đầu dò (detector), bộ phận tạo tia đơn sắc (monochromator) (Hình 1.3) Điều khiển chùm tia đơn (Hình 1.4) có một bộ lọc hoặc một bộ đơn sắc giữa nguồn và mẫu để phân tích một bước sóng tại một thời điểm Dụng cụ chùm tia kép (Hình 1.5) có một nguồn đơn và bộ đơn sắc, sau đó có một bộ tách và một loạt gương để đưa chùm tia tới mẫu chuẩn và mẫu được phân tích, điều này cho phép đọc chính xác hơn Ngược lại, thiết bị nhiều chùm tia (Hình 1.6) không có bộ đơn sắc giữa mẫu và nguồn Thay vào đó, thiết bị nhiều chùm tia có một bộ dò dãy diode cho phép thiết bị phát hiện đồng thời độ hấp thụ ở tất cả các bước sóng, đo đồng thời thường nhanh hơn và hiệu quả hơn nhiều [14]

Hình 1.4 Hình minh họa của một thiết bị UV-vis chùm tia đơn

Hình 1.5 Hình minh họa của một thiết bị UV-vis chùm tia kép

Hình 1.6 Hình minh họa của một thiết bị UV-vis nhiều chùm tia

1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.4.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [15]

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu [15, 16, 17]:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Hình 1.7 Bề mặt silica đã thủy phân

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào

Hình 1.8 Tạo nhánh trên bề mặt silica

Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3

Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.9 Cấu trúc của cột ODS

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether C18) ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa

(-O-Si-Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là số đĩa lý thuyết giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping) Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính base (cột LC-DB của hãng SUPELCO)

Hình 1.10 Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn

hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích

Hình 1.11 Cấu trúc cột có gốc isopropyl.

Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất

phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity)

Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1-13 Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và baz mạnh

1.4.4 Hệ thống máy HPLC

Hệ thống máy HPLC được minh họa dưới đây (Hình 1.12) [18, 19]:

Hình 1.12 Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống máy HPLC

 Pump (bơm)

Một máy bơm áp suất cao (hệ thống vận chuyển dung môi) được sử dụng để tạo và đo tốc độ dòng của pha động, thường là mililit trên phút Bơm hút pha động từ bình chứa dung môi và ép nó vào cột và sau đó chuyển đến đầu dò Áp suất vận hành phụ thuộc vào kích thước cột, kích thước hạt, tốc độ dòng chảy và thành phần của pha động Tốc độ dòng chảy bình thường trong HPLC nằm trong khoảng 1 đến 2 ml/ phút Máy bơm điển hình có thể đạt áp suất trong khoảng 6000-9000 psi (400 đến 600 bar)

 Injector (bộ tiêm mẫu)

Một bộ tiêm mẫu (bộ tiêm mẫu bằng tay hoặc bộ lấy mẫu tự động) có thể đưa hoặc bơm mẫu vào dòng pha động liên tục chảy mang mẫu vào cột HPLC Một van quay tiên tiến mới và kim phun vòng có thể được sử dụng để có thể tạo ra các kết quả lặp lại Thể tích mẫu điển hình là 5 đến 20 microlit (μl)

 Column (cột)

Đây là nơi mà sự phân tách thực sự diễn ra Cột chứa vật liệu sắc ký cần thiết để gây ra tác dụng phân tách Vật liệu này được gọi là pha tĩnh vì nó được giữ cố định bởi cột phần cứng Nó là ống thép không gỉ có chiều dài 5-25 cm và đường kính trong 4,6 mm Chất liệu đóng gói là bề ngoài xốp hoặc hoàn toàn xốp

 Detector (đầu dò)

Đầu dò có thể xác định (phát hiện) các phân tử riêng lẻ đi ra (rửa giải) từ cột Một đầu dò dùng để đo lượng của các phân tử đó để nhà hóa học có thể phân tích định lượng các thành phần mẫu Đầu dò cung cấp đầu ra cho máy ghi hoặc máy tính để tạo ra sắc ký đồ (tức là đồ thị phản ứng của máy dò)

Có một số cách để phát hiện khi một chất đã đi qua cột Nói chung, quang phổ UV được đính kèm để phát hiện các hợp chất cụ thể Nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ tia cực tím có bước sóng khác nhau Lượng ánh sáng được hấp thụ sẽ phụ thuộc vào lượng của một hợp chất cụ thể đang đi qua chùm tia tại thời điểm đó

 Data aquisition (phân tích dữ liệu phổ)

Đầu ra được ghi lại dưới dạng một loạt các đỉnh, mỗi đỉnh đại diện cho một hợp chất trong hỗn hợp đi qua máy dò và hấp thụ ánh sáng UV Diện tích dưới đỉnh tỷ lệ với lượng chất đi qua máy dò và diện tích này có thể được tính toán tự động bằng máy tính liên kết với màn hình

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NPX VÀ ESP

Bảng 1.3 Tổng hợp một số nghiên cứu phân tích đồng thời NPX và ESP

TLTK/Năm

xuất bản

Nhóm

[20]/ 2011

Nitesh Jain và cộng sự

HPLC

RP-˗ Cột: C18 (150mm x 4,6mm, 5𝜇m) ˗ Pha động: ACN –

đệm phosphate 7,0 (50:50, v/v)

˗ Bước sóng: 300 nm ˗ Tốc độ dòng: 0,5 ml/

phút

˗ Chế độ: Đẳng dòng

˗ trNPX = 2,67 ˗ trESP = 5,65 ˗ Khoảng nồng độ

tuyến tính: 50 – 250 𝜇g/ ml cho NPX và 2 – 10 𝜇g/ ml cho ESP với r2

tương ứng lần lượt là 0,999 và 0,998 ˗ Độ thu hồi của

NPX và ESP tương ứng là 100,01% và 97,76% với RSD thấp hơn 2%

[21]/ 2014

Deshpande và cộng sự

HPLC

RP-˗ Cột: C18 (250mm x 4,6mm, 5𝜇m)

˗ trNPX = 6,143 ˗ trESP =3,050

˗ Khoảng nồng độ tuyến tính: 50 –

˗ Pha động: ACN – đệm phosphate 7,0 (60:40, v/v)

˗ Bước sóng: 244 nm ˗ Tốc độ dòng: 1,0 ml/

phút

˗ Chế độ: Đẳng dòng

100 𝜇g/ ml cho NPX và 2 – 30 𝜇g/ ml cho ESP với r2

tương ứng lần lượt là 0,999 và 0,998 ˗ Độ thu hồi của

NPX và ESP tương ứng là 99,86% và 99,72% với RSD thấp hơn 2%

[22]/ 2014

Mahesh HRK và cộng sự

HPLC

RP-˗ Cột: C18 (150mm x 4,6mm, 3,5𝜇m) ˗ Pha động: gồm dd A

(đệm pH 6.5 gồm Ammonium hydrgen phosphate và 1-hexane sulphonic acid sodium) và dd B (gồm ACN–

Isopropanol tỉ lệ 90:10)

˗ Bước sóng: 302 nm ˗ Tốc độ dòng: 0,7 ml/

phút

˗ Chế độ: Gradient

˗ trNPX = 29 ˗ trESP= 46

˗ Khoảng nồng độ tuyến tính: 4,621 – 99,026 𝜇g/ ml cho NPX và 0,254 – 3,806 𝜇g/ ml cho ESP với r2 cả hai chất là 0,999 ˗ Độ chính xác thể

hiện qua RSD thấp hơn 2%

[23]/ 2014

R Kayesh và cộng

sự

IPC HPLC

-˗ Cột: C18 (250mm x 4,6mm, 3,5𝜇m) ˗ Pha động: ACN–

MeOH– đệm 7,6 có

˗ trNPX = 5,122 ˗ trESP= 6,921

˗ Khoảng nồng độ tuyến tính: 30,0 –

bổ sung tác nhân ion pair tỉ lệ 20:20:60 v/v ˗ Bước sóng: 290 nm ˗ Tốc độ dòng: 1,5 ml/

phút

˗ Chế độ: Đẳng dòng

200,0 𝜇g/ ml cho NPX và 3,0– 50,0 𝜇g/ ml cho ESP với r2 tương ứng cho cả hai chất là 0,999

˗ Độ thu hồi của NPX và ESP tương ứng là 99,70% và 102,28% với RSD thấp hơn 2%

[24]/ 2016

D M Shrestha

và cộng sự

HPLC

RP-˗ Cột: C18 (250mm x 4,6mm, 5𝜇m) ˗ Pha động: ACN–

MeOH– đệm ammonium acetate pH 3,8 tỉ lệ 44:11:45 v/v

˗ Bước sóng: 228 nm ˗ Tốc độ dòng: 1,0 ml/

phút

˗ Chế độ: Đẳng dòng

˗ trNPX = 6,60 ˗ trESP= 3,69 ˗ Khoảng nồng độ

tuyến tính: 2,0 – 12 𝜇g/ ml cho NPX và ESP với r2tương ứng lần lượt là 0,9988 và 0,995 ˗ Độ thu hồi của

NPX và ESP tương ứng là 99,70% và 102,28% với RSD thấp hơn 2%

Dựa trên Bảng 1.3 có thể thấy mỗi phương pháp được đề xuất đều có những

ưu nhược điểm khác nhau, tuy nhiên điểm chung có thể thấy ở các phương pháp trên là:

˗ Hệ pha động phức tạp hoặc chưa bổ sung tác nhân ion pair

˗ Đệm phosphate thường được sử dụng, lâu ngày có thể nhanh chóng làm giảm hiệu năng của cột

˗ Chỉ sử dụng cột C18 chưa thử nghiệm qua cột C8

˗ Bước sóng khảo sát hầu hết ở vùng 270 – 310 chưa có nhiều nghiên cứu ở vùng 220 – 240 nm

1.6 TỔNG QUAN VỀ KĨ THUẬT SẮC KÍ PHA ĐẢO GHÉP CẶP ION 1.6.1 Định nghĩa

Sắc ký cặp ion (Ion pair chromatography – IPC) được sử dụng để tách các chất phân tích ion trên cột trong RP - HPLC Sắc ký này dựa trên việc bổ sung các hợp chất ion (Ion pair - thuốc thử cặp ion) ghép cặp ion với chất phân tích Hình 1.13 trình bày ví dụ bổ sung chất ghép cặp ion (-) vào pha động để thúc đẩy sự hình thành các cặp ion với chất phân tích ion (+) trong mẫu để điều chỉnh việc lưu giữ các chất phân tích ion Sự gia tăng tính chất kỵ nước của cặp ion (trung hòa về điện) dẫn đến tăng độ phân giải mẫu Đầu dò UV được sử dụng rộng rãi Do đó thuốc thử cặp ion phải không hấp thụ tia cực tím để phát hiện các mẫu có độ nhạy cao Sự hấp thụ tia cực tím của natri ankan sulfonat và muối amoni bậc bốn là tối thiểu để những thuốc thử này có thể được sử dụng trong phương pháp HPLC-UV cho kết quả phân tích đáng tin cậy [25]

Hình 1.13 Tương tác giữa tác nhân ion pair và chuỗi C18

Ban đầu, sắc ký ghép cặp ion (IPC) được phát triển từ phương pháp chiết xuất dung môi gọi là chiết xuất ghép cặp ion Phương pháp chiết xuất này đòi hỏi phải chiết xuất lớp dung môi hữu cơ sau khi đưa những đối ion mang điện tích trái dấu vào nước có chứa sẵn các hợp chất ion để tạo thành các cặp ion và trung hòa toàn bộ điện tích dung dịch.

Mục đích của việc thêm thuốc thử cặp ion vào pha động thường là để thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ion Bằng cách thay đổi nồng độ pha động của thuốc thử cặp ion, hệ số lưu giữ của chất phân tích đơn tích điện trái dấu có thể liên tục tăng thêm 10 - 20 lần so với giá trị mà không thêm thuốc thử cặp ion Tương ứng, có thể giảm liên tục hệ số lưu của chất phân tích đơn tích điện tương tự đến 10 – 20lần Hệ số lưu giữ đối với chất phân tích không tích điện thường ít nhiều không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của thuốc thử cặp ion [26]

1.6.2 Cơ chế lưu giữ IPC

Cơ chế lưu giữ có thể được giải thích theo ba mô hình [27]

Thứ nhất là “mô hình ion ghép cặp”: Thêm các đối ion vào hợp chất ion có sẵn để tạo thành các cặp ion nhằm làm giảm độ phân cực và gia tăng lực lưu giữ chất Điều đó có nghĩa là, các ion ghép cặp (các đối ion) làm trung gian điều phối giữa pha tĩnh không phân cực và các mẫu cần phân tích mang tính ion

Muối alkyl sulfonate thường được sử dụng làm chất ghép cặp ion đối với những hợp chất có tính base Tetralkyl ammonium thường được dùng làm ion ghép cặp với những hợp chất mang tính acid

Thứ hai là “mô hình ion thay thế”, ban đầu những phần không phân cực của đối ion được hấp phụ lên trên phần pha tĩnh nhồi trong cột để tạo thành các bề mặt mang ion nhằm lưu giữ mẫu bằng cách thay thế ion

Sau cùng là “mô hình ion tương tác” là mô hình mà phạm vi ứng dụng của nó rộng hơn so với cả hai kiểu mẫu kia Mô hình này quan tâm đến cân bằng động, bao gồm những hiệu ứng không chỉ từ lực tĩnh điện mà còn từ lực hút và đẩy của pha tĩnh và của pha động

Nhưng cũng có một số hiện tượng không thể giải thích bằng 3 mô hình này mà phải sử dụng đến những kiểu mẫu khác để giải thích

1.7 TỔNG QUAN VỀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Dựa trên những so sánh trong Bảng 1.3 – Tổng hợp một số nghiên cứu phân tích đồng thời NPX và ESP có thể thấy việc phát triển phương pháp để phân tích

đồng thời NPX và ESP trong mẫu dược phẩm trong những năm qua vẫn là một hướng đi được quan tâm và tiếp tục nghiên cứu do tính ứng dụng thực tiễn của nó trong quy trình kiểm nghiệm dược phẩm đảm bảo chất lượng thuốc đến tay người tiêu dùng là thuốc đạt chất lượng đã công bố

Tuy nhiên mỗi phương pháp vẫn có những ưu nhược điểm khác nhau và số lượng nghiên cứu còn hạn chế Do đó để đa dạng hóa và có nhiều phương pháp phù hợp hơn trong việc ứng dụng phương pháp kiểm nghiệm cho các doanh nghiệp sản xuất dược có điều kiện thiết bị kiểm nghiệm khác nhau hay nền mẫu khác nhau cần có thêm nhiều nghiên cứu, vì vậy trong nghiên cứu này hướng đến việc mở rộng thêm dữ liệu các phương pháp phân tích đồng thời NPX và ESP, tối ưu hóa điều kiện phân tích và có thể dễ dàng ứng dụng trên các nền mẫu khác nhau

Quy trình thực hiện đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:

1.8 TỔNG QUAN THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Thẩm định phương pháp phân tích để đảm bảo phương pháp phân tích phù hợp với các yêu cầu đã được xác định trước và luôn tạo ra các kết quả phân tích tin cậy

Thẩm định phương pháp phân tích chỉ ra cách tiến hành phân tích, trong đó mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện từng phép thử phân tích Quy trình có thể bao gồm cách pha mẫu thử, mẫu chuẩn và thuốc thử, cách sử dụng thiết bị, cách thiết lập đường chuẩn, sử dụng công thức để tính kết quả

Tính tương thích hệ thống

Độ đặc hiệu

Tính tuyến tính

Độ chính xác

Thẩm định quy trình phân tích

Khảo sát cột sắc ký

Khảo sát pha động

Khảo sát bước sóng

Khảo sát tốc độ dòng

Khảo sát thể tích tiêm mẫu Tìm Tài liệu tham

khảo

Khảo sát điều kiện sắc kí

Hình 1.14 Sơ đồ các bước thực hiện đề tài nghiên cứu

Các chỉ tiêu cần thẩm định đối với mỗi quy trình theo hướng dẫn của ICH được thể hiện trong Bảng 1.4 [30]:

Bảng 1.4 Các chỉ tiêu cần thẩm định đối với mỗi quy trình

Các yêu cầu thẩm định với

(3): Có thể cần trong một số trường hợp

 Tính tương thích hệ thống

Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều phương pháp phân tích Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định

 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất nền Một quy trình phân tích kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng một hoặc nhiều quy trình phân tích khác Định nghĩa này có liên quan đến các phép thử sau:

 Định tính là để khẳng định sự có mặt của chất phân tích

 Thử tinh khiết là để khẳng định tất cả các quy trình phân tích cho phép xác định chính xác hàm lượng tạp chất trong chất phân tích ví dụ như phép thử tạp chất liên quan, kim loại nặng, hàm lượng của dung môi tồn dư

 Định lượng (hàm lượng hoặc hoạt lực) là đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng hoặc hoạt lực của chất phân tích trong mẫu thử

 Độ chính xác

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất Tuy nhiên, nếu không có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc một dung dịch mẫu thử Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ dao động, độ lệch chuẩn hoặc hệ số độ dao động của một loạt phép đo

 Độ lặp lại (Repeatability)

Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Độ lặp lại còn được gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng

- Thực hiện xác định trên 6 mẫu thử Tính hàm lượng dược chất trong 6 mẫu thử trên Từ các hàm lượng (%) thu được của 6 mẫu, tính độ lệch chuẩn tương đối với độ tin cậy P = 95 % theo công thức:

- Công thức tính độ lệch chuẩn tương đối

nSDxt X

Xi: Là giá trị đo được thứ i : Là giá trị trung bình

n: Số lần đo

t: t (5;5%) = 2,015

 Tính hàm lượng so nhãn của từng dược chất trong 6 mẫu thử trên

 Công thức tính hàm lượng NPX (C14H14O3) và ESP (C17H19N3O3S) có trong viên so với hàm lượng ghi nhãn [28, 29]:

Pt (%) =

St  Mc  Dt  Mtb  Pc  100  N Mr1

Sc  Mt  Dc  HLN  100  Mr2

Trong đó:

Pt (%) : Hàm lượng (%) dược chất có trong viên so với lượng ghi nhãn

St, Sc : Diện tích pic dược chất trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn Mc, Mt : Khối lượng cân mẫu chuẩn, thử (mg)

X

Dt, Dc : Độ pha loãng của dung dịch thử, dung dịch chuẩn (ml) Mtb : Khối lượng trung bình viên (mg)

Pc : Hàm lượng chuẩn dược chất nguyên trạng (%) HLN : Hàm lượng dược chất ghi nhãn (mg)

N : Tỉ lệ số mol quy đổi

Mr1 : Khối lượng phân tử dược chất Mr2 : Khối lượng phân tử chất chuẩn

 Độ chính xác trung gian (Intermediate precision)

Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau

 Độ tái lặp (Reproducibility)

Độ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm ( Các nghiên cứu phối hợp giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩn hoá phương pháp)

 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết để có thể định lượng được

˗ Giới hạn phát hiện có thể được xác định dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của phương trình hồi quy, giá trị LOD được tính như sau: LOD = 3,3  SD/ a