báo cáo thực hành thiết bị và kt cnsh

Dong vai tro chuyén đối dòng điện xoay chiều 220V thành dòng điện một chiều với nhiều mước điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị.. Bộ phận gia nhiệt hay đư

Ma mon hoc GVHD Nhóm thực hiện Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : THIẾT BỊ VÀ KT CNSH :211402

: TS HUỲNH VĂN BIẾT : NHÓM 1

: 2021-2025

TP Thủ Đức, Tháng 10 năm 2023

BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

BO MON CONG NGHE SINH HOC

BAO CAO THUC HANH THIET BI VA KT CNSH

TP Thủ Đức, Tháng 10 năm 2023

MUC LUC

Trang

MUC LUC ooocecccccccccccccecescsseseecesssssessesusessaseseevesasetsassssssasasitessasissevaasitvasatseeseacatesesseneaeeees i DANH SÁCH HÌNH ẢNH - S1 2222212121 11151 111111111 21111111210111 011015110 Ha v DANH SACH BANG W o.c.cccscesecssssssssssecucstvessceasesetuseasusseausstsaasiteasssiteneasitiesitsseneaeaees vii BAI 1 CAU TAO VA NGUYEN LY HOAT CUA MAY PCR VA REAL - TIME PCR

LL Cau tao may PCR o.eccccccccccseccsesceseceesssssseeesetsesesssseasstesvasstsatacstiteesitsecreeseteeeatseaeanes 1 1.1.1 Máy PCR cô điển 1S S123 11211118151 111111112111111111011101 0101128101 gà 1 1.1.2 Cau tao may PCR hién daii c.ccccccccccccceseccssssesesesssesacsseceeeeseetsasstetereecitesesstereaeates 1

1.1.3 Nguyén ly hoat déng may PCR TQ TT TS SH HH TT TT Tnhh kh ky 3 1.2 May Realtime PCR .A TA ố 3 1.2.1 Cau tao may Realtime PCR o cccccccccccccsesesesssssesesesescuteassssteecacetetsesssereecatitesanseens 3 1.2.2 Nguyên lý hoạt động của máy Realtime PCR nhe 4 1.2.3 Máy Realtme PCR Rotor- Gene Ô nọ nKEp 5 1.2.4 Nguyên lý hoạt động của máy Realtime PCR Rotor- Gene Q 5 1.2.5 Đọc kết quả của máy Real time PCR -.- - 1 2t S21212111 1215111111111 811 re 5 1.3 Một số dụng cụ khác trong PCR và Realtime PCR - ca 7

BAI 2 THUC HANH KY THUAT PCR .ececcescececeeeeseeeeeeeeseeieeeeeseeeeeesneseieesentieitenstenten 8 2.1 Giới thiệu về kỹ thudt PCR cccccccccccccscsesescscesseseseececeeeseeasstsecaestiseesessecreatteseeteeens 8 2.2 Quy trình, vật liệu và thiết bị - + 2 121 S 191231115151 12181111122121 2210111111111 te 8

Ca an cố ố ố ố .ẻ 8 2.2.2 Tính toán số liệu - c T2 1112111231551 1151 1 131111111511 11111111 1111111111111 E 1111 xxx k Hy sec 8

2.2.3, Quy trish ee ai 9

BÀI 3 THỰC HÀNH ĐIỆN DĨ L5 E222 21213515151 112115151511111511115111 181811 yeu 10 3.1 Giới thiệu kỹ thuật điện di - 2c 2E S121 S 1E1112111 1215111111 111115121 2110181111 rk 40

3.2 Vat Ldu nghién CUU «da 10

3.3 Cac burdc tién ham an sa 11 3.4 Quan sát kết quả và giải thích : 222221111 1 515123 1518151 121111111 181511 18111 de 11

Bài 4 THIẾT KẾ PRIMER 22 S113 E1 2125 18181 E32155151211815121011111 1815112 E101 y6 13 4.1 Tống quan - 5+ c2: 2121111111321 1112111 1118111111111 2111111111011111 1011111010111 511 Hư 13 4.2 Nguyên tắc thiết kế PFÏff@rr ¿+ 2c S1 12212123 151812321115111 1515111111111 111 gxe 13 4.3 Quy trình thiét ké Primer bang phan mềm Bioedit 5-5252 S22 cexss2 14 4.3.1 Chuẩn bị trình tự khuôn mẫU 2-2222 552223232328 EE2EE22EEEEEESEsEerrrsrrrrxra 14 4.3.2 Tiến hành thiết kế primer bằng phan mềm Bioedit 5222 sec se 15 4.3.3 Trình tự primer thiết kế - + 2 22 1S EE E151 1112311125125 155 2111181 1E tre 17

K Nuuyoềẻềaéặẽạa5ä$°ỪỪO 17 BÀI 5 GIẢI TRÌNH GENE -.- L1 2 2S 12121212111 51515111181111112111 0181110121111 2 818g rng 18

5.1 TỐng quan - 222C 2122 31111325115123 1118151 1111111 11151 111011111 1111 111010101011 111110 HH ng 18 5.2 Các loại phương pháp giải trình tự Øð€fl€ - 223 S2 ST kg 18

5.2.1 Phương pháp giải trình tự thế hệ thứ nhất ¿ 5: 2222 S+*+E£z£zE+ez£zxzx+zrred 18

5.2.1.1 Phuong phap Maxam — CHỈb€F à LH HS HS Tnhh 18 5.2.2 Phương pháp giải trình tự thế hệ thứ hai - +52 222222 S2*+*£2£22E+E£zxeererecss 20

5.2.3 Phương pháp giải trình tự thế hệ thứ ba ¿5-2225 S*S2£E+E2E+zE£EeEerrseseed 22

5.3 Quy trình giải trình tự gene bằng phần mềm Bioedit 5-2 5252 22s sa 23 5.3.1 Quy tri e aaa Ẽ.Ẽ.Ẽ ốốốố 23

5.3.2 KẾT QUả 2S 2.221 12121211112111 1111112111111 2811111 111111101 1010111011111 1121111 Hài 31

ca na 32 BAI 6 CAU TAO VA NGUYEN LY HOAT DONG HE THONG VI THAO TAC 33

DANH SACH CAC TU VIET TAT

ATP Adenosine triphosphate

Bp Base pair

DEPC Diethyl pyrocarbonate

dNTP Deoxy nucleotide triphosphate

ddNTP Dideoxy nucleotide triphosphate

DNA Deoxyribonucleic acid

dsDNA Douple strand deoxyribonucleic acid

EtBr Ethium Bromide

DANH SACH HINH ANH

Trang Hinh 1 1 May PCR 66 dit ccccccccccseccscssecesesssseecessssesecasseeassssececatitsesessscreesitetcatseaeanes 1

Hình 1 2 Máy PCR hiện đại - 0222200222 12211 111115111 1111k k nghe nh như, 1 Hình 1 3 Sò nóng lạnh c S222 1S TS TS TK TT KT kh KH 2 Hình 1, 4, May Real-time PCR - LH nn HT HH Hn TT TH TK KH gà kk kh 3

Hình 1 5 Máy Rotor-Gene Ô LH nH HH TT TH KT TT KH khu 5 Hình 1 6 Sơ đồ biêu diễn kết quả 5 2222 2122 2222E212523 1815122115115 E811 281515 E1 EteE 6

Hình 1 7 Tube dùng cho máy PCR -L ànL HH HH HT HT TT ETTt 7 Hình 1 8 Tube dùng cho máy Real-time PCH Q2 HT ke 7

Hinh 3 1 Két qua dig) dino ccccccecccccccccscceeesseceeeecsteseecassesasetsteeesiteesesesereatiteteatenens 11

Hình 4 1 Tải trình tự - L TQ 2n ĐH Ỳ ST HH TT KT TK kk TT ch 14 Hình 4 2 Mở trình tự - - LL CC Q1 HH ST TT HH TT TT TK TT ch 15 Hình 4 3 Copy đoạn trình tự 0S SSSSnSSSns TS TT TT ng KH ky 15 Hinh 4 4 ClustalW so sánh 2 trình tự - -cc- c ST SSn SH HS SH ng ky kh ra 16 Hình 4 5 So saénh hat trink tu 0 cc ccc cecccccececeeeeeeeeeeeaeeeeeueeeeaeseeeaaeeseaeeeeaeeeneeeeeneenees 16 Hình 5 1 Máy giải trình tự GS Junior phương pháp Pyrosequencing 20 Hình 5 2 Máy lon torrent PGM Dx system phương pháp lon torrent 21 Hình 5 3 Nguyên lý hoạt động của phương pháp lon †orrenf -cccccccssscs: 21 Hình 5 4 Máy Pacbio Sequel phương pháp Single molecule realtime 22 Hình 5 5 Máy MinION phương pháp Oxford nanopore -‹ các: 22 Hình 5 6 Các bước mở file trình tự Q@f@ - 0111 1n nà 23 Hình 5 7 Trình tự sau khi mở - - C1222 11Y SH HH ST HT TY HT chà 23 Hình 5 8 Quá trình thực hiện các bước dán G-R và G-ƑF c2 24 Hình 5 9 Quy trình reverse G-lR -c TS SH HH TT TT TH TK TT TT KH TT KE* 25

Hình §, 10 Quy trinh céc buéc so sanh trinh ty G-F va G-R oc eeeeeeeee teens 26

Hình 5 11 Két qua sau khi Run ClustalW 0.0ccccccccccccceceesesecesessscesesseteeetssereneaees 26

Hinh 5 12 Két quả trinh tur duoc so sanh ccc eeeeeeeeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeseeeeeeeasaaeeeeeeeees 26

Hình 5 13 So sánh tín hiệu giữa các trinh tu aU .cccccceccecececeeeseceseseeeeeeeteeeeenees 27 Hình 5 14 So sánh tín hiệu giữa các trình tự Cuối 5-2 5-5 2222222222 cersrei 27 Hình 5 15 Kết quả so sánh xác định priimer - ¿5:5 2222 £+E2E+2E£E£EEzxzxxrrersee 28 Hình 5 16 Kết qua so sánh trình tự giữa primer F và G-R .- 2-7 -c+c+cccce2 28 Hình 5 17 Kết qua so sánh trình tự primer F với G-R -5- S2 S22 2cc+xszxexsez 29

Hình 5 18.Quy trình các bước tra cứu tên loài từ trình từ đã giải - - 31

Hình 5 19 Kết quả sau tra cứu trình tựy ¿+ 1t S113 12123 12521125 E1 E11 E111 8111111 set 31

;¡1 8008 8 32

Hình 6 1 Kính hiển vi soi ngưỢC S122 2S 121321518155 11 15121 111111111 251115111111 xy6 33

Hình 6 2 Hệ thống vi tiêm . - CS: SE S222 E2E25151815321112111 15151 11111111011 1151 8 cey 34

Hình 6 3 Bộ phận chỉnh tỉnh . Q0 0000001111111 11 111 H1 TH TT nhe nhe 34 Hình 6 4 Bộ phận chỉnh tỉnh . - - Q00 0000001111111 11 111 TH TH n nh Tnhh nhe nhe 35 l§Ìì.) 0 S19 2v 0ììin nIẠỤỌỤỌỤỌỤỌỤỌỤẠỤIẠỤIẠIỘỤIỘỤỘIỘẦ 35 si) 6ì 2‹0‹ 8 .ỒỐố 36 Isi0:Ì:8 NV /Lìái2i8eaaiaiẠđỔiiaiiắiẳẳẳ 37 Hình 6 8 Vi tiêm được quan sát đưới kính hiến vi - 2522 2c+c+zc2£z+zszxzxssz 37

vi

DANH SACH BANG

Trang

Bang 2 1 Thanh phan cho phan tng PCR .c.cccccccesesessssecesesceteeseseseseeestetestetsneeeaees

Bảng 2 2 Chu trình nhiệt cho phan ung cece ceeeeeeecceeeeeeeeeeeescceeeseeeeteneeeaees 9

Bảng 5 1 Tên hóa chất và dạng biến đồi . - 2-2 1222 SE212523 1212121151221 2xe 19

Bảng 5 2 Bảng mô tả loài của Candidatus Liberibacter asiaticus 32

vil

BAI 1 CAU TAO VA NGUYEN LY HOAT CUA MAY

PCR VA REAL - TIME PCR

1 1 Cau tao may PCR

1.1.1 Máy PCR cô điển

Gồm ba bồn nước có nhiệt độ khác nhau tương ứng với 3 bước cua PCR biến tính, bắt cặp, kéo dải

Hình 1 1 Máy PCR cô điển

1.1.2 Cau tạo máy PCR hiện đại

Gém ba bộ phận bộ phận điều khiển, nguồn điện, bộ phận luân nhiệt

Hình 1 2 Máy PCR hiện đại

Bộ phận diéu khién bao g6m man hinh, ban phim, vi mach diéu khién Dong vai

trò là bộ phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lập chương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị

Nguồn điện gồm bién ap, cau chi, tu điện, điện trở, diot Dong vai tro chuyén đối dòng điện xoay chiều 220V thành dòng điện một chiều với nhiều mước điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị

Bộ phận luân nhiệt gồm đóng vai trò thay đôi nhiệt độ phản ứng liên tục theo chu trình nhiệt được thiết lập gồm

Nắp nhiệt gồm điện trở, cảm biến nhiệt Đóng vai trò gia nhiệt cho phần nắp tube PCR giúp ngăn cản quá trình bay hơi và ngưng tụ gây hao hụt thê tích phản ứng Block nhiệt nơi đặt tube PCR và phân phối nhiệt độ đên tube xúc tác cho các quá trình phản ứng trong tube Nhiệt độ trên block được phân bố theo dải eradient hoặc từng vùng riêng biệt

Bộ phận gia nhiệt hay được gọi là sò nóng lạnh phục vụ quá trình thay đôi nhiệt

độ trong các giai đoạn của quá trình PCR Máy PCR có thể có I sò nóng lạnh, có thể có

1.1.3 Nguyên lý hoạt động máy PCR

Nguyên lý hoạt động máy PCR dựa trên hiệu ứng ngược lai cua Peltier (so nong lạnh) được phát minh vào năm 1834 với cấu tạo và nguyên lý được thiết kế dựa trên nguyên lý và cầu tạo của Thermocouple (cặp nhiệt điện)

Cầu tạo của Peltier gồm hai loại bán dẫn NP làm từ hai kim loại khác nhau và gan dưới Block nhằm tăng hiệu suất gia tăng nhiệt độ Đây là bộ phận quan trọng nhất đối

với máy PCR vì đóng vai trò thay đôi nhiệt độ đối với từng quy trình PCR

Khi được cấp một hiệu điện thé, giữa hai mạch của Peltier sẽ xuất hiện sự chênh lệch nhiệt độ

Tại bước biến tính, khi muốn gia nhiệt cho Block nóng lén 95°C Ta cấp cho Peltier một hiệu điện thế, khi đó mạch trên sẽ nóng lên và mạch dưới lạnh đi trong 30s Khi muốn hạ nhiệt độ xuống 55°C cho bước bắt cặp, ta đảo chiều dòng điện cho một mạch trên lạnh đi và mạch dưới sẽ nóng lên khi đó nhiệt độ của Block được hạ xuống 559C

Khi muốn gia tăng nhiệt độ Block lên 72°C cho bước kéo dài, ta tiếp tục thay đối

dòng điện Việc thay đổi nhiệt độ liên tục dẫn đến việc nhiệt độ Block cũng sẽ thay đối

liên tục

1.2, Máy Realtime PCR

1.2.1 Cau tao may Realtime PCR

May Realtime PCR Applied Biosystems 7500

Hinh 1 4 May Real-time PCR

3

Buéng u nhiét cua may PCR

1.2.2 Nguyên lý hoạt động của máy Realtime PCR

May Realtime PCR có cầu tạo như máy PCR thông thường, tuy nhiên có thêm bộ phận phát ánh sáng và bộ phận thu nhận tín hiệu

Nguyên lý hoạt động của máy Real time PCR dựa vào cơ chế phát ánh sáng kích thích tín hiệu huỳnh quang và việc thu nhận các tín hiệu từ phản ứng đó Có hai loại phát tín hiệu huynh quang thường được sử dụng là SYBR GREEN và TaqMan probe Các chất phát huỳnh quang thường sẽ được kích thích bởi ánh sáng đơn sắc từ nguồn sáng mà máy Real time PCR phat ra

Khi thiết lập phản ứng PCR từ máy Real time PCR, nguồn sáng trắng kích thích

từ đèn Tungsten phát ra đi qua kính lọc để trở thành ánh sáng đơn sắc Bên trong máy

có một camera quét tín hiệu huỳnh quang, khi có phản ứng xảy ra ánh sáng đơn sắc kích thích chất huỳnh quang tạo thành tín hiệu huỳnh và được camera quét đưa vào bộ phận đọc tín hiệu Kết quả của tín hiệu thu sẽ được bộ phận thu nhận tín hiệu ghi lại

Tín hiệu cảng cao thì phản ứng xảy ra trong tube càng nhiều và ngược lại Đề đảm bảo máy đọc được tín hiệu huỳnh quang thì loại tube trong suét dam bao cho ngué sang kích thích chiếu vào trong tube

1.2.3 May Realtime PCR Rotor- Gene Q

Hinh 1 5 May Rotor-Gene Q

Khác với máy realttme PCR khác là máy Rotor-Gene Q block nhiệt có dạng vòng tròn co rotor quay

1.2.4 Neuyén ly hoat dong cia may Realtime PCR Rotor- Gene Q

Cau tao cua may Realtime PCR Rotor- Gene Q gồm có rotor đựng các tube quay tại 400 rpm, nguồn phát sáng là đèn led đóng vai trò là ánh sáng đơn sắc phù hợp cho việc đọc kết quả từng tube và bộ phận đọc tín hiệu Detector

Về nguyên lý hoạt động cũng tương tự như máy Realtime PCR thông thường Tuy nhiên đối với may Realtime PCR Rotor- Gene Q có sự khác biệt là việc đọc kết quả từng tube một

Khác với máy Real time PCR thông thường, việc gia nhiệt để phản ứng xảy ra thay vì cần Peltier như máy Real time PCR thông thường thì đối với máy Realtime PCR Rotor- Gene Q gia nhiệt bằng không khí đề giúp phản ứng xảy ra Đồng thời, việc quay liên tục trong không khí còn tạo ra lực ly tâm ngăn chặn sự đọng lại của các thành phần trên nắp

1.2.5 Đọc kết quả của máy Real time PCR

Kết quả Real time PCR sau khi được bắt sẽ xuất ra bằng tín hiệu huỳnh quang Được quan sát băng biêu đồ sau

ip Đường nên (base line)

6 40 45 20 25 30 35

- Chu ky nhiét Chu ky nén

Chu ky nguGng (Ct)

Hinh 1 6 So dé biéu dién két quả

Trong biểu đô, trục hoành (trục X) biểu diễn cho số chu kỳ của phản ứng, trục tung (trục Y) biểu diễn cho cường độ huỳnh quang trong phản ứng phát ra Biểu đồ khuếch đại Real-time PCR gồm 3 giai đoạn: giai đoạn ủ, giai đoạn lũy thừa và giai đoạn bình nguyên “Giai đoạn ủ” hay “giai đoạn tiềm phục” là giai đoạn đầu của quá trình phản ứng Lúc nảy trình tự DNA đích có thê đã được khuếch đại và có tín hiệu huỳnh quang phát ra nhưng số lượng và cường độ chưa đủ lớn đê thiết bị có thể phát hiện Khi đến thời điểm nhất định, số lượng bản sau DNA và tín hiệu huỳnh quang đủ lớn đề thiết

bị có thể phát hiện ra sẽ bước vào “giai đoạn lũy thừa”, ở giai đoạn này số lượng bản sau DNA đích tăng lên nhanh chóng và đường khuếch đại tín hiệu huỳnh quang được đây lên cao sau mỗi chu kỳ Cuối cùng là “giai đoạn bình nguyên”, tại đây tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng chậm và sau đó không còn tăng do một số thành phần của phản ứng như dNTP, primer, đã không còn đủ và enzyme DNA polymerase không còn hoạt lực đề tham gia vào quá trình khuếch đại

Ngoài ra, trong biểu đồ còn biểu thị một số yếu tố để làm rõ quá trình khuếch đại Trong đó: chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) là thời điểm mà tín hiệu huỳnh quang đủ

lớn đề thiết bị có thé phat hiện hoặc tín hiệu huỳnh quang trong ông phản ứng vượt qua tín hiệu huynh quang nền Đề xác định được chu kỳ ngưỡng, thiết bị real-time PCR sẽ

ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở các chu kỳ đầu (chu kỳ nền), lấy trung bình cường đỗ

huỳnh quang ở các chu kỳ này làm cường độ huỳnh quang nền, đường đi qua cường độ huỳnh quang nền được gọi là đường nền (base line) Chu kỳ ngưỡng là điểm giao nhau giữa đường nền và đường biểu diễn cường đồ huỳnh quang khuếch đại Do trải qua nhiều bước tính toán nên chu kỳ ngưỡng rất ít khi là một s6 chan

Hình I1 8 Tube dùng cho may Real-time PCR

Loại tube thường được dùng phô biến nhất trong máy Real time PCR là loại Frosted, vì vừa có thê giúp người đọc quan sát được thành phần trong tube đồng thời khả năng phát tín hiệu ôn định

BAI 2 THUC HANH KY THUAT PCR

2.1 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

PCR là một phản ứng khuyếch đại đoạn acid nucleic thành nhiều bản sao thông qua quá trình g1a nhiệt phản ứng trong máy luân nhiệt

2.2 Quy trình, vật liệu và thiết bị

2.2.1 Vật liệu và thiết bị

Máy luân nhiệt

Tủ an toàn sinh hoc, Micropipette, tube,

Mau A chứa DNA heo và B không chứa DNA heo

Đối chứng âm giúp kiêm soát sự nhiễm thao tác, hóa chat

Đối chứng đương giúp kiểm soát hóa chất, thiết bị và thao tác thực hiện

Master mix g6m buffer, dNTP, Taq polymerase

Cặp primer gồm primer xuôi và primer ngược

Nước DEPC giúp loại bỏ các enzyem nuclease có trong dung dịch phản ứng

2.2.2 Tính toán số liệu

Công thức CịVị=C¿ Và

Bang 2 1 Thanh phan cho phan ứng PCR

Thuốc thử Nông độ gốc Nông độ cuỗi Thé tich (ul) Master Mix 2X 1x 12,5

2.2.3 Quy trinh

2.2.3.1 Mix mau

Bước I: hút 12,5 ul Master mix vao tube

Bước 2: hut 0,5 ul Primer F va 0,5 ul Primer R vao tube

Bước 3: hút L0 ul H20

Bước 4: hút 1,5 ul mau A cho vao tube

Bước 5: vortex dung dich

Bước 6: cho vào máy luân nhiệt chạy PCR

Chú ý chuẩn bị đối chứng dương và đối chứng âm đề kiểm soát thao tác

2.2.3.2 Chạy PCR

Thiết lập chu trình cho máy PCR gồm chu kỳ nhiệt, thời gian cho từng giai đoạn

va tong so chu ky

Bang 2 2 Chu trình nhiệt cho phản ứng

Bước Nhiệt độ Thoi giann Chu ky

Bién tinh 95°C 30 giây 35

Bắt cặp 55°C 30 giây 35

Kéo dai 72°C 30 giây 35

Hậu kéo dài 72°C 10 phut 1

Bao quan mau truéc khi chay dién di xem két qua 6 -20°C

Chú ý nhiệt độ của quá trình bắt cặp phụ thuộc vào primer ( thanh phan nucleotide tham gia và chiêu dài của primer)

BAI 3 THUC HANH DIEN DI

3.1 Giới thiệu kỹ thuật điện di

Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường được dùng để phan tich nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di có thể được sử dụng trong phân tích hay phối hợp với các kỹ thuật khác, có thé định tính và định lượng Kỹ thuật điện di đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là kỹ thuật điện di theo phương ngang

Đề quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này Ethidium bromide (EtBr) đã từng

là chất nhuộm DNA phô biến Phân tử EtBr chèn vào giữa các cặp base đối diện nhau trên phân tử DNA và tạo huỳnh quang cam/đỏ khi được chiếu tia UV (~ 300 nm) Các chất nhuộm thay thế khác với độ nhạy tương đương và ít nguy nguy hiểm hơn, đó là SYBRGreen, GelRed hay Gelstar

Gel agarose co thé duge str dung dé phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100 bp Agarose là một dạng polymer có thé duoc đun hòa tan, đồ khuôn và tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác nhau (thường là minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) được định hình bằng lược gel (comb) sau khi đô gel vào khuôn Miếng gel được đặt ngập chìm trong dung dịch điện di va DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyền về phía cực dương

Agarose gel là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ

di chuyên qua dễ đàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Với yêu cầu độ phân giải cao hơn hay việc tách chiết các phân tử DNA ngắn hơn nên sử dụng gel polyacrylamide

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Micropipette

Bộ cung cấp nguồn điện (power source)44

Bồn điện di (gel box)

Mẫu A chứa DNA heo đã được khuếch đại bằng PCR

10

Đối chứng âm giúp kiểm soát sự nhiễm thao tác, hóa chat

Đối chứng dương giúp kiểm soát hóa chất, thiết bị và thao tác thực hiện

3.3 Các bước tiến hành

Lượng mẫu sử dụng phụ thuộc vào đạng lược sử dụng (độ dày và chiều dai) va

độ dày của gel Khi lượng mẫu sử dụng để chạy gel được xác định, ta tiến hành accs bước như sau

Bước I : Thêm 10 mL dung địch gồm loading dye, bromophenol bluemix và GelRed vào 5 mL dung địch DNA với nồng độ cuối là 1X Chất nhuộm này có tác dụng giữ mẫu ở đáy giếng điện di và giúp theo đõi sự di chuyên của mẫu trong quá trình điện

di

Bước 2 : Bơm mẫu vào giếng bằng micropipette Các giếng gel thường khó nhận biết, vậy nên trước khi bơm đề nhìn thấy các giếng rõ hơn có thê đặt tắm giấy hay băng keo màu đen bên dưới bồn điện di, ở vị trí các giếng

Bước 3 : Điện di Đậy nắp bồn điện di cân thận Không chạm vảo mẫu Thường các nắp bồn điện di chỉ có thể lắp vào bồn theo 1 hướng dựa vào vị trí đánh dấu các điện cực Nguồn điện cung cấp thay đối tùy theo độ dày, chiều đài và nồng độ của gel, dạng dung dịch đệm điện di sử dụng Hiệu điện thế 100V trong thời gian 30 phút Bước 4 : Quan sát mẫu dưới tia UV

3.4 Quan sát kết quả và giải thích

Hình 3 1 Kết quả điện di

11

Qua quan sát hình trên, ta thấy xuất hiện band của đối chứng duong va ladder DNA không thay sự xuất hiện của mẫu DNA con heo đã được khuếch đại bằng PCR Việc xuất hiện band của đối chứng dương là chứng minh cho hóa chất và thiết bị hoạt động tốt, đối chứng âm không xuất hiện band chứng minh cho không có sự nhiễm trong quá trinh thao tác

Vì vậy việc band DNA không xuất hiện có thể do nguyên nhân trong thao tác chuẩn bị mẫu DNA Có thể do trong quá trình lây mẫu khi thao tác hút mẫu thì lượng mẫu DNA hút lên quá ít nên khi điện di không thé tao ra band DNA cua mau đã chuẩn

bị Ngoài ra, việc mẫu không lên band có thể do thao tác người mix mẫu PCR trước khi điện di

3.5 Kết luận

Không thu được mẫu DNA heo sau khi chạy PCR

Bai 4 THIET KE PRIMER

4.1 Tổng quan

Thiết kế primer cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một quá trình quan trọng trong việc nhân đôi DNA Các primer là các đoạn ngắn của DNA được sử

dụng để làm đoạn khởi đầu cho quá trình nhân đôi của DNA trong phan tng PCR

Đề có thê thiết kế được một cap primer diéu can thiết nhất là biết được trình tự

mạch khuôn của đối tượng cần nghiên cứu Trình tự này được lấy từ Ngân hang Gene (Gene Bank), trình tự mạch khuôn này chỉ có một Sợi và là của sợi coding của DNA Primer được tong hợp dựa trên trình tự mạch khuôn cua DNA, primer xudi (Forward primer) bắt cặp với sợi non-coding của DNA( sợi mã hóa) và primer ngược

(Reverse primer) bắt cặp với sợi coding Primer xuôi có trình tự đối bô sung với sợi non-coding của mạch khuôn DNA, vì vậy đề có được primer xuôi thì chỉ cần cắt một

đoạn trình tự của Sợi coding Đối với pnmer ngược thì có trình tự đối bố sung với sợi coding, vì vậy để được primer ngược thì cần cắt một đoạn trình tự từ Sợi coding và đem

đối bổ sung lại với sợi coding

4.2 Nguyên tắc thiết kế primer

Việc thiết ké pnmer được tong hợp cần dựa trên một số nguyên tac sau nham dam bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cua primer trong quá trinh PCR tong hop thanh DNA mdi

Chiéu dai cua primer: D6 dai primer khoang tir 15 — 30 nucleotide, thuong dé dai primer tối ưu khoảng 18-22 nucleotide

Nhiệt độ nóng chảy: Nhiệt độ nóng chảy được tính theo công thức Tm = 2*(A+T)

+ 4*(G+C), Tm cua 2 primer thường nằm trong khoảng 50-65°C và không chênh lệch

quá 5°

Mật độ GC: ty lệ GC thường năm trong khoảng 40-60%, tối ưu nhất là 50%

Dau 3’ cua primer: Day 1a noi enzyme Taq polymerase bam vao va tién hanh kéo dài tông hợp mạch mới Đầu 3' của primer nên được kết thúc bằng G hoặc C nham tao

3 liên kết hidro (liên kết mạnh), để đảm báo các nucleotide gắn vào đề tổng hợp mạch

moi Tuy nhién, 5 nucleotide tai dau 3’ nén cé it hon 3 nucletide G hoac C tranh viéce

mài bắt cặp không đặc hiệu

Hiện tượng lặp lại nhiều lần trình tự primer: Lặp lại nhiều lần các trình tự primer ATATAT hoặc GGGG sẽ gây hiện tượng bắt cặp nhằm, vì vậy trình tự lặp lại nên đạt tối đa 4 lần đối với một primer

Đảm bảo độ đặc hiệu của primer và hình thành dimer thấp

4.3 Quy trình thiết kế Primer bằng phần mềm Bioedit

Mục tiêu: Thiết kế một cặp primer khuéch đại một đoạn DNA(gene cytochrome) dài 200-1000 bp đặc hiệu cho con bò (CATTLE) (yêu cầu: đảm bảo không bắt cặp trên

DNA heo)

4.3.1 Chuẩn bị trình tự khuôn mẫu

Trình tự khuôn mẫu được lấy từ Ngân Hàng Gene (GeneBank) trên https:/Avww.ncbi.nim.nih.gov/