Nghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt

Nghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệtNghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Lê Văn Đông

HÀ NỘI – NĂM 2024

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là công trình nghiên cứucủa riêng tôi Các số liệu nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được aicông bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Trọng Phúc

Để hoàn thành công trình nghiên cứu này, tôi xin được bày tỏ lòng biết

ơn tới:

Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y,

Đảng uỷ, Ban Giám đốc, Khoa Ngoại Tiết Niệu - Bệnh viện K

Phòng Sau đại học - Học viện Quân y,

Bộ môn Miễn Dịch - Học viện Quân y,

Ban Lãnh đạo CTCP Y Sinh Immutek

Ban Lãnh đạo Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến những người bệnh điều trị tạiKhoa Ngoại Tiết niệu Bệnh viện K đã đồng ý tham gia nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn tới Ban Lãnh đạo và toàn thể nhân viên khoa NgoạiTiết Niệu - Bệnh viện K đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho tôi thực hiệnnghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Thầy PGS.TS Nguyễn ĐặngDũng – Chủ nhiệm Bộ môn Miễn dịch, TS.BS Đỗ Khắc Đại – Phó Chủnhiệm Bộ môn, cùng các anh chị em Bác sĩ, KTV Bộ môn Miễn dịch đã tạođiều kiện cho tôi được học tập, nghiên cứu và cho tôi nhiều kiến thức quýbáu giúp tôi triển khai thành công nghiên cứu này tại Bộ môn

Đặc biệt, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn gửi tới người Thầy hướngdẫn luận án: PGS.TS Lê Văn Đông, Thầy đã dành nhiều thời gian, côngsức và trí tuệ để giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè

và người thân đã giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này./

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trọng Phúc

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tế bào NK và bệnh ung thư tuyến tiền liệt 3

1.1.1 Nguồn gốc và vai trò tế bào NK của hệ miễn dịch 3

1.1.2 Đặc điểm bề mặt và chức năng tế bào NK 4

1.1.3 Thụ thể đặc trưng của tế bào NK 7

1.1.4 Hoạt tính NK 12

1.1.5 Tế bào NK với quá trình kiểm soát ung thư 16

1.1.6 Ung thư tuyến tiền liệt và phương pháp điều trị miễn dịch 20

1.1.7 Một số đặc điểm đặc trưng của tế bào NK trong ung thư tuyến tiền liệt 23 1.1.8 Dấu ấn bề mặt một số dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt 26

1.2 Nuôi cấy tăng sinh tế bào NK ex vivo và ứng dụng 27

1.2.1 Một số nguồn tế bào NK sử dụng nuôi cấy tăng sinh 27

1.2.2 Tổng hợp kết quả một số phương pháp tinh sạch và nuôi cấy tăng sinh tế bào NK 29

1.2.3 Một số phương pháp đánh giá khả năng giết của tế bào NK sau nuôi cấy tăng sinh 32

1.2.4 Những hướng tiếp cận mới điều trị ung thư bằng tế bào NK 34

1.2.5 Nghiên cứu quốc tế về ứng dụng liệu pháp tăng cường miễn dịch tự thân điều trị ung thư 37

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 40

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 40

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 41

2.1.3 Thời gian thực hiện nghiên cứu 41

2.2 Vật liệu nghiên cứu 41

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 41

2.2.2 Thiết bị - Sinh phẩm chính sử dụng trong nghiên cứu 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu 43

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 43

2.3.2 Các biến số nghiên cứu 43

2.4 Các kỹ thuật xét nghiệm, can thiệp sử dụng trong nghiên cứu 45

2.4.1 Xét nghiệm NKA-INF-γ 45

2.4.2 Phương pháp xét nghiệm đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) 50 2.4.3 Quy trình phân lập (tinh sạch) tế bào NK bằng cột từ 56

2.4.4 Quy trình nuôi cấy tăng sinh tế bào NK 58

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1 Đặc điểm hoạt tính, kiểu hình miễn dịch của tế bào NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 61

3.1.1 Một số đặc điểm về lâm sàng, cận lâm sàng của nhóm nghiên cứu 61

3.1.2 Đặc điểm miễn dịch tế bào NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 63

3.2 Kết quả nuôi cấy tăng sinh, tạo khối tế bào NK và khả năng giết tế bào đích PC3 ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 73

3.2.1 Kết quả nuôi cấy tăng sinh tạo khối tế bào NK 73

3.2.2 Kết quả giết tế bào đích PC3 của tế bào NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 84

thư tuyến tiền liệt 92

4.1.1 Một số đặc điểm về lâm sàng, cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 92

4.1.2 Đặc điểm chung về tế bào NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 94

4.1.3 Đặc điểm hoạt tính NK của bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 96

4.1.4 Đặc điểm số lượng và kiểu hình NK theo ngưỡng hoạt tính NKA-IFN-γ 100

4.1.5 Mối tương quan giữa hoạt tính NK với một số đặc điểm kiểu hình NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 100

4.2 Hiệu quả nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và khả năng giết tế bào đích PC3 ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 102

4.2.1 Đặc điểm tế bào NK của bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt trước và sau nuôi cấy tăng sinh 102

4.2.2 Hiệu quả tinh sạch và nuôi cấy tăng sinh 105

4.2.3 Hiệu quả giết tế bào dòng ung thư (PC3) bởi tế bào NK trước và sau nuôi cấy 110

HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI 117

KẾT LUẬN 118

KIẾN NGHỊ 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QỦA NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

1 ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity/ Gây độc

tế bào bởi tế bào phụ thuộc kháng thể

2 AIET Autologous immune enhancement therapy/ Điều

trị tăng cường miễn dịch tự thân

3 CAR Chimeric antigen receptor/ Thụ thể kháng nguyên

khảm

5 CD Cluster of diffrentiation/ Cụm biệt hóa theo dòng

6 CTL Cytotoxic T lymphocytes/ Lympho T gây độc

7 DCs Dendritic cells/ tế bào tua

8 DFS Disease free survival/ Thời gian sống thêm không

bệnh

10 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay/ Kỹ thuật

miễn dịch gắn men

11 FBS Fetal bovine serum/ Huyết thanh bào thai bê

12 GR Glucocorticoid receptor/ Thụ thể glucocorticoid

16 HPA Hypothalamic–pituitary–adrenal axis/ Trục dưới

đồi – tuyến yên – tuyến thượng thận

17 HSCT Hematopoietic stem cell transplant/ Ghép tế bào

gốc tạo máu

20 IFN-γ Interferon gamma

21 iPSC Induced pluripotent stem cells/ Tế bào gốc vạn

30 mAb Monoclonal antibody/ Kháng thể đơn clone

31 LAK Lymphokine-activated killer/ tế bào lympho được

hoạt hóa bởi lymphokine

33 NK natural killer/ tế bào giết tự nhiên

34 NKA Hoạt tính của tế bào NK (Hoạt tính NK)

35 NKA- IFN-γ Hoạt tính chế tiết cytokin IFN-γ của tế bào NK

36 NK-VUE Bộ sinh phẩm xét nghiệm NKA

38 OS Overall survival/ Thời gian sống thêm toàn bộ

39 PBMC Peripheral blood mononuclear cells/ Tế bào đơn

nhân máu ngoại vi

41 PĐLTTTL Phì đại lành tính tuyến tiền liệt

43 TBUTTTL Tế bào ung thư tuyến tiền liệt

44 TIL Tumor-infiltrating lymphocytes/ Tế bào lympho

thâm nhiễm khối u

45 TGF- β Transforming growth factor β/ yếu tố tăng trưởng

chuyển dạng β

46 TME Tumor microenvironment/ Vi môi trường khối u

48 TNF Tumor necrosis factor/ yếu tố hoại tử u

48 UTTTL Ung thư tuyến tiền liệt

49 SLE Systemic lupus erythematosus/ Bệnh lupus ban đỏ

hệ thống

50 RUO Research use only/ Chỉ dùng cho nghiên cứu

Bảng Nội dung Trang

1.1 Một số phương pháp đánh giá tế bào NK 13

1.2 Phân loại giai đoạn UTTTL theo AJCC 2017 22

1.3 Biểu lộ một số dấu ấn trên bốn dòng tế bào ung thư TTL 26

1.4 Một số công nghệ tinh sạch và nuôi cấy tăng sinh được ứng dụng những năm gần đây 30

3.1 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 61

3.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 62

3.3 Kết quả tỉ lệ, kiểu hình và hoạt tính NK ở bệnh nhân UTTTL 63

3.4 Kết quả tỉ lệ, kiểu hình miễn dịch và hoạt tính NK ở bệnh nhân UTTTL phân nhóm theo độ tuổi bệnh nhân 67

3.5 Hoạt tính NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt theo ngưỡng 500 pg/mL và 200 pg/mL 68

3.6 Đặc điểm số lượng, kiểu hình NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt phân loại theo giá trị ngưỡng NKA-IFN-γ 500 pg/mL 69

3.7 Đặc điểm số lượng, kiểu hình NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt phân loại theo giá trị ngưỡng NKA-IFN-γ 200 pg/mL 70

3.8 Tương quan giữa hoạt tính NK với một số đặc điểm kiểu hình miễn dịch tế bào NK 71

3.9 Đặc điểm hoạt tính NK ở nhóm bệnh nhân được nuôi cấy tăng sinh NK phân loại loại theo hai ngưỡng cut-off 73

3.10 Kết quả biểu lộ thụ thể NKG2D trước và sau nuôi cấy tăng sinh tạo khối tế bào NK 74

3.11 Kết quả biểu lộ thụ thể NKG2D trước và sau nuôi cấy tăng sinh tạo khối tế bào NK theo ngưỡng NKA-IFN-γ = 500 pg/mL 75

3.12 Kết quả biểu lộ thụ thể NKG2D trước và sau nuôi cấy tăng sinh tạo

khối tế bào NK theo ngưỡng NKA-IFN-γ = 200 pg/mL 763.13 Kết quả biểu lộ thụ thể NKG2A trước và sau nuôi cấy tăng sinh tạo

khối tế bào NK 773.14 Kết quả biểu lộ thụ thể NKG2A trước và sau nuôi cấy tăng sinh tạo

khối tế bào NK theo ngưỡng NKA-IFN-γ = 500 pg/mL 783.15 Kết quả biểu lộ thụ thể NKG2A trước và sau nuôi cấy tăng sinh tạo

khối tế bào NK theo ngưỡng NKA-IFN-γ = 200 pg/mL 793.16 Kết quả tinh sạch tế bào NK tại hai thời điểm D0 và D14 803.17 Kết quả tăng sinh tạo khối tế bào NK 813.18 Kết quả tăng sinh tạo khối tế bào NK theo ngưỡng NKA-IFN-γ 500

pg/mL 813.19 Kết quả tăng sinh tạo khối tế bào NK theo ngưỡng NKA-IFN-γ 200

pg/mL 823.20 Kết quả giết PC3 bởi tế bào NK của bệnh nhân UTTTL trước và sau

nuôi cấy 843.21 Kết quả giết PC3 bởi tế bào NK trước và sau nuôi cấy của bệnh nhân

ung thư tuyến tiền liệt theo ngưỡng NKA-IFN-γ 500 pg/mL 873.22 Kết quả giết PC3 bởi tế bào NK trước và sau nuôi cấy của bệnh nhân

ung thư tuyến tiền liệt theo ngưỡng NKA-IFN-γ 200 pg/mL 883.23 Tương quan một số đặc điểm tế bào NK trước và sau khi nuôi tăng

sinh tạo khối tế bào NK ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt với khảnăng giết TBUTTTL dòng PC3 893.24 Kết quả tỉ lệ giết PC3 và một số đặc điểm ở một số bệnh nhân 91

Biểu đồ Nội dung Trang

2.1 Phương trình đường chuẩn được xây dựng theo OD đo được ở 4

nồng độ mẫu chuẩn 493.1 Mối tương quan giữa giá trị NKA với một số đặc điểm tế bào NK ở

bệnh nhân UTTTL 723.2 Tỷ lệ ly giải PC3 bởi tế bào NK/D0 và NK/D14 ở bệnh nhân ung thư

tuyến tiền liệt 853.3 Mối quan hệ tuyến tính giữa một số đặc điểm của tế bào NK miễn

dịch trước và sau khi nuôi tăng sinh tế bào NK ở bệnh nhân UTTTL

và khả năng giết TBUTTTL dòng PC3 90

Hình Nội dung Trang

1.1 Quá trình sinh máu và hình thành tế bào NK từ tế bào gốc 41.2 Các thụ thể hoạt hóa và ức chế tế bào tế bào NK khi tiếp xúc với tế

bào ung thư 61.3 Con đường hoạt hóa tế bào NK thông qua thụ thể NKG2D 71.4 Thụ thể NKG2A ức chế hoạt động gây độc của tế bào NK thông qua

tương tác với phân tử HLA-E 101.5 Quá trình định lượng NKA-IFN-γ bằng bộ sinh phẩm NK Vue™ 151.6 Vai trò của tế bào NK trong tầm soát miễn dịch đối với tế bào ung thư 161.7 Cơ chế thúc đẩy rối loạn chức năng NK ở vi môi trường khối u bệnh

nhân ung thư 191.8 Ứng dụng lâm sàng của tế bào NK trong liệu pháp miễn dịch chống

ung thư 352.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 432.2 Sơ đồ nguyên lý phản ứng ELISA định lượng NKA-IFN-γ 462.3 Sơ đồ chạy mẫu và kết quả đo mật độ quang (OD) trên máy đọc

ELISA 482.4 Hình ảnh cách lựa chọn phân tích các quần thể tế bào miễn dịch máu

ngoại vi sử dụng hệ thống đếm tế bào dòng chảy 512.5 Sơ đồ kỹ thuật tách tế bào NK sử dụng công nghệ từ 563.1 Kết quả phân tích số lượng tế bào NK, NKT bằng kỹ thuật tế bào

dòng chảy 633.2 Kết quả phân tích thụ thể NKG2A của tế bào NK bằng kỹ thuật tế

bào dòng chảy 64

3.3 Kết quả phân tích thụ thể NKG2D của tế bào NK bằng kỹ thuật tế

bào dòng chảy 653.4 Kết quả phân tích độ tinh sạch tế bào NK tại các thời điểm .803.5 Hình ảnh quan sát bằng kính hiển vi quá trình tăng sinh tạo khối tế

bào tại các thời điểm D0;D3;D11 833.6 Kết quả kiểm định khả năng ly giải tế bào ung thư tuyến tiền liệt

dòng PC3 của tế bào NK ngày D0 và D14 bằng kỹ thuật tế bào dòngchảy 86

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào NK (Natural killer – hay tế bào giết tự nhiên) là những tế bàothuộc dòng bạch cầu lympho thuộc hệ thống đáp ứng miễn dịch tự nhiên vàchiếm khoảng 10% trong máu ngoại vi [1] Chức năng sinh học của tế bào

NK là khả năng tấn công và gây độc giết tế bào đích trực tiếp mà không cầntới giai đoạn cảm ứng, tế bào NK nhận diện và tấn công các tế bào của cơ thể

bị biến đổi do nhiễm virus hoặc tế bào ung thư Khả năng hoạt động của tếbào NK phụ thuộc vào sự biểu lộ và cân bằng giữa thụ thể hoạt hóa và thụ thể

ức chế có trên bề mặt tế bào Khi các tế bào NK được hoạt hóa sẽ đáp ứngtheo hai cách, cách thứ nhất là gây độc trực tiếp thông qua các hoạt chất sinhhọc là perforin, granzyme và kích hoạt tế bào đích chết theo chương trình;cách thứ hai, tế bào NK hoạt hóa và chế tiết ra các cytokin, chủ yếu là IFN-γ,một yếu tố điều hòa các phản ứng miễn dịch đặc hiệu khác làm tăng khả nănggiết và loại bỏ các tế bào ung thư của hệ thống miễn dịch

Ở bệnh nhân mắc ung thư nói chung và ung thư tuyến tiền liệt(UTTTL) nói riêng, một số nghiên cứu đã chứng minh khối u ác tính có thểtiết ra một số yếu tố làm thay đổi kiểu hình và điều hòa ức chế tới hoạt động

tế bào NK tại chỗ hoặc toàn thân [2] Những chất ức chế này có tác dụng làmgiảm khả năng nhận diện, khả năng gây độc, khả năng chế tiết cytokin của tếbào NK trong hoạt động kiểm soát miễn dịch chống khối u (immunesurveillance) thông qua sự thay đổi mức độ biểu lộ của các thụ thể hoạt hóa(điển hình là thụ thể NKG2D) và thụ thể ức chế (điển hình là thụ thể NKG2A)

có thể làm giảm hoạt tính tế bào NK (NKA/Natural killer cell activity), làmcho tế bào NK dần đi vào trạng thái bị suy kiệt Ngược lại, khi hoạt tính NK

bị suy giảm liên quan tới làm tăng quá trình tiến triển của bệnh, tăng mức độ

di căn và tiên lượng bệnh nặng hơn [3]

Những năm gần đây, công nghệ nuôi cấy tăng sinh hoạt hóa và truyền

tế bào NK trong một số loại bệnh ung thư đã được nghiên cứu, ứng dụng ở

nhiều nước có nền y học tiên tiến như Nhật Bản, Mỹ, Singapore, TrungQuốc Liệu pháp miễn dịch truyền tế bào T tự thân, tế bào NK tự thân hoặcđồng loài cho người bệnh bị ung thư nhằm tăng cường miễn dịch chống khối

u được xem là phương pháp điều trị mới và giảm các tác dụng phụ khôngmong muốn như thường thấy trong hóa – xạ trị Những liệu pháp mới này đã

có những thành công ban đầu đáng ghi nhận với nhiều phương pháp làm tănghiệu quả của quá trình tăng sinh, hoạt hóa, nhận diện và giết tế bào đích

Tại Việt Nam, đến nay đã có một số cơ sở như Bệnh viện Đa khoaQuốc tế Vinmec, Trường Đại học Y Hà Nội và Bộ môn Miễn dịch – Học việnQuân y bước đầu đã triển khai nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật tăng sinh tạokhối tế bào NK, tế bào T trên một số loại bệnh ung thư như ung thư phổi, ungthư đường tiêu hóa hoặc trên người khỏe mạnh Tuy nhiên, chưa có nghiêncứu về khả năng tăng sinh, hiệu quả tăng sinh tạo khối tế bào NK ở bệnhnhân UTTTL và ảnh hưởng của hoạt tính cùng kiểu hình miễn dịch tế bào

NK lên quá trình này vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ Trong khi đó,đây là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở namgiới, đặc biệt ở người cao tuổi

Vì vậy, câu hỏi được đặt ra là kiểu hình miễn dịch của tế bào NK ởbệnh nhân UTTTL có gì khác biệt hay không? Bên cạnh đó, tế bào NK ởbệnh nhân UTTTL có khả năng đáp ứng với quá trình tăng sinh, đặc biệt làtác dụng giết tế bào ung thư của tế bào NK ở những người UTTTL trước vàsau nuôi cấy tăng sinh có khác nhau hay không? Từ đó, chúng tôi tiến hành đề

tài “Nghiên cứu đặc điểm miễn dịch và hiệu quả tăng sinh tế bào NK máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt” với hai mục tiêu:

1 Khảo sát đặc điểm miễn dịch và hoạt tính NK máu ngoại vi bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt.

2 Đánh giá khả năng tăng sinh và giết tế bào ung thư tuyến tiền liệt dòng PC3 in vitro của tế bào NK phân lập từ máu ngoại vi bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt.

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tế bào NK và bệnh ung thư tuyến tiền liệt

1.1.1 Nguồn gốc và vai trò tế bào NK của hệ miễn dịch

Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể chúng ta sẽ được hệ thốngmiễn dịch của cơ thể chống lại bằng hai loại đáp ứng là miễn dịch tự nhiênhay bẩm sinh (innate immune cells) và miễn dịch thích ứng (adaptive immunesystem) Thành phần chính của hệ miễn dịch tự nhiên là hàng rào biểu mô,các tế bào làm nhiệm vụ thực bào (phagocytic leukocytes), tế bào tua(dendritic cells) và tế bào NK [1] Tế bào NK chiếm khoảng 10% trong tổng

số tế bào bạch cầu lympho lưu hành ngoại vi, lớn thứ ba sau lympho B và T,

tế bào NK còn được tìm thấy trong các khoang phúc mạc, lách, gan, phổi,hạch bạch huyết, tuyến ức, và tử cung trong thời gian mang thai [1]

Tế bào NK trước đây được biết đến chủ yếu sinh ra và phát triển từ tủyxương, tương tự tế bào B và các tế bào gốc tủy khác Tuy nhiên, các nghiêncứu gần đây đã chỉ ra rằng tế bào NK có thể trưởng thành ở các hạch bạchhuyết và gan [4], [5] Tiền thân tế bào NK (NK-cell precursors/NKP) đã đượcxác định trong quần thể tế bào gốc tạo máu (Hình 1.1), được sử dụng để phânbiệt là tế bào NK mà không phải tế bào gốc các dòng khác, quá trình này tiếptục bằng sự trưởng thành về hình thái và chức năng của tế bào NK, sau cùng

tế bào NK trải qua quá trình cân bằng nội môi, một số yếu tố phiên mã và yếu

tố hòa màng được xác định để điều tiết và hỗ trợ tế bào NK phát triển Cácyếu tố phiên mã liên quan đến giai đoạn của NKP bao gồm Ets-1, ID2, Ikaros

và PU.1 [6] Cytokin IL-15 đã được chứng minh là rất cần thiết cho sự pháttriển của tế bào NK, cho cân bằng nội môi và sự tồn tại của tế bào Nghiêncứu của Freud và Ferlazzo cho thấy có liên quan của IL-2 có nguồn gốc từ tếbào T trong chức năng ly giải tế bào của tế bào NK trưởng thành [4], [7] Tếbào NK, bên cạnh việc nhận diện và giết các mục tiêu đích, ngày nay chúng

còn được biết đến với chức năng tương tác với các tế bào miễn dịch kháctrong quá trình đáp ứng miễn dịch thông qua các hoạt chất được chế tiết, tếbào NK có thể điều chỉnh đáp ứng của chúng với môi trường các cơ quan vàthậm chí một số có khả năng mang trí nhớ miễn dịch [8], [9].

Hình 1.1 Quá trình sinh máu và hình thành tế bào NK từ tế bào gốc

*Nguồn: Latham K (2021) [10]

1.1.2 Đặc điểm bề mặt và chức năng tế bào NK

Tế bào NK của người được phân loại thành hai dưới nhóm chính, tùytheo kiểu hình miễn dịch và chức năng của chúng là: CD56dim và CD56bright CD56dim chiếm 90% tổng số quần thể tế bào NK trong máu ngoại vi và có dấu

ấn ái lực thấp đối với vùng hằng định của IgG, FcγRIIIa (CD16) Về mặt chứcnăng, những tế bào loại này có hoạt tính gây độc cao Còn lại khoảng 10% tếbào NK kiểu hình dưới nhóm CD56bright có chức năng tham gia vào việc sảnxuất các cytokin (chức năng chế tiết) là chủ yếu [11]

Các tế bào NK trong các mô lympho ngoại vi như amidan, hạch bạchhuyết, lách khác với quần thể tế bào NK trong máu ngoại vi, những tế bào nàyđược hoạt hóa bởi các tế bào tua (DC cells) và chúng tiết ra các cytokin nhưinterferon, có tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khả nănggiết hiệu quả hơn (của tế bào T) [7], [12].

Chức năng của tế bào NK được kiểm soát bởi hàng loạt các thụ thể hoạthóa và thụ thể ức chế trên bề mặt tế bào Những thụ thể này có chức năng tựnhiên là ức chế hoặc hoạt hóa tế bào NK Họ thụ thể ức chế bao gồm các thụthể giống globulin miễn dịch (CD158), thụ thể lectin loại C (CD94/NKG2A)

và thụ thể ức chế (LIR1, LAIR-1) Các thụ thể hoạt hóa là những thụ thể gâyđộc tự nhiên (NKp46, NKp44), thụ thể lectin loại C (NKG2D,CD90/NKG2C), và thụ thể giống Ig (2B4) Một tế bào NK riêng biệt thườngbiểu lộ có 2-4 thụ thể ức chế thêm vào một dãy các thụ thể hoạt hóa (Hình1.2) [1], [13] Tế bào NK khác nhau biểu lộ sự kết hợp khác nhau với thụ thể

ức chế hay hoạt hóa, có sự không đồng nhất đáng kể trong quần thể tế bào

NK Chính vì lý do này mà các tế bào NK được cho là có khả năng để đốiphó với hàng loạt các kích thích và tham gia vào nhiều đáp ứng miễn dịchvới các điều kiện bệnh lý khác nhau [1]

Khả năng gây độc của tế bào NK được quy định chặt chẽ bởi một cânbằng giữa tín hiệu kích hoạt và ức chế Các thụ thể ức chế tế bào NK nhậntín hiệu từ phân tử MHC lớp I biểu lộ trên mọi tế bào bình thường của cơthể, điều này giúp cho tế bào NK không bị hoạt hóa và giết các tế bào bìnhthường của cơ thể túc chủ Các phát hiện trước đây đã chỉ ra rằng tế bào

NK được hoạt hóa khi chúng gặp các tế bào bị thiếu phân tử MHC lớp I(missing – self) Ngoài ra, các tế bào NK có thể phân biệt các tế bào túc chủbình thường và nhiễm vi sinh vật hoặc tế bào bất thường bằng cách nhận diện

sự có mặt hay không của phân tử MHC lớp I Tế bào nhiễm virus và tế bàokhối u thường giảm biểu lộ của phân tử MHC lớp I để trốn thoát sự nhận diệncủa tế bào lympho T gây độc (CTL), nhưng kết quả lại làm tế bào NK có thểnhận diện và tấn công Trong trường hợp này, các thụ thể hoạt hóa không bị

kìm hãm và chúng tạo ra các tín hiệu kích thích mạnh và làm nghiêng ưu thế

về thụ thể hoạt hóa NK [14]

Hình 1.2 Các thụ thể hoạt hóa và ức chế tế bào tế bào NK khi tiếp xúc với tế

bào ung thư

*Nguồn: Theo Chester C (2015) [13]

Một khi tế bào đích bị nhận diện bởi các tế bào NK, tế bào NK đượchoạt hóa và gây độc tế bào đích chủ yếu thông qua hai con đường Một là phácấu trúc protein màng tế bào bằng cách tiết ra chất perforin, tạo ra các lỗthủng trên màng tế bào đích Đồng thời, một loạt chất sinh học khác là cácgranzym được tế bào NK giải phóng vào bên trong tế bào đích, kích hoạt quátrình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào đích Trong con đường thứ

2, sự chết theo chương trình phụ thuộc vào caspase diễn ra liên quan đến sựkết hợp của các thụ thể chết (ví dụ Fas/CD95) trên tế bào đích với các phối tửtương ứng của chúng như FasL Ngoài ra, có một protein hoạt động như phối

tử gây ra quá trình chết theo chương trình liên quan tới yếu tố TNF được gọi

là TRAIL (TNF - related apoptosis-inducing ligand) có trên tế bào NK, tínhiệu qua trung gian TRAIL có thể gây ra độc tế bào tự phát chống lại các tếbào khối u nhạy cảm với TRAIL [13] Gây độc tế bào bởi tế bào phụ thuộckháng thể (ADCC) cũng là một cơ chế của việc giết chết tế bào khối u bởi tếbào NK vì các phân tử CD16 là các thụ thể FcγRIII có ái lực thấp trên bề mặt

tế bào NK, có khả năng liên kết với phần Fc của phân tử IgG phủ trên bề mặt tếbào đích (hiện tượng opsonin hóa) [11]

1.1.3 Thụ thể đặc trưng của tế bào NK

1.1.3.1 Thụ thể NKG2D

Thụ thể NKG2D: Ở người, NKG2D là một thụ thể hoạt hóa xuyên

màng giống như lectin loại II (type II lectin-like), có chức năng liên quan đếnviệc điều chỉnh hoạt hóa tế bào NK Cấu trúc phân tử NKG2D (thụ thể) baogồm hai nếp gấp dạng β, hai chuỗi xoắn ốc α và bốn liên kết di-sulfide [15]

Hình 1.3 Con đường hoạt hóa tế bào NK thông qua thụ thể NKG2D

*Nguồn: Theo Shixin D (2019) [16]

Con đường tín hiệu hoạt hóa tế bào NK bởi NKG2D thông qua trụctương tác NKG2D/NKG2DL (NKG2DL – phối tử NKG2D) NKG2D có haidạng đồng phân riêng biệt (NKG2D-S: dạng đồng phân ngắn và NKG2D-L:dạng đồng phân dài) được tạo ra nhờ quá trình ghép nối thay thế NKG2D-S

và NKG2D-L tương tác với bộ phận nhận đáp ứng, là protein kích hoạtDNAX có trọng lượng phân tử 10 kDa (DAP10) hoặc KARAP (còn được gọi

là tiểu đơn vị tín hiệu DNAX kích hoạt phân tử nhận đáp ứng có trọng lượng

12 kDa, DAP12) (Hình 1.3) Các homodimer NKG2D-L (được tạo thành từ 2protein giống nhau) tương tác với DAP10 xuyên màng trong màng tế bào đểkích hoạt tín hiệu nội bào, thu hút các phân tử khác cần thiết cho đườngtruyền tín hiệu bằng các phản ứng phosphoryl hóa kinase (PI3K) và tạo ramột loạt phản ứng gây độc tế bào khi được kích hoạt thông qua các chấtchống chết theo chương trình Akt và chất điều hòa tín hiệu ngoại bào(ERK) 1/2 MAP kinase [15]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng việc hoạt hóa tế bào NK bằng cáctín hiệu qua trung gian con đường NKG2D/NKG2DL có thể lấn át các tínhiệu gây ra bởi các thụ thể ức chế, qua đó cho phép NKG2D hoạt động nhưmột yếu tố then chốt có thể thay đổi xu hướng để hoạt hóa tế bào NK [15],[17]

Phối tử NKG2DL: Ở người, có hai họ của phối tử NKG2DL, đó là các

phân tử liên quan đến chuỗi MHC lớp I là MICA/MICB và các protein liênkết UL16 (ULBP) Sự biểu lộ của NKG2DL trên bề mặt các tế bào khối uđược tạo ra bởi quá trình điều hòa phiên mã sau hiện tượng stress ở cấp độ tếbào hoặc gen (cellular or genomic stress) Phối tử này thường được biểu lộ ởhầu hết các tế bào khối u có nguồn gốc từ biểu mô, chẳng hạn như ung thưbuồng trứng, ung thư đại tràng và bệnh bạch cầu, hiếm khi được phát hiện ởcác mô trưởng thành khỏe mạnh [15], [18] Hơn nữa, khi tế bào tiếp xúc vớicác tác nhân gây tổn hại DNA, các cytokin đặc biệt hoặc các yếu tố tăng sinh

tế bào, sự biểu lộ của các phối tử này được tăng lên, làm cho hoạt động gây

độc và chế tiết cytokin IFN-γ cũng tăng lên [19] Bằng chứng về sự tăng lêncác thụ thể NKG2DL này cho thấy đáp ứng qua con đườngNKG2D/NKG2DL là cần thiết liên quan tới tiến triển của nhiều bệnh ác tínhkhác nhau.

Một số phương pháp can thiệp điều trị ung thư dựa vào NKG2D: Hiệu

quả điều trị của liệu pháp miễn dịch dựa trên tế bào NK có thể đạt được bằngcách điều chỉnh tăng biểu lộ của NKG2D [15] Vì vậy, việc xác định và hiểu

rõ vai trò của các yếu tố phiên mã quy định biểu lộ NKG2D trên bề mặt tếbào thông qua phối tử của nó là vô cùng quan trọng Ví dụ sử dụng cáccytokin liên quan đến chuỗi γ hòa tan, chẳng hạn như IL-2, IL-12, IL-18 vàIL-15 đã được chứng minh có tác dụng điều chỉnh làm tăng cường hoặcgiảm biểu lộ của NKG2D (tùy theo nồng độ) trên bề mặt tế bào và đã được

sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu điều trị chống ung thư [16], [20] IL-2,một cytokin quan trọng trong điều trị ung thư, tăng cường khả năng gâyđộc tế bào của tế bào NK bằng cách tăng biểu lộ NKG2D trên tế bàoCD16+ NK ở bệnh nhân có khối u ác tính [21]

1.1.3.2 Thụ thể NKG2A

Thụ thể NKG2A: là thành viên của siêu họ thụ thể lectin loại C [22].

Gen mã hóa của thụ thể này được định vị trên nhiễm sắc thể số 12 bao gồm 7exon trên tế bào NK [23] NKG2A là một glycoprotein xuyên màng tích hợp(Có bảy thành viên họ NKG2 được mô tả: NKG2A, NKG2B, NKG2C,NKG2D, NKG2E, NKG2F và NKG2H) NKG2A và NKG2B có chức năng

ức chế [24] Biểu lộ NKG2A có thể xuất hiện ở quần thể lympho gây độc tếbào, bao gồm hầu hết là tế bào NK và một phần tập con tế bào TCD8+ [25]

Nó được phát hiện dưới dạng biểu lộ kết hợp dị vòng với kháng nguyênCD94, cũng thuộc siêu họ lectin loại C [26]

Phối tử NKG2A: Các phối tử của phức hợp thụ thể dị vòng

NKG2A/CD94 là các phân tử MHC lớp I phi cổ điển, là kháng nguyên(HLA)-E ở hệ bạch cầu người [27], [28]

Khoảng một nửa số tế bào NK trong máu ngoại vi của người có biểu lộNKG2A [29], [30] Dấu ấn này chủ yếu được quan sát thấy ở các tế bào NKchưa trưởng thành có kiểu hình CD56bright và giảm dần theo giai đoạn trưởngthành của tế bào NK [31] Biểu lộ của NKG2A có mối tương quan nghịch vớihoạt động của tế bào NK và các thụ thể giống globulin miễn dịch của tế bào

NK (Killer-cell immunoglobulin-like receptors/ KIR), và vì vậy có ảnhhưởng đến quá trình biệt hóa của tế bào NK [32], [33] Nhiều cytokin baogồm interleukin-21 (IL), IL-15, IL-12, IL-10 và yếu tố chuyển đổi tăng trưởng(TGF-β) có thể làm tăng biểu lộ NKG2A trong tế bào NK [34], [35] Trên cácthành phần (tế bào, mô ) có gắn các phối tử, các thụ thể NKG2A/CD94 phát

ra các tín hiệu ngăn chặn hoạt động của tế bào NK Trong khi đó nếu giánđoạn sự tương tác của NKG2A/CD94 với HLA-E sẽ làm kích hoạt hoạt tínhgây độc tế bào của tế bào NK [28], [36], [37]

Hình 1.4 Thụ thể NKG2A ức chế hoạt động gây độc của tế bào NK thông

qua tương tác với phân tử HLA-E (HLA lớp I)

*Nguồn: Theo Jack G F (2022) [38]

Chú thích: A) Trên tế bào bình thường, biểu lộ phân tử HLA-E (thuộc HLA

lớp I) đóng vai trò là phối tử của thụ thể NKG2A, nhận diện HLA-E (tế bào bình thường) – NKG2A (NK) có tác dụng ức chế hoạt động giết của tế bào

NK; B) Tế bào bất thường (ung thư, nhiễm virus) mất hoặc giảm biểu lộ

HLA-E dẫn tới thụ thể NKG2A không được kích hoạt (không có hoạt động ức chế), dẫn tới tế bào NK trở nên hoạt động và tăng cường khả năng giết tế bào

đích C) Tế bào ung thư có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch thông qua tế

bào NK bằng cách tăng biểu lộ phân tử HLA-E dẫn tới thụ thể ức chế NKG2A luôn trong trạng thái được hoạt động làm cho tế bào NK bị ức chế, giảm hoặc mất khả năng gây độc.

Các thụ thể ức chế của tế bào NK với các phân tử HLA trên bề mặt tếbào đóng vai trò then chốt trong quá trình huấn luyện khả năng nhận diện một

tế bào là bình thường hay bất thường và từ đó ảnh hưởng lớn đến khả năngđáp ứng của tế bào NK trưởng thành [39] Ít nhất có một thụ thể ức chế đặchiệu cho HLA – lớp I cần được biểu lộ trên tế bào NK trưởng thành để nhậnbiết tế bào đích cũng như ngăn cản hoạt hóa tế bào NK chống lại tế bào bìnhthường của cơ thể [40] Thiếu thụ thể ức chế NK với HLA làm cho tế bào NKchuyển thành trạng thái hoạt động [41] (Hình 1.4)

Đến nay, theo nhiều nghiên cứu, thụ thể NKG2A được chứng minhrằng có tăng biểu lộ quá mức ở quần thể tế bào lympho gây độc thâm nhiễmvào khối u (TIL) ở nhiều loại ung thư [42], [43], [44] Sự gia tăng NKG2Aquần thể TIL có NKG2A+ liên quan đến tiên lượng xấu ở bệnh nhân bệnhnhân bị ung thư đại trực tràng, buồng trứng và gan [45], [46] Hơn nữa, ngàycàng có nhiều bằng chứng cho thấy trục tín hiệu NKG2A-HLA-E góp phầngiúp khối u trốn thoát khỏi cơ chế tầm soát miễn dịch (tumor escape fromimmune surveillance) và loại bỏ khả năng gây độc của quần thể TILs ở nhiềuloại khối u [47]

Ngoài vai trò quan trọng với quá trình miễn dịch khối u, NKG2A cònđược chứng minh có vai trò kìm hãm khả năng gây độc của tế bào NK, tế bàoTCD8 trong đáp ứng miễn dịch chống nhiễm trùng, phổ biến như HIV, HBV,HCV, HPV, EBV, HCMV và cả SARS-CoV-2 [28] Ngoài ra, mức độ biểu lộthụ thể NKG2A ở tế bào NK cũng thay đổi tăng hoặc giảm ở nhiều bệnh tựmiễn như ở bệnh nhân Lupus ban đỏ hệ thống (SLE), bệnh viêm khớp dạngthấp, bệnh vẩy nến hay bệnh mảnh ghép chống chủ (GvHD) [28], [48]

1.1.4 Hoạt tính NK

Hoạt tính NK (Nature Killer Activity - NKA) là khả năng hoạt độngcủa tế bào NK khi gặp hoặc được tương tác với các yếu tố kích thích (như các

tác nhân virus gây bệnh, các tế bào bị biến đổi (tế bào ác tính hóa) hoặc một

số cytokin tự nhiên trong cơ thể được chế tiết bởi các tế bào miễn dịch hoặcđược tổng hợp trong phòng thí nghiệm) Hoạt tính NK được cho là một đặcđiểm ổn định xuyên suốt ở các cá thể khỏe mạnh [49] Như vậy, hoạt tính NKthấp, trung bình và cao ở mỗi cá thể không có nhiều thay đổi cho đến khimầm bệnh phát triển Những người có hoạt tính gây độc tế bào của các tếbào NK thấp đã được chứng minh trong một nghiên cứu dịch tễ học có nguy

cơ mắc ung thư cao hơn người bình thường Các gia đình có tỷ lệ mắc ungthư cao đã cho thấy hoạt tính NK giảm so với các gia đình thuộc nhómchứng [49], [50]

Để đánh giá được hoạt tính NK, đến nay có một số phương pháp đã

và đang được sử dụng: Đầu tiên, hoạt tính của các tế bào NK có thể được

đo bằng đánh giá khả năng gây độc của tế bào bằng phương pháp cổ điển

(51Chromium assay) hoặc mới hơn là các xét nghiệm độc tế bào nhuộm huỳnh quang không phóng xạ (non-radioactive fluorescent dye cytotoxicity

assays) [51], [52] (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số phương pháp đánh giá tế bào NK Tên

phương

pháp

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy

[53]

Thử nghiệm giải phóng Chromium-

51 [51,52]

Kỹ thuật tế bào dòng chảy (dấu ấn CD107a, CD69…) [53]

NK VUE – Định lượng hoạt tính tổng số tế bào NK thông qua khả năng chế tiết IFN-

γ [49] Mục đích Đếm số

lượng tế bào NK

Đo độc tính tế bào

NK thông qua đồng nuôi cấy với

Quần thể NK trước hoặc sau nuôi cấy

1mL máu toàn phần

Cách

đánh giá

Đếm số lượng chính xác

Đo lượng Cr 51

giải phóng ra từ tế bào K562 bị gây độc/ ly giải

Đánh giá hoạt tính một tỉ lệ quần thể tế bào có khả năng hoạt hóa sớm (early activated NK cell)

Định lượng thông qua đo mật độ quang học theo nguyên lý ELISA

Tiêu

chuẩn

Gần đây nhất Kim J và cs (2020) đã phát triển xét nghiệm định lượngNKA máu toàn phần (WB) dựa trên kỹ thuật ELISA bằng cách thiết kế các tếbào đích (P815-ULBP1+CD48) có khả năng gây ra kích thích hiệp đồng vớicác tế bào NK thông qua các thụ thể NKG2D và 2B4 [54] Sau đó, nồng độgranzyme B và IFN-γ có nguồn gốc từ tế bào NK được định lượng để đánhgiá mức độ hoạt tính NK của bệnh nhân Đây là xét nghiệm còn tương đốimới và chưa được thực hiện trên nhiều loại bệnh ung thư

Mặc dù có nhiều phương pháp đo hoạt tính NK khác nhau và một sốcòn có những hạn chế như sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc không đánh giáđược hoạt tính của cả hai quần thể tế bào NK Trong số này, phương phápđánh giá hoạt tính NK do công ty NKMAX (Hàn Quốc) nghiên cứu và pháttriển có tên gọi là NK Vue™ (Hình 1.5) là một phương pháp đã được chứngminh có khả năng đánh giá hoạt tính tổng số của quần thể tế bào NK trongmáu ngoại vi Công nghệ này sử dụng một số cytokin có khả năng hoạt hóa tếbào NK ở điều kiện 370C trong vòng 24 giờ như IL-2, IL-12, IL-15, IL-18.Sau khi hoạt hóa, tế bào NK sẽ trở nên hoạt động và chế tiết các hoạt chấtsinh học vào trong môi trường (huyết tương) trong đó có hoạt chất chính làIFN-γ Do cả hai quần thể tế bào NK là CD56bright và CD56dim đều có khả nănggiải phóng IFN-γ nên định lượng nồng độ IFN-γ cho phép đánh giá khả nănghoạt động của toàn bộ quần thể tế bào NK (bao gồm kiểu hình CD56dim vớitiềm năng gây độc tế bào và kiểu hình CD56bright với tiềm năng chế tiết) [49],

[55] Như vậy, trong khuôn khổ nghiên cứu này, “Hoạt tính NK” được hiểu

là khả năng chế tiết cytokin IFN-γ của tế bào NK và có thể định lượng được nồng độ IFN-γ này (đơn vị là pg/mL) dựa theo nguyên lý của kỹ thuật ELISA, hoạt tính NK sau đây được viết tắt là NKA-IFN-γ Xét nghiệm đánh

giá NKA-IFN-γ gần đây đã được sử dụng như một biện pháp hữu ích để kiểmtra các thay đổi trong hoạt động kiểm soát miễn dịch của tế bào NK Từ đó,NKA-IFN-γ có thể cho thấy dấu hiệu của một tình trạng bệnh lý tiềm ẩn hoặcmột bệnh lý đang hiện hữu trong cơ thể người được xét nghiệm

Hình 1.5 Quá trình định lượng NKA-IFN-γ bằng bộ sinh phẩm NK Vue™.

*Nguồn: Theo Lee S.B (2014) [49]

Chú thích: PROMOCA/ống chống đông heparine để lấy 1 ml máu ngoại vi,

ống có chứa các cytokin hoạt hóa NK Lượng IFN-γ do NK chế tiết ra sẽ được định lượng thông qua xét nghiệm ELISA Lượng IFN-γ đo được là một dấu ấn gián tiếp đánh giá chức năng tế bào NK máu ngoại vi.

1.1.5 Tế bào NK với quá trình kiểm soát ung thư

1.1.5.1 Vai trò tế bào NK trong kiểm soát ung thư

Cơ chế:

Các tế bào NK ban đầu nhận ra các tế bào khối u thông qua các tínhiệu stress hoặc biến đổi bất thường từ tế bào Các tế bào NK được kíchhoạt giết trực tiếp các tế bào khối u (tế bào đích) thông qua ít nhất bốn cơchế [56] (Hình 1.6):

Hình 1.6 Vai trò của tế bào NK trong tầm soát miễn dịch đối với tế bào ung thư

*Nguồn: Theo Cheng M (2013) [56]

Chú thích: CTL – tế bào lympho T gây độc; Th1 – Tế bào lympho T hỗ trợ

Cách thứ 1: Tế bào NK giải phóng hạt Granzyme và Perforine dẫn đến

quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào khối u theo hai conđường là phụ thuộc và không phụ thuộc caspase (protein đóng vai trò quantrọng với quá trình chết theo chương trình) Các hạt chứa chất gây độc tế bàođược định hướng về phía tế bào khối u ngay sau khi có tương tác giữa khối u

và tế bào NK, các hạt độc được giải phóng vào khoảng gian bào theo conđường phụ thuộc canxi; các hạt perforin gây ra thủng màng tế bào khối u,đồng thời cho phép các hạt granzyme xâm nhập vào bên trong tế bào khối u,

dẫn đến tế bào chết theo chương trình [55], [57], [58] Cách thứ 2: Gây chết

theo chương trình thông qua trung gian thụ thể gây chết Một số tế bào NK có

biểu lộ yếu tố hoại tử khối u (TNF), chẳng hạn như phối tử FasL hoặc phối tử TRAIL liên quan tới TNF, hai phối tử này có thể gây ra apoptosis cho tế bào khối u bằng cách tương tác với các thụ thể tương ứng của chúng, là Fas và thụ

thể TRAIL (TRAILR) trên tế bào khối u [59], [60], [61] TNF-α được sảnxuất bởi các tế bào NK được kích hoạt cũng có thể gây ra apoptosis tế bào

khối u [62] Cách thứ 3: Bằng cách tiết ra nhiều phân tử (là các cytokin) để

chống lại tế bào ung thư theo nhiều cách khác nhau, bao gồm cả việc hạn chế

sự hình thành mạch khối u và kích thích khả năng đáp ứng miễn dịch thíchứng của cơ thể (chẳng hạn như IFN- γ) [63], [64] Tăng cường các cytokinhoạt hóa hoặc tiếp xúc với các tế bào khối u cũng liên quan đến việc tăng sảnxuất oxit nitric (NO), là điều kiện để tế bào NK nhắm mục tiêu giết tế bào

đích là các tế bào khối u có tín hiệu NO [65], [66] Cách thứ 4: Thông qua

gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC) bởi các tế bào NK có biểu lộCD16+ để giết các tế bào khối u [67], [68] Hoạt động chống khối u của tếbào NK có thể được tăng cường hơn nữa nhờ kích thích cytokin, chẳng hạnnhư IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 hay những chất làm tăng quá trình sản xuất IFN[67], [69], [70]

1.1.5.2 Sự thay đổi đặc điểm NK trong vi môi trường khối u

Để tìm hiểu về ảnh hưởng từ vi môi trường khối u lên quá trình pháttriển cũng như hoạt động chức năng của tế bào NK ở bệnh nhân ung thư,chúng tôi tiến hành phân tích một số nghiên cứu gần đây về vấn đề này trênmột số loại ung thư

Về cơ chế gây rối loạn chức năng tế bào NK trong quá trình ung thư;tác giả Shaver K.A và cs đã tiến hành tổng hợp kết quả từ nhiều nghiên cứu

cho thấy, vi môi trường khối u (Tumor Microenvironment/ TME) là nơi phátsinh nhiều cơ chế ức chế tế bào NK [71] Chuyển hóa tế bào bị rối loạn làmtăng kích thích viêm, tình trạng thiếu oxy mô và các tế bào ức chế miễndịch cục bộ đều có thể thúc đẩy quá trình ngừng hoạt động của tế bào NK

và làm giảm khả năng gây độc tế bào của tế bào NK Các phân tử đượctiết ra như cytokin, adenosin, TGF- β, prostaglandin E2 (PGE2) vàIndoleamin 2,3-dioxygenase (IDO) trong môi trường khối u cũng thúc đẩyquá trình điều hòa giảm chức năng tế bào NK, làm tế bào NK suy kiệt vàchết theo chương trình (Hình 1.7) [71]

Sự mất khả năng của tế bào NK ảnh hưởng tới sự ức chế phát triển củakhối u từ đó ảnh hưởng tới sự tiến triển của bệnh và hiệu quả điều trị Thậtvậy, vi môi trường khối u ảnh hưởng lên khối u rắn đặc biệt gây khó cho khảnăng giết tế bào đích của tế bào NK thông qua rất nhiều cơ chế khác nhau, từviệc ngăn cản quá trình huy động tế bào NK vào nội mô khối u, bên cạnh đólôi kéo các tế bào NK không có khả năng gây độc tế bào(CD56brightCD16low/neg) vào bên trong khối u nhằm giảm hoặc né tránh đượcquá trình kiểm soát miễn dịch của cơ thể chống ung thư [72]

Trong ung thư gan, số lượng tế bào NK trong khối u có kiểu hìnhCD56dimCD16bright giảm đáng kể so với khu vực ngoài khối u [73] Các tế bàonày cũng cho thấy khả năng gây độc tế bào bị suy giảm Gần đây, một tập hợpdưới nhóm mới của các tế bào NK ở gan có biểu lộ của phân tử CD49a đãđược phát hiện, mật độ tế bào NK cao trong nội mô khối u của ung thư biểu

mô tế bào gan cho thấy thời gian sống thêm (OS) và thời gian lui bệnh (DFS)tốt hơn [74] Những tế bào này có nhiều trong vùng phúc mạc của ung thưbiểu mô tế bào gan và được đặc trưng bởi sự biểu lộ của PD1, CD96 vàTIGIT Sự tập trung của các tế bào này trong các khối u gan có tương quanvới tiên lượng xấu, do đó quần thể dưới nhóm tế bào NK này có giá trị gợi ý

về tiến triển của ung thư biểu mô tế bào gan

Trong ung thư tuyến tiền liệt, thử nghiệm đồng nuôi cấy cho thấy rằngcác tế bào khối u đã làm tăng biểu lộ của các thụ thể ức chế và điều hòa giảmcác thụ thể hoạt hóa như NKp46, NKG2D và CD16 trên các tế bào NK, do đóngăn chặn sự nhận diện của tế bào NK [2]

Tương tự, ung thư nội mạc tử cung có sự giảm xâm nhập bởi tế bào

NK Các tế bào này, khi có mặt cho thấy biểu lộ các phân tử đồng ức chế,chẳng hạn như TIGIT và TIM-3, theo tỷ lệ với mức độ nghiêm trọng củabệnh, do đó cho thấy một vai trò của vi môi trường khối u trong việc giảmhuy động các tế bào NK thực hiện chức năng đến vị trí khối u [75]

Hình 1.7 Cơ chế thúc đẩy rối loạn chức năng NK ở vi môi trường khối u

bệnh nhân ung thư

*Nguồn: Theo Shaver K.A (2021) [71]

Chú thích: Các yếu tố được tiết ra từ vi môi trường khối u như cytokin,

adenosin, TGF-β, prostaglandin E2 (PGE2) và Indoleamin 2,3-dioxygenase (IDO) trong môi trường khối u thúc đẩy quá trình điều hòa giảm chức năng

tế bào NK, làm tế bào NK suy kiệt và nhanh chóng bị chết theo chương trình.

1.1.6 Ung thư tuyến tiền liệt và phương pháp điều trị miễn dịch

1.1.6.1 Ung thư tuyến tiền liệt

Tổng quan về ung thư tuyến tiền liệt

UTTTL là một trong những loại ung thư thường gặp nhất ở nam giớivới khoảng 1,1 triệu ca trên toàn thế giới trong năm 2012, chiếm khoảng 15%trong số tất cả các loại ung thư ở nam giới Năm 2018, toàn thế giới có1.276.106 ca mắc mới, chiếm 13,5% các loại ung thư ở nam giới Tại ViệtNam năm 2012, theo số liệu ghi nhận ung thư quần thể của Cơ quan Nghiêncứu Ung thư Thế giới (International Agency for Research on Cancer/ IARC),UTTTL có tỷ lệ mắc và tử vong chuẩn theo tuổi lần lượt là 3,4 và 2,5/100.000dân Bệnh thường gặp hàng thứ 10 trong các ung thư ở hai giới cũng nhưriêng cho giới nam với 1.275 trường hợp mắc mới và 872 trường hợp tử vongước tính mỗi năm trên cả nước Năm 2018, UTTTL đứng hàng thứ 6 trongcác ung thư ở nam giới với 301.174 ca mới mắc và 120.300 ca tử vong Tỷ lệ

tử vong do UTTTL đã giảm trong những năm gần đây do những tiến bộ trongchẩn đoán và điều trị, và cũng một phần là do những hiểu biết của người dân

về bệnh ngày càng tăng lên [76]

Nguyên nhân bệnh UTTTL chưa được xác định rõ Các yếu tố dinhdưỡng như ăn nhiều thịt, chất béo, hay thói quen uống rượu, hút thuốc khôngliên quan rõ rệt đến mắc UTTTL Vai trò phòng ngừa của các acid béo cóthành phần omega 3 cũng không được minh chứng rõ ràng Sự liên quan đếncác yếu tố chuyển hóa, nội tiết… không được khẳng định qua nhiều nghiêncứu khác nhau Cho đến hiện nay người ta vẫn chưa tìm thấy các gen có ýnghĩa sinh ung thư dù nhiều quan sát lâm sàng ghi nhận có vai trò của yếu tốgia đình trong UTTTL

Với sự hữu hiệu của xét nghiệm định lượng PSA và kỹ thuật sinh thiếttuyến tiền liệt, ngày càng có nhiều trường hợp UTTTL được chẩn đoán sớm Tuy nhiên, việc tầm soát UTTTL có thể gây nên những điều trị quá mức,không cần thiết, dẫn đến ảnh hưởng chất lượng sống của người bệnh, và tăngchi phí cho chăm sóc sức khoẻ

Điều trị UTTTL là một chiến lược tổng thể phối hợp đa mô thức baogồm các biện pháp điều trị đặc hiệu tại chỗ hoặc toàn thân và các biện phápchăm sóc giảm nhẹ [76] Đặc biệt, gần đây các tiến bộ trong việc ứng dụngcác công nghệ về miễn dịch trị liệu trong ung thư như sử dụng vắc-xin ungthư, truyền kháng thể đơn clon hay truyền tế bào miễn dịch (T, NK) đã mở ranhững hướng đi mới và có thêm cơ hội kéo dài thời gian sống thêm của bệnhnhân mắc ung thư nói chung và UTTTL nói riêng

Phân loại giai đoạn bệnh

 Theo tiêu chuẩn AJCC (American Joint Committee on Cancer)/ Hiệp

hội Ung thư Hoa Kỳ 2017 UTTTL được phân loại theo hệ TNM (Bảng1.2)

- Tumour (khối u);

- Nodes (u di căn hạch) ;

- Metastasis (di căn xa)

Bảng 1.2 Phân loại giai đoạn UTTTL theo AJCC 2017

*Nguồn: Bộ Y Tế, QĐ số 3130/QĐ-BYT (2020) [76]

1.1.6.2 Liệu pháp miễn dịch, điều trị đích trong ung thư tuyến tiền liệt

Trước đây, liệu pháp miễn dịch trong ung thư chủ yếu là các biện phápthuộc nhóm miễn dịch không đặc hiệu Hiện nay, liệu pháp miễn dịch đặchiệu được chú trọng với hướng nghiên cứu tập trung vào việc giúp các thànhphần của hệ miễn dịch của bệnh nhân có thể nhận diện tế bào ung thư dễ dànghơn và tăng cường hiệu quả của các phản ứng miễn dịch giết tế bào ung thư,như sử dụng các kháng thể đơn clon (như kháng thể kháng PD-1, kháng PD-L1, kháng CTLA-4,…) [76]

Thuốc ức chế chốt kiểm soát miễn dịch PD-1 như Pembrolizumab cũngbước đầu cho thấy có hiệu quả ở một nhóm người bệnh UTTTL di căn khángcắt tinh hoàn và thất bại sau điều trị ít nhất một phương pháp và được FDAchấp thuận điều trị Sipuleucel-T là vaccin cấu tạo bởi các tế bào tua tạo ra từcác bạch cầu đơn nhân chiết xuất từ máu ngoại biên được gây đáp ứng miễndịch với PAP (prostatic acid phosphatase) đã được chứng minh hiệu quả ởbệnh nhân UTTTL kháng cắt tinh hoàn sau điều trị Docetaxel [76]

1.1.7 Một số đặc điểm đặc trưng của tế bào NK trong ung thư tuyến tiền liệt

1.1.7.1 Đặc điểm kiểu hình

Tế bào NK là thành phần chính của hệ thống miễn dịch tự nhiên chốngkhối u, đã được Pasero C và cs phân lập từ khối u để đánh giá mức độ xuấthiện, loại kiểu hình và chức năng của các tế bào NK xâm nhập kiểm soát khối

u tuyến tiền liệt Sự xâm nhập của tế bào NK vào bên trong mô tuyến tiền liệt

có kiểu hình chủ yếu là CD56+ (NCAM1) và hiển thị kiểu hình chưa trưởngthành và không như kỳ vọng, các tế bào NK tại đây tuy đã được hoạt hóanhưng suy giảm hoặc không có khả năng gây độc tế bào [2]

Hơn nữa, nghiên cứu quan sát thấy rằng TGF-β1 được tế bào ung thưtiết nhiều vào vi môi trường tuyến tiền liệt và một phần làm trung gian chocác tác động tăng cường ức chế lên tế bào NK [2], [77] Thêm vào khả năngdung nạp miễn dịch của tế bào NK, vi môi trường tuyến tiền liệt còn trở nên

đề kháng đối với cơ chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào NK xâmnhập khối u trên bệnh nhân ung thư [2] Các đánh giá kiểu hình và thửnghiệm đồng nuôi cấy với tế bào đích của tế bào NK mới phân lập (fresh NKcells) từ mô ung thư hoặc máu ngoại vi bệnh nhân cho thấy tế bào NK ở bệnhnhân UTTTL di căn có tăng cường sự biểu lộ của thụ thể ức chếCD94/NKG2A, ILT2/CD85J và giảm biểu lộ các thụ thể hoạt hóa trên tế bào

NK như NKG2D (KLRK1) và CD16 (FCGR3); đặc biệt nồng độ NKp46(NCR1) trong máu cũng giảm ở bệnh nhân UTTTL và có tương quan nghịchvới mức độ kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt PSA (yếu tố tiên lượngchính của ung thư tuyến tiền liệt), do đó ngăn cản sự nhận diện của tế bào NKđối với các tế bào khối u, khả năng gây độc tế bào đích của quần thể NK ởnhững bệnh nhân này là yếu hơn so với người khỏe mạnh [2] Kết quả nghiêncứu cho thấy, sự thay đổi về kiểu hình và chức năng NK trong máu ngoại vibệnh nhân UTTTL di căn phản ánh sự thay đổi của tế bào này trong mô ungthư [2]

Như vậy, ở bệnh nhân UTTTL cho thấy tế bào NK đã được vi môitrường khối u “thuần hóa” bằng cách ức chế các thụ thể hoạt hóa và tăng biểu

lộ của các thụ thể ức chế, làm tăng biểu lộ của các dấu hiệu suy kiệt và giảmkhả năng ly giải tế bào Đồng thời môi trường ung thư cũng có khả năng làmphân cực tế bào, quá trình này làm tăng sản xuất các yếu tố tiền viêm và tăngtạo mạch khối u, có lợi cho quá trình phát triển của khối u [2] Tuy vậy, dướiảnh hưởng bởi môi trường nuôi cấy và hoạt hóa tế bào NK ngoài cơ thể, cóthể có những biến đổi điều chỉnh về kiểu hình và hoạt tính NK theo hướng