nguyễn như hiệp 21126342

Trichoderma không chỉ phổ biến trong môi trường và dễ phân lập mà còn có thể dễ dàng nhân lên trong các điều kiện có kiểm soát trên nhiều loại giá thể và có thể bảo quản trong nhiều thán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC

Ngành học Sinh viên thực hiện

Mã số sinh viên Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NGUYỄN NHƯ HIỆP : 21126342

: 2021 – 2025

MỤC LỤC

Contents

MỤC LỤC 3

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG 6

DANH SÁCH CÁC BẢNG 7

DANH SÁCH CÁC HÌNH 8

CHƯƠNG 1 NUÔI NẤM TRICHODERMA ĐỂ TẠO SINH KHỐI LỚN 9

1.1. Tổng quan về nấm Trichoderma sp 9

1.1.1 Phân loại 9

1.1.2 Nguồn gốc 9

1.1.3 Đặc điểm hình thái 10

1.1.4 Đặc điểm sinh học 10

1.2 Địa điểm thực hành 12

1.3 Chuẩn bị vật liệu 12

1.4 Chuẩn bị môi trường nhân giống 12

1.6 Kết quả và biện luận 3

1.6.1 Kết quả 3

1.6.2 Biện luận 3

CHƯƠNG 2 KIỂM TRA MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS 4

2.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis 4

2.1.1 Phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 5

Sơ lược về các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 6

2.2 Địa điểm thực hành 6

2.2.1 Chuẩn bị 6

2.3 Quy trình kiểm tra mật độ 7

2.4 Kết quả và biện luận 10

2.4.1 Kết quả 10

2.4.2 Biện luận 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1 Kết quả đếm số lượng khuẩn lạc ở 3 nồng độ 10-4,10-5,10-6 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Trichoderma spp 5

Hình 1.2 Chuẩn bị nito và nước 8

Hình 1.3 Chuẩn bị tấm và trấu 9

Hình 1.4 Chuẩn bị vật liệu 9

Hình 1.5 Trộn đều các thành phần 10

Hình 1.6 Hoàn thành sản phẩm 10

Hình 1.7 Hấp môi trường 11

Hình 1.8 Túi giống sau khi hấp 11

Hình 1.9 Bổ sung dung dịch nấm vào túi giống 12

Hình 1.10 Phơi túi giống 12

Hình 1.11 Túi tăng sinh Trichoderma sau 1 tuần 13

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 14

Hình 2.2 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi 15

Hình 2.3 Chế phẩm sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17

Hình 2.4 Dụng cụ cấy 17

Hình 2.5 Dung dịch mẫu sau khi lắc 15-20 phút 18

Hình 2.6 Pha loãng hỗn hợp mẫu vừa lắc 18

Hình 2.7 Cấy trang 19

Hình 2.8 Đĩa petri nuôi cấy Bt ở mức pha loãng 10-4 20

Hình 2.9 Đĩa petri nuôi cấy Bt ở mức pha loãng 10-5 20

Hình 2.10 Đĩa petri nuôi cấy Bt ở mức pha loãng 10-6 20

CHƯƠNG 1 NUÔI NẤM TRICHODERMA ĐỂ

TẠO SINH KHỐI LỚN

1.1 Tổng quan về nấm Trichoderma sp

Nấm Trichoderma spp là một loại nấm đối kháng có khả năng kiểm soát tất cả các loại nấm gây bệnh khác, giết được nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium,

Rhizoctonia và Fusarium

Hình 1.1 Nấm Trichoderma spp (a) Nấm Trichoderma spp được quan sát gần; (b) Nấm

Trichoderma được nuôi trên môi trường thạch

Nấm Trichoderma spp gồm 4 loại: Trichoderma aureaviride, Trichoderma viride,

Trichoderma koningii và Trichoderma harzianum

1.1.2 Nguồn gốc

Nấm đối kháng Trichoderma là loài hoại sinh, tức chúng sẽ sinh sống bằng cách

phân hủy chất mùn hữu cơ trong đất, xác bả thực vật như lá cây, quả non rụng, cỏ dại

sau khi cắt,… thành các chất hữu cơ, vô cơ để sử dụng cho quá trình phát triển chính nó

và biến các chất này thành dinh dưỡng dễ tiêu hóa cho cây trồng

Chi Trichoderma được phân loại là nấm thiên dưỡng, thường sống dưới dạng nội sinh của thực vật thân gỗ Trichoderma không chỉ phổ biến trong môi trường và dễ phân

lập mà còn có thể dễ dàng nhân lên trong các điều kiện có kiểm soát trên nhiều loại giá thể và có thể bảo quản trong nhiều tháng mà không bị mất khả năng sống và đặc tính của nó

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Trichoderma sp không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PGA,

ban đầu Trichoderma sp có màu trắng, khi sinh ra bào tử chuyển sang xanh đậm, xanh

vàng hoặc lục trắng Bào tử đính có màu sắc khác nhau tùy theo từng loại nấm Thông thường có màu xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Bào tử có thể mọc dày đặc hoặc từng chùm riêng lẽ Ở một số loài, sợi nấm tiết ra những chất làm cho môi trường bên trong có màu vàng, hay tiết ra mùi thơm mang tính đặc trưng Đặc điểm nổi bật của nấm

Trichoderma sp là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng, màu vàng hay

xám Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc oval, đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5µm

1.1.4 Đặc điểm sinh học

Nấm Trichoderma sinh sản vô tính bằng bào tử Bào tử nấm có dạng hình trứng

(elip), màu xanh lục đính trên những sợi nấm Tốc độ phát triển của loài nấm này tương đối nhanh, chúng có thể đạt đường kính từ 2 - 9cm sau khoảng 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt

độ 20oC

1.1.5 Ứng dụng

Hiệu quả của việc sử dụng nấm Trichoderma trong nông nghiệp phụ thuộc vào

hoạt động trao đổi chất của chúng và kiểu tương tác với thực vật và các vi sinh vật khác Những loại nấm này cư trú hiệu quả trên thân rễ cây, sinh quyển, đồng thời tạo ra một

số chất chuyển hóa có tính năng chống vi khuẩn (enzyme phân hủy thành tế bào, kháng sinh, các hợp chất dễ bay hơi và không bay hơi) và kích thích sinh học (phytohormones,

phytoregulators) Hơn nữa, Trichoderma được biết đến với khả năng hấp thụ sâu lịch

trình rễ và tương tác không chỉ với vi sinh vật gây bệnh, mà còn tương tác với toàn bộ

hệ vi sinh vật trong đất

Nấm Trichoderma được sử dụng nhiều trong quá trình xử lí phân chuồng giúp rút

ngắn quá trình ủ và khử mùi hôi của phân chuồng và phế phẩm nông nghiệp

Trichoderma tiết ra loại enzyme có khả năng làm tan vách tế bào của các loại nấm có

hại khác, các enzyme này tấn công vào bên trong nấm bệnh gây hại, biến chúng thành thức ăn và tạo nên hữu cơ có lợi cho đất trồng, bảo vệ vùng rễ cây trồng và chống lại nấm thối rễ

Trichoderma giúp tiêu diệt nấm Fusarium solani (tác nhân gây Vàng lá thối rễ trên

nhiều loại cây trồng, chết nhanh chết chậm trên cây tiêu) Giúp phân hủy cellulose, phân giải lân tan chậm Giúp tăng số lượng rễ mọc sâu Tăng khả năng chống khô hạn của cây trồng, cân bằng pH, giải độc đất hiệu quả

Trichoderma giúp tiết kiệm được lượng phân bón trong quá trình chăm sóc Chúng

có khả năng phòng trị, cạnh tranh hoặc tiêu diệt các tác nhân gây bệnh giúp cải thiện sức khỏe của cây

Ngoài hiệu quả trực tiếp trên các tác nhân gây bệnh ở cây, nhiều loài Trichoderma

kí sinh ở bề mặt rễ cây giúp thay đổi khả năng biến dưỡng của cây Nhiều dòng nấm đã kích thích sự tăng trưởng của cây Giúp gia tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, cải thiện năng suất cây và giúp cây kháng được bệnh

Nấm Trichoderma khi sử dụng trong đất cũng sẽ bám vào xung quanh rễ cây, tiết

ra đất những chất kích thích giúp rễ cây ăn sâu vào lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn

và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ trước nấm và khuẩn cho rễ

Trichoderma khi sống trong đất, sẽ liên tục sinh khối tạo thành lớp lớp Trichoderma

xung quanh rễ như một lớp bảo vệ rễ cây tránh được sự xâm nhập của nhiều loại nấm hại từ bên ngoài Làm giảm khả năng nhiễm bệnh vùng rễ cho cây lên đến trên 70%

Nhờ nấm Trichoderma bám vào các đầu rễ, liên tục sản sinh ra enzyme và chất

dinh dưỡng cho rễ nên giúp cho cây tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất, chất lượng cây trồng

Đối với nấm Trichoderma có khả năng sinh khối rất nhanh trong đất Gần như

chúng sẽ xâm chiếm hoàn toàn vùng đất xung quanh tán cây khi được cấy vào đó Tuy

nhiên, Trichoderma có một điểm yếu đó là khi các chủng nấm hại trong đất quá đông sẽ khiến khả năng đối kháng của chúng giảm đi khá nhiều Đây là lý do vì sao Trichoderma

chủ yếu được sử dụng trong việc phòng bệnh chứ không phải là trị bệnh

1.2 Địa điểm thực hành

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 23/02/2024 đến ngày 01/03/2024

Thực hành được thực hiện tại phòng Xưởng thực nghiệm vi sinh Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

1.4 Chuẩn bị môi trường nhân giống

Bước 1: cân 100g nito được pha vào 1L nước

Hình 1.2 Chuẩn bị nito và nước (a) Cân nito; (b) Pha nito với nước

Bước 2: cân 8kg tấm và 150g trấu

Hình 1.3 Chuẩn bị tấm và trấu (a) Cân tấm; (b) Cân trấu

Bước 3: chuẩn bị bịch và nút bông Bịch gấp lại từ ngoài vào trong và được cố định bằng kim bấm để chừa một lỗ vừa đủ để đậy nút

Hình 1.4 Chuẩn bị vật liệu (a) Gấp nút bông; (b) Chuẩn bị bịch đựng

Bước 4: trộn đều tấm và trấu sau đó thêm từ từ dung dịch nito vào và trộn đều

Hình 1.5 Trộn đều các thành phần (a) Trộn đều trấu với tấm; (b) Trộn hỗn hợp trấu

và tấm với dung dịch nito

Bước 3: cho vào mỗi bịch đã chuẩn bị sẵn 400g và đóng nút bông

Hình 1.6 Hoàn thành sản phẩm (a) Bỏ môi trường vào bịch; (b) Đậy nút bông

Bước 4: cho 20 bịch môi trường vào nồi hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 2 tiếng

Hình 1.7 Hấp môi trường

1.5 Quy trình tiến hành nhân giống

Bước 1: lấy môi trường ra khỏi nồi hấp

Bước 2: cho 10mL nước đã hấp khử trùng vào đĩa nấm chọn làm giống và trang đều để lấy giống nấm

Bước 3: cho dung dịch sau khi trang vào trong bình chứa có chứa 1L nước đã hấp khử trùng và lắc đều

Bước 4: cho vào túi giống đã chuẩn bị mỗi túi 40mL dung dịch giống nấm và lắc đều

Hình 1.9 Bổ sung dung dịch nấm vào túi giống (a) Dung dịch nấm; (b) Đổ dung dịch

vào túi giống

Bước 4: đem túi giống đặt ở nơi có nhiệt độ, độ ẩm phù hợp

Hình 1.10 Phơi túi giống

1.6 Kết quả và biện luận

1.6.1 Kết quả

Sau một tuần nấm Trichoderma spp phát triển tốt, bào tử lan rộng hết túi giống

Hình 1.11 Túi tăng sinh Trichoderma sau 1 tuần

1.6.2 Biện luận

Tăng sinh thành công Trichoderma vì có xuất hiện màu xanh đặt trưng của

Trichoderma trong túi

CHƯƠNG 2 KIỂM TRA MẬT ĐỘ VI KHUẨN

BACILLUS THURINGIENSIS

2.1 Tổng quan về Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là một loài vi khuẩn Gram dương hiếu khí; Sống trong

đất, trong nước, lá cây, côn trùng, tuyến trùng… Có khả năng tạo ra các tinh thể protein độc trong quá trình sinh bào tử Bt là một thành viên của họ Bacillaceae, thuộc nhóm

Bacillus cereus bao gồm các loài B cereus, B thuringiensis, B anthracis, B mycoides,

B pseudomycoides, và B weihenstephanensis Ứng dụng nổi bật nhất của Bt trong thế

kỷ qua là trong lĩnh vực nông nghiệp, chế tạo thuốc trừ sâu sinh học diệt côn trùng gây hại Tính đến nay các nhà khoa học Việt Nam cũng có khoảng thời gian nghiên cứu và ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học Bt hơn 35 năm

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3 - 6µm, có thể đứng riêng lẻ hoặc tạo thành chuỗi Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng

di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8 - 10µm Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn

Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6 - 2µm Bào tử được hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt

độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng

Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp Tinh thể có kích thước 0,6 - 2 µm, có hình dạng không cố định (có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu) Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt

Hình 2.2 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi

2.1.4 Sơ lược về các loại độc tố của Bacillus thuringiensis

Bt có hai pha riêng biệt trong quá trình phát triển tế bào: phân chia tế bào sinh dưỡng và hình thành bào tử Trong cả hai pha, Bt sản sinh ra các protein gây độc cho côn trùng, tuyến trùng, động vật nguyên sinh và động vật có vú Các độc tố Bt xác định mục tiêu cụ thể của chúng thông qua nhận dạng các protein thụ thể đặc hiệu trên màng

tế bào đích

Protein Cry (Crystal protein) là độc tố được biết đến và công bố nhiều nhất từ Bt Cry gây độc tế bào cho ấu trùng côn trùng ảnh hưởng đến cây trồng Hơn nữa, một số độc tố Cry như Cry4A, Cry4B và Cry11A có tác dụng hiệp đồng với độc tố Cyt chống lại các vectơ ấu trùng gây bệnh ở người

PS là một nhóm nhỏ các Cry nhưng không có cấu trúc tương đồng cao với Cry, không có hoạt tính diệt côn trùng và tế bào bình thường, có thể tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư bằng cách nhận ra các thụ thể màng cụ thể, sau khi đã được hoạt hóa bởi các enzym phân giải thành các phân tử polypeptide nhỏ hơn

Độc tố Cyt (Cytolytic protein) có cấu trúc hầu như khác xa độc tố Cry Những độc

tố này ảnh hưởng chủ yếu đến muỗi là vectơ của các bệnh ở người

Độc tố Cry, PS và Cyt được biểu hiện trong quá trình hình thành bào tử, có thể tạo thành các tinh thể protein độc

2.2 Địa điểm thực hành

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 23/02/2024 đến ngày 01/03/2024

Thực hành được thực hiện tại phòng Xưởng thực nghiệm vi sinh Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

2.2.1 Chuẩn bị

2.2.1.1 Chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis

Hình 2.3 Chế phẩm sinh học vi

khuẩn Bacillus thuringiensis

Hình 2.4 Dụng cụ cấy

2.3 Quy trình kiểm tra mật độ

Bước 1: lắc hỗn hợp gồm 10 g/10 mL sản phẩm nuôi cấy cùng với 90mL nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,9% trong 15 - 20 phút

Hình 2.5 Dung dịch mẫu sau khi lắc

15 - 20 phút

Bước 2: pha loãng hỗn hợp vừa lắc theo nồng độ bậc 10 liên tiếp đến nồng độ 10

-7 (mỗi nồng độ 3 lần lặp lại)

Hình 2.6 Pha loãng hỗn hợp mẫu vừa lắc

Bước 3: hút 200µL dịch từ các ống nghiệm của ba nồng độ liên tiếp (10-4, 10-5, 10

-6) để cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường dinh dưỡng với 2 lần lặp lại

C1, C2: lần lượt là số khuẩn lạc đếm được trên đĩa 1 và đĩa 2 ở nồng độ 10-4

C3, C4: lần lượt là số khuẩn lac đếm được trên đĩa 1 và đĩa 2 ở nồng độ 10-5

n1, n2: lần lượt là số khuẩn lạc đếm được ở nồng độ pha loãng 10-4 và 10-5 d: độ pha loãng nhỏ nhất

V: thể tích dịch khuẩn cấy ở mỗi đĩa (mL)

2.4 Kết quả và biện luận

Bảng 2.1 Kết quả đếm số lượng khuẩn lạc ở 3 nồng độ 10-4, 10-5, 10-6

Số khuẩn lạc: đếm số khuẩn lạc sau khi ủ, chọn những đĩa có từ 25-250 khuẩn lạc:

Ở nồng độ 10-4, mật độ khuẩn lạc lớn, không thể đếm được số khuẩn lạc

Ở nồng độ 10-5, có khuẩn lạc đơn và số lượng nằm trong phạm vi 25 - 250 nên đếm được

Ở nồng độ 10-6, ở lần lặp lại 1 số khuẩn lạc đơn có thể đếm được nhưng ở lần lặp lại 2 số lượng khuẩn lạc nằm ngoài phạm vi 25 – 250 nên không đếm được

Điều này có thể do trong quá trình cấy, thao tác cấy không chuẩn làm cho số lượng khuẩn lạc ở các đĩa có sự chênh lệch và mọc không đều không rõ khuẩn lạc đơn

Ở các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6 đều có xuất hiện Bt Tuy nhiên, số khuẩn lạc đơn ở các nồng độ không thỏa điều kiện để tính mật độ khuẩn trong mẫu theo phương pháp CFU