Thực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm

Thực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩmThực trạng nhiễm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm

NGUYỄN THẾ ANH

THỰC TRẠNG NHIỄM PATULIN, AFLATOXIN B1, OCHRATOXIN A TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM TẠI HÀ GIANG VÀ CHẾ TẠO QUE THỬ MIỄN DỊCH

PHÁT HIỆN PATULIN TRONG THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NGUYỄN THẾ ANH

THỰC TRẠNG NHIỄM PATULIN, AFLATOXIN B1, OCHRATOXIN A TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM TẠI HÀ GIANG VÀ CHẾ TẠO QUE THỬ MIỄN DỊCH

PHÁT HIỆN PATULIN TRONG THỰC PHẨM

Ngành: Y học dự phòng

Mã số: 9 72 01 10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS, TS Nguyễn Văn Chuyên

2 GS, TS Nguyễn Văn Ba

Sau thời gian học tập tại Học viện Quân y, được sự giúp đỡ của BanGiám đốc Học viện và các Phòng, Ban và Khoa, đến nay tôi đã hoàn thànhchương trình học tập.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Đảng uỷ, Ban Giám đốc, phòngSau đại học, Khoa Vệ sinh học quân sự đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôitrong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến GS, TS Nguyễn Văn Ba, PGS,TSNguyễn Văn Chuyên, những người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, truyềnđạt kiến thức, tận tình hướng, luôn tin tưởng, khích lệ, tạo mọi điều kiện tốtnhất cho tôi trong quá trình học tập và làm luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô cùng toàn thể cán bộ, nhânviên Khoa Vệ sinh học quân sự, Học viện Quân y đã luôn giúp đỡ, hướng dẫn

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu đểtôi hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sỹ, các nhàkhoa học trong hội đồng chấm luận văn đã dành thời gian để cho tôi những ýkiến quý báu trong quá trình hoàn thiện và bảo vệ luận án

Tôi xin được gửi lời biết ơn tới những người thân trong gia đình đãluôn động viên giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trìnhhọc tập và nghiên cứu Tôi trân trọng cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bêntôi, động viên và hỗ trợ cho tôi

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Nguyễn Thế Anh

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

Đề tài khoa học và công nghệ cấp Quốc gia “Nghiên cứu đặc điểm nhiễm độc

tố vi nấm trong một số thực phẩm tại Việt Nam và chế tạo que thử bán định lượng phát hiện nhanh, đồng thời một số độc tố vi nấm” (Học viện Quân y

chủ trì) Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể nghiên cứuviên thuộc đề tài Tôi là thành viên nghiên cứu của đề tài và đã được cácthành viên nghiên cứu của đề tài đồng ý cho phép sử dụng một phần số liệu từ

đề tài này vào trong luận án để bảo vệ luận án tiến sĩ Các kết quả nêu trongluận án là trung thực và được công bố một phần trong các bài báo khoa học.Luận án chưa từng được công bố ở bất cứ đâu Nếu có điều gì sai tôi xin hoàntoàn chịu trách nhiệm

TÁC GIẢ

Nguyễn Thế Anh

LỜI CAM ĐO

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về một số độc tố vi nấm 3

1.1.1 Khái niệm độc tố vi nấm 3

1.1.2 Phân loại độc tố vi nấm 4

1.1.3 Một số độc tố vi nấm thường gặp 6

1.2 Thực trạng thực phẩm bị nhiễm độc tố vi nấm 11

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 12

1.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 13

1.3 Phương pháp, kỹ thuật xét nghiệm và phát hiện độc tố vi nấm 17

1.3.1 Phương pháp lý hóa 17

1.3.2 Phương pháp sinh học 19

1.4 Nghiên cứu về que thử phát hiện độc tố vi nấm 21

1.4.1 Que thử miễn dịch dòng chảy bên 21

1.4.2 Một số nghiên cứu chế tạo que thử miễn dịch phát hiện độc tố vi nấm trong thực phẩm 24

1.5 Tổng quan về địa bàn nghiên cứu 26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm, thiết kế nghiên cứu 30

2.1.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 30

2.1.2 Thiết kế nghiên cứu 31

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 36

2.3 Nội dung và các chỉ tiêu nghiên cứu 37

2.4 Kỹ thuật lấy mẫu, phương pháp xét nghiệm và đánh giá 37

2.4.1 Kỹ thuật lấy mẫu 37

2.4.2 Phương pháp xét nghiệm 38

2.4.3 Phương pháp đánh giá 43

2.5 Chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm 43

2.5.1 Xây dựng quy trình lý thuyết chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin .43

2.5.2 Quy trình chế tạo que thử miễn dịch 44

2.5.3 Xác định các thông số kỹ thuật và khả năng phát hiện patulin của que thử miễn dịch 53

2.6 Xử lý số liệu 55

2.7 Đạo đức nghiên cứu 55

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1 Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang 56

3.1.1 Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin trong một số thực phẩm tại Hà Giang 56

3.1.2 Kết quả phân tích độc tố vi nấm aflatoxin B1 trong một số thực phẩm tại Hà Giang 59

3.1.3 Kết quả phân tích độc tố vi nấm ochratoxin A một số thực phẩm tại Hà Giang 63

3.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình, chế tạo, xác định các thông số, khả năng phát hiện patulin của que thử miễn dịch 67

3.2.2 Xác định thông số kỹ thuật và khả năng phát hiện patulin của que thử

miễn dịch 84

3.2.3 Kết quả quá trình chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm 88

Chương 4 BÀN LUẬN 89

4.1 Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin, aflatoxin B1, achratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang 89

4.1.1 Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin trong một số thực phẩm chỉ điểm tại Hà Giang 89

4.1.2 Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin B1 trong các mẫu ngô, gạo, lạc và các loại hạt có dầu được thu thập tại Hà Giang 92

4.1.3 Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm ochratoxin A trong thực phẩm được thu thập tại Hà Giang 95

4.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình, chế tạo, xác định thông số kỹ thuật, khả năng phát hiện patulin trong thực phẩm của que thử miễn dịch 96

4.2.1 Nghiên cứu chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin 96

4.2.2 Xác định một số thông số kỹ thuật, khả năng phát hiện patulin trong thực phẩm của que thử miễn dịch 108

KẾT LUẬN 110

HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI 112

KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC Y

4 BSA Bovine Serum Albumine (Albumine huyết thanh bò)

5 Borat Borate buffer (Đệm Borate)

7 CEA Carcinoembryonic antigen (Kháng nguyên ung thư phổi)

8 ĐTVN Độc tố vi nấm (Mycotoxin)

10 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Kỹ thuật miễndịch gắn enzym)

11 Fab Đầu biến thiên của kháng thể

12 GC Gas Chromatography (Sắc ký khí)

13 GNP Gold Nanoparticles (Hạt nano vàng)

15 HIV Human Immunodeficiency virus

17 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏnghiệu năng cao)

19 IAC Immuno affinity chromatography (Xét nghiệm sắc ký

20 LC/MS Liquid chromatography/mass spectrometry (Sắc kýlỏng khối phổ)

21 LD50 Liều độc gây chết 50% động vật thực nghiệm

22 LFIA Lateral flow immunochromatography assay (Xétnghiệm miễn dịch dòng chảy bên)

23 LOD Limited of detection (Ngưỡng phát hiện)

24 MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (Dung dịch đệmMES)

27 PBS Phosphat Buffered Saline (Dung dịch đệm phosphat)

28 POC Point of care (Xét nghiệm tại chỗ)

29 pM Picomet (Đơn vị đo chiều dài)

33 TBS Tris Buffered Saline (Dung dịch đệm Tris)

35 TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lỏng lớp mỏng)

36 UV-Vis Tử ngoại khả kiến (Ultra violet – Visible)

37 WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Một số nhóm nấm sản sinh độc tố vi nấm chính 5

2.1 Số lượng mẫu thực tế đã lấy tại thực địa 35

2.2 Kết quả kiểm tra hệ số thu hồi đối với patulin 39

2.3 Kết quả kiểm tra hệ số thu hồi đối với aflatoxin B1 41

2.4 Kết quả kiểm tra hệ số thu hồi đối với ochratoxin A 43

2.5 Lựa chọn loại dung dịch đệm 50

3.1 Kết quả xét nghiệm patulin trong nước quả, rượu táo, sản phẩm từ táo tại Hà Giang và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt giới hạn cho phép 56

3.2 Kết quả xét nghiệm patulin và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo nhóm thực phẩm 57

3.3 Kết quả xét nghiệm patulin trong nước quả, rượu táo, sản phẩm từ táo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo địa phương 57

3.4 Kết quả xét nghiệm patulin trong nước quả, rượu táo, sản phẩm từ táo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP theo cơ sở lấy mẫu 58

3.5 Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang 59

3.6 Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo nhóm thực phẩm 59

3.7 Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo địa phương 60

3.8 Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu vượt GHCP tại Hà Giang theo cơ sở lấy mẫu 61

3.9 Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong lạc và các loại hạt có dầu và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang 61

mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo nhóm thực phẩm 62

3.11 Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong lạc và các loại hạt có dầu và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo địa phương 62

3.12 Kết quả xét nghiệm ochratoxin A trong trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang 63

3.13 Kết quả xét nghiệm ochratoxin A trong trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo nhóm thực phẩm 64

3.14 Kết quả xét nghiệm ochratoxin A trong trong ngô, gạo và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo địa phương 64

3.15 Kết quả xét nghiệm ochratoxin A trong trong các mẫu gia vị và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang 65

3.16 Kết quả xét nghiệm ochratoxin A trong trong các mẫu gia vị và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo loại thực phẩm 65

3.17 Kết quả xét nghiệm ochratoxin A trong trong các mẫu gia vị và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo địa phương 66

3.18 Tổng hợp tình trạng nhiễm và vượt GHCP của patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong thực phẩm tại Hà Giang 66

3.19 Kết quả lựa chọn kích thước hạt từ để chế tạo LFIA 68

3.20 Kết quả lựa chọn kích thước hạt nano vàng để chế tạo LFIA 69

3.21 Kết quả tối ưu hóa pH của dung dịch đệm 70

3.22 Kết quả tối ưu hóa nồng độ kháng thể hấp thụ trên hạt nano vàng 72

3.23 Kết quả tối ưu thể tích của dung dịch đệm 74

3.24 Kết quả tối ưu dung dịch đệm nhỏ lên que thử 75

3.25 So sánh khoảng phát hiện, LOD của hạt nano từ và hạt nano vàng 76

phóng phức hợp hạt vàng-kháng thể 77

3.27 Kết quả thử nghiệm tính ổn định hạt vàng-kháng thể trên màng cộng hợp .79

3.28 Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm xử lý màng mao dẫn 80

3.29 Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm xử lý màng hút mẫu 81

3.30 Kết quả tối ưu nồng độ kháng nguyên patulin-OVA 82

3.31 Kết quả thử nghiệm giới hạn phát hiện của que thử 85

3.32 Kết quả thử nghiệm tính ổn định của que thử miễn dịch khi bảo quản ở nhiệt độ khác nhau 85

3.33 Độ nhạy, độ đặc hiệu của que thử miễn dịch 86

3.34 So sánh kết quả phát hiện patulin của que thử miễn dịch với HPLC 87

Hình Tên hình Trang

1.1 Quả táo bị nhiễm Penicillium expansum 7

1.2 Cấu tạo của patulin 8

1.3 Cấu tạo của aflatoxin B1 9

1.4 Cấu tạo của ochratoxin A 11

1.5 Cấu trúc que thử miễn dịch 21

1.6 Sự khác nhau về màu sắc của hạt nano vàng có kích thước khác nhau 22

1.7 Mối liên quan giữa đặc tính của màng mao dẫn và độ nhạy của que thử .23

2.1 Sơ đồ tổ chức nghiên cứu 31

2.2 Sơ đồ minh họa que thử miễn dịch phát hiện patulin 44

2.3 Sơ đồ quy trình phủ APTES lên hạt nano từ 45

3.1 Kết quả gắn kháng thể nhận diện lên hạt nano từ 67

3.2 Kết quả thử nghiệm hạt nano từ với đường kính khác nhau trong chế tạo que thử 68

3.3 Kết quả thử nghiệm hạt nano vàng với đường kính khác nhau trong chế tạo que thử 69

3.4 Kết quả tối ưu hoá pH dung dịch đệm 71

3.5 Thay đổi màu sắc của dung dịch hạt vàng-kháng thể sau khi thêm NaCl 0,1M 72

3.6 Hình ảnh kết quả thử nghiệm tối ưu hoá thể tích kháng thể gắn trên hạt nano vàng 73

3.7 Hình ảnh que thử với mẫu chuẩn có nồng độ kháng nguyên 1 µg/l khi sử dụng thể tích dung dịch đệm khác nhau 74

3.9 Thử nghiệm LFIA hạt nano từ và nano vàng với nồng độ patulin

khác nhau 76

3.10 Hình ảnh kết quả lựa chọn hệ đệm để tăng giải phóng phức hợp hạt nano vàng-kháng thể 78

3.11 Kết quả thử nghiệm que thử miễn dịch với mẫu chuẩn patulin nồng độ 1 µg/l ở thời điểm 1 tháng và 3 tháng 79

3.12 Kết quả thử nghiệm que thử miễn dịch với màng mao dẫn có được xử lý (1) và không được xử lý (2) với mẫu âm tính 80

3.13 Kết quả thử nghiệm que thử miễn dịch khi xử lý màng hút mẫu 81

3.14 Hình ảnh kết quả tối ưu hóa nồng độ kháng nguyên patulin-OVA trên vạch phát hiện 82

3.15 Que thử miễn dịch dòng chảy bên với bề rộng là 0,3 cm 83

3.16 Xác định thời gian xét ngiệm với que thử có chiều rộng 0,3cm 83

3.17 Xác định giới hạn phát hiện của que thử miễn dịch 84

3.18 Kết quả thử nghiệm độ ổn định của que thử miễn dịch khi bảo quản ở nhiệt độ khác nhau trong thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng 86

3.19 Sơ đồ hoá kết quả chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin 88

ĐẶT VẤN ĐỀ

Độc tố vi nấm là các độc tố do nấm mốc sinh ra Sự xuất hiện của độc tố vinấm trong thực phẩm đã trở thành mối quan tâm trên toàn thế giới và là vấn đềkinh tế ảnh hưởng đến cả các nước sản xuất và nhập khẩu thực phẩm Tổ chứcLương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc ước tính khoảng 25% cây trồngtrên thế giới, bao gồm nhiều loại thực phẩm cơ bản bị nhiễm nấm sản sinh độc

tố [1] Con người phơi nhiễm với độc tố vi nấm thông qua việc tiếp xúc và sửdụng thực phẩm bị nhiễm độc tố vi nấm Ảnh hưởng sức khỏe khi phơi nhiễmvới độc tố vi nấm bao gồm: ung thư, biến đổi gen, dị tật bẩm sinh, sảy thai,độc trên gan, thận, ức chế miễn dịch [2]

Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm tại Việt Nam nói chung, và Hà Giang nóiriêng là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc Đồng thời, Hà Giang

là tỉnh có kinh tế - xã hội - y tế kém phát triển, người dân chưa có thói quen tốttrong bảo quản lương thực - thực phẩm, tình trạng ô nhiễm lương thực - thựcphẩm nói chung và ô nhiễm độc tố vi nấm cao Trong 9 tháng đầu năm 2023, tại

Hà Giang xảy ra 11 vụ ngộ độc thực phẩm với 58 ca mắc, 6 ca tử vong [3]

Độc tố vi nấm là những hợp chất ổn định về mặt hóa học, bền với cácbiện pháp xử lý thông thường trong chế biến thực phẩm nên biện pháp hiệu quảnhất để đảm bảo an toàn thực phẩm là phân tích nhanh, chính xác các độc tố nàynhằm ngăn ngừa các sản phẩm có nồng độ độc tố vi nấm vượt giới hạn cho phéplưu hành trên thị trường

Để bảo vệ sức khoẻ người dân và thuận lợi cho công tác quản lý chấtlượng thực phẩm, Bộ Y tế nước ta đã ban hành Quy chuẩn kỹ thuật Quốc giađối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm Trong quy định nàyxác định 6 loại độc tố vi nấm phổ biến tại Việt Nam gồm aflatoxin, ochratoxin,patulin, deoxynivalenol, zearalenone, fumonisin [4] Một số loại độc tố vi nấmđược xếp vào nhóm chất gây ung thư trên người như aflatoxin B1 (nhóm 1A),

ochratoxin A (nhóm 2B) và đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp pháthiện, định lượng độc tố các chất trên Trong những năm gần đây, nhiều nghiêncứu cho thấy patulin cũng gây ung thư, đột biến gen, dị tật bẩm sinh và sảy thaitrên động vật thực nghiệm, mặc dù hiện nay độc tố này đang được Cơ quannghiên cứu ung thư Quốc tế xếp vào nhóm 3 [5] Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa

có nghiên cứu về tình trạng nhiễm patulin trong thực phẩm cũng như que thửphát hiện độc tố này

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài nhằmhai mục tiêu:

1 Đánh giá thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang (2021-2023).

2 Chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về một số độc tố vi nấm

1.1.1 Khái niệm độc tố vi nấm

Độc tố vi nấm (ĐTVN) là các chất hóa học có độc tính được sinh ra trong

tự nhiên bởi một số chủng vi nấm có khả năng sinh độc tố Thuật ngữ ĐTVN

(mycotoxin) bắt nguồn từ thuật ngữ “mykes” trong tiếng Hy lạp có nghĩa là vi nấm và thuật ngữ “toxicum” trong tiếng La-tinh có nghĩa là chất độc thuật ngữ

này được các nhà nghiên cứu Anh giới thiệu vào năm 1962 [6]

Thuật ngữ “ĐTVN” thường được dành cho các sản phẩm hóa học độc hạitương đối nhỏ (khối lượng phân tử ∼700 Da), được hình thành dưới dạng chấtchuyển hóa thứ cấp bởi một số loại nấm dễ dàng xâm nhiễm cây trồng tại đồngruộng hoặc sau khi thu hoạch[7]

ĐTVN là các sản phẩm tự nhiên có trọng lượng phân tử thấp được tạo rabởi nấm mốc gây độc cho động vật có xương sống ở nồng độ thấp Trong hầuhết các trường hợp, ĐTVN được tạo ra bởi một số loài trong một số chi nấmnhất định Động vật phơi nhiễm với ĐTVN qua đường ăn uống, hít phải, tiếpxúc với da [8] Một số loại ĐTVN nhất định được sản xuất bởi nhiều hơn mộtloài nấm, và một số loại nấm có khả năng sản xuất nhiều hơn một loại độc tố.Tình trạng ô nhiễm nấm, ĐTVN ở các nước đang phát triển, các nước vùng nhiệtđới cao hơn so với các nước phát triển và ôn đới [9] Cho đến nay, trên 300 loại

ĐTVN đã được phát hiện và nghiên cứu Trong đó, nấm Aspergillus, Fusarium, Penicillium là 3 loại nấm chính sản sinh ra ĐTVN [10]

Bệnh do tiếp xúc với ĐTVN được gọi là nhiễm độc ĐTVN Nhiều ĐTVN

có tác dụng mạnh ở liều lượng thấp, nghĩa là, một lượng khá nhỏ độc tố này cóthể gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe Vì nấm sợi là sinh vật phổ biến và cơhội nên ĐTVN rất phổ biến Chúng được tìm thấy trong thực phẩm và thức ăn

chăn nuôi trên toàn cầu và ngày càng được quan tâm Giống như tất cả các chấtđộc, phương thức phơi nhiễm, liều lượng và thời gian phơi nhiễm tương tác vớinhau quyết định mức độ nghiêm trọng của nhiễm độc ĐTVN là nguyên nhângây ra bệnh ung thư cũng như nhiều rối loạn khác nhau ảnh hưởng đến hệ tiêuhóa, hệ tiết niệu - sinh dục, mạch máu, thận và thần kinh Một số ĐTVN gâysuy giảm miễn dịch, do đó làm giảm khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm [8]

Nguy cơ nhiễm ĐTVN qua đường ăn uống cao hơn nguy cơ nhiễm cáchóa chất tổng hợp, độc tố thực vật, phụ gia thực phẩm hoặc dư lượng thuốc trừsâu Nhiễm độc ĐTVN phổ biến hơn ở các quốc gia có thu nhập thấp, thựcphẩm chủ yếu thường xuyên bị ô nhiễm và các biện pháp kiểm soát còn hạnchế Mặc dù nấm sinh độc tố có thể tạo ra hàng trăm chất chuyển hóa độc hại,nhưng chỉ một số ít trong số đó gây ra mối lo ngại nghiêm trọng đối với sứckhỏe con người và động vật trên toàn thế giới: AF được sản xuất bởi các loài

thuộc chi Aspergillus; fumonisins được sản xuất chủ yếu bởi các loài Fusarium, thuộc chi Aspergillus; OTA được sản xuất bởi các loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium; PAT được sản xuất bởi loài Penicillium; các ĐTVN được tạo ra bởi các loài Fusarium như trichothecenes chủ yếu là độc tố T-2 và HT-2

(trichothecenes loại A), deoxynivalenol, nivalenol và các dẫn xuất liên quan(trichothecenes loại B), zearalenone [11]

Các ĐTVN chính được liệt kê trong bảng 1.1, được phân loại theo giốngnấm sản sinh ra chúng Các chi quan trọng của nấm sản sinh ĐTVN bao gồm

Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Claviceps, Fusarium, Myrothecium,

Penicillium và Stachybotrys cũng như các dạng biến đổi của chúng (trong giai

đoạn sinh sản) [8]

Bảng 1.1 Một số nhóm nấm sản sinh độc tố vi nấm chính

Tên hợp chất và nguồn gốc Ảnh hưởng gây độc

Alternaria toxins

Tenuazonic acid Chất ức chế tổng hợp protein

AA-toxins Chất ức chế chuyển hóa spakenolipid

Aspergillus species

Aflatoxins Chất gây ung thư, gây đột biến, gây dị tật

bẩm sinhCyclopiazonic acid Chất gây rối loạn vận chuyển canxi

Sterigmatocystin Chất gây ung thư, gây đột biến

Verruculogen Chất gây hội chứng độc tremorgen

Claviceps toxins

Ergot alkaloids Chất co mạch, chất độc thần kinh

Fusarium toxins

Butennolide Bệnh Fescue foot ở gia súc

Fumonisin Chất ức chế chuyển hóa spakenolipid

Moniliformin Chất gây tổn thương nhiễm sắc thể, suy timTrichothecenes Chất ức chế tổng hợp protein

Deoxynivalenol (‘vomitoxin’) Chất gây nôn

Diacetoxyscirpenol Chất gây xuất huyết

Penicillium toxins

Citrinin Độc tố thận, độc tố gan, độc tố thai nhi

Mycophenolic acid Thuốc ức chế miễn dịch

Patulin Thuốc ức chế miễn dịch, chất độc thần kinh

Xanthomegnin Độc tố gan, độc tố thận

Stachybotrys toxins

Satratoxin Chất ức chế tổng hợp protein

* Nguồn: Theo Bennett J.W., Klich M (2009) [8]

1.1.3 Một số độc tố vi nấm thường gặp

1.1.3.1 Patulin

PAT (C7H6O4) là một polypetide lactone được sản xuất bởi nhiều loại nấm

khác nhau, trong đó P expansum là chủ yếu P expansum có thể gây ô nhiễm ở

nhiều loại trái cây và rau quả khác nhau nhưng nó phổ biến nhất là táo Vì vậy,táo và các sản phẩm thực phẩm làm từ táo là nguồn phơi nhiễm PAT chính củacon người PAT lần đầu tiên được xác định vào năm 1943 với tên gọi tercinin

[13] Một số loại nấm mốc sản xuất PAT bao gồm P expansum, A sp, B fulva và

B nivea PAT là một hợp chất phân cực nhỏ, hòa tan trong nước, được hấp thu

nhanh, chuyển hóa và bài tiết qua nước tiểu [14]

Mặc dù được phân loại vào nhóm 3 về tính chất gây ung thư, nhưngIARC đã bày tỏ quan ngại sâu sắc về khả năng khả năng gây ung thư của PAT[15], [16] PAT và tiền chất của nó là axit 6-methylsalicylic có nguồn gốc từAcetyl-CoA, chất này tạo thành polypetide và ĐTVN gây ung thư Chúng cókhả năng gây đột biến gen ở các tế bào động vật có vú khác nhau Tiêm PATdưới da hai lần một tuần trong 15 tháng cho thấy sự phát triển của các tế bàokhối u ác tính ở khu vực tiêm, chứng tỏ tác dụng gây ung thư của ĐTVN này.PAT được phát hiện là có khả năng gây đột biến, gây ung thư, gây quái thai và

có xu hướng gây tổn thương đường ruột, gây tổ thương DNA tế bào ở vi khuẩn

và con người [17]

Các triệu chứng cấp tính khi tiếp xúc với PAT gây suy giảm miễn dịch, đặcbiệt là ức chế chức năng đại thực bào, nhiễm độc thần kinh và có thể gây tổnthương gan, lá lách và thận [14] Ở loài gặm nhấm, LD50 qua đường uống củaPAT nằm trong khoảng từ 29 mg/kg đến 55 mg/kg trọng lượng cơ thể Gia cầm ítnhạy cảm hơn, với LD50 đường uống là 170 mg/kg thể trọng Khi dùng quađường tiêm tĩnh mạch, qua phúc mạc hoặc dưới da, PAT độc hơn gấp 3-6 lần.Các dấu hiệu độc hại được báo cáo nhất quán trong tất cả các nghiên cứu là trạng

thái kích động, trong một số trường hợp co giật, khó thở, tắc nghẽn phổi, phù nề

và loét, tăng huyết áp và tăng nhu động dạ dày, ruột [18]

Hình 1.1 Quả táo bị nhiễm Penicillium expansum

* Nguồn: Theo Puel và cs (2010) [18]

Nhiều nghiên đã chứng minh rằng cơ chế gây độc chính của PAT thôngqua hiện tượng stress oxy hoá Các hóa chất phản ứng có chứa oxy được gọi làgốc oxy hoạt tính (ROS), bao gồm peroxit, gốc hydroxyl, superoxide và các loạikhác [19] ROS thường là sản phẩm phụ tự nhiên của quá trình chuyển hóa tếbào bình thường; chúng cũng có thể được tạo ra bởi các enzym oxidoreductase

và trong quá trình oxy hóa có xúc tác kim loại ROS đóng vai trò quan trọngtrong việc truyền tín hiệu tế bào và chu kỳ tế bào Các tế bào có thể tạo ra ROSnhư một phản ứng đối với xenobiotic, cytokine và sự xâm nhập của vi sinh vật.Khi lượng ROS vượt quá khả năng chống oxy hóa của tế bào sẽ xuất hiện tìnhtrạng stress oxy hóa Stress oxy hóa có thể gây tổn thương một số đại phân tử(protein, DNA và lipid) Nồng độ ROS cao đã được chứng minh ở nhiều bệnhkhác nhau bao gồm tiểu đường, ung thư, thoái hóa thần kinh và lão hóa [20]

ROS quá mức có thể gây ra hiện tượng tự thực bào Việc kích hoạt hệthống tự thực bào bao gồm sự thoái hóa số lượng lớn của một số protein tế bào

chất bên cạnh sự thoái hóa có chọn lọc của các bào quan tế bào chất Cơ chếnhư vậy đã được quan sát thấy ở các tế bào gan (HepG2) tiếp xúc với PAT, việcđiều trị các tế bào bằng chất ức chế hình thành autophagosome (3-methyladenine) đã làm giảm độc tính của PAT, điều này cho thấy con đườngnhiễm độc PAT có thể trải qua quá trình tự thực bào do stress oxy hóa [21].

Hình 1.2 Cấu tạo của patulin

* Nguồn: Theo Ahmadi-Zenouz A và cs (2007) [22]

Tại châu Âu và Việt Nam, quy định GHCP đối với PAT là 50 µg/kg đốivới nước táo và rượu táo, 25µg/kg đối với các sản phẩm táo dạng rắn và 10µg/kg trong các sản phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ [4], [23]

1.1.3.2 Aflatoxin B1

Nấm A flavus, A parasiticus và A nominus sản sinh ra AF Tuy nhiên, A flavus là loài phổ biến nhất [24] Cho đến nay, gần 20 loại AF khác nhau đã được xác định Các chủng nấm thuộc loài A flavus thường tạo ra AFB1 và AFB2, trong khi A parasiticus tạo ra AFG1 và AFG2 AFB2 và AFG2 là dẫn xuất

dihydro của các hợp chất gốc, còn AFM1 và AFM2 là các chất chuyển hóahydroxyl hóa của AFB1 và AFB2 và được bài tiết qua sữa ở động vật nhai lại khi

ăn thức ăn bị nhiễm các ĐTVN này AF hiện diện nhiều ở các vùng nhiệt đới vàcận nhiệt đới, nơi có điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tối ưu cho quá trình sản sinhđộc tố [25] Nấm sản sinh ra AF xuất hiện ở nhiều loại thực phẩm như đậu

phộng, gạo, lúa mì, ngô, đậu nành, pho mát, hạt ca cao, thịt, rượu vang, bơ và gia

vị [26]

Hình 1.3 Cấu tạo của aflatoxin B1

* Nguồn: Theo Bennett J.W., Klich M (2009) [8]

Đợt bùng phát bệnh do nhiễm AF được công bố rộng rãi và được biết đếnnhiều nhất xảy ra vào đầu 1960 ở Anh khi một số lượng lớn gà tây non mắc phải

"Bệnh Turkey-X" chưa được ghi nhận trước đó Sau đó, người ta xác định rằngnhững cái chết của gia cầm này là do tổn thương gan nghiêm trọng xảy ra khigia cầm trong trang trại ăn thức ăn có lạc chứa một lượng khá đáng kể nấm mốc

S flavus [26] Sau sự bùng nổ của bệnh Turkey - X ở Vương quốc Anh vào năm

1960, Aflatoxin đã được phân lập Khả năng gây ung thư của AF đã sớm đượcxác định [27]

AF được hấp thu nhanh chóng và chuyển hóa chủ yếu ở gan trong hệthống vi thể thành các chất chuyển hóa có độc tính thấp hơn hoặc được giải độc.Tốc độ trao đổi chất và các sản phẩm được hình thành quyết định sự khác biệt

về tính nhạy cảm của loài với AF Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứngminh AFB1 là yếu tố căn nguyên chính gây ung thư biểu mô tế bào gan ở nhữngngười bị nhiễm vi rút viêm gan B [27]

Bằng chứng về bệnh do nhiễm AF cấp tính ở người đã được báo cáo từnhiều nơi trên thế giới Các điều kiện làm tăng khả năng mắc bệnh AF cấp tính

ở người bao gồm nguồn thức ăn sẵn có hạn chế, điều kiện môi trường thuận lợicho nấm phát triển trên cây trồng và thiếu hệ thống quản lý để theo dõi và kiểm

soát AF [28] Các nghiên cứu cho thấy phơi nhiễm AF có thể gây quái thai, sinhnon, sẩy thai và làm chậm sự phát triển của thai nhi trên người và động vật [29].

Theo QCVN 8-1:2011/BYT, GHCP của AFB1 trong các loại thực phẩmdao động từ 2-12 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg đối với AF tổng số.GHCP đối với thực phẩm dùng cho trẻ nhỏ dưới 36 tháng tuổi được quy định là0,1 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg (AFB1) [4]

1.1.3.3 Ochratoxin A

Ochratoxin A (OTA) là một loại ĐTVN được sản xuất bởi nấm

Aspergillus ochraceus, A carbonarius, A niger và Penicillium [30] Kể từ khi

OTA được phát hiện, nó đã trở nên phổ biến như một chất gây ô nhiễm tựnhiên trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bị mốc Con người tiếp xúc vớiOTA có thể bị nhiễm độc cấp tính (đặc biệt là qua đường hô hấp dẫn đến suythận cấp trong vòng 24 giờ) và các bệnh lý mãn tính như ung thư biểu môđường tiết niệu trên OTA đóng vai trò chính trong sinh bệnh học của một sốbệnh thận bao gồm bệnh thận lưu hành vùng Balkan, khối u thận ở một sốvùng của bán đảo Balkan, bệnh thận kẽ mãn tính ở các nước Bắc Phi và có thể

ở các nơi khác trên thế giới OTA dẫn đến sự hình thành chất cộng DNA, đượcbiết đến với tính độc gen và khả năng gây ung thư [31]

Hình 1.4 Cấu tạo của ochratoxin A

* Nguồn: Theo Bennett J.W., Klich M (2009) [8]

Loài, giới tính và đường hấp thu ảnh hưởng đến độc tính của OTA Giá trị

LD50 dao động từ 3,4 mg/kg thể trọng đối với gà chân trắng đến 30,3 mg/kg đối

với chuột Đường hấp thu qua phúc mạc có khả năng ảnh hưởng nhanh hơnđường uống Thận là cơ quan đích, được chứng minh bằng những thay đổi vềchức năng và hình thái, nhưng các tác động khác cũng đã được quan sát thấy Ví

dụ, ở chuột, những bất thường được ghi nhận ở hình thái gan, ống tiêu hoá, tim,tuỷ xương, và các yếu tố đông máu [32]

QCVN 8-1:2011/BYT quy định GHCP của OTA trong một số loại thựcphẩm như ngũ cốc sử dụng làm thực phẩm, các sản phẩm từ ngũ cốc (3 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg),hạt cà phê rang và cà phê bột (5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg), rượu vang (2 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/l) và gia vị (30 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg);với các sản phẩm dùng cho trẻ nhỏ, quy định là 0,5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg [4]

1.2 Thực trạng thực phẩm bị nhiễm độc tố vi nấm

Các nghiên cứu độc học ngày nay đã cho thấy, các ĐTVN chủ yếu gâyđộc trường diễn và bán trường diễn, tuy nhiên không hiếm các trường hợp mứcnhiễm quá lớn đã gây ngộ độc cấp

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới hiện nay, ĐTVN trong lương thực, thực phẩm là một mối đedọa rất lớn đối với ngành công nghiệp thực phẩm và chăn nuôi gây thiệt hại vềkinh tế và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người và vật nuôi

Vào đầu những năm 1960, khi bùng phát dịch làm gà tây chết do bệnh

“Thổ Nhĩ Kỳ - X” Người ta đã xác định nguyên nhân gây bệnh có liên quan

đến bột lạc Brazil bị nhiễm nấm A flavus Chất độc này được đặt tên là độc tố

Aspergillus flavus - Aflatoxin [33]

Một trong những đợt bùng phát bệnh do nhiễm AF trên người đầu tiên đượcbáo cáo ở miền Tây Ấn Độ vào năm 1974 với 106 người dân bản địa chết vì ngộđộc lương thực chủ yếu là ngô Đây có lẽ là báo cáo đầu tiên trực tiếp xác định AFtrong thực phẩm là mối nguy hại cho sức khỏe con người ở cấp độ địa phương.Một nghiên cứu độc lập về đợt bùng phát tương tự được thực hiện sau đó cũng chỉ

ra rằng AF là nguyên nhân chính gây ra đợt bùng phát xơ gan ở trẻ em Ấn Độ Họ

cũng tìm thấy mối tương quan giữa ô nhiễm AF, lượng nấm và bệnh gan to ở trẻ

em ở quận Canara phía nam Karnataka [34]

Trong 6 tháng đầu năm 2004, Bộ Y tế Kenya đã thông báo có 317 trườnghợp suy giảm chức năng gan cấp tính ở miền đông Kenya dẫn đến 125 trườnghợp tử vong Nguyên nhân là do trong ngô được lưu trữ trong điều kiện ẩm ướtdẫn đến phơi nhiễm AFB1 với hàm lượng rất cao Trong số 342 mẫu ngô đượcthu thập từ chợ, có 182 mẫu có hàm lượng AFB1 lớn hơn 20µg/kg, 31 mẫu thuthập trong các hộ gia đình có nạn nhân tử vong, hàm lượng AFB1 trong khoảng

20 - 8.000 µg/kg so với mức GHCP của Kenya là 20µg/kg [35], [36]

Có rất nhiều nghiên cứu về nồng độ ĐTVN trong thực phẩm ĐTVNđược quan tâm nhất là AF, trong đó AFB1 là loại độc tố được nghiên cứu nhiềunhất do các ảnh hưởng của nó đối với sức khỏe cũng như sự phổ biến trong tựnhiên Do điều kiện khí hậu khác nhau giữa các nước trên thế giới nên nồng độĐTVN ở các khu vực cũng có sự khác biệt Phần lớn các nước nhiệt đới có tỷ lệmẫu bị nhiễm AF cao hơn Đối tượng mẫu thường gặp là ngũ cốc và các loại hạt

có dầu Theo một thống kê của Marin S và cs, từ năm 2008 đến 2012 các quốcgia châu Âu đã từ chối 3.450 sản phẩm nông sản nhập khẩu vào châu Âu dokhông đạt các tiêu chuẩn về nồng độ ĐTVN Kết quả điều tra cho thấy, AF làĐTVN nhiễm nhiều nhất chiếm đến gần 95% các trường hợp phát hiện Đứngthứ hai là OTA chiếm 4,2% Thực phẩm nhiễm PAT chủ yếu tập trung vào cácsản phẩm từ táo [37]

Nghiên cứu của Poostforoushfard A và cs tại Iran (2017) cho thấy,53,0% nước táo đóng chai, 45,0% nước táo đóng lon nhiễm PAT [38] Husain

S và cs nghiên cứu tại Pakistan (2019) về tình trạng nhiễm PAT trong xoài vàcam Tỷ lệ các mẫu xoài nhiễm PAT là 61,7%, tỷ lệ vượt GHCP (50 µg/kg) là21,8%, nồng độ trung bình là 110,9 µg/kg Tỷ lệ mẫu cam nhiễm PAT là 52,5%,nồng độ trung bình là 5,3 µg/kg [39] Tangni E.K và cs tiến hành khảo sát tại

Bỉ (2023) cho thấy 54,4% mẫu nước táo và 7,1% mẫu táo xay nhuyễn nhiễmPAT [40].

1.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Tại nước ta, với điều kiện khí hậu nhiệt đới, gió mùa, thường xuyên cónhiệt độ cao và độ ẩm lớn làm cho việc bảo quản các sản phẩm nông sản gặp rấtnhiều khó khăn, mặt khác tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển nhanh.Mặc dù khoa học, công nghệ việc chế biến, bảo quản lương thực thực phẩm đã

có nhiều tiến bộ, tình trạng nhiễm ĐTVN trong thực phẩm vẫn diễn ra với tỷ lệkhông nhỏ Kết quả nghiên cứu của các tác giả Huong B.T.M và cs năm 2016trên khảo sát 1.134 mẫu thực phẩm các loại cho thấy 85,7% mẫu nhiễm AFB1[41]

Nghiên cứu của Đỗ Hữu Tuấn và cs cho kết quả sự hiện diện của cácĐTVN được phân tích trong tổng cộng có 606 mẫu, trong đó có 144 mẫu lúa,

189 mẫu ngô, 144 mẫu lạc và 129 mẫu vừng được thu ngẫu nhiên từ tháng10/2016 đến tháng 9/2017 tại 3 tỉnh miền Bắc là Hà Nội, Hà Giang và ThanhHóa, với AFB1 được phát hiện nhiều nhất trong các loại thực phẩm (19,1%),OTA là 5,9% [42]

Theo nghiên cứu của Phuong H.N và cs về hàm lượng của AF, FU vàzearalenone trong ngô ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên Việt Nam Bốntỉnh được chọn để lấy mẫu ngô: Đồng Nai, Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông.AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, fumonisin B1 (FB1), fumonisin B2 (FB2) vàzearalenone (ZEA) được phân tích bằng HPLC trong 97 mẫu hạt ngô.Fumonisin là chất độc phổ biến nhất được tìm thấy trong tất cả các mẫu(67,0%), tiếp theo là AF (55,7%) và zearalenone (27,8%) Tỷ lệ mẫu dương tínhvới AF (61,7%) ở các tỉnh Đông Nam Bộ cao hơn ở Tây Nguyên (50,0%), trongkhi tỷ lệ nhiễm fumonisins và zearalenone cao hơn ở Tây Nguyên Hàm lượngFB1 trung bình trong các mẫu lấy từ các tỉnh Tây Nguyên (1757 µg/kg) lớn hơnđáng kể (p < 0,05) so với các tỉnh Đông Nam Bộ (740 µg/kg) [43]

Tri N.M và cs đánh giá mức độ nhiễm AFB1, citrinin và OTA trong gạo ở

5 tỉnh miền Trung Việt Nam AFB1 là độc tố có tỷ lệ nhiễm cao nhất, tiếp theo làOTA, không phát hiện thấy citrinin trong các mẫu nghiên cứu Hàm lượng AFB1lớn nhất phát hiện ở tỉnh Quảng Nam với giá trị trung bình là 10,08 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg và giátrị lớn nhất là 29,82 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg [44]

Trong nghiên cứu của Đỗ Hữu Tuấn năm 2020 về đánh giá ô nhiễm vànguy cơ do ĐTVN trong thực phẩm tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam cho thấy,đối với AFB1, số mẫu bị nhiễm độc tố là 192/996 mẫu (19,28%) với mẫu bịnhiễm có hàm lượng cao nhất là 1572,5 µg/kg Số mẫu bị nhiễm AFB1 chiếm tỷ

lệ cao nhất trong các mẫu ngô 30,66% (88/287 mẫu), tiếp theo là trong các mẫulạc 23,81% (60/252 mẫu), mẫu gạo 10,50% (25/238 mẫu) và ít nhất là mẫuvừng 8,68% (19/219 mẫu) [45] Trong một nghiên cứu khác, tổng cộng có 40mẫu thực phẩm tổng hợp đại diện cho 1.008 mẫu thực phẩm riêng lẻ được phântích bằng phương pháp ELISA Kết quả cho thấy phơi nhiễm trong chế độ ănuống với AFB1, OTA và tổng số fumonisins lần lượt là 118,7 ng/kgbw/ngày,52,6 ng/kg bw/ngày và 1250,0 ng/kg bw/ngày Nguy cơ ung thư gan liên quanđến phơi nhiễm AFB1 là 12,1 trường hợp/100.000 người/năm [46]

Tra N.H và cs (2004) phân tích 181 mẫu thức ăn và sản phẩm thức ănchăn nuôi được thu thập từ một số tỉnh ở miền Bắc Việt Nam Sự xuất hiện tựnhiên của AFB1 và OTA được khảo sát trong 26 mẫu nhân đậu phộng, 55 mẫuthức ăn chăn nuôi, 20 mẫu sản phẩm đậu phộng bao gồm kẹo đậu phộng và đậuphộng chiên, 15 mẫu sản phẩm đậu nành bao gồm bột đậu nành, bánh đậu nànhnén và thịt đậu nành, 15 mẫu sản phẩm ngô bao gồm bột ngô dinh dưỡng và ngôchiên, 18 mẫu sản phẩm cà phê bao gồm cà phê hòa tan và cà phê berry, 16 mẫusản phẩm từ hạt điều bao gồm bột hạt điều, bánh hạt điều và bột màu hạt điều, và

16 mẫu các sản phẩm thịt kể cả thịt động vật giáp xác [47]

Một số nghiên cứu khác trước đây đã cho thấy sự hiện diện của AFB1,OTA, FB1, ZEA, citrinin trong các loại thực phẩm khác nhau như gạo, ngô và

đậu phộng ở Việt Nam, như nghiên cứu của Trung T.S và cs phát hiện OTAtrên gạo với hàm lượng cao (21,3 và 26,2 ppb), hay nghiên cứu của Lee H.S và

cs với 2.370 mẫu ngô đã phát hiện có 799 (33,71%) mẫu có nồng độ AFB1 trên2µg/kg và 687 (28,98%) mẫu có nồng độ trên 5µg/kg [48], [49] Một nghiêncứu năm 2009 về tình trạng nhiễm các loại nấm mốc trên một số cây trồng ởViệt Nam cho thấy: 106 chủng nấm đã được phân lập từ 85 mẫu bao gồm lạc,ngô và đất Định danh các chủng bằng hình thái khuẩn lạc và sinh AF thấy tất cả

các chủng Việt Nam là A flavus, không phân lập được A parasiticus A flavus

hiện diện trong 36,0% mẫu lạc, 31,1% mẫu ngô, 27,3% mẫu đất trồng và khôngđược tìm thấy trong các mẫu đất nguyên sinh [50]

Thieu N.Q và cs (2008) thực hiện nghiên cứu khảo sát tình trạng nhiễmmột số ĐTVN trong thực phẩm chăn nuôi ở phía nam Việt Nam và nhận thấy

AF và ZEA được phát hiện trong tất cả các mặt hàng được phân tích AFB1được tìm thấy lần lượt là 100%, 92%, 92%, 83%, 100% và 96% mẫu sắn lát,ngô, cám gạo, gạo tấm và thức ăn hỗn hợp cho lợn choai và lợn nái, với nồng độ trungbình là 0,86 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg, 77,5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg, 1,3 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg, 1,6, μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg 4,7 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg và 7,5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.g/kg tươngứng [51] Kết quả nghiên cứu của Huong B.T.M năm 2016 cho thấy 107

(96,4%) mẫu lúa và 84 (82,4%) mẫu ngô bị nhiễm nấm A flavus được tìm thấy trong 68 (61,3%) mẫu gạo và 30 (29,4%) mẫu ngô, A parasiticus trong 40

(36,0%) mẫu gạo và 27 (26,7%) mẫu ngô AF được phát hiện trong 27 mẫu gạo(24,3%) và 27 mẫu ngô (26,4%) ở mức tối thiểu và tối đa trong gạo lần lượt là2,06 và 77,8 ng/g và 20,5 và 110 ng/g trong ngô [52]

Năm 2020, Nguyễn Thị Hà Bình và cs đã thực hiện nghiên cứu đánh giáhàm lượng ĐTVN AF, OTA, ZEA, DEO và FB1 trong một số sản phẩm thựcphẩm bao gồm bánh kẹo, bột thính trộn, bột ngũ cốc dinh dưỡng, thực phẩm bảo

vệ sức khỏe, ngũ cốc nguyên liệu và gia vị các loại [53] Mẫu thực phẩm đượcchiết và làm sạch bằng phương pháp QuEChERS, sau đó dịch chiết được phântích bằng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Kết quả khảo sát

300 mẫu thực phẩm các loại cho thấy có 43 mẫu nhiễm ĐTVN chiếm tỷ lệ14,3%, chủ yếu tập trung vào nhóm ngũ cốc chưa qua chế biến Trong đó pháthiện 10 mẫu gia vị, 04 mẫu nguyên liệu thực phẩm, 01 mẫu kẹo, 01 mẫu bộtngũ cốc dinh dưỡng, 01 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe phát hiện có nhiễm

AF, OTA vượt ngưỡng tối đa cho phép của Bộ Y tế theo quy chuẩn QCVN 1:2011/BYT [53]

8-Có thể nhận thấy rằng, tỷ lệ mẫu ngũ cốc và hạt có dầu bị nhiễm các loạiĐTVN ở Việt Nam là khá lớn Các loại ĐTVN được nghiên cứu là AF,fumonisin, OTA và ZEA Cho đến nay, rất ít nghiên cứu tại Việt Nam đề cậpđến sự ô nhiễm PAT trong thực phẩm

1.3 Phương pháp, kỹ thuật xét nghiệm và phát hiện độc tố vi nấm

Nhiều phương pháp xét nghiệm và phát hiện ĐTVN đã được AOAC quyđịnh Các phương pháp trên được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu an toànthực phẩm và trong pháp luật như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), miễndịch liên kết enzyme (ELISA), chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction - LLE),chiết chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction - SFE), phương phápchiết pha rắn (solid-phase extraction - SPE), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc kýlỏng với đầu dò UV hoặc huỳnh quang [54]

1.3.1 Phương pháp lý hóa

1.3.1.1 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Cho đến thập niên 1990, TLC vẫn được coi như là phương pháp phân tíchĐTVN rộng rãi và phổ biến nhất [55] Vào thời điểm phát hiện ra AF, TLC là kỹthuật sắc ký chiếm ưu thế, được ứng dụng rộng rãi trong việc xác định AF và cácchất chuyển hóa thứ cấp khác của nấm được phát hiện là chất gây ô nhiễm thựcphẩm Kể từ đó, những cải tiến trong phân tích ĐTVN đã song hành với sự pháttriển của khoa học sắc ký Mặc dù TLC vẫn được một số phòng thí nghiệm ở cácnước đang phát triển sử dụng, đặc biệt nếu kết hợp với đầu dò UV hoặc huỳnh

quang, nhưng hiện nay nó ít khi được sử dụng và đã được thay thế bằng GC vàHPLC [56].

Sắc ký lớp mỏng sử dụng một tấm thủy tinh mỏng được phủ một lớp oxitnhôm hoặc silica gel làm pha rắn Pha động là dung môi được chọn theo tính chấtcủa các thành phần trong hỗn hợp Nguyên lý của TLC là sự phân bố hợp chấtgiữa pha rắn cố định (lớp mỏng) được phủ lên tấm thủy tinh hoặc nhựa và phađộng lỏng (dung môi rửa giải) đang chuyển động trên pha rắn Dung môi đượchút lên qua các hạt trên tấm thông qua hoạt động mao dẫn và khi dung môi dichuyển qua hỗn hợp, mỗi hợp chất sẽ tồn tại ở pha rắn hoặc hòa tan trong dungmôi và di chuyển lên trên tấm Việc hợp chất di chuyển lên trên tấm hay ở lạiphía sau phụ thuộc vào tính chất vật lý của từng hợp chất đó và do đó phụ thuộcvào cấu trúc phân tử của nó, đặc biệt là các nhóm chức[57]

TLC là một phương pháp hiệu quả, đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, ổnđịnh, tiết kiệm chi phí Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm: không phânbiệt được các chất đồng phân, thành phần pha động dễ bị thay đổi, các vết sắc kí

có thể bị kéo đuôi nếu kỹ thuật không đảm bảo [58]

1.3.1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC)

HPLC ra đời năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phươngpháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạngtiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mangđược bao phủ bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương phápnày ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: độ nhạy cao,khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phânhủy nhiệt HPLC phân tích định lượng, xác định được chính xác hàm lượng tổn

dư ĐTVN trong thực phẩm ở lượng rất thấp, hiện nay là phương pháp phổ biếnđược dùng ở các labo phân tích

Khi công nghệ HPLC được cải tiến, kết quả phân tích ĐTVN cũng tăngtheo Đặc biệt, độ nhạy cao hơn của đầu dò và những tiến bộ trong thiết kế bơmHPLC và vật liệu nhồi trong cột liên quan đến việc giảm kích thước hạt đã cảithiện tính chất hóa học của lớp phủ bề mặt và độ đồng đều kích thước hạt tốt hơn,dẫn đến giới hạn phát hiện thấp hơn và cải thiện hiệu suất sắc ký Vì vậy, HPLC đãphát triển thành một kỹ thuật hoàn thiện Một cải tiến gần đây hơn là sự ra đời củasiêu HPLC với vật liệu nhồi cột đồng nhất có kích thước hạt đường kính khoảng1,5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.m Ưu điểm so với các phương pháp sử dụng cột chứa vật liệu nhồi có đườngkính khoảng 5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.m bao gồm thời gian xét nghiệm ngắn hơn, mức tiêu thụ dung môithấp hơn, độ phân giải và hiệu quả sắc ký được cải thiện, đồng thời tăng độ nhạy[56]

Sau khi ĐTVN được chiết xuất từ mẫu bằng dung môi, một phần dịchchiết mẫu và liên hợp của ĐTVN kết hợp với enzyme được trộn và sau đó đượcthêm vào các giếng vi thể được phủ kháng thể Bất kỳ ĐTVN nào trong dịchchiết mẫu hoặc chất chuẩn đối chứng đều được phép cạnh tranh với ĐTVN liênhợp enzyme để giành vị trí gắn kết kháng thể Sau khi rửa, cơ chất enzyme đượcthêm vào và màu xanh xuất hiện Cường độ màu tỷ lệ nghịch với nồng độĐTVN trong mẫu hoặc chất chuẩn Sau đó, một dung dịch được thêm vào đểdừng phản ứng enzyme

Cường độ màu của dung dịch trong các giếng microtiter được đo quanghọc bằng cách sử dụng đầu đọc ELISA với bộ lọc hấp thụ 450 nm Mật độquang học (OD) của các mẫu được so sánh với OD của tiêu chuẩn và kết quảdiễn giải được xác định Bộ dụng cụ xét nghiệm ELISA được sử dụng rộng rãi

vì xét nghiệm hiệu quả cao với yêu cầu về thể tích mẫu nhỏ, quy trình làm sạchdịch chiết mẫu đơn giản hơn so với các phương pháp TLC và HPLC ELISA có

ưu điểm nhanh chóng, đơn giản, độ đặc hiệu, độ nhạy ổn định [60]

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch (Immuno Affinity Chromatography - IAC)

IAC là phương pháp tiêu chuẩn được lựa chọn để chuẩn bị mẫu ĐTVNtrước khi đưa vào hệ thống HPLC, GC và LC-MS/MS Cột ái lực miễn dịch làcông cụ làm sạch lý tưởng để phân tích các mẫu thực phẩm và thức ăn có màuhoặc nền mẫu phức tạp Các kháng thể đơn dòng phân lập chọn lọc và tập trungĐTVN cần phân tích, loại bỏ bất kỳ thành phần gây nhiễu nào khỏi mẫu Việclàm sạch có tính đặc hiệu cao này loại bỏ sự ảnh hưởng của nền mẫu và đưa đếndung dịch sau rửa giải sạch, cột ái lực miễn dịch IAC cải thiện nền sắc ký đồ,qua đó làm giảm giới hạn phát hiện của phương pháp

Việc sử dụng IAC dựa trên kháng thể đã nổi lên như một kỹ thuật làmsạch quan trọng trong phân tích ĐTVN, đặc biệt với sự sẵn có của các cộtthương mại cho AF, OTA, fumonisins, ZEA và DEO Ưu điểm chính là tính đặchiệu - giúp loại bỏ hầu hết các yếu tố cản trở bên ngoài trong dịch chiết và do đócho phép giới hạn phát hiện thấp, mức độ sử dụng dung môi thấp, tăng khả năng

tự động hóa và khả năng tái sử dụng cột Nhược điểm chính là chi phí của cột,chỉ có một số lượng nhỏ ĐTVN có sẵn trên thị trường và đôi khi cần phải làmsạch trước cột Trong một số trường hợp, độ thu hồi thấp là do ái lực với độc tốthấp hoặc không đủ kháng thể liên kết trên cột (ví dụ, đối với AFG2 và DEO).Tuy nhiên, IAC yêu cầu sử dụng lượng kháng thể lớn hơn các phương pháp hóamiễn dịch khác Do đó, chi phí cho mỗi xét nghiệm cao hơn Để giảm chi phí,cần nghiên cứu thêm về việc tái sử dụng IAC, tự động hóa và kỹ thuật tổng hợpkháng thể bằng công nghệ tái tổ hợp, cho phép phát hiện nhanh một số lượnglớn các kháng nguyên một cách nhanh chóng và hiệu quả giúp chọn lọc cáckháng thể cho việc chuẩn bị IAC [61]

1.4 Nghiên cứu về que thử phát hiện độc tố vi nấm

1.4.1 Que thử miễn dịch dòng chảy bên

Sự phát triển của que thử miễn dịch cũng được gọi là xét nghiệm miễn

dịch dòng chảy bên (LFIA), được phát triển từ những năm 1959 [62].

Nguyên lý hoạt động

Cơ chế cạnh tranh: Cơ chế LFIA dựa trên sự cạnh tranh của khángnguyên có trong mẫu thử nghiệm với kháng nguyên trên màng nitrocellulose.Với sự có mặt của kháng nguyên, phức hợp vật liệu mang kháng thể-kháng thể

sẽ liên kết với kháng nguyên có trong mẫu và không thể phản ứng với khángnguyên trên màng mao dẫn Nếu không xuất hiện vạch phát hiện thì đây làmẫu dương tính Trong trường hợp không có kháng nguyên, phức hợp vật liệumang kháng thể-kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên ở vạch phát hiện Sựxuất hiện của vạch phát hiện trong thời gian 15 phút, đánh giá đây là phản ứng

âm tính [63].

Hình 1.5 Cấu trúc que thử miễn dịch

* Nguồn: Theo Wong R và cs (2009) [63]

Cấu tạo và tối ưu que thử:

Thiết kế định dạng que thử: LFIA cạnh tranh thường được sử dụng để

phát hiện các chất có khối lượng phân tử nhỏ như thuốc, độc chất, ĐTVN Vìcác chất có khối lượng phân tử nhỏ có thể chỉ có 1 điểm quyết định khángnguyên nên không thể được nhận diện bằng 2 kháng thể đơn dòng khác nhau

PAT có khối lượng phân tử là 154 Da, là chất có phân tử nhỏ do vậychúng tôi lựa chọn phương pháp phát hiện kháng nguyên theo cơ chế LFIA cạnhtranh.

Lựa chọn vật liệu mang kháng thể:

Chỉ thị màu: có nhiều loại hạt nano như hạt nano vàng, nano bạc, hạt

nano từ, latex, phân tử huỳnh quang, enzym… được sử dụng làm chỉ thị màutrong que thử miễn dịch [64] Trong đó, hạt nano vàng là thông dụng nhất dochúng ái lực cao với protein và phân tử sinh học Thêm vào đó, hạt nano vàng

dễ dàng chức năng hóa bề mặt và kích thước hạt có thể điều chỉnh bằng cách sửdụng nồng độ chất khử phù hợp Hạt vàng có kích thước khác nhau có màu sắckhác nhau, nhiều nghiên cứu lựa chọn kích thước 10-60 nm [65] Các kíchthước này cho màu sắc rõ khi quan sát bằng mắt thường, và không quá lớn nênphù hợp với que thử miễn dịch dòng chảy bên

Hình 1.6 Sự khác nhau về màu sắc của hạt nano vàng

có kích thước khác nhau

* Nguồn: Theo Abrica-González P và cs (2018) [65]

Lựa chọn màng: có 3 loại màng là: màng mao dẫn, màng cộng hợp, màng

hút mẫu

Màng mao dẫn: Để tạo điều kiện cho dòng chảy dễ dàng, màng thường có

kích thước lỗ > 3µm; kích thước 0,45 µm thường được sử dụng trong sinh họcphân tử Màng có kích thước lỗ 8 µm hoặc 15-20 µm là phù hợp cho LFIA [63]

Mỗi loại màng thường có ưu nhược điểm riêng, tùy vào mục đích chế tạo quethử (độ nhạy, thời gian phản ứng, loại mẫu…) để lựa chọn loại màng cho phùhợp Que thử có thời gian mao dẫn nhanh thì có độ nhạy thấp, ngược lại thờigian mao dẫn chậm thì có độ nhạy cao [66]

Hình 1.7 Mối liên quan giữa đặc tính của màng mao dẫn và độ nhạy của

que thử

* Nguồn: Theo Millipore E.M.D và cs (2013) [66]

Màng cộng hợp: thông số lựa chọn màng cộng hợp bao gồm độ dày của

màng, tốc độ di chuyển của phức hợp vật liệu mang kháng thể - kháng thể - khángnguyên, hiệu suất giải phóng vật liệu mang kháng thể - kháng thể là lớn nhất

Xử lý các màng: việc lựa chọn hệ đệm thích hợp để xử lý các màng cũng

tùy thuộc vào mục đích chế tạo que thử Mỗi hệ đệm thích hợp cho các mẫu xétnghiệm khác nhau

Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp: với mỗi chỉ thị màu đều có quy trình gắn

riêng, thông thường đều có hướng dẫn của nhà sản xuất đi kèm Tuy nhiên, khi

sử dụng gắn với protein hay các phân tử sinh học cần có các bước tối ưu về pHdung dịch đệm, nồng độ thích hợp

Tối ưu hóa nồng độ kháng thể: các kháng thể đóng vai trò rất quan trọng

trong chế tạo que thử Do khả năng bắt giữ kháng nguyên của các kháng thể khônggiống nhau, nên trong từng trường hợp cụ thể cần tối ưu nồng độ kháng thể đểphản ứng xảy ra tốt nhất

1.4.2 Một số nghiên cứu chế tạo que thử miễn dịch phát hiện độc tố vi nấm trong thực phẩm

1.4.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Do tính ưu việt của phương pháp que thử miễn dịch dòng chảy bên nên hiệnnay đã có một số nhóm nghiên cứu trên thế giới thực hiện theo phương pháp này

và đã tạo ra một số KIT thương mại để phát hiện ĐTVN

Công trình được xem là nghiên cứu đầu tiên theo hướng này là của HoJ.A.A và cs, nhóm nghiên cứu đã sử dụng lyposome như là một chất chỉ thị.Lyposome được gắn với AFB1 và được phủ với chất màu có thể nhìn thấy bằngmắt thường Khi lyposome di chuyển dọc theo thanh que thử đến vị trí kiểm tragắn sẵn kháng thể kháng AFB1 thì sẽ bị bắt giữ lại và tạo thành vạch tín hiệumàu Nếu trong mẫu có AFB1 thì phản ứng giữa lyposome và kháng thể cố định

bị cạnh tranh do đó không xuất hiện vạch màu tại vị trí này Que thử theo địnhdạng này có giới hạn phát hiện AFB1 là 18 ng và thời gian xét nghiệm là 12phút [67]

Một nghiên cứu tổng quan về các phương pháp xét nghiệm phát hiện nhanhAFB1, tác giả Xue Z và cs (2019) nhận thấy rằng sự tiến bộ của vật liệu nano, nhờhiệu suất cao và đặc tính linh hoạt, mang lại triển vọng lớn để thực hiện phát hiệnAFB1 có độ nhạy cao, chọn lọc và đơn giản, khắc phục các hạn chế của cácphương pháp truyền thống như quy trình phức tạp, tốn thời gian, nhân công chuyênsâu và dụng cụ đắt tiền Nhiều vật liệu nano đã được sử dụng để cố định các phân

tử sinh học làm máy phát tín hiệu hoặc chất khử huỳnh quang hoặc để khuếch đạitín hiệu trong phát hiện AFB1 Đánh giá này nhấn mạnh những tiến bộ gần đây đãđạt được trong việc phát triển các thử nghiệm dựa trên hạt nano và tập trung vàotiềm năng phân tích của vật liệu nano, chẳng hạn như hạt nano Au/Ag (NPAu/Ag), hạt nano dựa trên carbon (CBN), hạt nano từ (MNP), chấm lượng tử (QD)

và vật liệu nano mới khác [68]