Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong thực phẩm tại Hà Giang và chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm
MỤC LỤC
Thực trạng thực phẩm bị nhiễm độc tố vi nấm
Tại nước ta, với điều kiện khí hậu nhiệt đới, gió mùa, thường xuyên có nhiệt độ cao và độ ẩm lớn làm cho việc bảo quản các sản phẩm nông sản gặp rất nhiều khó khăn, mặt khác tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển nhanh. Năm 2020, Nguyễn Thị Hà Bình và cs đã thực hiện nghiên cứu đánh giá hàm lượng ĐTVN AF, OTA, ZEA, DEO và FB1 trong một số sản phẩm thực phẩm bao gồm bánh kẹo, bột thính trộn, bột ngũ cốc dinh dưỡng, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, ngũ cốc nguyên liệu và gia vị các loại [53].
Phương pháp, kỹ thuật xét nghiệm và phát hiện độc tố vi nấm
Đặc biệt, độ nhạy cao hơn của đầu dò và những tiến bộ trong thiết kế bơm HPLC và vật liệu nhồi trong cột liên quan đến việc giảm kích thước hạt đã cải thiện tính chất hóa học của lớp phủ bề mặt và độ đồng đều kích thước hạt tốt hơn, dẫn đến giới hạn phát hiện thấp hơn và cải thiện hiệu suất sắc ký. Ưu điểm so với các phương pháp sử dụng cột chứa vật liệu nhồi có đường kính khoảng 5 μg/kg đối với AFB1 và từ 4-15 μg/kg đối với AF tổng số.m bao gồm thời gian xét nghiệm ngắn hơn, mức tiêu thụ dung môi thấp hơn, độ phân giải và hiệu quả sắc ký được cải thiện, đồng thời tăng độ nhạy [56].
Nghiên cứu về que thử phát hiện độc tố vi nấm 1. Que thử miễn dịch dòng chảy bên
Màng cộng hợp: thông số lựa chọn màng cộng hợp bao gồm độ dày của màng, tốc độ di chuyển của phức hợp vật liệu mang kháng thể - kháng thể - kháng nguyên, hiệu suất giải phóng vật liệu mang kháng thể - kháng thể là lớn nhất. Đánh giá này nhấn mạnh những tiến bộ gần đây đã đạt được trong việc phát triển các thử nghiệm dựa trên hạt nano và tập trung vào tiềm năng phân tích của vật liệu nano, chẳng hạn như hạt nano Au/Ag (NP Au/Ag), hạt nano dựa trên carbon (CBN), hạt nano từ (MNP), chấm lượng tử (QD) và vật liệu nano mới khác [68].
Nội dung và các chỉ tiêu nghiên cứu
- Hãng Whatman: Màng hút mẫu và màng hút trên (Sample pad, Absorbent pad - CF3 Whatman; CF4 Whatman; USA); màng nitrocelullose (Whatman FF80HP; Whatman FF120HP; Whatman FF170HP; USA); màng cộng hợp (Conjugate pad - Standard 17 whatman: USA); tấm lót plastic vinyl. Tỷ lệ nước quả ép, rượu táo, sản phẩm từ táo nhiễm PAT và vượt GHCP tại Hà Giang theo nhóm thực phẩm, theo địa phương, cơ sở lấy mẫu.
Kỹ thuật lấy mẫu, phương pháp xét nghiệm và đánh giá 1. Kỹ thuật lấy mẫu
Để thẩm định hệ số thu hồi của phương pháp phân tích, thí nghiệm được thêm chuẩn vào mẫu trắng ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi thêm chuẩn được lặp lại 5 lần và tính kết quả. Để thẩm định hệ số thu hồi của phương pháp phân tích, thí nghiệm được thêm chuẩn vào mẫu trắng ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi thêm chuẩn được lặp lại 5 lần và tớnh kết quả.
Chế tạo que thử miễn dịch phát hiện patulin trong thực phẩm
Quá trình ngưng tụ: Nhóm silanol này sẽ liên kết với silanol khác hình thành liên kết siloxane (Si-O-Si) thông qua phản ứng khử nước. Sau cùng là các nhóm OH trên hạt Fe3O4 liên kết cộng hóa trị với các nhóm OH trên silanol. Sơ đồ quy trình phủ APTES lên hạt nano từ Quy trình :. Đánh giá mẫu đạt: Sự hiện diện của gốc NH2 của APTES trên bề mặt hạt nano từ được xác nhận bằng cách phân tích quang phổ UV-Vis. Nhóm axit amin tự do phản ứng hóa học với ninhydrin làm dung dịch có màu xanh tím. Tối ưu hóa quá trình gắn kháng thể nhận diện lên hệ hạt nano từ phủ APTES. Nguyên lý: Hạt từ sau khi được chức năng hoá bằng APTES trên bề mặt xuất hiện các nhóm -NH2, nhóm chức này sẽ kết hợp với gốc -COOH ở đầu Fc. của kháng thể tạo thành liên kết cộng hoá trị. Tuy nhiên mỗi loại kháng thể sẽ hoạt động tối ưu trong những điều kiện môi trường khác nhau về nhiệt độ, pH, dung dịch đệm cũng như thời gian tương tác. Do vậy, tối ưu hoá quá trình gắn kháng thể lên hạt từ là cần thiết để khảo sát các yếu tố này sao cho số lượng gắn lên bề mặt và hoạt tính của kháng thể là lớn nhất. Quy trình thực hiện. Đánh giá hiệu quả tối ưu kháng thể trên bề mặt hạt từ Fe3O4@APTES: Kiểm tra tín hiệu dot-blot. Tối ưu hoá quá trình gắn kháng thể nhận diện lên hạt nano vàng Gắn kháng thể lên hạt nano vàng đóng vai trò quan trọng quyết định độ nhạy, độ đặc hiệu và LOD của que thử. Vì vậy cần tối ưu hóa các giai đoạn trong quá trình này. Tối ưu hóa pH của dung dịch đệm. Tối ưu hóa pH của dung dịch đệm để kháng thể hấp thụ trên hạt nano vàng đạt trạng thái bão hòa. Đánh giá mẫu đạt: sau khi gắn kháng thể lên hạt nano vàng, tiến hành nhỏ phức hợp hạt vàng-kháng thể lên màng cộng hợp và dựng que thử. Mẫu có kết quả tốt là mẫu có cường độ tín hiệu màu sắc trên vạch phát hiện đậm nhất khi thử nghiệm với mõ̃u thờm chất chuẩn PAT cú nụ̀ng độ 1 àg/l. Dung dịch sau ủ kháng thể ở dạng huyền phù và hạt nano vàng sau khi gắn kháng thể không bị kết tụ. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể hấp thụ trên hạt nano vàng. Đánh giá mẫu đạt:. Nồng độ kháng thể gắn trên hạt nano vàng được xác định là tối ưu khi phức hợp hạt nano vàng-kháng thể không đổi màu sau khi thêm NaCl 0,1M. Giới hạn phát hiện của que thử miễn dịch cạnh tranh được hiểu là nồng độ thấp nhất của kháng nguyên mà vạch phát hiện hoàn toàn không nhìn thấy. Tối ưu hóa thể tích của dung dịch đệm. Tối ưu hóa thể tích của dung dịch đệm để kháng thể hấp thụ trên hạt nano vàng đạt trạng thái bão hòa. Giữ ổn định cỏc. Đánh giá mẫu đạt: Mẫu có kết quả tốt là mẫu có cường độ tín hiệu màu sắc trên vạch phát hiện là đậm nhất khi thử nghiệm trên mẫu có nồng độ kháng nguyờn 1 àg/l. Tối ưu hóa dung dịch đệm nhỏ lên que thử. Dung dịch đệm nhỏ lên que thử được chuẩn bị như sau để tìm thông số tối ưu:. Mỗi thông số làm 5 lần để kiểm tra độ lặp lại của thử nghiệm. Đánh giá mẫu đạt: dung dịch đệm nhỏ lên que thử có cường độ màu trên vạch kiểm tra đậm nhất khi thử nghiệm với mẫu âm tính, đồng thời không xuất hiện tình trạng âm tính giả khi thử nghiệm với mẫu dương tính. c) Đánh giá và lựa chọn vật liệu mang kháng thể: Loại hạt nano sau khi ủ. Mỗi thông số chúng tôi tiến hành trên 5 lần với mẫu có chứa kháng nguyờn PAT nụ̀ng độ 20àg/l đờ̉ kiờ̉m tra õm tớnh giả và độ lặp lại, 5 lần với mõ̃u không có kháng nguyên để kiểm tra dương tính giả.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Thực trạng nhiễm độc tố vi nấm patulin, aflatoxin B1, ochratoxin A trong một số thực phẩm tại Hà Giang
Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong lạc và các loại hạt có dầu và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo nhóm thực phẩm (n=96). Kết quả xét nghiệm aflatoxin B1 trong lạc và các loại hạt có dầu và tỷ lệ mẫu nhiễm, vượt GHCP tại Hà Giang theo địa phương (n=96).
Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình, chế tạo, xác định các thông số, khả năng phát hiện patulin của que thử miễn dịch
(b) Chế tạo que thử bằng hạt nano vàng kích thước 20nm. Thử nghiệm LFIA hạt nano từ và nano vàng với nồng độ patulin khác nhau. Nồng độ kháng nguyên 10 àg/l là nụ̀ng độ thấp nhất vạch kiờ̉m tra khụng xuất hiện màu. Vỡ vọ̃y, giới hạn. Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn hạt nano vàng để phát triển que thử miễn dịch. Bước 2: Kết quả xử lý màng cộng hợp. a) Kết quả lựa chọn hệ đệm xử lý màng cộng hợp để tăng hiệu quả giải phóng phức hợp hạt vàng-kháng thể. (a) Kết quả giải phóng phức hợp hạt vàng- kháng thể khi xử lý màng cộng hợp bằng đường. b) Cường độ màu trên vạch phát hiện, vạch kiểm tra với mẫu âm tính. Hình ảnh kết quả lựa chọn hệ đệm để tăng giải phóng phức hợp hạt nano vàng-kháng thể. Cả 3 miếng đệm khi xử lý bằng nồng độ đường khác nhau, gần như khô hoàn toàn. b) Kết quả tính ổn định của kháng thể trên màng cộng hợp.
BÀN LUẬN
Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thực trạng nhiễm PAT trong thực phẩm và chưa có nghiên cứu nào về việc chế tạo, sản xuất que thử phát hiện PAT tại cộng đồng để sàng lọc nhanh thực phẩm bị nhiễm PAT, bảo đảm an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. 2 loại vật liệu được lựa chọn trong nghiên cứu của chúng tôi là hạt nano từ (Fe3O4) và hạt nano vàng. a) Lựa chọn kích thước vả gắn kháng thể nhận diện lên hạt nano từ. Đường kính của hạt nano dễ dàng được điều chỉnh dựa vào phương pháp tổng hợp như: đồng kết tủa, dung môi nhiệt và thủy nhiệt. Hạt nano từ. có thể dùng làm hạt nhãn để sản xuất que thử miễn dịch. Do đặc tính lý hóa của hạt từ, que thử miễn dịch có thể cung cấp kết quả định tính và kết quả định lượng. Đối với que thử định tính, cường độ màu sắc trên vạch phát hiện sẽ được đọc bằng mắt thường. Đối với que thử bán định lượng, nồng độ chất cần phân tích sẽ được đọc bằng máy đọc từ tính. Tiến hành chế tạo que thử LFIA với các kích thước khác nhau của hạt nano từ. Thử nghiệm với mẫu âm tính, chúng tôi quan sát thấy hạt có kích thước 80 nm tớn hiệu rừ hơn tại vạch phỏt hiện và vạch kiờ̉m tra so với kớch thước 20 nm và 120 nm. Nghiên cứu sử dụng phương pháp cộng hóa trị để gắn kháng thể nhận diện lên hạt nano từ. Các lớp vật liệu bao phủ lên hạt từ gồm APTES, glutaraldehyde, kháng thể đơn dòng PAT. Kết quả nghiên cứu cho thấy, độ lặp lại đối với que thử đạt yêu cầu là 3/5. Độ ổn định của que thử miễn dịch không cao do có nhiều lớp bao phủ lên hạt nano từ, khiến lớp vật liệu lỏng lẻo. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi quan sát thấy phức hợp hạt từ- kháng thể thường bị tắc ở vị trí tiếp giáp giữa màng cộng hợp và màng mao dẫn, điều này gây ra hiện tượng âm tính giả. b) Lựa chọn kích thước và gắn kháng thể nhận diện lên hạt nano vàng.