Quy Trình Định Lượng Clostridium Perfringenes

Môn: Phân Tích Vi Sinh Vật Thực Phẩm Đề Tài: Quy Trình Định Lượng Clostridium Perfringenes Clostridium perfringens là vi khuẩn gram dương hình que tương đối ngắn, di động, kỵ khí. Các tế bào vi khuẩn của Clostridium perfringens chúng tạo ra một bào tử duy nhất nằm ở một trong các đầu cuối của nó. Trong quá trình hình thành các độc tố bào tử được tổng hợp gây tử vong cho con người và một loạt các động vật, thường gặp trong đất, bụi và ruột của động vật. Ngoài ra Clostridium perfringens thường được tìm thấy trên thịt và gia cầm sống. Ngoài những vi sinh vật có lợi cũng có những vi sinh vật có hại gây bệnh cho cây trồng, động vật, thủy hải sản và nhất là ảnh hưởng tới con người. Ngày nay, khi xã hội phát triển thì mặt hàng thực phẩm cũng khá phong phú và tiện lợi cho người tiêu dùng lựa chọn. Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và được nhiều người sử dụng. Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dự trữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra. Một trong những thực phẩm thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp. Nếu khi mua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển ở trong loại thực phẩm này. Theo thống kê tại Mỹ, ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens có trong đồ hộp và được xếp vào hàng thứ 3 sau Salmonella và Staphylococcus aureus.

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.Hồ Chí MinhKhoa: Công Nghệ Thực Phẩm

Môn: Phân Tích Vi Sinh Vật Thực Phẩm

Đề Tài: Quy Trình Định Lượng ClostridiumPerfringenes

Nhóm 7.2

TP Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2022

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.Hồ Chí MinhKhoa: Công Nghệ Thực Phẩm

Môn: Phân Tích Vi Sinh Vật Thực Phẩm

Đề Tài: Quy Trình Định Lượng ClostridiumPerfringenes

GVHD: Liêu Mỹ ĐôngSVTH: Nhóm 7.2

TP Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2022

Mục lục

Lời Mở Đầu 1

1 Tổng quan về Clostridium Perfringens 2

1.1 Khái quát đặt điểm chung của Clostridium Perfringens 2

1.2 Điều kiện sinh trưởng và môi trường phát triển 2

1.3 Phân loại 3

1.4 Độc tố và các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens 3

1.5 Các triệu chứng và phương pháp chẩn đoán khi nhiễmClostridium Perfringens 5

1.6 Giải pháp điều trị hiện nay 6

2 Quy Trình Định Lượng Clostridium Perfringens 7

2.1 Nguyên tắc định lượng Clostridium Perfringens 7

2.2 Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất của quá trình địnhlượng clostridium Perfringens 7

2.3 2.3 Quy trình phân tích định lượng Clostridium Perfringenes92.4 Các bước tiến hành định lượng Clostridium Perfringens 10

2.5 Kết quả phân tích quy trình định lượng ClostridiumPerfringens 11

3 Tiêu Chuẩn Về Định Lượng Clostridium Perfringens 12

3.1 Quyết định số 3348/QĐ-BYT 12

3.2 Giới thiệu sơ lược về TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004) 17

4 Một số thử nghiệm sinh hóa phân tích Clostridium perfringens214.1 Thử tính di động 21

4.2 Thử nghiệm nitratase 22

4.3 Thử nghiệm gelatinase 22

4.4 Thử nghiệm CAMP 234.5 Tổng kết khi thực nghiệm hóa sinh trên Clostridiumperfringens 24Kết Luận 24TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

Mục lục hình ảnh

Hình 1: Khái quát đặt điểm chung của Clostridium Perfringens 2

Hình 2: Điều kiện sinh trưởng và môi trường phát triển 3

Hình 3: Độc tố và các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens 5

Hình 4: Thử nghiệm Gelatin 23

Lời Mở Đầu

Với sự phát triển vượt bậc của ngành công nghệ thực phẩm, qua đó chất lượngcuộc sống con người ngày càng được nâng cao do đó điều mà đại đa số người dân ViệtNam và thế giới quan tâm đến là vấn đề vệ sinh trong các sản phẩm thực phẩm Hàngnăm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu quả nghiêm trọngđến sức khoẻ của cộng đồng người tiêu dùng Điều này không chỉ phổ biến ở ViệtNam mà ngay cả các nước khác trên thế giới cũng vậy Một trong những nguyên nhângây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi sinh vật gây hại trongthực phẩm Nhằm khắc phục tình trạng đó, chúng ta cần có các biện pháp phòng tránh,ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm Mà yếu tố gây ra ngộ độc thựcphẩm đáng kể đến chính là các mối nguy do sự hiện diện của các chủng vi sinh gây hạinhư: E Coli, Salmonella, Clostridium tạo ra độc tố khi nhiễm các loại vi sinh vật này.

Ngoài những vi sinh vật có lợi cũng có những vi sinh vật có hại gây bệnh cho câytrồng, động vật, thủy hải sản và nhất là ảnh hưởng tới con người Ngày nay, khi xã hộiphát triển thì mặt hàng thực phẩm cũng khá phong phú và tiện lợi cho người tiêu dùnglựa chọn Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và được nhiều người sử dụng Vàomùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dựtrữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra Mộttrong những thực phẩm thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp Nếu khimua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ănphải mầm bệnh phát triển ở trong loại thực phẩm này Theo thống kê tại Mỹ, ngộ độcthường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens có trongđồ hộp và được xếp vào hàng thứ 3 sau Salmonella và Staphylococcus aureus.

Qua những tác hại mà Clostridium perfringens cũng như các loại khuẩn khác gâynên mà môn học Phân tích vi sinh thực phẩm đã trở thành một môn học thiết yếu chosinh viên ngành Công nghệ Thực Phẩm Chính vì vậy ta cần phải tìm hiểu toàn bộnhững gì có liên quan đến vi sinh vật để từ đó sử dụng tối đa đặc tính có hại và đềphòng những ảnh hưởng của chúng đem lại Với ý nghĩa thực tế như vậy, nhóm chúngem đã được lựa chọn tiến hành thực hiện tiểu luận “Quy trình định lượng Clostridiumperfringens“ nhằm tìm hiểu về cách thực hiện quá trình định lượng Clostridium

perfringens và tự trao dồi, học hỏi thêm nhiều kiến thức xây dựng nên nền tảng vữngmạnh cho bản thân.

1.Tổng quan về Clostridium Perfringens

1.1. Khái quát đặt điểm chung của Clostridium Perfringens

Clostridium perfringens là vi khuẩn gram dương hình que tương đối ngắn, diđộng, kỵ khí Các tế bào vi khuẩn của Clostridium perfringens chúng tạo ra một bào tửduy nhất nằm ở một trong các đầu cuối của nó Trong quá trình hình thành các độc tốbào tử được tổng hợp gây tử vong cho con người và một loạt các động vật, thường gặptrong đất, bụi và ruột của động vật Ngoài ra Clostridium perfringens thường được tìmthấy trên thịt và gia cầm sống

Hình 1: Khái quát đặt điểm chung của Clostridium Perfringens

1.2. Điều kiện sinh trưởng và môi trường phát triển  Điều kiện sinh trưởng

Clostridium perfringens có một số điều kiện pH và nhiệt độ nhất định để có thểphát triển tối ưu Nhiệt độ mà nó có thể phát triển nằm trong khoảng từ 20 đến 50°C vàphát triển mạnh 43 - 47°C.

Về độ pH, vi khuẩn này thích môi trường có độ axit và tính trung tính nhất định,đặt độ pH lý tưởng của nó trong khoảng từ 6.0 – 7.0.

Khi nó phải đối mặt với điều kiện môi trường căng thẳng, nó tạo ra các bào tử.Chúng có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi, như nhiệt độ cao, giá trịpH cực cao và không có chất dinh dưỡng.

 Môi trường phát triển

C perfringens có thể tồn tại ở nhiệt độ cao Trong quá trình làm lạnh và giữ thựcphẩm ở nhiệt độ từ 12°C - 60°C, vi khuẩn sẽ phát triển Nó có thể phát triển rất nhanh

Loài: Clostridium perfringens.

1.4. Độc tố và các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens Độc tố

Loại độctố

Các bệnh chính do độc tố gây ra Đối tượng gây bệnh A - Viêm ruột hoại tử

- Viêm ruột nhiễm độc máu- Ngộ độc thực phẩm

- Viêm dạ dày xuất huyết

- Heo, gà

- Bò và cừu con- Người

- ChóB Viêm ruột nhiễm độc máu ở ngựa

con, cừu và dê

Ngựa con, cừu và dê

C - Viêm ruột nhiễm độc máu

- Viêm ruột hoại tử - Cừu, bê con, cừu con, heo con- Người

D - Viêm ruột nhiễm độc máu - Cừu con, dê và trâu bòE - Viêm ruột

- Viêm ruột nhiễm độc máu

- Thỏ

- Bê con và cừu con

Clostridium perfringens được chia thành 5 type (A B C D E ) dựa vào khảnăng tạo ra 1 hay nhiều độc tố gây chết: alpha, beta, epsilon và iota

Độc tố Alpha: Độc tố này được sản xuất nhiều nhất ở C.perfringens type A Vìvậy, Closntium perfringens type A thường biểu hiện đặc tính rất mạnh và việc nhiễmtype A của Clostridian perfringens thường dẫn đến các hậu quả như loại tử cơ, tăngtính thẩm mạch máu và tụ huyết Hậu quả nặng hơn, có thể gây tử vong ở người dobệnh hoại thư sinh khí và ở động vật gây viêm ruột hoại tử, nhiễm độc máu.

Độc tố beta: Là độc tố gây chết chủ yếu ở type B và C của Clostridiumperfringens Độc tố này có vai trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm ruột hoại tử ởngười và động vật Ở người, bệnh do nhiễm phải Clostridium perfringens type C và cócác biểu hiện lâm sàng như nôn ói, đau bụng, tiêu chảy ra máu Ngoài ra, Clostridiumperfringens C còn gây viêm ruột hoại tử ở bê, cứu, lợn con Clostridium perfringenstype B là nguyên nhân gây nhiễm độc máu hoặc viêm ruột hoại tử ở cừu và dê.

Độc tố epsilon: Do C perfringens type C và D tạo ra Độc tố này gây nhiễm độcmáu mãn tính ở gia cầm Nghiêm trọng nhất là những ảnh hưởng gây hoại tử mo não,phù não.

Độc tố iota: Chỉ tạo ra bởi C perfringens type E ở dạng tiền độc tố Tiền độc tốnày thấm vào mạch máu Độc tố này gây hoại tử da ở chuột và nhiễm độc máu ở bê vàcừu con.

 Các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens

Những người bị nhiễm C perfringens bị tiêu chảy, đau thắt vùng bụng xảy rabuồn nôn, gây sốt trong vòng 6 đến 24 giờ (thường là 8 đến 12 giờ) Bệnh thường bắtđầu đột ngột và kéo dài dưới 24 giờ Những người bị nhiễm C perfringens thườngkhông bị sốt hoặc nôn Bệnh không truyền từ người này sang người khác.

Hình 3: Độc tố và các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens

1.5.Các triệu chứng và phương pháp chẩn đoán khi nhiễm Clostridium Perfringens

a.Triệu chứng

Nếu vô tình ăn nhiều thực phẩm có chứa vi khuẩn, C perfringens sẽ gây tiêu

chảy Các triệu chứng khác có thể gồm buồn nôn, nôn, đau bụng, sốt, đau dạ dày,nhiễm trùng đường tiêu hóa, hoại tử ruột Thông thường các triệu chứng phát hiện saukhoảng thời gian từ 18-20 giờ Bệnh không có khả năng lây truyền từ người sang

người C perfringens loại C đôi khi gây hoại tử nặng ở ruột non (chủ yếu là hỗng

tràng)

Ngoài ra, C perfringens còn có khả năng gây bệnh ở các loài động vật C.perfringens gây bênh ở động vật chủ yếu là C perfringens loại B và C perfringensloại D C perfringens loại B sinh ra e-toxin và b- toxin là nguyên nhân chính gây ra

các loại bệnh đường ruột ở cừu như: Viêm ruột mãn tính ở cừu con, viêm ruột ở bê,

dê và ngựa con, bệnh kiết lị ở cừu con C perfringens loại D tạo ra độc tố alpha và

epsilon, chủ yếu ảnh hưởng đến cừu có chế độ ăn phong phú làm tăng khả năng mấtcân bằng vi sin vật trong ruột làm cho thức ăn không được tiêu hóa kịp nên

C.perfringens sinh sôi với số lượng lớn và sản sinh chất độc và tạo điều kiện cho chất

độc xâm nhập vào cơ thể gây ra bệnh đường ruột ở cừu ( thận mềm,…) và còn gâybệnh cho các con vật như dê, bê, ngựa con.

Các triệu chứng thường khởi phát sớm và đột ngột trong vòng 8-12 giờ Tuynhiên, trong một số trường hợp, các dấu hiệu có thể xuất hiện trong vòng 24 giờ saukhi ăn Thời gian kéo dài triệu chứng thường không quá 24 giờ.

 Các triệu chứng hoại thư sinh khí:

+ Các triệu chứng đột ngột khởi phát và đau dữ dội ở vị trí vết thương

+ Màu da ở khu vực nhiễm bệnh đổi màu (thay đổi từ trắng sang hồng, rồi tím hoặcđỏ)

+ Cảm thấy có khí dưới da

b.Phương pháp chẩn đoán khi nhiễm Clostridium Perfringens

Xác định các sinh vật trong thực phẩm hoặc phân hoặc enterotoxin trong phân

Chẩn đoán của ngộ độc thực phẩm do C perfringens dựa trên các bằng chứng

dịch tễ và phân lập được một số lượng lớn vi khuẩn từ thực phẩm bị ô nhiễm hoặc từphân của người bị nhiễm hoặc xác định trực tiếp độc tố ruột trong các mẫu phân.

Nhiễm trùng được xác nhận khi xét nghiệm trong phòng thí nghiệm phát hiện vikhuẩn hoặc độc tố của chúng trong mẫu phân (phân) hoặc vi khuẩn được tìm thấytrong thực phẩm có liên quan đến bệnh tật Các phòng thí nghiệm chẩn đoán ngộ độc

thực phẩm C perfringens bằng cách phát hiện một loại độc tố vi khuẩn trong phân

hoặc bằng các xét nghiệm để xác định số lượng vi khuẩn trong phân Số lượng ít nhất106 C bào tử C.perfringens trên mỗi gram phân trong vòng 48 giờ kể từ khi bệnh bắt

đầu để chẩn đoán nhiễm trùng.

Bác sĩ sẽ chẩn đoán ngộ độc thực phẩm do C perfringens bằng cách xác định số

lượng vi khuẩn trong thức ăn và số lượng nội bào tử trong phân.

Để chẩn đoán hoai thư sinh khí, bác sĩ sẽ phải phân lập và nuôi cấy vi khuẩn từmột mẫu bệnh phẩm từ vết thương.

Chẩn đoán viêm ruột hoại tử do clostridial dựa trên biểu hiện lâm sàng cộng với

sự hiện diện của độc tố C perfringens loại C trong phân.

1.6. Giải pháp điều trị hiện nay

Hầu hết mọi người có thể tự phục hồi sau nhiễm C perfringens mà không cần

điều trị kháng sinh Bệnh nhân nên uống thêm nước nếu tiêu chảy kéo dài.Có thể sử

dụng bù nước đường uống hoặc trong trường hợp nặng, truyền dịch tĩnh mạch và thaythế điện giải để ngăn ngừa hoặc điều trị mất nước và cần được nghỉ ngơi ngay sau đó.

Đối với hoại thư sinh khí, bác sĩ sẽ mổ mô bị nhiễm độc và tổn thương Sau đó,bác sĩ sẽ chỉ định kháng sinh để điều trị các nhiễm trùng còn lại.

2.Quy Trình Định Lượng Clostridium Perfringens2.1. Nguyên tắc định lượng Clostridium Perfringens

Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc mộtlượng huyền phù ban đầu quy định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt môitrường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri.

Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãngthập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính môitrường này.

Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 37OC trong khoảng 24 giờ.Định lượng các khuẩn lạc điển hình.

Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C Perfringenestrong 1ml hoặc trong 1g mẫu.

2.2. Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất của quá trình định lượng clostridium Perfringens

+ ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp

+ pipet chia độ xả hết có dung tích 1ml và 10ml, được chia vạch tương ứng 0,1 và0,5ml.

+ Đĩa petri bằng thủy tinh hoặc chất dẻo đường kính 90mm đến 100mm.+ Nồi cách thủy có thể hoạt động ở 44 - 470C

+ Máy đếm khuẩn lạc+ Máy đồng nhất mẫu+ Máy lắc Vortex

 Môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đíchSPW (Saline Peptone Water) Pha loãng mẫuTSC agar base

Nuôi cấy C PerfringenesD-xycloserin

Thioglycolat lỏngLS (lactose sunfit)

Khẳng định C PerfringenesNitrat (thử di động)

 Môi trường nuôi cấy

+ Môi trường thạch sunfit xycloserin (TSC)+ Môi trường nitrat để thử tính di động+ Môi trường lactose – gelatin

+ Thuốc thử để phát hiện nitrit

+ Bụi kẽ

2.3. 2.3 Quy trình phân tích định lượng Clostridium Perfringenes

Sản phẩm dạng lỏngSản phẩm dạng khác10g mẫu+90mL SPW

02 đĩa petri

02 đĩa

petri 02 đĩa petri

02 đĩa petri

Đọc kết quả Clotridium perfringenes

2.4. Các bước tiến hành định lượng Clostridium Perfringens.Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu.

Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn pha loãng hoặc đong mẫu với thể tích 10mlđối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túinhựa vô trùng (hoặc bình tam giác).

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml ( sai số cho phép ± 5%)vô trùng vào túi nhựa( bình tam giác) chứa mẫu.

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đềubình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong khoảng 2 đến 3 phút.

Bước 2: Pha loãng mẫu.

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai sô ± 5% cho vàomột ốngnghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.

Trộn kỹ bằng máy vortẽ trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 ( đối vớicác loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần,lập lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5,… cho đến khi thuđược lượng vi khuẩn thích hợp.

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầuđối với sáng phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri Lặp lại qui trình với các dungdịch pha loãng thập phâ tiếp theo, nếu cần Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗinồng độ 2 đĩa petri Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường TSC, trộn đều bằng cáchxoay nhẹ từng đĩa Khi môi trường đã đông lại thì phủ kín thêm một lớp dày n10mlcủa cùng loại môi trường TSC Để cho đông đặc lại Lật úp đĩa và ủ trong điều kiện kỵkhí ở 37oC trong 24 giờ.

Bước 4: Đêm và chọn khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới150 sau 24 giờ nuôi cấy Khuẩn lạc C perfringenes điển hình có màu đen trên môitrương TSC Đếm các khuẩn lạc C perfringenes trên những đĩa có số đếm phù hợp. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và chọn một trong hai kỹ thuật thử khẳng định sau:

Kỹ thuật 1: kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS