Môn: Phân Tích Vi Sinh Vật Thực Phẩm Đề Tài: Quy Trình Định Lượng Clostridium Perfringenes Clostridium perfringens là vi khuẩn gram dương hình que tương đối ngắn, di động, kỵ khí. Các tế bào vi khuẩn của Clostridium perfringens chúng tạo ra một bào tử duy nhất nằm ở một trong các đầu cuối của nó. Trong quá trình hình thành các độc tố bào tử được tổng hợp gây tử vong cho con người và một loạt các động vật, thường gặp trong đất, bụi và ruột của động vật. Ngoài ra Clostridium perfringens thường được tìm thấy trên thịt và gia cầm sống. Ngoài những vi sinh vật có lợi cũng có những vi sinh vật có hại gây bệnh cho cây trồng, động vật, thủy hải sản và nhất là ảnh hưởng tới con người. Ngày nay, khi xã hội phát triển thì mặt hàng thực phẩm cũng khá phong phú và tiện lợi cho người tiêu dùng lựa chọn. Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và được nhiều người sử dụng. Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dự trữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra. Một trong những thực phẩm thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp. Nếu khi mua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển ở trong loại thực phẩm này. Theo thống kê tại Mỹ, ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens có trong đồ hộp và được xếp vào hàng thứ 3 sau Salmonella và Staphylococcus aureus.
Tổng quan về Clostridium Perfringens
Khái quát đặt điểm chung của Clostridium Perfringens
Clostridium perfringens là vi khuẩn gram dương hình que tương đối ngắn, di động, kỵ khí Các tế bào vi khuẩn của Clostridium perfringens chúng tạo ra một bào tử duy nhất nằm ở một trong các đầu cuối của nó Trong quá trình hình thành các độc tố bào tử được tổng hợp gây tử vong cho con người và một loạt các động vật, thường gặp trong đất, bụi và ruột của động vật Ngoài ra Clostridium perfringens thường được tìm thấy trên thịt và gia cầm sống
Hình 1: Khái quát đặt điểm chung của Clostridium Perfringens
Điều kiện sinh trưởng và môi trường phát triển
Clostridium perfringens có một số điều kiện pH và nhiệt độ nhất định để có thể phát triển tối ưu Nhiệt độ mà nó có thể phát triển nằm trong khoảng từ 20 đến 50°C và phát triển mạnh 43 - 47°C.
Về độ pH, vi khuẩn này thích môi trường có độ axit và tính trung tính nhất định, đặt độ pH lý tưởng của nó trong khoảng từ 6.0 – 7.0.
Khi nó phải đối mặt với điều kiện môi trường căng thẳng, nó tạo ra các bào tử. Chúng có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi, như nhiệt độ cao, giá trị pH cực cao và không có chất dinh dưỡng.
C perfringens có thể tồn tại ở nhiệt độ cao Trong quá trình làm lạnh và giữ thực phẩm ở nhiệt độ từ 12°C - 60°C, vi khuẩn sẽ phát triển Nó có thể phát triển rất nhanh trong khoảng từ 43°C - 47°C.
Các đợt bùng phát dịch bệnh thường xảy ra tại các cơ sở tập thể đông người như bệnh viện, nhà ăn trường học, nhà tù và viện dưỡng lão Ngoài ra, dịch bệnh cũng có thể bùng phát tại các sự kiện có phục vụ đồ ăn uống.
Hình 2: Điều kiện sinh trưởng và môi trường phát triển
Phân loại
Độc tố và các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens
Các bệnh chính do độc tố gây ra Đối tượng gây bệnh
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Viêm dạ dày xuất huyết
B Viêm ruột nhiễm độc máu ở ngựa con, cừu và dê
Ngựa con, cừu và dê
C - Viêm ruột nhiễm độc máu
- Viêm ruột hoại tử - Cừu, bê con, cừu con, heo con
D - Viêm ruột nhiễm độc máu - Cừu con, dê và trâu bò
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Bê con và cừu con
Clostridium perfringens được chia thành 5 type (A B C D E ) dựa vào khả năng tạo ra 1 hay nhiều độc tố gây chết: alpha, beta, epsilon và iota Độc tố Alpha: Độc tố này được sản xuất nhiều nhất ở C.perfringens type A Vì vậy, Closntium perfringens type A thường biểu hiện đặc tính rất mạnh và việc nhiễm type A của Clostridian perfringens thường dẫn đến các hậu quả như loại tử cơ, tăng tính thẩm mạch máu và tụ huyết Hậu quả nặng hơn, có thể gây tử vong ở người do bệnh hoại thư sinh khí và ở động vật gây viêm ruột hoại tử, nhiễm độc máu. Độc tố beta: Là độc tố gây chết chủ yếu ở type B và C của Clostridium perfringens Độc tố này có vai trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm ruột hoại tử ở người và động vật Ở người, bệnh do nhiễm phải Clostridium perfringens type C và có các biểu hiện lâm sàng như nôn ói, đau bụng, tiêu chảy ra máu Ngoài ra, Clostridium perfringens C còn gây viêm ruột hoại tử ở bê, cứu, lợn con Clostridium perfringens type B là nguyên nhân gây nhiễm độc máu hoặc viêm ruột hoại tử ở cừu và dê. Độc tố epsilon: Do C perfringens type C và D tạo ra Độc tố này gây nhiễm độc máu mãn tính ở gia cầm Nghiêm trọng nhất là những ảnh hưởng gây hoại tử mo não, phù não. Độc tố iota: Chỉ tạo ra bởi C perfringens type E ở dạng tiền độc tố Tiền độc tố này thấm vào mạch máu Độc tố này gây hoại tử da ở chuột và nhiễm độc máu ở bê và cừu con.
Các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens
Những người bị nhiễm C perfringens bị tiêu chảy, đau thắt vùng bụng xảy ra buồn nôn, gây sốt trong vòng 6 đến 24 giờ (thường là 8 đến 12 giờ) Bệnh thường bắt đầu đột ngột và kéo dài dưới 24 giờ Những người bị nhiễm C perfringens thường không bị sốt hoặc nôn Bệnh không truyền từ người này sang người khác.
Hình 3: Độc tố và các bệnh gây ra bởi Clostridium Perfringens
Các triệu chứng và phương pháp chẩn đoán khi nhiễm
Nếu vô tình ăn nhiều thực phẩm có chứa vi khuẩn, C perfringens sẽ gây tiêu chảy Các triệu chứng khác có thể gồm buồn nôn, nôn, đau bụng, sốt, đau dạ dày, nhiễm trùng đường tiêu hóa, hoại tử ruột Thông thường các triệu chứng phát hiện sau khoảng thời gian từ 18-20 giờ Bệnh không có khả năng lây truyền từ người sang người C perfringens loại C đôi khi gây hoại tử nặng ở ruột non (chủ yếu là hỗng tràng)
Ngoài ra, C perfringens còn có khả năng gây bệnh ở các loài động vật C. perfringens gây bênh ở động vật chủ yếu là C perfringens loại B và C perfringens loại D C perfringens loại B sinh ra e-toxin và b- toxin là nguyên nhân chính gây ra các loại bệnh đường ruột ở cừu như: Viêm ruột mãn tính ở cừu con, viêm ruột ở bê, dê và ngựa con, bệnh kiết lị ở cừu con C perfringens loại D tạo ra độc tố alpha và epsilon, chủ yếu ảnh hưởng đến cừu có chế độ ăn phong phú làm tăng khả năng mất cân bằng vi sin vật trong ruột làm cho thức ăn không được tiêu hóa kịp nên
C.perfringens sinh sôi với số lượng lớn và sản sinh chất độc và tạo điều kiện cho chất độc xâm nhập vào cơ thể gây ra bệnh đường ruột ở cừu ( thận mềm,…) và còn gây bệnh cho các con vật như dê, bê, ngựa con.
Các triệu chứng thường khởi phát sớm và đột ngột trong vòng 8-12 giờ Tuy nhiên, trong một số trường hợp, các dấu hiệu có thể xuất hiện trong vòng 24 giờ sau khi ăn Thời gian kéo dài triệu chứng thường không quá 24 giờ.
Các triệu chứng hoại thư sinh khí:
+ Các triệu chứng đột ngột khởi phát và đau dữ dội ở vị trí vết thương
+ Màu da ở khu vực nhiễm bệnh đổi màu (thay đổi từ trắng sang hồng, rồi tím hoặc đỏ)
+ Cảm thấy có khí dưới da b Phương pháp chẩn đoán khi nhiễm Clostridium Perfringens
Xác định các sinh vật trong thực phẩm hoặc phân hoặc enterotoxin trong phân
Chẩn đoán ngộ độc thực phẩm do C perfringens dựa trên bằng chứng dịch tễ, phân lập được vi khuẩn từ thực phẩm bị ô nhiễm hoặc phân của người bệnh và xác định trực tiếp độc tố trong mẫu phân.
Nhiễm trùng được chẩn đoán khi xét nghiệm trong phòng thí nghiệm phát hiện vi khuẩn hoặc độc tố trong mẫu phân hoặc xác định số lượng vi khuẩn có trong thực phẩm gây bệnh Phòng thí nghiệm chẩn đoán ngộ độc thực phẩm C perfringens bằng cách phát hiện độc tố vi khuẩn trong phân hoặc đếm số lượng vi khuẩn trong phân.
10 6 C bào tử C.perfringens trên mỗi gram phân trong vòng 48 giờ kể từ khi bệnh bắt đầu để chẩn đoán nhiễm trùng.
Bác sĩ sẽ chẩn đoán ngộ độc thực phẩm do C perfringens bằng cách xác định số lượng vi khuẩn trong thức ăn và số lượng nội bào tử trong phân. Để chẩn đoán hoai thư sinh khí, bác sĩ sẽ phải phân lập và nuôi cấy vi khuẩn từ một mẫu bệnh phẩm từ vết thương.
Chẩn đoán viêm ruột hoại tử do clostridial dựa trên biểu hiện lâm sàng cộng với sự hiện diện của độc tố C perfringens loại C trong phân.
Giải pháp điều trị hiện nay
Hầu hết mọi người có thể tự phục hồi sau nhiễm C perfringens mà không cần điều trị kháng sinh Bệnh nhân nên uống thêm nước nếu tiêu chảy kéo dài.Có thể sử dụng bù nước đường uống hoặc trong trường hợp nặng, truyền dịch tĩnh mạch và thay thế điện giải để ngăn ngừa hoặc điều trị mất nước và cần được nghỉ ngơi ngay sau đó.Đối với hoại thư sinh khí, bác sĩ sẽ mổ mô bị nhiễm độc và tổn thương Sau đó,bác sĩ sẽ chỉ định kháng sinh để điều trị các nhiễm trùng còn lại.
Quy Trình Định Lượng Clostridium Perfringens
Nguyên tắc định lượng Clostridium Perfringens
Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu quy định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri.
Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính môi trường này. Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 37 O C trong khoảng 24 giờ. Định lượng các khuẩn lạc điển hình.
Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C Perfringenes trong 1ml hoặc trong 1g mẫu.
Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất của quá trình định lượng clostridium Perfringens
Dụng cụ và thiết bị
+ Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ớt (nồi hấp).
+ Tủ ấm điều chỉnh ở nhiệt độ 37 ± 1 0 C.
+ Bình nuôi cấy kỵ khí, hoặc có thể sử dụng bình tự tạo nhưng đảm bảo được môi trường kỵ khí.
+ Có thể đọc chính xác đến ± 0,01 đơn vị pH ở 25 0 C, có thể đo phép đo chính xác đến 0,1 đơn vị pH.
+ Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crom, đường kính khoảng 3mm, và các kim cấy sâu.
+ ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp
+ pipet chia độ xả hết có dung tích 1ml và 10ml, được chia vạch tương ứng 0,1 và 0,5ml.
+ Đĩa petri bằng thủy tinh hoặc chất dẻo đường kính 90mm đến 100mm.
+ Nồi cách thủy có thể hoạt động ở 44 - 47 0 C
Môi trường và hóa chất
Môi trường và hóa chất Mục đích
SPW (Saline Peptone Water) Pha loãng mẫu
HCl và NaOH 10% Chỉnh pH
+ Môi trường thạch sunfit xycloserin (TSC)
+ Môi trường nitrat để thử tính di động
+ Thuốc thử để phát hiện nitrit
2.3 2.3 Quy trình phân tích định lượng Clostridium Perfringenes
Sản phẩm dạng lỏng Sản phẩm dạng khác
Sau khi đông đặc thêm 10mL TSC mỗi đĩa, chờ đông đặc, lật ngược đĩa ủ kỵ khí ở 37 trong 202h
Lactose sunfit hoặc Nitrat, Lactose-gelatin ủ hiếu khí 46/18-24h Thioglycolate broth, ủ kỵ khí 37, 18-24h Đọc kết quả Clotridium perfringenes
Dịch mẫu Dịch mẫu Dịch mẫu
2.4 Các bước tiến hành định lượng Clostridium Perfringens.
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu.
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn pha loãng hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (hoặc bình tam giác).
Cho 90ml dung dịch pha loãng SPW vô trùng vào túi nhựa chứa mẫu, sai số cho phép là ±5% Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều trong 2-3 phút để đảm bảo mẫu và dung dịch pha loãng SPW hòa trộn đều.
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai sô ± 5% cho vàomột ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortẽ trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 ( đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1 ) Nếu cần, lập lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 ,… cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.
Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu đối với sáng phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phâ tiếp theo, nếu cần Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường TSC, trộn đều bằng cách xoay nhẹ từng đĩa Khi môi trường đã đông lại thì phủ kín thêm một lớp dày n10ml của cùng loại môi trường TSC Để cho đông đặc lại Lật úp đĩa và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37 o C trong 24 giờ.
Bước 4: Đêm và chọn khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới
150 sau 24 giờ nuôi cấy Khuẩn lạc C perfringenes điển hình có màu đen trên môi trương TSC Đếm các khuẩn lạc C perfringenes trên những đĩa có số đếm phù hợp.
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và chọn một trong hai kỹ thuật thử khẳng định sau:
Kỹ thuật 1: kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS
Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường thioglycolat lỏng, ủ ở 37oC trong 24 giờ trong điều kiện kỵ khí Sauk hi ủ, dung pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycolat sang môi trương LS, ủ ở 46oC trong 24 giờ trong điều kiện hiếu khí Kiểm tra các ống nghiệm chuaw môi trường LS về sự sinh khí và có xuất hiện kết tủamàu đen được coi là dương tính.
Kỹ thuật 2: kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường nitrat để thử tính di đônhgj và môi trường lactose-gelatin
Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc sang môi trường nitrat để thử tính di động, ủ 37oC trong 24 giờ trong điều kiện kị khí Kiểm tra ống môi trường nitrat để thử tính di động đối với loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu Tính di động là bằng chứng phát triểnlan rộng vào môi trường cách xa đường cấy đâm sâu Tiếp theo kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách thêm 0,2-0,5ml thuốc thử phát hiện nitrit vào từng ống môi trường nitrit để kiểm tra sự có mặt của nitrit.
Tương tự cấy khuẩn lạc chọn lọc đã chọn ở trên sang môi trường lactose-gelatin, ủ ở 37oC trong 24 giờ trong điều kiện kỵ khí Kiểm tra các ống nghiệm về việc sinh khí và có xuất hiện màu vàng cho thấy sự lê men lactoza Làm lạnh các ống 1 giờ ở5oC để kiểm tra sự hóa lỏng của gelatin, nếu môi trường đông đặc thì ủ thêm 24 giờ và kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin.
Kết quả phân tích quy trình định lượng Clostridium Perfringens
Đối với kỹ thuật 1: vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch TSC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C. Perfringens Trong trường hợp khác, các ống được coilà âm tính. Đối với kỹ thuật 2: các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong môi trường TSC mà không di động, thường khử itrat thành nitri, inh acid và sinh khí từ lactoza và hóa lỏng gelatin được coi là C Perfringens.
Perfringens trong 1g/ml mẫu (X) được tính theo công thức:
V ×(n 1 +0,1×n 2 )× d (CFU/g hay CFU/ml)C1,2,3,4: Số khuẩn lạc C Perfringens đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp.
V: thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n2: Số đĩa ở độ loãng thứ hai được giữ lại d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất
R1,2,3,4: Tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp.
Tiêu Chuẩn Về Định Lượng Clostridium Perfringens
Quyết định số 3348/QĐ-BYT
ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM
(Ban hành kèm theo Quyết định số 3348/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
Vi khuẩn C perfringens phát triển trên môi trường TSC trong điều kiện kỵ khí sẽ hình thành khuẩn lạc có màu đen Sau khi chọn một khuẩn lạc điển hình, các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn sẽ được xác định theo quy trình tiêu chuẩn để hỗ trợ chẩn đoán.
II PHẠM VI ÁP DỤNG
Phát hiện ô nhiễm Clostridium perfringens trong nước, thực phẩm và thức ăn chế biến sẵn.
III DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
- Bình nuôi cấy kỵ khí.
- Thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC agar).
- Canh thang gan cục hoặc canh thang thịt.
- Canh thang nuôi cấy nha bào.
- Dung dịch đệm glycerin - salt.
IV CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được pha chế theo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110 o C/30 phút hoặc 121 o C/15 phút)
2 Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
Lưu ý: Nếu thời gian xét nghiệm kéo dài quá 8 giờ, mẫu thực phẩm phải được bảo quản trong dung dịch muối đệm - glycerin (Buffer glycerin Salt Solution - BGS) theo tỷ lệ 1:1 Sau khi ngâm trong dung dịch BGS, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ lạnh - 20 độ C.
Trước khi xét nghiệm, phải làm tan băng.
2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -1
Cân chính xác 25 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 225 ml nước muối đệm pepton (BPW) 9‰.
Lắc đều 2 - 3 phút Thu được dung dịch mẫu thử 10 -1
2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 - 2 ,10 - 3 ,10 - 4
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối đệm pepton 9‰ Lắc đều trong 2-3phút. Thu được dung dịch 10 -2
- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 (theo sơ đồ).
A Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch
- Rót 6 - 7 ml thạch TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu nồng độ pha loãng Lắc cho thạch láng đều mặt đĩa.
Khi thạch đông đặc, các nhà khoa học sử dụng pipette để chiết xuất chính xác 1 ml dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng khác nhau Sau đó, các mẫu này được cấy lên đĩa petri theo từng nồng độ, mỗi nồng độ được cấy vào hai đĩa riêng biệt.
- Rót tiếp 15 ml thạch TSC vào mỗi đĩa petri đã được láng mẫu thử. Lắc trộn đều sao cho thạch phủ đều khắp bề mặt đĩa petri.
- Khi thạch đông chặt, lật ngược đĩa, đặt vào bình kỵ khí (ví dụ các túi hóa chất tạo kỵ khí hoặc tủ ấm nuôi vi khuẩn kỵ khí). Đặt bình kỵ khí vào tủ ấm 35 0 C/20 -24 giờ.
Bước 2: Đọc kết quả sơ bộ sau 24 giờ
- Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, có màu đen
- Tính số lượng vi khuẩn C perfringens /1 g thực phẩm bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng.
- Chỉ đếm các đĩa thạch có khoảng 20 - 200 khuẩn lạc để tính kết quả.
- Nếu các khuẩn lạc phân bố trên đĩa nuôi cấy không rõ ràng thì phải làm lại.
Bước 3: Xác định hình thể và tính chất bắt mầu a) Chuẩn bị canh trùng thuần nhất
Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc điểm: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen trên đĩa thạch TSC cấy vào 1 ống môi trường canh thang thioglycolat hoặc canh thang gan cục và canh thang nha bào. Ủ ấm 35 0 C/18 - 24 giờ Thu được canh trùng thuần nhất. b) Hình thể và tính chất bắt mầu
- Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram để xem hình thể và tính chất bắt mầu C perfringens là trực khuẩn ngắn, bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr (+).
- Phát hiện khả năng sinh nha bào: nhuộm Gram từ canh thang nha bào thấy: trực khuẩn ngắn, tròn đầu, giữa có khoảng trắng sáng không bất mầu thuốc nhuộm.
Bước 4: Thử tính chất sinh vật hoá học a) Thử nghiệm Iron - Milk
- Lấy 1ml canh trùng thuần nhất cho vào ống nghiệm môi trường Iron
- C.perfringen làm đông sữa nhanh ở đáy ống nghiệm và tạo ra lớp nhũ tương ở trên. b) Thử tính chất lên men đường và hoá lỏng gelatin
- Từ canh trùng thuần nhất cấy vào môi trường lactoza gelatin Sau
24 giờ ở 35 0 C, nhận định khả năng lên men đường Lactoza, và khả năng sinh hơi Đặt ống nghiệm vào 5 0 C/1 giờ - Đọc kết quả sơ bộ khả năng hóa lỏng gelatin.
- Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc, ủ thêm 24 giờ/ 35 0 C. c) Khả năng chuyển hoá nitrat thành nitrit:
- Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35 o C/24 giờ Nhỏ 0,25ml thuốc thử A và B.
- Quan sát mầu môi trường chuyển sang mầu cam hoặc tím (+)/10 phút.
Tiêu chuẩn để xác định C perfringen
Có nha bào Khuẩn lạc mầu đen trên
B Phương pháp nuôi cấy trong ống thạch
Bước 1: Môi trường thuốc thử
- Thạch Wilson Blair hay thạch Perfringens selective được đổ vào mỗi ống nghiệm (mỗi ống nghiệm khoảng 30ml thạch)
- Dung dịch ferrous amon sunfat 5% (dung dịch phèn sắt 5%).
- Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử như trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn của mẫu mà pha loãng đến đậm độ dùng nuôi cấy.
to the agar Inoculate each concentration in two tubes To each tube, add 2 mL of **egg yolk emulsion**.
Na2SO3 20% và 5giọt phèn sắt 5% Lắc trộn đều.
- Đun cách thủy 75 0 C/15phút Làm đông nhanh thạch.
Bước 3: Đọc kết quả: Khuẩn lạc vi khuẩn C perfringens tròn, đen, có đường kính 3mm.
Tính số vi khuẩn có trong 1g mẫu bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ C perfringens có trong hai đĩa thạch hoặc ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng độ nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.
Ví dụ: Độ pha loãng 10 -2 :
- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc
- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc
- Số khuẩn lạc có trong 1g thực phẩm được tính
Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm có 1,2 ´ 10 2 vi khuẩn C.perfringens
Sơ đồ định lượng C perfringens
Thạch Tryptose – Sunfit – Cycloserin (TSC)
Bình kỵ khí để trong điều kiện 35 0 C/20-24 giờ
5 Nhận định kết quả sơ bộ: Chọn đĩa có 20-200 khuẩn lạc đen để đếm
6 Xác định hình thể, tính chất bắt mầu và khả năng sinh nha bào
7 Xác định tính chất sinh vật hoá học
Trực khuẩn ngắn Có nha bào Mầu đen trên môi trường TSC
Lactoza: (+) Hơi: (+) Iron – milk: (+) Làm lỏng gelatin
Giới thiệu sơ lược về TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004)
Tên gọi đầy đủ: TIÊU CHUẨN VIỆT NAM 4991:2005
Nội dung tiêu chuẩn: VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN ĐĨA THẠCH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC
Phạm vi áp dụng của TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004): Tiêu chuẩn qui định phương pháp định lượng Clostridium perfringens có khả năng mọc trên đĩa thạch Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn cho động vật.
Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
Yêu cầu về nguyên tắc định lượng của TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004):
Các đĩa Petri được cấy một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Đối với các đĩa Petri khác, trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính môi trường này.
Nguyên tắc 2: Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 37°C trong 20 h ± 2 h.
Nguyên tắc 3: Định lượng các khuẩn lạc điển hình.
Nguyên tắc 4: Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu.
Chuẩn bị dịch pha loãng, môi trường cấy theo TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004)
Dịch pha loãng: Dựa theo TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).
Môi trường cấy: Dựa theo TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2.
Một số môi trường có thể dùng để định lượng dựa theo TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004)
Môi trường thạch sunfit xycloserin (SC)
Dinatri disunfit (Na2S2O5), dạng khan 1,0 g
Nước 1 000 ml a Thuốc thử này phải chứa ít nhất 15 % (phần khối lượng) sắt. b Tuỳ thuộc vào sức đông của thạch.
Chú ý: Ngay trước khi sử dụng trong phương pháp rót đĩa, cứ 100 ml môi trường cơ bản tan chảy vô trùng đã được làm nguội đến 44°C đến 47°C thì thêm 1 ml dung dịch D-xycloserin.
Thành phần dung dịch D-xycloserin
Nước 100 ml a Chỉ sử dụng bột tinh thể trắng.
Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường SC
+ Để xác định tính chọn lọc và năng suất theo ISO/TS 11133-1 + Để kiểm tra tính năng theo ISO/TS 11133-2:2003
Nước 1 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.
Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường thioglycolat Để xác định tính chọn lọc và năng suất theo ISO/TS 11133-1 Để kiểm tra tính năng theo ISO/TS 11133-2:2003.
Môi trường lactoza sunfit (LS) (Tùy chọn)
Môi trường nitrat để thử tính di động (Tùy chọn)
Môi trường lactoza-gelatin (Tùy chọn)
Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).
+Chọn một trong hai kỹ thuật thử khẳng định
Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS
Phản ứng thu được trong môi trường lactoza sunfit khi ủ ở 46 °C là rất đặc trưng cho C.perfringens và C.absonum Do đó, không cần phải khẳng định sự thuần khiết của các khuẩn lạc màu đen được lấy từ môi trường thạch trước khi cấy vào môi trường thioglycolat và cấy truyền vào môi trường thạch lactoza sunfit nữa.
Kiểm tra các ống nghiệm đựng môi trường LS về việc sinh khí và có xuất hiện màu đen (kết tủa của sắt sunfit) Các ống Durham có phần bọt khí chiếm hơn một phần tư chiều dài ống và các ống có kết tủa màu đen được coi là dương tính.
Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch
SC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C.perfringens Trong các trường hợp khác, các ống được coi là âm tính.
Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường nitrat để thử tính di động và môi trường lactoza-gelatin
Kỹ thuật khẳng định này đòi hỏi các khuẩn lạc điển hình phân lập tốt. Nếu không phải như thế (nghĩa là bề mặt của các đĩa bị mọc quá dày và không thể chọn các khuẩn lạc điển hình phân lập tốt), thì cấy năm khuẩn lạc điển hình vào môi trường thioglycollat lỏng đã khử khí trước. Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 18 h đến 24 h Cấy ria các khuẩn lạc lên các đĩa thạch cơ bản SC và phủ kín thêm 10 ml thạch cơ bản SC. Để cho đông đặc và ủ kỵ khí ở 37 °C trong 18h đến 24h Chọn từ mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và phân lập tốt Nếu cần, lặp lại quá trình cấy ria và cấy trên các đĩa môi trường thạch cơ bản SC cho đến khi thu được các khuẩn lạc đen điển hình phân lập tốt.
Các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong môi trường SC mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh axit và sinh khí từ lactoza và hoá lỏng gelatin trong vòng 48 h được coi là C.perfringens Các chủng cho phản ứng yếu đối với nitrit (tức là có màu hồng) phải được loại bỏ, vì C.perfringens luôn luôn phản ứng mạnh và phản ứng tức thì.
+Có thể sử dụng loại có bán sẵn nếu phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218).
Một số thử nghiệm sinh hóa phân tích Clostridium perfringens21 1 Thử tính di động
Thử nghiệm nitratase
Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nitrat (Khử NO3-) của Clostridium perfringens
Môi trường: Môi trường nitrat
Thuốc thử: Gress A (acid sulfanilic), Gress B ( α −¿naphthylamin), ngoài ra còn có bột kẽm (nếu cần)
Thao tác: Tiến hành cho 0,2-0,5 mL thuốc thử Gress A, Gress B vào ống môi trường nitrat di động (tiến hành trong tủ HOP). Đọc kết quả:
- Môi trường có màu đỏ → (+¿) Clostridium perfringens
Nếu trong 15 phút màu đỏ không hình thành thì thêm bột kẽm và để yên 10 phút
- Môi trường không chuyển màu → (+¿) Clostridium perfringens
- Môi trường có màu hồng đỏ→(−¿) Clostridium perfringens
Thử nghiệm gelatinase
Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải gelatin của Clostridium perfringens
Môi trường: Môi trường gelatin-lactose
Thao tác: Dùng que cấy thẳng cấy Clostridium perfringens vào môi trường, ủ trong điều kiện yếm khí, nhiệt độ 37℃, 18-24 giờ Đọc kết quả:
Kiểm tra ống môi trường xem có sinh khí, có chuyển thành màu vàng do tạo acide => lên men lactose
Làm lạnh 1 giờ ở nhiệt độ 5℃
- Môi trường hóa lỏng → (+¿) Clostridium perfringens
- Môi trường đông đặc → (−¿) Clostridium perfringens
Thử nghiệm CAMP
Nguyên tắc: Nhằm xác định hiện tượng tan huyết do phối hợp giữa nhân tố CAMP và α−¿hemolysin của Clostridium perfringens.
Môi trường: môi trường thạch máu
Thuốc thử: dạng dung dịch CAMP nhỏ giọt
Thao tác: Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần chủng của
C.perfringens thành một đường zíc-zắc thẳng đứng ở giữa đĩa Ria chủng vi khuẩn cần thử nghiệm theo một đường thẳng vuông góc với đường cấy C.perfringens nhưng không chạm vào đường đó.Ria chủng làm đối chứng dương song song và cách đường ria chủng cần xác định khoảng 1 inch (2,54 cm) Đề tên mỗi đường ria vào mặt sau của đĩa Ủ đĩa qua đêm ở 35℃ trong tủ ấm có CO2 Đọc kết quả:
- Có sự hình thành vùng tan huyết trong rõ hình đầu mũi tên tại vùng tiếp giáp giữ đường cấy của chủng kiểm nghiệm vàC.perfringens → (+¿)
- Không có vùng tan huyết tại vùng tiếp giáp như trên →(−¿)
Tổng kết khi thực nghiệm hóa sinh trên Clostridium perfringens
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn đen ở môi trường TSC, không di động, khử nitrat thành nitrit, sinh acide và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin trong 48h được coi là Clostridium perfringens.Nếu nhiều hơn hoặc bằng 80% số khuẩn lạc điển hình đếm được được xác định là Clostridium Perfringens thì toàn bộ số khuẩn lạc được coi là Clostridium perfringens.
Các trường hợp khác kết quả được tính toán dựa vào tỉ lệ phần trăm của các khuẩn lạc được xác nhận là Clostridium perfringens so với số khuẩn lạc đếm được.
