Thẩm định quy trình định lượng cafein trong trà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC O C O THỰC TẬP ĐỊNH LƯỢNG CAFEIN TRONG TRÀ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Học viên: Lê Nguyễn Phúc Hiền Lớp: CH DL-DCT (2017-2019) TPHCM – 04/2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC O C O THỰC TẬP ĐỊNH LƯỢNG CAFEIN TRONG TRÀ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Cô hướng dẫn: TS Trần Thị Vân Anh Học viên: Lê Nguyễn Phúc Hiền Lớp: CH DL-DCT (2017-2019) TPHCM – 04/2019 MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG iii I Quy trình chuẩn bị mẫu 1.1 Mẫu thử (mẫu trà B) 1.2 Mẫu chuẩn 1.3 Điều kiện sắc ký II Các kết phân tích 2.1 Kiểm tra độ tinh khiết chất chuẩn 2.2 Xây dựng đường thẳng tuyến tính 2.3 Xác định hàm lượng cafein mẫu thử III Kế hoạch thực việc thẩm định quy trình định lượng cafein trà 3.1 Kiểm tra tính tương thích hệ thống 3.2 Tính đặc hiệu 3.3 Khoảng tuyến tính 3.4 Khảo sát độ lặp lại 10 3.5 Khảo sát độ 10 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử Hình 1.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (nồng độ 500 µg/ml) Hình 1.3 Đồ thị đường chuẩn cafein Hình 1.4 Sắc ký đồ dãy dung dịch cafein chuẩn Hình 1.5 Sắc ký đồ của mẫu thử (B2) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Kết khảo sát độ tuyến tính Bảng 1.2 Hàm lượng cafein mẫu thử Bảng 1.3 Kết định tính cafein Bảng 1.4 Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 1.5 Khảo sát độ đặc hiệu Bảng 1.6 Kết khảo sát độ tuyến tính Bảng 1.7 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng cafein 10 Bảng 1.8 Kết khảo sát độ 11 iii I Quy trình chuẩn bị mẫu 1.1 Mẫu thử (mẫu trà B) - Mẫu trà phơi khô xay nhuyễn rây qua rây 0,2 mm - Cân xác 100 mg bột trà rây cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm 10 mL nước sơi, nhúng ống nghiệm vào bếp cách thủy 95 0C vòng 15 phút, sau siêu âm 40 ℃ vịng 15 phút - Để lắng, lọc qua bông, dùng pipet pasteur chuyển dịch chiết vào bình định mức 25 mL - Tiếp tục chiết thêm lần với điều kiện tương tự - Lần thứ chiết với mL nước thực điều kiện chiết lần đầu - Bổ sung nước cho đủ 25 mL, lắc - Lọc mẫu qua màng lọc 0,22 μm Hình 1.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử 1.2 Mẫu chuẩn Tiến hành pha dung dịch chuẩn: pha 10 ml dung dịch cafein chuẩn nước cất lần có nồng độ mg/ml (dung dịch A) Từ dung dịch A pha dung dịch chuẩn có nồng độ 500, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml 1.3 Điều kiện sắc ký - Cột sắc kí: Diamonsil - Pha động: H2O : MeOH (65:15) isocratic phút, rửa cột với tỉ lệ H2O: MeOH (10:90) phút - Giữa lần chạy cân cột phút - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 μl - Bước sóng phát hiện: 273 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng thí nghiệm II Các kết phân tích 2.1 Kiểm tra độ tinh khiết chất chuẩn Tiêm dung dịch chuẩn 500 μg/mL với chương trình chạy có bước sóng phát 200-400 nm Thời gian lưu: 5,006 (phút) Diện tích 14927678 peak: Độ tinh khiết: 100% Hình 1.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (nồng độ 500 µg/ml) 2.2 Xây dựng đường thẳng tuyến tính Tiêm dung dịch chuẩn với dãy nồng độ Tiến hành xây dựng đường thẳng tuyến tính Bảng 1.1 Kết khảo sát độ tuyến tính Mẫu Nồng độ mẫu chuẩn Diện tích peak mẫu chuẩn (µg/ml) chuẩn 507 14723817 304.2 8955565 7517930 253.5 126.75 4138680 50.7 1524762 10.14 345833 Phương trình tuyến tính là: y = 28822x +185440 Độ tương quan: R2 = 0,9991 Phân tích liệu hồi quy: Phương trình hồi quy có dạng: y = ax + b  F =4427,689 > F 0,05 nên tồn phương trình hồi quy  P-value Intercept (tung độ góc b) = 0,186 > 0,05 nên tồn b khơng có ý nghĩa thống kê  P-value X Variable (hệ số góc a) < 0,05 nên tồn a có ý nghĩa thống kê  Do đó, phương trình hồi quy cafein chuẩn là: y = 28822x Hình 1.3 Đồ thị đường chuẩn cafein Hình 1.4 Sắc ký đồ dãy dung dịch cafein chuẩn Độ tinh khiết chất chuẩn đạt 100 % 2.3 Xác định hàm lượng cafein mẫu thử Tiến hành tiêm mẫu thử (mẫu trà B) Dựa vào tương quan nồng độ diện tích peak cafein chuẩn, tiến hành tính hàm lượng cafein có mẫu trà phân tích Phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 28822x Nồng độ cafein mẫu thử (µg/ml) = Ban đầu cân 100 mg bột trà, chiết bổ sung đủ 25 ml dung dịch thử, nên hàm lượng cafein X (µg) mg bột trà tính sau: X= (µg/mg) hay (mg/g) Bảng 1.2 Hàm lượng cafein mẫu thử Mẫu tR (phút) Diện tích peak mẫu thử Hàm lượng cafein (mg/g (B) (µV*sec) ngun liệu khơ) 4,902 3514384 30,483 4,944 3495720 30,322 4,962 3495780 30,322 TB 4,936 3501961,333 30,376 Hàm lượng cafein mẫu trà B: XB = 30,376 (mg/g) Vậy 100 mg bột trà đem chiết với quy trình thu 3,0376 mg cafein Nồng độ Cafein mẫu trà B: 3,0376 % Bảng 1.3 Kết định tính cafein Mẫu Thời gian lưu peak cafein (phút) Chuẩn 5,006 B1 4,902 B2 4,944 B3 4,962 Trung bình 4,95 ± 0.043 Kết trình bày Bảng 1.3 cho thấy mẫu chuẩn thử có thời gian lưu giống nhau, giá trị tR 4,95 ± 0.043 (phút) Thời gian lưu: 4.944 (phút) Diện tích peak: 3495720 Độ tinh khiết: 99,9 % Hình 1.5 Sắc ký đồ của mẫu thử (B2) III Kế hoạch thực việc thẩm định quy trình định lượng cafein trà Các tiêu điển hình thẩm định cần xem xét: - Kiểm tra tính tương thích hệ thống - Tính đặc hiệu - Tính tuyến tính - Độ lặp lại - Độ 3.1 Kiểm tra tính tương thích hệ thống Mục đích: Thẩm định hệ thống có phù hợp với quy trình hay không Tiến hành: tiêm mẫu cafein (mẫu chuẩn hay mẫu thử được) lần vào hệ thống với điều kiện sắc ký chọn ghi nhận sắc ký đồ Tổng hợp, ghi nhận thông số (thời gian lưu diện tích peak) dựa vào bảng 1.5 Tính tốn kết để xét độ lệch thơng số Bảng 1.4 Khảo sát tính tương thích hệ thống Mẫu chuẩn tR (phút) Diện tích peak TB SD RSD (%) Kết phân tích cần so sánh: RSD thời gian lưu diện tích peak Nếu RSD < % cho thấy quy trình đạt tính tương thích hệ thống 3.2 Tính đặc hiệu Mục đích: Đánh giá chắn có mặt chất cần phân tích (ở cafein) có diện thành phần khác có mẫu thử Tiến hành: - Mẫu trắng: Ở đây, quy trình chiết dùng nước cất để chiết cafein trong, mẫu trắng dung môi pha mẫu nên mẫu trắng nước cất - Mẫu thử: Cân 100 mg bột trà, tiến hành chiết chuẩn bị mẫu quy trình - Mẫu chuẩn: dùng dung dịch chuẩn có nồng độ C4 = 126.75 (µg/ml) (mẫu chuẩn số dãy nồng độ dung dịch chuẩn), mẫu có nồng độ gần giống với nồng độ cafein mẫu thử Nếu muốn pha loãng (trong trường hợp khác có chênh lệch nhiều) tiến hành sau: Trong 100 mg bột trà (mẫu B) đem chiết với quy trình thu 3,0376 mg cafein, có nồng độ = = = 121,503 (µg/ml) Vậy tiến hành pha mẫu chuẩn có nồng độ 121,503 (µg/ml) cách pha lỗng từ dung dịch chuẩn có nồng độ C4 = 126.75 (µg/ml) (mẫu chuẩn số dãy nồng độ dung dịch chuẩn) bình định mức ml V4 = (121,503*5)/126,75 = 4,793 (ml) Lấy 4,793 ml dung dịch chuẩn (mẫu 4) cho vào bình định mức ml, thêm nước cất đến vạch, ta có mẫu chuẩn có nồng độ 121,503 (µg/ml) - Mẫu thử thêm chuẩn: Thường để thấy chênh lệch diện tích peak rõ ràng, ta thêm lượng chất chuẩn gấp đôi lượng chất cần định lượng (ở cafein) có mẫu thử  thêm 1ml dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ 507 (µg/ml) (mẫu 1) vào ml dung dịch mẫu thử có nồng độ 121,503 (µg/ml)  thu dung dịch mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ 250 (µg/ml) (đáp ứng u cầu)  lọc, chuẩn bị tiêm mẫu vào hệ thống Tiến hành tiêm chạy mẫu trắng, mẫu cafein chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn vào hệ thống với điều kiện phân tích chọn ban đầu Ghi nhận kết theo bảng 1.6 So sánh peak mẫu trắng với peak mẫu chuẩn, so sánh diện tích peak mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn So sánh thời gian lưu mẫu chuẩn mẫu thử Bảng 1.5 Khảo sát độ đặc hiệu STT Mẫu tR (phút) Diện peak tích Mẫu trắng (dung môi: nước cất) Chuẩn Thử Thử thêm chuẩn Kết phân tích cần đạt điều kiện sau: mẫu trắng khơng có peak trùng với peak cafein chuẩn Mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn có thời gian lưu giống Mẫu thử thêm chuẩn nồng độ tăng lên nên có diện tích peak lớn diện tích peak mẫu chuẩn 3.3 Khoảng tuyến tính Chuẩn bị dãy nồng độ dung dịch chuẩn: 500 µg/ml, 300 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml; tiến hành phân tích với hệ thống HPLC Ghi nhận thông số theo bảng 1.7 Từ thơng số: nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml) diện tích peak (µV*sec) Dùng phần mềm excel xuất phương trình hồi quy tuyến tính giá trị R2 Bảng 1.6 Kết khảo sát độ tuyến tính Mẫu Nồng độ mẫu chuẩn Diện tích peak (µV*sec) (µg/ml) Nhận xét: với giá trị R2 nằm khoảng giới hạn 0,9995 ≤ R2 ≤ cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích peak Giới hạn phát hiện: nồng độ thấp chất phân tích mẫu co thể phát chưa định lượng LOD co thể xác định dựa vào độ dốc đường chuẩn độ lệch chuẩn tín hiệu đo (diện tích peak mẫu chuẩn) LOD = (SD: Độ lệch chuẩn tín hiệu; a: độ dốc đường chuẩn) Giới hạn định lượng: nồng độ tối thiểu chất có mẫu thử mà phương pháp kiểm nghiệm xác định với độ xác độ cho phép LOQ = (SD: Độ lệch chuẩn tín hiệu; a: độ dốc đường chuẩn) LOQ chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường Ngồi ra, tính giới hạn định lượng giới hạn phát cách lấy mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất, pha lỗng nhiều lần Rồi tiến hành chạy máy điều kiện ban đầu kiểm tra xem nồng độ tín hiệu peakchuẩn có tỉ lệ với đường 1/3 định tính 1/10 định lượng, sau ghi nhận lại thơng số nồng độ 3.4 Khảo sát độ lặp lại Tiêm mẫu thử khác chuẩn bị theo quy trình vào hệ thống HPLC Ghi nhận kết theo bảng 1.8 Bảng 1.7 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng cafein Khối lượng cân tR (phút) mẫu thử (mg) Mẫu Diện tích peak (µV*sec) Trung bình RSD Nhận xét giá trị RSD, RSD < % quy trình nghiên cứu đạt độ lặp lại 3.5 Khảo sát độ Chuẩn bị mẫu thử, tính tốn lượng chuẩn cần thêm vào mẫu thử với tỷ lệ 80%, 100%, 120%, nồng độ tiến hành lần điều kiện khảo sát Tính tốn lượng chuẩn cần thêm: Hàm lượng cafein mẫu thử = 121,503 (µg/ml) Trong 100 mg bột trà đem chiết với quy trình thu 3,0376 mg cafein Giả sử quy trình đạt độ lặp lại, ta có hàm lượng cafein trung bình mẫu thử 3,0376 % - Lượng chất chuẩn cần thêm (80 %) = 3,0376 * 80 % = 2,43 mg - Lượng chất chuẩn cần thêm (100 %) = 3,0376 * 100 % = 3,0376 mg - Lượng chất chuẩn cần thêm (120 %) = 3,0376 * 120 % = 3,645 mg Để có lượng chất chuẩn thêm vào mẫu thử, ta tiến hành pha dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ 3,0376 (mg/ml) Thêm 0,8 ml (tương ứng 80 %), ml (tương ứng 100 %), 1,2 ml (tương ứng 120 %) vào 100 mg mẫu bột trà tiến hành chiết xuất theo quy trình 10 Tiến hành tiêm chạy mẫu với điều kiện sắc ký chọn ban đầu Xác định tỷ lệ hồi phục (%) (hàm lượng chuẩn thực tế / hàm lượng chuẩn lý thuyết) tính tốn lượng chuẩn cần thêm vào mẫu thử với tỷ lệ 80 %, 100 %, 120 %, nồng độ tiến hành lần điều kiện khảo sát Ghi nhận kết theo bảng 1.9 Bảng 1.8 Kết khảo sát độ Phép thử % thêm Diện vào tích peak 80 % mchuẩn lý mchuẩn tìm Tỷ lệ hồi Trung RSD thuyết thấy thực phục bình (%) (%) (mg) tế (mg) (%) 2,43 100 % 3,0376 120 % 3,645 Trung bình tỷ lệ hồi phục (%) Kết phân tích cần đạt yêu cầu sau: tất lần thử RSD < % tỷ lệ hồi phục trung bình phương pháp nằm giới hạn cho phép 95 % – 105 % Từ kết luận phương pháp đạt độ 11 ... Xây dựng đường thẳng tuyến tính 2.3 Xác định hàm lượng cafein mẫu thử III Kế hoạch thực việc thẩm định quy trình định lượng cafein trà 3.1 Kiểm tra tính tương thích hệ thống ... 99,9 % Hình 1.5 Sắc ký đồ của mẫu thử (B2) III Kế hoạch thực việc thẩm định quy trình định lượng cafein trà Các tiêu điển hình thẩm định cần xem xét: - Kiểm tra tính tương thích hệ thống - Tính đặc... 30,376 (mg/g) Vậy 100 mg bột trà đem chiết với quy trình thu 3,0376 mg cafein Nồng độ Cafein mẫu trà B: 3,0376 % Bảng 1.3 Kết định tính cafein Mẫu Thời gian lưu peak cafein (phút) Chuẩn 5,006 B1