MÔN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỨC UỐNG SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÂN HỦY CỦA DIACETYL TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG CÓ CỒN

- Diacetyl danh pháp hệ thống IUPAC: butandion hoặc 2,3-butandione là các diketone phụ VDK được hình thành trong quá trình lên men bia dưới dạng sản phẩm phụ của quá trình tổng hợp axit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

MÔN: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỨC UỐNG

SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÂN HỦY CỦA DIACETYL TRONG SẢN XUẤT ĐỒ

UỐNG CÓ CỒN

Giảng viên hướng dẫn: TS Dương Thị Ngọc Diệp

Nhóm sinh viên thực hiện: NHÓM 4

Lớp: Thứ 7 ca 3 - 4

Thủ Đức, tháng 04 năm 2024

LỜI MỞ ĐẦU

Trong thời buổi hiện nay, ai cũng có thể thấy sự phát triển của xã hội cũng như con người

Xã hội phát triển nhiều kỹ thuật ứng dụng trong công nghiệp lẫn cuộc sống của mọi người.Cũng như nhu cầu của con người cũng một ngày tăng, không còn chỉ no mà cần phải đủ phải ngon phải đẹp phải tốt Để có thể phục vụ cho nhu cầu cũng xã hội phát triển thì các nhà sản xuất phải áp những kỹ thuật mới để cải thiện và phát triển những sản phẩm của mới đạt tới những nhu cầu mong đợi của người tiêu dùng

Trong ngành sản xuất đồ uống đặc biệt là đồ uống có cồn, Diacetyl không chỉ là một thànhphần quan trọng tạo nên hương vị đặc trưng mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc định hình chất lượng và sự hấp dẫn của sản phẩm Tuy nhiên, quá trình hình thành và phânhủy Diacetyl đòi hỏi sự hiểu biết sâu rộng về các yếu tố ảnh hưởng

Sự hình thành và phân hủy của Diacetyl đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng, việc kiểm soát quá trình này phải được thực hiện thông qua các phương pháp và điều kiện lưu trữ phù hợp

Tuy là yếu tố quan trọng trong sản xuất nhưng Diacetyl vẫn có nhiều tranh cãi về vấn đề sức khỏe Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng Diacetyl cao có thể gây ra các vấn đềsức khỏe cho người tiêu dùng

Nếu bạn là một người đang sử dụng hay có dự định sử dụng đồ uống có cồn thì dưới đây

là những thông tin về cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phân hủy của Diacetyl, cũng như những nỗ lực mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu về vấn đề này

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, chúng em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Dương Thị NgọcDiệp Trong quá trình học tập và tìm hiểu môn Công nghệ sản xuất thức uống, chúng em

đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn tâm huyết và tận tình của cô Cô

đã giúp chúng em tích lũy thêm nhiều kiến thức về môn học này để có thể hoàn thànhđược bài báo cáo về đề tài: Sự hình thành và phân hủy diacetyl trong sản xuất đồ uống cócồn

Trong quá trình làm bài chắc chắn khó tránh khỏi những thiếu sót Do đó, chúng em kínhmong nhận được những lời góp ý của cô để bài báo cao của chúng em ngày càng hoànthiện hơn

Nhóm chúng em xin chân thành cảm ơn cô!

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC HÌNH 4

DANH MỤC BẢNG 5

I Đặt vấn đề 6

1.1 Lý do nghiên cứu đề tài 6

1.2 Diacetyl là gì? 6

1.3 Những ảnh hưởng của diacetyl đối với sức khỏe 6

1.4 Nguồn gốc của diacetyl 7

1.5 Khả năng sinh diacetyl của các VSV 8

1.6 Vai trò của diacetyl trong sản xuất bia? 9

II Sự hình thành diacetyl 9

2.1 Điều kiện và sự hình thành diacetyl 9

2.2 Yếu tố ảnh hưởng 14

III Sự phân hủy diacetyl 15

3.1 Quy trình phân hủy diacetyl 15

3.2 Yếu tố ảnh hưởng 17

3.3 Quy định về hàm lượng diacetyl trong bia 19

IV Cách hạn chế và kiểm soát diacetyl trong sản xuất bia 20

4.1 Trong quá trình lên men sử dụng dưỡng chất nấm men lager Saccharomyces spp. .20

4.2 Sử dụng chế phẩm của enzyme ALDC (  - acetolactate decarboxylase ) .20

4.3 Khử diacetyl bằng phương pháp nấm men cố định 20

4.4 Ủ chín bia ở nhiệt độ cao 20

4.5 Tối ưu hóa quy trình nghiền trong sản xuất bia 21

V Thảo luận- Kết luận 21

5.1 Thảo luận 21

5.2 Kết luận 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Công thức cấu tạo Diacetyl 6Hình 2.Con đường hình thành và khử diacetyl và 2,3-pentandione, cũng như tổng hợp valine và isoleucine ở Saccharomyces spp men AHA, axit acetohydroxy; DHA, axit dihydroxy; BCAA, axit amin chuỗi nhánh [14] [15] [16] [17] 9Hình 3 Kết quả chứng minh ảnh hưởng đáng kể của nhiệt độ đến mức độ diacetyl Trong bia đối chứng, diacetyl cao hơn tất cả các loại bia khác và có tốc độ khử rất chậm 17

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Sản xuất acetoin và diacetyl (µmoles ml-1 ) từ pyruvate và citrate (50 µmoles ml )-1 bằng phương pháp đồng nhất và dị thể vi khuẩn axit lactic trong môi trường PYG 24 giờ ở30°C 8Bảng 2 Hàm lượng axit amin (mg trên 100 g mạch nha) của dịch nha được chế biến từ cácloại mạch nha khác nhau 13Bảng 3 Hàm lượng valine (phần trăm trong tổng lượng protein) của các loại ngũ cốc 13Bảng 4 Hàm lượng diacetyl trong bia: mức tối đa 0,2 (mg/l) theo TCVN 6058:1995 19

I Đặt vấn đề

I.1 Lý do nghiên cứu đề tài

Nhu cầu tiêu thụ đồ uống có cồn đặc biệt là rượu, bia ở Việt Nam và trên thế giới rất cao,

có nhiều lý do đến từ mùi vị, hương thơm và cả những kích thích nó mang do sự biến đổi sinh hoá vô cùng quan trọng trong quá trình lên men bia, ngoài việc tạo thành các men bia,các sản phẩm chủ yếu là cồn và CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao, este, aldehyt, glycerin làm cho bia có hương thơm đặc trưng Tuy nhiên, trong quá trình chuyển hoá ra các sản phẩm phụ, có những sản phẩm không mong đợi, sự có mặt củasản phẩm này làm giảm chất lượng bia, ảnh hưởng tới chất lượng người tiêu dùng

Diacetyl là một loại sản phẩm đó

1.2 Diacetyl là gì?

- Diacetyl (danh pháp hệ thống IUPAC: butandion hoặc 2,3-butandione) là các diketone phụ (VDK) được hình thành trong quá trình lên men bia dưới dạng sản phẩm phụ của quá trình tổng hợp axit amin (tương ứng là valine và isoleucine) trong nấm men

Saccharomyces và chúng có thể có tác dụng ảnh hưởng đáng kể đến hương vị và mùi

thơm của bia [1]

- Nó là một hợp chất dixeton gồm hai nhóm C=O liền kề, công thức hóa học là C4H6O2 Làhợp chất hữu cơ có màu vàng thường được trộn với các thành phần khác để tạo ra hương

bơ hoặc các hương vị khác trong thực phẩm [2]

Hình 1 Công thức cấu tạo Diacetyl.

1.3 Những ảnh hưởng của diacetyl đối với sức khỏe

 Đối với động vật

Các nhà nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm kích ứng mắt đối với diacetyl ở ba con thỏ Một lượng 0,1 ml diacetyl nguyên chất được chưng cất vào mắt trái của mỗi con thỏ để điều trị một lần, mắt phải dùng làm đối chứng Các phản ứng được tính điểm theo

Draize vào lúc 1, 4, 24, 48, 72 và 96 giờ và một lần nữa vào lúc 7, 14 và 21 ngày Diacetylđược quan sát thấy gây kích ứng nghiêm trọng và do đó được phân loại là vật liệu ăn mòn loại III (nghĩa là gây ra tác dụng ăn mòn mà không thể phục hồi trong vòng 21 ngày).Hubbs và cộng sự đã nghiên cứu độc tính của diacetyl dạng hít ở chuột ở nồng độ lên tới

365 ppm (trung bình có trọng số theo thời gian hoặc TWA), dưới dạng phơi nhiễm liên tụctrong sáu giờ hoặc dưới dạng bốn phơi nhiễm ngắn, cường độ cao trong sáu giờ Một nhóm riêng biệt hít một xung diacetyl -1800 ppm (trung bình 92,9 ppm trong sáu giờ)

Việc hoại tử chuột thử nghiệm xảy ra từ 18 đến 20 giờ sau khi tiếp xúc Hít phải diacetyl gây hoại tử biểu mô và tạo mủ dẫn đến viêm xơ hóa ở mũi, thanh quản, khí quản và phế quản Phế quản thể hiện tác dụng ở nồng độ diacetyl từ 294,6 ppm trở lên, khí quản và thanh quản biểu hiện tác dụng ở nồng độ diacetyl từ 224 ppm trở lên [3]

Hubbs và cộng sự đã nghiên cứu việc tiếp xúc cấp tính qua đường hô hấp với diacetyl đơn thuần thay vì hương vị bơ được đun nóng như đã nghiên cứu trong nghiên cứu trước đây của họ Các nhà nghiên cứu kết luận rằng việc tiếp xúc cấp tính với diacetyl đơn thuần

là đủ để gây hoại tử biểu mô đường hô hấp trên ở chuột ở nồng độ 198,4 ppm hoặc cao hơn [4]

Hubbs và cộng sự báo cáo rằng cả hai kiểu phơi nhiễm xung và liên tục đều gây tổn thương biểu mô Các tác giả cho rằng những phát hiện này phù hợp với kết luận rằng diacetyl hít phải là mối nguy hiểm cho đường hô hấp [5]

 Đối với con người

Van Rooy và cộng sự từ Trung tâm Chuyên môn Hà Lan về Rối loạn hô hấp nghề nghiệp(NECORD) và Viện Rủi ro Khoa học Đánh giá (IRAS) tại Đại học Utrecht đã thực hiện một nghiên cứu hồi cứu tại một nhà máy sản xuất diacetyl ở Hà Lan trong số những công nhân có khả năng tiếp xúc với diacetyl trong giai đoạn từ năm 1960-2003 Tỷ lệ mắc các triệu chứng hô hấp ở những người lao động có khả năng tiếp xúc với diacetyl được so sánh với mẫu dân số Hà Lan nói chung Nhóm công nhân gặp nhiều khó khăn hơn đáng kể

về hô hấp, ho hàng ngày và hen suyễn Tuy nhiên, điều thú vị là không có sự khác biệt rõ ràng về chức năng phổi đo được Không thể thiết lập mối quan hệ giữa những bất thường

về chức năng phổi và việc tiếp xúc với diacetyl [6]

Kể từ khi công bố các nghiên cứu toàn diện gần đây về độc tính hô hấp của diacetyl khi

sử dụng chuột C57BBI/6,65 vấn đề sức khỏe nghề nghiệp ở công nhân tại các nhà máy liên quan đến Hơi diacetyl, chẳng hạn như các nhà máy sản xuất hương liệu bơ, đã nhận được nhiều sự chú ý Diacetyl đã được sản xuất với số lượng lớn (228.000 pound năm 2005) để sử dụng làm chất tạo hương vị trong các sản phẩm thực phẩm Gần đây nó được cho là có liên quan đến bệnh viêm tiểu phế quản xảy ra ở công nhân nhà máy [7]

Một đánh giá gần đây chỉ ra rằng diacetyl có liên quan đến các dạng mãn tính của bệnh nhu mô phổi lan tỏa [8] Khi tế bào biểu mô phổi của con người tiếp xúc với hơi diacetyl,

đã quan sát thấy sự gia tăng một số chỉ số bệnh, bao gồm các chất trung gian gây viêm,

IL-6 và TNF-α [9] Một nghiên cứu khác gần đây chỉ ra rằng amyloid-β tổng hợp diacetyl, có liên quan đến bệnh Alzheimer Các tác giả khác đã đề xuất, trên cơ sở đó về việc xác định chất cộng diacetyl/2-deoxyguanosine, diacetyl tạo thành chất cộng này với dư lượng guanosine của DNA, dẫn đến chết tế bào [10]

1.4 Nguồn gốc của diacetyl

- Diacetyl được sản xuất bởi một số loài thuộc họ vi khuẩn axit lactic (LAB) bao

gồm Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus và Oenococcus Ngoài việc

là một hợp chất hương vị chính của bơ, diacetyl còn có trong các sản phẩm sữa khác, rượuvang (làm từ nho), rượu mạnh, cà phê rang, thức ăn ủ chua và nhiều loại thực phẩm lên

men khác Nó cũng được tìm thấy trong bia, tuy nhiên trong loại đồ uống này, nó được coi

là một đặc tính gây hư hỏng Trong rượu vang, nồng độ diacetyl thường thấp so với

ngưỡng hương vị của nó và dường như rất quan trọng để xác định phong cách rượu vang [11]

1.5 Khả năng sinh diacetyl của các VSV

- Hiện nay, quá trình tổng hợp sinh học diacetyl chủ yếu sử dụng citrate hoặc glucose làm chất nền cho quá trình lên men vi sinh vật Nhiều chiến lược kỹ thuật trao đổi chất đã đượcthiết kế để cải thiện sản lượng diacetyl thông qua quá trình lên men vi sinh vật

Bảng 1 Sản xuất acetoin và diacetyl (µmoles ml -1 ) từ pyruvate và citrate (50 µmoles ml -1 ) bằng phương pháp đồng nhất và dị thể vi khuẩn axit lactic trong môi trường PYG 24 giờ

ở 30°C.

 Xác định acetoin và diacetyl

Tổng acetoin và diacetyl cũng như lượng diacetyl được xác định riêng biệt trên các mẫu

đã khử protein bằng acid Cho 1 ml dịch cấy 2 ml nước cất 1 ml 2/3 N H2S04 và thêm 1

ml 10% dung dịch Na2S04*2H20 vào và mẫu được ly tâm ở tốc độ 3000 x g trong 20 phút

bằng máy ly tâm Janetzki, piccolo Chất lỏng nổi phía trên là được sử dụng để xác định

màu của acetoin và diacetyl tổng số bằng phương pháp phương pháp Westerfeld (21) ở bước sóng 530nm và diacetyl bằng phương pháp Krampitz (18) ở bước sóng 470nm, sử

dụng máy quang phổ kế Bausch & Lomb 20

 Kết quả

Mười một chủng lên men đồng nhất và dị hình vi khuẩn lactic được sàng lọc diacetyl và

acetoin sản xuất từ pyruvate và citrate Như thể hiện trong Bảng 1, ngoại trừ Leuconostoc paramesenteroides II 47, tất cả các chủng lên men đồng nhất và dị tính được thử nghiệm

đều có khả năng sản xuất cả acetoin và diacetyl (AD) từ pyruvate và citrate Các loài lên

men đồng nhất, ngoại trừ S jaecalis subsp liquejaciens, tạo ra nhiều AD từ pyruvate hơn

từ citrate, điều ngược lại đúng với các chất lên men dị thể trong đó Lactobacillus brevis làtích cực nhất Tuy nhiên, chỉ có thể phát hiện được một lượng nhỏ diacetyl được sinh vậtnày tạo ra từ citrate khi ủ trong 24 giờ Độ thu hồi A cao nhất thu được ở đây là từ

pyruvate nhờ vi khuẩn lactobacilli lên men đồng nhất, có lẽ phần còn lại bị khử thành

2,3-butanediol bởi 2,3-2,3-butanediol dehydrogenase có thể ít hoạt động hơn ở những chủng cókhả năng phục hồi cao Thu hồi acetoin từ citrate dao động từ 14 đến 56%

1.6 Vai trò của diacetyl trong sản xuất bia?

- Diacetyl là một hợp chất có mùi và vị bơ lạ có thể xuất hiện trong quá trình lên men, ở

một lượng nhỏ khoảng 0,1-0,4 ppm nó cung cấp một lớp hương thơm bơ nhẹ Nhưng nếu vượt quá ngưỡng hương vị khoảng 0,9-1,0 ppm [12] không thể bị che lấp bởi hương vị mạch nha và hoa bia Sự hiện diện của VDK vượt quá ngưỡng hương vị của chúng trong bia thường được coi là một khiếm khuyết, vì hương vị của chúng không được mong muốn trong nhiều loại bia Điều này có thể làm hỏng trải nghiệm uống bia, làm giảm giá trị thương hiệu của sản phẩm và nó cũng có thể cho thấy sự ô nhiễm vi khuẩn, ví dụ

Lactobacillus spp., Pediococcus spp hoặc Pantoea agglomerans [13]

II Sự hình thành diacetyl

2.1 Điều kiện và sự hình thành diacetyl

Diacetyl được sản xuất bởi men bia trong quá trình lên men Nó được hình thành ngoại bào thông qua quá trình khử carboxyl oxy hóa không cần enzyme tự phát của α-

acetolactate, một chất chuyển hóa trung gian trong con đường sinh tổng hợp valine

Hình 2.Con đường hình thành và khử diacetyl và 2,3-pentandione, cũng như tổng hợp valine và isoleucine ở Saccharomyces spp men AHA, axit acetohydroxy; DHA, axit

dihydroxy; BCAA, axit amin chuỗi nhánh [14] [15] [16] [17]

Vì diacetyl được liên kết trực tiếp với con đường sinh tổng hợp valine nên nồng

độ valine nội bào ảnh hưởng đến lượng diacetyl sinh ra trong quá trình lên men

Nó đã được hiển thị valine ức chế mạnh acetohydroxyaxit synthase (AHAS),

enzyme chịu trách nhiệm xúc tác cho sự hình thành α-acetolactate từ pyruvate

(xem Hình 2) Do đó, càng có nhiều valine có mặt trong tế bào nấm men thì lượng α-acetolactate sẽ càng ít được tổng hợp, enzyme xúc tác bị ức chế và do đó diacetylđược hình thành cũng sẽ ít hơn Các nghiên cứu đã cho thấy dữ liệu khác nhau về tác dụng ức chế của các chuỗi nhánh khác axit amin trên AHAS Cả Barton và

Slaughter [18] và Magee và de Robichon-Szulmajster [19] quan sát thấy rằng

leucine ức chế hoạt động của enzyme AHAS, mặc dù không nhiều như valine

Không có tác dụng ức chế nào được quan sát thấy với isoleucine Pang và

Duggleby [20] lại quan sát điều ngược lại, tức là isoleucine có tác dụng ức chế nhẹ

và leucine không có tác dụng ức chế hoạt động AHAS

Nakatani và cộng sự [21] đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung valine và isoleucine vào quá trình lên men dịch nha trong việc sản xuất diacetyl và nhận thấy rằng nồng độ valine trong dịch nha tăng lên làm giảm đáng kể lượng diacetyl được tạo ra trong quá trìnhlên men Trong các thử nghiệm lên men với men bia liên quan đến dịch nha có trọng lượng ban đầu khác nhau, hàm lượng nitơ amin tự do và valine, Petersen et al [22] đã quan sát thấy rằng nồng độ valine thấp trong dịch nha dẫn đến sự hình thành cấu hình diacetyl đỉnh kép (rất có thể là kết quả của sự suy giảm valine vào cuối quá trình lên men),trong khi nồng độ valine cao trong dịch nha dẫn đến đơn cấu hình diacetyl đỉnh có mức diacetyl tối đa thấp hơn so với các loại đường có nồng độ valine thấp Kết quả cho thấy nồng độ valine quá trình chuyển hóa dịch nha ảnh hưởng đến lượng diacetyl được hình thành, nhưng các thử nghiệm được thực hiện trong nghiên cứu khác nhau về trọng lượng riêng và nitơ amin tự do, có nghĩa là không thể rút ra kết luận chắc chắn nào về mối quan

hệ giữa nồng độ valine dịch nha và nồng độ diacetyl Cyr và cộng sự [23] đã quan sát thấytrong các thử nghiệm với hai chủng nấm men bia khác nhau cho thấy nồng độ diacetyl trong dịch nha lên men không đổi hoặc giảm khi sự hấp thu valine tăng lên, trong khi nồng

độ diacetyl tăng khi sự hấp thu valine giảm hoặc bằng không Krogerus và Gibson [24] đã chỉ ra rằng việc bổ sung trực tiếp dịch nha bằng valine (100–300 ppm), và do đó các tế bàonấm men hấp thu valine nhiều hơn, dẫn đến ít diacetyl được hình thành trong quá trình lênmen Các thông số lên men khác như tốc độ lên men và sự phát triển của nấm men không

tế bào Do đó, tốc độ vận chuyển valine vào tế bào nấm men trong quá trình lên men cũng

có thể ảnh hưởng đến lượng diacetyl được tạo ra, vì nếu nhu cầu về valine vượt quá tốc độvận chuyển valine vào tế bào thì cần phải có quá trình tổng hợp đồng hóa, có khả năng gây

ra sản xuất diacetyl đồng thời Tỷ lệ hấp thu valine có thể tăng lên một cách có thể hình dung được bằng cách giảm tỷ lệ leucine và isoleucine (vì chúng sử dụng các protein vận chuyển tương tự) với valine trong dịch nha, dẫn đến khả năng giảm sản xuất diacetyl Tuy nhiên, điều này sẽ khó khăn về mặt thực tế và cũng có thể làm tăng lượng 2,3-

pentanedione được tạo ra

Romkes và Lewis [25] báo cáo rằng việc điều hòa trước nấm men S cerevisiae thu hoạch

trong dung dịch glucose hoặc bằng cách oxy hóa sẽ làm giảm độ dài của giai đoạn trễtrước khi hấp thu axit amin, và do đó tốc độ hấp thu valine có thể tăng lên bằng cách xử lýtrước nấm men trong dung dịch glucose có sục khí Những kết quả này cũng đồng ý vớinhững kết quả của Verbelen et al [26], người đã biểu hiện sự biểu hiện BAP2 tăng lên domen được cung cấp oxy trước khi ủ Việc bổ sung valine vào dung dịch tiền xử lý và điềuchỉnh độ pH của tiền xử lý thành nhỏ hơn 5 cũng có khả năng làm tăng tốc độ hấp thuvaline trong quá trình lên men và do đó làm giảm sản xuất diacetyl, vì nó làm tăng lượngthẩm thấu axit amin chuỗi nhánh (Bap2p và Bap3p) được phiên mã [27] Mặt khác báo

cáo bằng tay cho thấy sự giảm biểu hiện của gen BAP2 có nguồn gốc từ S (eu)bayanus và không có sự thay đổi biểu hiện của gen BAP2 có nguồn gốc từ S cerevisiae trong chủng

nấm men lager trong môi trường YPM với 1 mM sorbate (pH 4,5) so với đối chứng Môitrường YPM, cho thấy rằng điều kiện axit có thể có tác động tiêu cực đến việc sản xuấtcác chất thẩm thấu axit amin chuỗi nhánh

Hàm lượng nito tự do (FAN) chung của dịch nha cũng có thể ảnh hưởng đến tốc độ hấp thu valine và do đó ảnh hưởng đến việc sản xuất diacetyl Đã có báo cáo rằng, khimức FAN giảm xuống, việc sản xuất diacetyl cũng giảm xuống, có lẽ do sự hấp thu

các axit amin ưa thích nhanh hơn, dẫn đến nhu cầu valine sớm hơn và lớn hơn và sự hấp thu của nó tăng lên do ít cạnh tranh hơn cho phép tương tác Việc tăng mức nền của các axit amin dịch nha ban đầu (trong khi vẫn giữ nồng độ valine không đổi) dẫn đến sản xuất diacetyl nhiều hơn Sự gia tăng sản xuất này bị ảnh hưởng bởi việc tăng lượng axit amin nào Các axit amin được ưu tiên, nghĩa là những axit được hấp thụ

nhanh hơn valine, gây ra sự hình thành diacetyl nhiều hơn trong giai đoạn lên men

đầu tiên, đồng thời làm tăng nồng độ các axit amin không được ưa thích sẽ ảnh hưởngđến mức diacetyl sau này trong quá trình lên men và do đó có ảnh hưởng lớn hơn đến quá trình lên men mức độ diacetyl trong bia xanh Pugh và cộng sự [28] cũng quan

sát thấy rằng nồng độ diacetyl tối đa trong quá trình lên men giảm khi hàm lượng

FAN ban đầu tăng từ 122 lên 144 ppm, sau đó nó lại tăng khi hàm lượng FAN ban

đầu tăng từ 144 đến 168 lên 216 ppm Verbelen [29] báo cáo tỷ lệ sản xuất diacetyl

thấp hơn và đồng thời tăng tốc độ hấp thu valine và mức biểu hiện BAP2 trong nấm men nhẹ hơn để lên men dịch nha 18°P có chứa chất bổ trợ (hàm lượng FAN khoảng 150–210 ppm) so với tất cả 18°P -malt wort (hàm lượng FAN khoảng 300 ppm)

Mặt khác, báo cáo mối tương quan nghịch giữa hàm lượng FAN dịch nha ban đầu vàVDK tối đa nồng độ quan sát được trong quá trình lên men Những kết quả mâu thuẫnnày có lẽ là do sự khác biệt trong việc hấp thu valine Ở mức FAN cao, tế bào nấm

men sử dụng các axit amin ưa thích và kết quả là ít valine được hấp thụ hơn (dẫn đến sản xuất α-acetolactate cao hơn), trong khi ở mức FAN rất thấp, nhiều axit amin sẽ bị loại bỏ hoàn toàn khỏi hệ thống và nấm men phát triển bị ảnh hưởng Nếu valine bị cạn kiệt theo cách này thì nhu cầu tổng hợp valine đồng hóa sẽ tăng lên và kết quả là mức độ α-acetolactate sẽ tăng lên Từ các giá trị có sẵn trong tài liệu, có vẻ như mức FAN ~150 ppm là tối ưu để sản xuất diacetyl thấp; tuy nhiên, giá trị này sẽ thay đổi

tùy thuộc vào điều kiện lên men và quy trình riêng lẻ Lei và cộng sự [30] cũng quan sát thấy lượng valine được hấp thụ trong quá trình lên men giảm khi hàm lượng FAN tăng từ 264 ppm lên 384, 398 và 433 ppm bằng cách thêm enzyme protease trong quá trình nghiền, mặc dù tổng nồng độ valine tăng

Barton và Slaughter đã nghiên cứu tác động của việc bổ sung các axit amin riêng lẻ

và amoni clorua vượt quá nghiên cứu về nồng độ VDK và hoạt động AHAS trong

quá trình lên men và nhận thấy rằng alanine và amoni clorua làm giảm đáng kể cả

lượng diacetyl được hình thành và hoạt động AHAS, cho thấy chúng có tác dụng ức chế enzyme Valine và leucine cũng cho thấy tác dụng ức chế AHAS (tác dụng của

chúng đối với nồng độ diacetyl chưa được nghiên cứu)

Kết quả cho thấy alanine, amoni clorua và có thể cả leucine có thể được sử dụng quá mức cùng với valine trong dịch nha, để giảm thiểu sự hình thành diacetyl trong quá trình lên men và hoạt động AHAS rất quan trọng để kiểm soát sự hình thành diacetyl Dasari vàKölling [31] quan sát thấy sự sản xuất diacetyl tăng cao ở các loại vật liệu nhỏ đột biến

của S cerevisiae, là kết quả của quá trình định vị tế bào chất của enzyme AHAS, cho thấy

rằng sự tích tụ AHAS trong cytosol có thể làm tăng sản xuất diacetyl, có thể là do là kết quả của sự tăng tiết α-acetolactate từ tế bào Tốc độ ném và mật độ tế bào cũng ảnh hưởng đến lượng diacetyl có trong bia ở giai đoạn cuối của quá trình lên men, vì nó có tácdụng đã được quan sát thấy rằng nồng độ tăng lên khi tăng tỷ lệ ném bóng Trong các thử nghiệm với nhiều chủng nấm men bia khác nhau, Verbelen et al [32] đã quan sát thấy lượng diacetyl trong bia tăng gấp 10 lần nồng độ khi tốc độ ném bóng tăng lên gấp nhiều lần Điều này có thể được giải thích là do có nhiều α-acetolactate hơn có lẽ đã được sản xuất và thời gian lên men ngắn hơn ở tốc độ ném cao hơn, giảm lượng α-acetolactate được khử carboxyl một cách tự nhiên thành diacetyl bên ngoài tế bào trong quá trình lên men tích cực ở bước giới hạn tốc độ của diacetyl con đường loại bỏ, dẫn đến tăng nồng độ α-acetolactate sau lên men và cuối cùng là nồng độ diacetyl Mặt khác, quan sát thấy nồng độ giảm dần của diacetyl với tốc độ tăng dần (10 × 106 tế bào sống/mL đến 100

× 106 tế bào sống/mL) trong bia lên men ở trọng lực cao wort với men lager Trong

nghiên cứu này tất cả các quá trình lên men đều được Tuy nhiên, được thực hiện trong 11 ngày, trong khi quá trình lên men diễn ra được đưa ra bởi Verbelen et al kéo dài ~2–14 ngày tùy thuộc vào độ căng và tốc độ ném, với thời gian lên men ngắn hơn ở mức cao hơn

tỷ lệ ném bóng Điều này cho thấy mối tương quan nghịch giữa thời gian lên men và nồng

độ diacetyl trong bia, với nấm men có nhiều thời gian hơn để đồng hóa và khử diacetyl thời gian tiếp xúc với bia càng lâu Ekberg và cộng sự [33] cũng quan sát thấy nồng độ