nghiên cứu thành phần hóa học sâm việt nam panax vietnamensis araliaceae theo hướng tác động bảo vệ thận

Nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm Việt Nam theo hướng sàng lọccác hợp chất có tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vitro.. Nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm Việt Nam theo hướng s

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu

Lô 1: Sâm Việt Nam 2-7 tuổi (n=5) được thu hái tại Trạm Dược liệu Trà Linh, Quảng Nam vào tháng 11/2012 Nguyên liệu Sâm Việt Nam sau khi thu hái được bảo quản lạnh trong thùng xốp, vận chuyển bằng đường hàng không về Thành phố Hồ Chí Minh trong vòng 24 h Các củ được rửa sạch đất đá và rêu bám dưới vòi nước, để ráo Mỗi củ được tách riêng thân rễ và rễ củ Các mẫu sâm được sấy khô theo chu trình: 40 °C trong 24 h, 50 °C trong 48 h, 60 °C đến khi khô kiệt Các mẫu được xay thành bột cú kớch thước dưới 425 àm Cỏc mẫu này được dựng để phõn tớch sự tăng trưởng về sinh khối và tích lũy saponin trong thân rễ và rễ củ Sâm Việt Nam qua các độ tuổi.

Lô 2: Sâm Việt Nam 6 tuổi (300 g) được thu hái tại Trạm Dược liệu Trà Linh, Quảng Nam vào tháng 11/2017 Các củ cũng được rửa sạch đất đá và rêu bám dưới vòi nước, để ráo, sấy khô theo chu trình: 40 °C trong 24 h, 50 °C trong 48 h, 60 °C đến khi khô kiệt Các mẫu được xay thành bột có kích thước dưới 1,0 mm và được bảo quản trong bình hút ẩm Mẫu này được dùng để phân tích thành phần hóa học Sâm Việt Nam hướng tác dụng bảo vệ thận.

Các chất chuẩn saponin được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) với số lô và độ tinh khiết được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Các chất chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu.

Saponin Số lô Độ tinh khiết

Ginsenosid-Rb1 GRb1.Ref.012011 99,17 %Ginsenosid-Rd GRd-001-0913 94,48 %Ginsenosid-Re GRe-001-0913 94,28 %Ginsenosid-Rg1 GRg1.ref.012011 96,43 %

Saponin Số lô Độ tinh khiết

Majonosid-R2 Majo.Ref.012012 98,86 % Notoginsenosid-R1 NR1-001-0913 94,08 %

Các chất chuẩn saponin được phân lập và cung cấp bởi Giáo sư Park Jeong Hill, Khoa Dược, Đại học Quốc Gia Seoul độ tinh khiết được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Độ tinh khiết của các chất chuẩn được cung cấp bởi Đại học Quốc gia Seoul

Peudoginsenosid-RT4 (p-RT4) 95,12 % Ocotillol genin (OT) 95,26 % Cao khô Sun Ginseng (100 g) được cung cấp bởi công ty Ginseng Science, Hàn Quốc, số lô 16GSP1105.

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.

2.1.3 Động vật và tế bào

Tế bào biểu mô thận lợn LLC-PK1 (Lilly Laboratories Cell-Porcine Kidney 1) được cung cấp bởi American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, Hoa Kỳ.

Chuột nhắt đực C57/BL6 7 tuần tuổi được cung cấp bởi Đại học Gachon (Hàn Quốc), trọng lượng trung bình 20-25 g, được sử dụng cho thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ thận của panaxynol với mô hình sử dụng cisplatin làm tác nhân gây độc.

Chuột nhắt Swiss albino đực (7-8 tuần tuổi), trọng lượng trung bình 20-25 g, được cung cấp bởi viện Pasteur Nha Trang được sử dụng cho thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam chế biến với mô hình sử dụng cyclosporin

A làm tác nhân gây độc.

Phương tiện nghiên cứu

Bảng 2.3 Hóa chất và vật tư sử dụng trong chiết xuất phân lập

STT Tên hóa chất Đặc tính Xuất xứ

1 Bản mỏng sắc ký Silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm

2 Chloroform Tinh khiết phân tích Trung Quốc

3 Cột sắc ký bán điều chế

4 Ethyl acetat Tinh khiết phân tích Trung Quốc

5 Methanol Tinh khiết phân tích Trung Quốc

6 n-Butanol Tinh khiết phân tích Trung Quốc

7 Silica gel Kớch thước hạt 40-63 àm Merck, Đức

Bảng 2.4 Hóa chất và vật tư sử dụng trong phân tích

STT Tên hóa chất Đặc tính Xuất xứ

1 Acetonitrile Tinh khiết sắc ký J T Baker, USA

2 Acid formic Tinh khiết sắc ký Sigma Aldrich, USA

3 Cột HPLC Gemini C18 (150ì4,6 mm; 5 àm) Phenomenex, USA

4 Cột UHPLC Kinetex C18 (50ì4,6 mm, 2,6 àm) Phenomenex, USA

5 Methanol Tinh khiết sắc ký J T Baker, USA

Bảng 2.5 Hóa chất sử dụng thử nghiệm in vitro và in vivo STT Tên hóa chất Đặc tính/ thương hiệu Xuất xứ

1 Acid hydrochlorid Guangdong Guanghua Trung Quốc

2 Acid thiobarbituric (TBA) Sigma-Aldrich Mỹ

1 5 vial (250 àl) Alexa Fluor 488 annexin V chứa 25 mM HEPES;

140 mM NaCl; 1 mM EDTA pH 7,4; 0,1 % albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin)

2 1 vial 100 àl chứa propidium iodid 1 mg/ml trong nước khử khoáng.

3 Chai chứa 50 ml đệm gắn annexin 5X chứa 50 mM HEPES, 700 mM NaCl, 12,5 mM CaCl2 được điều chỉnh đến pH 7,4

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

STT Tên hóa chất Đặc tính/ thương hiệu Xuất xứ

7 DBPS Không chứa calcium, magnesium, pH 7,0-7,3

8 Dimethyl sulfoxid Loại dùng cho cho thử nghiệm sinh học, độ tinh khiết ≥ 99,9 %

9 Huyết thanh nhau thai bò Hàm lượng nội độc tố ≤ 1

Lọc 3 lần qua màng lọc 0,1 àm.

11 Kit chiết RNA NuActor Ugenecell, Hàn

12 Kit định lượng creatinin huyết

Kit định lượng trong dịch sinh học bằng đo quang

13 Kit định lượng urea huyết

Kit định lượng trong dịch sinh học bằng đo quang

14 Kit tổng hợp cDNA RevertAid First Strand cDNA Synthesis

16 N-acetylcystein Dùng cho thử nghiệm sinh học, độ tinh khiết ≥ 99 %, nội độc tố ≤ 500 EU/g

17 Thuốc thử Ellman Sigma-Aldrich Mỹ

18 Thuốc thử EZ-Cytox Dung dịch pha sẵn, hộp 2 lọ × 4 ml

Daeil Lab Services, Hàn Quốc

STT Tên hóa chất Đặc tính/ thương hiệu Xuất xứ

20 Trypsin/EDTA Trypsin 0,25 % trong đệm

EDTA, có chứa đỏ phenol

Bảng 2.6 Các máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu STT Tên thiết bị Hãng sản xuất - Mã hiệu Xuất xứ

1 Hệ thống đo dòng chảy tế bào Tali

2 Hệ thống đọc huỳnh quang

3 Hệ thống HPLC-UV-ELSD Perkin Elmer series 200 kèm đầu dò UV và ELSD Sedex 80-LT

Shimadzu HPLC Prominence-i LC-2030C 3D Plus

4 Hệ thống PCR Thermo QuantStudio 3 USA

5 Hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

6 Hệ thống sắc ký điều chế Gilson pump 321, UV/Vis detector 155, fraction collector FC204

7 Hệ thống sắc ký siêu cao áp kèm đầu dò QToF-MS

8 Máy đọc đĩa 96 giếng SpectraMax 190 USA

Ngoài ra còn có các dụng cụ thủy tinh chính xác dùng trong phân tích và các dụng cụ thủy tinh thông thường khác

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử

Nơi thực hiện nghiên cứu

- Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam: chiết xuất và phân lập

- Khoa Dược, Trường đại học Tôn Đức Thắng, Việt Nam: xây dựng quy trình định lượng và kiểm nghiệm nguyên liệu

- Khoa Dược, Đại học Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc: phân lập định hướng tác dụng bảo vệ thận

- Khoa Dược, Đại học Gachon, Hàn Quốc: các thí nghiệm đánh giá tác dụng sinh học in vitro và in vivo.

Phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu Sâm Việt Nam 6 tuổi được kiểm nghiệm theo các chỉ tiêu cảm quan, vi phẫu, soi bột, định tính bằng sắc ký lớp mỏng silica gel và định lượng bằng HPLC-ELSD

Thực hiện theo phương pháp mô tả ở Dược diển Việt Nam V (Phụ lục 12.18, trang PL-283) 117

Mẫu nguyên liệu được định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin- layer chromatography – TLC) so sánh với các chất chuẩn đối chiếu và mẫu Sâm Việt Nam chuẩn với điều kiện sắc ký như sau:

Bản mỏng sắc ký: Silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck)

Pha động: n-butanol – Nước – Acid acetic (4:5:1; lớp trên)

Mẫu thử: Cân khoảng 100 mg bột Sâm Việt Nam và chiết siêu âm với 5 ml

MeOH 100 % trong 15 phút, ly tâm ở 3.000 vòng trong 5 phút và dịch nổi được sử dụng làm mẫu thử

Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn G-Rg1, G-Rb1 và M-R2 trong methanol

Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 20 àl của mẫu thử và mẫu chuẩn Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol Sấy bản mỏng ở 110 °C đến khi hiện màu và quan sát dưới ánh sáng thường

2.4.1.3 Định lượng saponin chính trong nguyên liệu Sâm Việt Nam a Xây dựng quy trình định lượng

Xây dựng quy trình định lượng các saponin chính trong nguyên liệu Sâm Việt Nam với các thông số:

- Số lần chiết: Cân chính xác 100 mg bột Sâm Việt Nam cho vào ống ly tâm

15 ml, thêm chính xác 5 ml MeOH 80 % và chiết bằng siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 20 phút Mẫu thử được ly tâm thu phần dịch phía trên, phần bã dược liệu được chiết tiếp với quy trình đã nêu Dịch chiết được khảo sát bằng TLC với điều kiện đã nêu ở mục 2.4.1.1 trang 49, sử dụng hệ dung môi chloroform – methanol – nước (65:35:10, lớp dưới) Số lần chiết được xác định khi dịch chiết không còn cho vết của saponin trên bản mỏng sắc ký

- Tinh chế mẫu thử bằng cột chiết pha rắn (SPE): Phần dịch của các lần chiết được gộp lại và cô dưới áp suất giảm Dịch chiết được phân tán lại với 6 ml nước và nạp lên cột SPE đã được hoạt hóa với 6 ml MeOH và cân bằng với

12 ml nước Xác định thể tích nước loại tạp, thể tích MeOH 100 % để rửa giải hoàn toàn phân đoạn chứa saponin cần định lượng

- Các thông số của phương pháp HPLC-ELSD được tham khảo từ quy trình có sẵn của nhóm nghiên cứu với một số điều chỉnh để có được điều kiện phù hợp

Thử nghiệm thăm dò được thực hiện lặp lại 3 lần b Đánh giá quy trình định lượng

- Tính tương thích hệ thống: Lần lượt tiêm 6 lần mẫu thử vào hệ thống HPLC, đánh giá độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích đỉnh và các thông số sắc ký như

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. độ phân giải, hệ số bất đối, số đĩa lý thuyết của các đỉnh tương ứng với các saponin quan tâm

- Độ đặc hiệu: Lần lượt bơm mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn Mẫu trắng không có được có đỉnh có thời gian lưu tương ứng với các đỉnh tương ứng với các saponin quan tâm Thời gian lưu của các đỉnh quan tâm trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tương ứng nhau Khi thêm các chuẩn vào mẫu thử, diện tích đỉnh và chiều cao của các đỉnh tương ứng với các saponin quan tâm phải tăng lên

- Tính tuyến tính: Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn S1 bằng cách cân chính xác 3,55 mg

G-Rb1 và 1,7 mg G-Rd vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH 80 % và siêu âm cho tan và thêm dung môi đến vạch Hỗn hợp chuẩn S2 được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 2,77 mg G-Rg1 và 4,60 mg M-R2 vào bình định mức 2 ml, thờm chớnh xỏc 800 àl hỗn hợp chuẩn S1, thờm MeOH 80 %, siờu õm cho tan và thêm dung môi đến vạch Từ dung dịch chuẩn S2 pha dãy nồng độ như Bảng 2.7 Xây dựng đường tuyến tính tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh có dạng y = ax + b với x là nồng độ và y là diện tích đỉnh

Bảng 2.7 Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-ELSD

Nồng độ (mg/ml) G-Rb 1 G-Rd G-Rg 1 M-R2 V-R2

- Độ lặp lại: Chuẩn bị 6 mẫu thử và tiến hành định lượng các saponin theo quy trình đã xây dựng Hàm lượng các saponin thu được trên 6 mẫu thử sau khi tính toán thống kê phải có % RSD nhỏ hơn 2 %

- Độ đúng: Tiến hành thêm chuẩn các saponin cần định lượng vào mẫu thử với lượng thêm bằng 80 %, 100 % và 120 % hàm lượng chất đó có trong mẫu, mỗi mức chất chuẩn thêm vào lặp lại 3 lần Tiến hành chiết theo quy trình đã xây dựng và phân tích bằng HPLC-ELSD theo các thông số đã tối ưu hóa Tính toán tỷ lệ tìm lại được so với chất chuẩn đã thêm vào theo công thức (1):

Trong đó: A: lượng saponin sẵn có (mg)

B: lượng saponin chuẩn thêm vào (mg) C: lượng saponin tìm thấy (mg)

2.4.2 Quy trình chế biến Sâm Việt Nam

Cân chính xác 100 mg bột Sâm Việt Nam cho vào cóng thép chịu nhiệt 25 ml, thêm 1 ml nước cất, vặn chặt nắp cóng Các cóng được đặt vào tủ sấy được cài đặt ở nhiệt độ 120 °C trong thời gian lần lượt 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h và 20 h, mỗi mốc thời gian được có 3 mẫu lặp lại Mẫu thử sau khi chế biến được làm nguội, đông khô và chiết với 3 ml methanol (MeOH) 100 % bằng siêu âm trong 1 h Mẫu thử được siêu âm thu dịch nổi và bã dược liệu được chiết tiếp thêm 5 lần nữa Dịch chiết được gộp lại và làm khô dưới áp suất giảm để thu được cao khô Sâm Việt Nam chế biến Cao khô được hòa với DMSO tạo thành dung dịch mẹ có nồng độ 100 mg/ml để dùng cho các thử nghiệm phân tích hóa học bằng HPLC-QToF-MS và đánh giá khả năng bảo vệ thận

2.4.3 Xây dựng quy trình thử nghiệm khả năng bảo vệ thận in vitro

2.4.3.1 Quy trình nuôi cấy tế bào LLC-PK1 tổng quát

Nghiên cứu sử dụng mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ thận theo các bài báo đã công bố của Kang Ki Sung và cộng sự với một số thay đổi nhỏ ở một số thông số của quy trình 8,118 Cụ thể, tế bào LLC-PK1 được nuôi trên các đĩa trong môi trường DMEM-Glutamax-I được bổ sung 10 % huyết thanh nhau thai bò (Fetal bovine serum – FBS) và khỏng sinh (penicillin 100 đơn vị/ml và streptomycin 100 àg/ml) Tế bào được giữ trong tủ ấp có với môi trường ẩm chứa 5 % CO2 và nhiệt độ 37 °C Khi tế bào đạt mật độ khoảng 80 %, tế bào được tách ra khỏi đĩa bằng trypsin 0,25 % trong đệm EDTA và chia vào các giếng trong đĩa 96 giếng với mật độ thích hợp và ủ trong

24 h để tế bào bỏm vào đĩa Sau đú, mụi trường cũ được loại bỏ và thờm vào 90 àl môi trường mới chứa các cao, phân đoạn hoặc các hợp chất cần đánh giá hoạt tính với nồng độ cần thiết Tế bào được ủ với mẫu thử trong vũng 2 h, sau đú thờm 10 àl cisplatin ở nồng độ 10X (X là nồng độ đã khảo sát) được pha trong PBS và được ủ tiếp trong 24 h Sau thời gian ủ, thờm vào mỗi giếng 10 àl thuốc thử WST-8 (Ez- Cytox) và ủ thêm 2 h Tế bào sau khi ủ với thuốc thử được lắc nhẹ nhàng để phân tán đều màu mới sinh ra và được đo độ hấp thu ở bước sóng 450 nm bằng máy đo 96 giếng SpectraMax 190 Mỗi mẫu được lặp lại trên ba giếng và lấy giá trị trung bình Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần ở ba ngày khác nhau Tỷ lệ tế bào sống được tính bằng công thức:

Trong đó: %SC: Tỷ lệ mật độ quang của giếng chứa mẫu thử và cisplatin so với giếng chứng

%C: Tỷ lệ mật độ quang của giếng chỉ chứa cisplatin so với giếng chứng

2.4.3.2 Thử nghiệm xác định nồng độ cisplatin gây độc

Sử dụng quy trình thử nghiệm chung ở mục 2.4.3.1 với mật độ tế bào là 1×10 4 và 2×10 4 tế bào/giếng Sau khi tế bào được chia vào các giếng được ủ 24 h Sau đó, mụi trường cũ được loại bỏ và thờm 90 àl mụi trường Tế bào được ủ tiếp trong 2 h, sau đú thờm 10 àl dung dịch cisplatin pha trong PBS cú nồng độ 200, 250, 300, 400,

500 và 1.000 àM để đạt nồng độ cuối cựng trong mỗi giếng lần lượt là 20, 25, 30, 40,

KẾT QUẢ

Kiểm nghiệm nguyên liệu

Thân rễ: Vi phẫu thân rễ Sâm Việt Nam hình tròn chia làm 2 phần: phần vỏ và phần trung trụ Từ ngoài vào trong, lớp bần gồm 10-12 lớp tế bào hình chữ nhật xếp thành hàng, có vài chỗ bong tróc Mô mềm vỏ đặc gồm nhiều lớp tế bào hình bầu dục, vách cellulose, kích thước lớn, sắp xếp lộn xộn, rải rác có các tinh thể calci oxalate hình cầu gai và các ống tiết ly bào chứa chất tiết màu nâu đỏ Tầng sinh libe- gỗ liên tục, các bó libe-gỗ hình thoi, cách nhau bởi tia tủy rộng Libe cấp 1 tế bào nhỏ, xếp lộn xộn, libe cấp 2 xếp thành dãy xuyên tâm Gỗ cấp 2 gồm các mạch gỗ to xếp lộn xộn, gỗ cấp 1 xếp thành dãy ly tâm Mô mềm tủy đạo gồm những tế bào có vách cellulose Các ống tiết thường ở vị trí ứng với các bó libe-gỗ các ở mô mềm vỏ và mô mềm tủy (Hình 3.1)

Rễ củ: Vi phẫu rễ củ Sâm Việt Nam cũng hình tròn, chia làm 2 phần: phần vỏ và phần trung trụ Từ ngoài vào trong, lớp bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật xếp thành nhiều vòng, có những chỗ bong tróc Mô mềm vỏ đặc gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách mỏng bằng cellulose xếp khít nhau, rải rác có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai và các ống tiết ly bào chứa chất tiết màu vàng, tập trung ở vùng libe Tầng sinh libe-gỗ liên tục gồm một lớp tế bào hình chữ nhật dẹt Libe-gỗ xếp thành từng bó riêng lẻ kéo dài thành theo hướng xuyên tâm, ngăn cách bởi nhiều dãy tia tủy rộng Libe cấp 1 xếp lộn xộn, libe cấp 2 xếp thành dãy Mạch gỗ 2 ít, chiếm tâm, bao xung quanh bởi mô mềm không hóa gỗ (Hình 3.2)

Kết quả kiểm nghiệm vi phẫu thân rễ và rễ củ nguyên liệu Sâm Việt Nam cho thấy vi phẫu của các mẫu này phù hợp với mô tả trong chỉ tiêu Vi phẫu của chuyên luận Sâm Việt Nam trong Dược điển Việt Nam V

Hình 3.1 Vi phẫu thân rễ nguyên liệu Sâm Việt Nam

Hình 3.2 Vi phẫu rễ củ nguyên liệu Sâm Việt Nam

Bột nguyên liệu Sâm Việt Nam màu vàng xám, vị rất đắng, soi dưới kính hiển vi phát hiện các cấu tử được minh họa trong Hình 3.3 Kết quả phù hợp với mô tả trong chỉ tiêu Soi bột của chuyên luận Sâm Việt Nam trong Dược điển Việt Nam V

Mảnh bần Mảnh mô mềm Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột

Khối chất tiết màu nâu đỏ

Tinh thể calci oxalat hình cầu gai

Hình 3.3 Các cấu tử trong bột nguyên liệu Sâm Việt Nam

3.1.3 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Dịch chiết nguyên liệu Sâm Việt Nam được định tính bẳng sắc ký lớp mỏng sử dụng hai hệ dung môi CHCl3 – MeOH – H2O (65:35:10, lớp dưới) và n-BuOH –

H2O – AcOH (4:5:1, lớp trên) Bản mỏng sắc ký (Hình 3.4) cho thấy sắc ký đồ tương ứng với dịch chiết của mẫu nguyên liệu Sâm Việt Nam có các vết tương ứng với các vết của các chuẩn M-R2, G-Rg1, G-Rd, G-Rb1 trong hỗn hợp chuẩn và các vết trong dịch chiết Sâm Việt Nam chuẩn

Bản mỏng: Silica gel F254 (Merck) Pha động: n-BuOH – H 2 O – AcOH (4:5:1, lớp trên)

Phát hiện: Phun thuốc thử H 2 SO 4 10 % trong EtOH, sấy ở 105 °C đến khi hiện màu, quan sát dưới ánh sáng thường

C: Hỗn hợp chuẩn T: Mẫu thử nguyên liệu Sâm Việt Nam M-R2: Majonosid-R2

Hình 3.4 Bản mỏng sắc ký định tính nguyên liệu Sâm Việt Nam

3.1.4 Xây dựng quy trình định lượng bằng HPLC-ELSD

3.1.4.1 Thăm dò số lần chiết của quá trình chiết xuất

Nghiên cứu sử dụng phương pháp siêu âm để chiết xuất saponin chính trong Sâm Việt Nam với dung môi MeOH 80 % Cân chính xác 100 mg bột Sâm Việt Nam vào ống ly tâm 15 ml và chiết với 5 ml MeOH 80 % trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Mẫu thử được ly tâm thu được dịch chiết và phần cắn được chiết tiếp thêm 2 lần nữa Dịch chiết được khảo sát bằng TLC với quy trình được trình bày tại mục 2.4.1.1, trang 49 Kết quả được trình bày trong Hình 3.5

Bản mỏng: Silica gel F254 (Merck) Pha động: n-BuOH – H 2 O – AcOH (4:5:1, lớp trên)

Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng khảo sát số lần chiết mẫu thử Sâm Việt Nam

Nhận xét: Kết quả TLC cho thấy dịch chiết lần ba không còn phát hiện vết saponin trên bản mỏng Vì vậy ba lần chiết có thể chiết kiệt được các saponin trong mẫu thử bột rễ Sâm Việt Nam

3.1.4.2 Thăm dò các thông số quá trình tinh chế

Mẫu thử của ba lần chiết được gộp và cô đến cắn dưới áp suất giảm Dịch chiết được phân tán với 6 ml nước và nạp lên cột SPE C18 đã hoạt hóa bằng 6 ml nước và cân bằng với 12 ml nước cất Cột được loại tạp bằng 3×2 ml nước cất Dịch nạp và dịch rửa thứ 4 và thứ 6 được khảo sát bằng TLC (Hình 3.6A) Cột SPE sau khi loại tạp được hút khô và rửa giải bằng 5×1 ml MeOH 100 % Dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thể tích MeOH có thể rửa giải hoàn toàn saponin từ trong cột SPE (Hình 3.6B)

Nhận xét: Kết quả TLC cho thấy sắc ký đồ của dịch nạp mẫu không có vết màu hồng tương ứng với các saponin, vì vậy, quá trình nạp mẫu không làm thất thoát các saponin Quá trình loại tạp bằng nước, ở 6 ml nước không còn vết tạp phân cực màu đen nên 6 ml nước được sử dụng để loại tạp Ở giai đoạn rửa giải, khi rửa giải đến 4 ml MeOH 100 %, dịch rửa giải không còn cho vết saponin màu tím trên bản mỏng Vì vậy, 4 ml MeOH được dùng để rửa giải saponin trong cột SPE

Bản mỏng: Silica gel F254 (Merck) Pha động:

C: Hỗn hợp chuẩn N: Dịch nạp mẫu W4: Dịch rửa nước 4 ml W6: Dịch rửa nước 6 ml M1-M5: dịch rửa giải MeOH 1-5

Hình 3.6 Bản mỏng sắc ký khảo sát quá trình nạp mẫu, loại tạp (A) và rửa giải (B) mẫu thử Sâm Việt Nam sử dụng SPE

3.1.4.3 Quy trình định lượng nguyên liệu rễ Sâm Việt Nam bằng HPLC-ELSD

- Hệ thống HPLC: Shimadzu HPLC Prominence-i LC-2030C 3D Plus;

- Cột: KyaTech C18 (150 mm ì 4,6 mm; 5 àm);

- Đầu dò: Sedere 85 LT-ELSD (khí mang nitơ; áp suất 0,4 mPa; nhiệt độ hóa hơi

- Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút;

- Pha động: sử dụng hỗn hợp acetonitrile và nước với chương trình rửa giải gradient được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Chương trình rửa giải gradient của phương pháp HPLC-ELSD

- Mẫu chuẩn: Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn S1 bằng cách cân chính xác 3,55 mg G-Rb1 và 1,7 mg G-Rd vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH 80 % và siêu âm cho tan và thêm dung môi đến vạch Hỗn hợp chuẩn S2 được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 2,77 mg G-Rg1 và 4,60 mg M-R2 vào bình định mức 2 ml, thêm chính xỏc 800 àl hỗn hợp chuẩn S1, thờm MeOH 80 %, siờu õm cho tan và thờm dung môi đến vạch Từ dung dịch chuẩn gốc pha dãy chuẩn có nồng độ được trình bày trong Bảng 2.7, trang 51 Xây dựng đường tuyến tính tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh có y = ax + b với x là nồng độ và y là diện tích đỉnh

- Dung dịch thử: 100 mg bột Sâm Việt Nam thực hiện chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 5 ml methanol 80 % trong 20 phút, ly tâm lấy dịch Dịch chiết được cô cách thủy đến cắn trong chén sứ Cắn được hòa với 6 ml nước và nạp lên cột SPE-C18 đã được hoạt hóa với 6 ml methanol 100 % (TT), sau đó ổn định cột với 12 ml nước Mẫu trên cột SPE được loại tạp với 6 ml nước và rửa giải với 4 ml methanol vào bình định mức 5 ml, thêm methanol 100 % đến vạch

3.1.4.4 Đánh giá quy trình định lượng a Tính tương thích hệ thống

Tiến hành phân tích sắc ký 6 lần mẫu thử Sâm Việt Nam bằng phương pháp HPLC- ELSD Các thông số sắc ký tương ứng với các đỉnh của G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Thông số sắc ký của các đỉnh tương ứng với G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 của phương pháp HPLC-ELSD

Nhận xét: Các thông số về thời gian lưu, diện tích đỉnh của các đỉnh tương ứng với các saponin chính có %RSD ≤ 2 %, hệ số kéo đuôi 0,8-1,5, độ phân giải

 1,25, số đĩa lý thuyết > 10.000 Vì vậy, hệ thống HPLC-ELSD được sử dụng phù hợp để thực hiện quy trình định lượng các saponin trong nguyên liệu Sâm Việt Nam b Độ đặc hiệu

Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu của phương pháp HPLC-ELSD được thể hiện trong Hình 3.7 Sắc ký đồ của mẫu thử có các đỉnh tương ứng với các saponin G-Rg1, M-R2, G-Rb1 và G-Rd có thời gian lưu tương đương với các đỉnh của các saponin này trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn Khi thêm chuẩn vào dung dịch thử, diện tích đỉnh và chiều cao của các đỉnh này trên sắc ký đồ tăng lên so với trước khi thêm chuẩn Mẫu trắng không có đỉnh có thời gian lưu tương đương với các đỉnh tương ứng với các saponin trong mẫu thử Vì vậy phương pháp HPLC-ELSD đạt độ đặc hiệu

Hình 3.7 Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu của phương pháp HPLC-ELSD định lượng saponin trong rễ Sâm Việt Nam

Chú thích: A: mẫu trắng, B: mẫu chuẩn, C: mẫu thử, D: mẫu thử thêm chuẩn 1: G-Rg 1 , 2: M-R2, 3: V-R2, 4: G-Rb 1 , 5: G-Rd c Tính tuyến tính

Đánh giá sự thay đổi thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam qua quá trình xử lý nhiệt

3.2.1 Đánh giá sự thay đổi thành phần hóa học

3.2.1.1 Định tính bằng HPLC-QToF-MS

Bột Sâm Việt Nam sau khi hấp trong thời gian 2-20 h ở nhiệt độ 120 °C được làm khô và chiết 3 lần với MeOH 100 % Dịch MeOH được gộp, cô đuổi dung môi và hòa lại với MeOH với nồng độ khoảng 100 ppm Dịch thử được phân tích bằng HPLC-QToF-MS với điều kiện trình bày ở mục 2.4.4.1, trang 54 và sắc ký đồ đại diện của dịch chiết Sâm Việt Nam ở từng thời điểm chế biến được trình bày ở Hình 3.13 Sắc ký đồ cho thấy khi hấp dịch chiết Sâm Việt Nam từ 2-4 h, các đỉnh tương ứng với các ginsenosid phân cực có thời gian lưu từ 0-28 phút giảm dần Từ thời gian hấp 4 giờ bắt đầu xuất hiện các đỉnh tương ứng với các ginsenosid kém phân cực có thời gian lưu từ 28 phút Ở thời gian hấp 8 h, các đỉnh tương ứng với các ginsenosid phân cực như N-R1, G-Rg1, G-Rb1, G-Rc, G-Rd gần như biến mất hoàn toàn Ở thời gian này, đỉnh tương ứng với ocotillol genin có thời gian lưu khoảng 25 phút bắt đầu xuất hiện cùng với sự giảm dần của các đỉnh tương ứng với các saponin thuộc khung ocotillol như M-R2, V-R2 Cũng ở thời gian này có sự tăng lên đáng kể của đỉnh tương ứng với p-RT4 Từ thời gian 8-12 h đỉnh tương ứng với ocotillol genin tăng lên rõ rệt Tuy nhiên ở thời gian từ 12-20 h, sự thay đổi của các đỉnh tương ứng các saponin khung ocotillol không còn rõ rệt nữa Ngoài ra, các đỉnh tương ứng với các ginsenosid kém phân cực có thời gian lưu trên 28 phút trong dịch chiết Sâm Việt Nam ở 20 h bắt đầu giảm rõ rệt so với thời gian 12 h

Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC-QToF-MS đại diện của dịch chiết Sâm Việt Nam hấp ở 0-20h

1: N-R1; 2: M-R1; 3: G-Rg 1 ; 4: G-Re; 5: M-R2; 6: V-R11; 7: p-RT 4 ; 8: V-R2; 9: V-R1; 10: G-Rb 1 ; 11+12+13: 20(R/S)-G-Rh 1 +G-Rc; 14: OT genin; 15: G-Rd; 16+17: G-Rk 3 +G-Rh 4 ; 18+19: 20(R+S)-G-Rg 3 ; 20; G-Rk 1 ; 21: G-Rg 5 ; 22: 20(R)-G-Rh 2

Hệ thống HPLC: Agilent 1260; Đầu dò: Agilent QToF-MS 6530 (Nguồn ion hóa: electrospray, điện thế mao quản 3,5 kV, áp suất hóa hơi 45 psi, lưu lượng khí làm khô 5 l/phút, nhiệt độ khí làm khô 300 °C, điện áp vòi phun: 500 V, điện thế phân mảnh: 250 V ở chế độ ion dương); Cột sắc ký: Phenomenex Kinetex C18 (50×4,6 mm, 2,6 àm); Nhiệt độ cột: 25 °C; Pha động: hỗn hợp acetonitrile và nước chứa acid formic 0,1 % ở cả hai kờnh với chương trỡnh rửa giải gradient; Tốc độ dũng: 0,3 ml/phỳt; Thể tớch tiờm mẫu: 2,0 àl

3.2.1.2 Phân tích toàn bộ chất chuyển hóa

Dữ liệu HPLC-QToF-MS tiếp tục được trích xuất và phân tích bằng phương pháp metabolomics để quan sát rõ hơn sự thay đổi thành phần hóa học của dịch chiết

Sâm Việt Nam qua quá trình hấp (n = 3) Trên mô hình phân tích trực quan PCA, kết quả cho thấy các nhóm 0, 2, 4, 8 và 12 h tách hoàn toàn với nhau trong khi nhóm

12 h, 16 h và 20 h chồng lấn một phần lên nhau (Hình 3.14) Điều này cho thấy quá trình biến đổi hóa học rõ rệt diễn ra trong khoảng 12 h đầu, trong khi đó, khi tăng thời gian hấp lên 12-20 h, sự thay đổi hóa học không đáng kể

Hình 3.14 Biểu đồ điểm PLS-DA của dữ liệu HPLC-QToF-MS phân tích thành phần hóa học của dịch chiết Sâm Việt Nam hấp ở 120 °C trong thời gian 0-20 h

Từ kết quả phân tích PLS-DA, 11 hợp chất đóng góp nhiều nhất vào sự tách biệt giữa các nhóm được trích xuất và trọng số (VIP score) của mỗi hợp chất được xác định Ở ngưỡng VIP score trên 1,5; OT, p-RT4, G-Rg1, đóng vai trò quan trọng trong sự tách biệt giữa các nhóm M-R2 và V-R2 có VIP score 1-1,5 cho thấy vai trò quan trọng thứ hai trong sự khác biệt thành phần hóa học giữa các nhóm, nhất là nhóm 12-20 h

Từ sơ đồ nhiệt trong Hình 3.15, ở thời điểm hấp 2 h, các saponin phân cực như M-R2, V-R2, G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Rh1 đạt hàm lượng cao nhất Ở thời điểm 4-8 h, hàm lượng của các saponin phân cực này giảm dần và có sự tăng lên của hàm lượng các saponin kém phân cực Ở thời điểm 12 h, các saponin kém phân cực G-

Rk3, G-Rh4, G-Rg5, G-Rk1, 20(S)-G-Rg3 và 20(R)-G-Rg3 chiếm hàm lượng cao trong khi các saponin phân cực hoàn toàn biến mất OT genin và p-RT4 bắt đầu xuất hiện ở thời điểm 12h và đạt hàm lượng cao nhất ở thời điểm 20 h

Hình 3.15 Biểu đồ điểm trọng số và biểu đồ nhiệt đánh giá mức độ đóng góp của các saponin vào sự khác biệt thành phần hóa học của dịch chiết Sâm Việt Nam hấp ở các thời điểm khác nhau

3.2.2 Đánh giá sự thay đổi tác dụng bảo vệ thận của

3.2.2.1 Xây dựng mô hình in vitro đánh giá tác dụng bảo vệ thận a Thử nghiệm lựa chọn nồng độ cisplatin

Kết quả thể hiện ở Hình 3.16 cho thấy ở mật độ 1×10 4 tế bào/giếng, khi tế bào được tiếp xỳc với cisplatin ở nồng độ 10 àM, số lượng tế bào giảm cũn 78,7 % Khi tăng nồng độ cisplatin lờn 20 àM, tỷ lệ tế bào sống cũn khoảng 58,6 % và khi tăng

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. nồng độ cisplatin cao hơn (30-100 àM), tỷ lệ tế bào sống khụng giảm thờm nữa Vỡ vậy, nồng độ cisplatin từ 20 àM cú thể được dựng cho cỏc thử nghiệm tiếp theo

Hình 3.16 Biểu đồ so sánh tỷ lệ sống của tế bào ở các nồng độ cisplatin khác nhau

Chỳ thớch: Control: nhúm chứng õm (100 %) khụng được xử lý với cisplatin; 20-100 àM: nhúm chứng bệnh được xử lý với cisplatin 20-100 àM; Nồng độ DMSO của cỏc giếng là 0,2 %; *: p < 0,05 so với nhúm chứng âm (100 %); **: p < 0,01 so với nhóm chứng âm (100 %) b Thử nghiệm mật độ tế bào

Kết quả ở Hỡnh 3.17 cho thấy ở nồng độ cisplatin 20 àM, với mật độ tế bào 1×10 4 tế bào/giếng, tỷ lệ tế bào sống là 53 % Khi tăng mật độ tế bào lên 2×10 4 và 3×10 4 , tỷ lệ tế bào sống tăng lên 74 % và 91 % Vì vậy, mật độ tế bào 1×10 4 tế bào/giếng được chọn cho mô hình thử nghiệm tác dụng bảo vệ thận

Hình 3.17 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ tế bào sống ở các mật độ tế bào khác nhau do độc tính của cisplatin 20 àM

Chú thích: Tỷ lệ % so với nhóm chứng có cùng mật độ tế bào nhưng không có cisplatin *: p < 0,05 so với nhóm chứng c Thử nghiệm khả năng bảo vệ thận của chứng dương

Hình 3.18 Khả năng bảo vệ thận của N-acetylcystein

Chú thích: #: p < 0,05 so với nhóm chứng âm (100 %); *: p < 0,05 so với nhóm chứng bệnh Ở mật độ 1ì10 4 tế bào/giếng, tế bào được tiếp xỳc với NAC cú 1.000 àM trong thời gian 2 h trước khi tiếp xỳc với cisplatin ở cỏc nồng độ 20, 30 và 50 àM Kết quả

Mật độ tế bào thử nghiệm

Nồng độ (àM) Cisplatin Cisplatin + NAC 1.000 àM

Nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm Việt Nam theo hướng sàng lọc các hợp chất có tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vitro

3.3.1 Chế biến Sâm Việt Nam và chiết xuất cao toàn phần Sâm Việt Nam chế biến

Bột Sâm Việt Nam (45 g) sau khi hấp với 200 ml nước ở 120 °C trong 12 h được đông khô và chiết với 3×1.000 ml MeOH bằng siêu âm ở nhiệt độ phòng Dịch chiết sau khi cô thu hồi dung môi thu được 27 g cao khô chiết Sâm Việt Nam chế biến (PVG)

Dịch chiết PVG được đánh giá khả năng bảo vệ tế bào thận trước độc tính của cisplatin Ở nồng độ cisplatin 20 àM, tỷ lệ tế bào sống là 57,9 % so với cỏc giếng khụng xử lý cisplatin PVG ở nồng độ 50, 100 và 200 àg/ml cú tỷ lệ tế bào sống lần lượt là 68,4 %, 73 % và 83 % Khả năng bảo vệ thận của PVG ở nồng độ 50 àg/ml và 100 àg/ml tương đương với NAC ở nồng độ 1.000 àM, nồng độ 200 àg/ml cho khả năng phục hồi cao nhất (87,5 %) (Hình 3.22)

Hình 3.22 Tác dụng bảo vệ thận của cao chiết Sâm Việt Nam chế biến so sánh với

Chỳ thớch: 0 àg/ml: nhúm chứng bệnh chỉ được xử lý với cisplatin 20 àM; A: 50-200 àg/ml: nhúm được xử lý với dịch chiết Sõm Việt Nam chế biến cú nồng độ 50-200 àg/ml trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h NAC 1.000: nhúm được xử lý với N-acetyl cystein 1.000 àM trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h #: p < 0,05 so với nhóm chứng âm (100 %); *: p < 0,05 so với nhóm chứng bệnh; **: p < 0,01 so với nhóm chứng bệnh

3.3.2 Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ thận của các phân đoạn chiết xuất có độ phân cực khác nhau

Cao toàn phần PVG (26 g) được chiết phân bố lần lượt với diethyl ether, ethyl acetat, và n-butanol bão hòa nước thu được phân đoạn diethyl ether (Et), ethyl acetat (EA) và n-butanol Khối lượng các phân đoạn được trình bày tại Bảng 3.6

Bảng 3.6 Khối lượng các phân đoạn có độ phân cực tăng dần thu được sau khi chiết phân bố lỏng-lỏng cao toàn phần Sâm Việt Nam chế biến

Diethyl ether 3,48 Ethyl acetate 3,53 n-butanol 6,74

Các cao phân đoạn được đánh giá khả năng bảo vệ thận khỏi độc tính của cisplatin Kết quả cho thấy phân đoạn EA và Et có làm tăng rõ rệt tỷ lệ tế bào sống (Hình 3.23) Vì vậy hai phân đoạn này được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu phân lập định hướng tác dụng sinh học

Hình 3.23 Kết quả khảo sát khả năng bảo vệ thận của các phân đoạn có độ phân cực khác nhau của Sâm Việt Nam chế biến

Chỳ thớch: 0 àg/ml: nhúm chứng bệnh chỉ được xử lý với cisplatin 20 àM; 25-100 àg/ml: nhúm được xử lý với cỏc phõn đoạn cú nồng độ 25-100 àg/ml trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h NAC 1000: nhúm được

PVG Nước Bu EA Et NAC 1000

Tỷ lệ tế bào sống (%)

0 àg/ml + cis 25 àM 25 àg/ml + cis 25 àM xử lý với N-acetylcystein 1.000 àM trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h #: p < 0,05 so với nhúm chứng âm (100 %); *: p < 0,05 so với nhóm chứng bệnh

3.3.3 Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ thận của phân đoạn diethyl ether

Phân đoạn Et (3,3 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel (16×200 mm) với pha động là hỗn hợp CHCl3-MeOH (100:0; 100:1; 50:1; 30:1; 20:1) thu được 8 phân đoạn Et1-8 với khối lượng được trình bày ở Bảng 3.7 Các phân đoạn này được thử nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ thận và kết quả được thể hiện ở Hình 3.24

Bảng 3.7 Khối lượng các phân đoạn Et1-8

Phân đoạn Khối lượng (mg)

Hình 3.24 Tác dụng bảo vệ thận của các phân đoạn Et5-8

Chỳ thớch: 0 àg/ml: nhúm chứng bệnh chỉ được xử lý với cisplatin 20 àM; 10-50 àg/ml: nhúm được xử lý với cỏc phõn đoạn Et1-Et8 cú nồng độ 10-50 àg/ml trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h NAC 1.000: nhúm được xử lý với N-acetylcystein 1.000 àM trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h #: p < 0,05 so với nhúm chứng âm (100 %); *: p < 0,05 so với nhóm chứng bệnh, **: p < 0,01 so với nhóm chứng bệnh

Et 1 Et 2 Et 3 Et 4 Et 5 Et 6 Et 7 Et 8 NAC 1000

0 àg/ml 10 àg/ml 25 àg/ml 50 àg/ml

Dựa vào khối lượng cao phân đoạn thu được và mức độ tiềm năng của các phân đoạn, phân đoạn Et3 (106,6 mg) và Et5 (92,5 mg) và Et8 (66,3 mg) được lựa chọn để tiếp tục phân lập

Phân đoạn Et3 tiếp tục được phân tách bằng cột silica gel (3×20 cm) với pha động chloroform 100 % thu được hợp chất 1 (35,1 mg) dạng chất lỏng màu vàng nhạt Hợp chất này được đánh giá tác dụng bảo vệ thận bằng mô hình đã xây dựng Kết quả ở Hỡnh 3.25 cho thấy khi xử lý với cisplatin 20 àM, tỷ lệ tế bào sống là 49,1 % so với nhúm chứng Khi tế bào được xử lý với Et3.1 ở nồng độ 0,3 àg/ml, tỷ lệ tế bào sống tăng lờn lần lượt là 63,6 % Khi tăng nồng độ thử nghiệm lờn 1,3 àg/ml, hợp chất này bắt đầu thể hiện độc tính trên tế bào thận LLC-PK1 và làm giảm đáng kể tỷ lệ tế bào sống Hợp chất này được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm và dữ liệu phổ được trình bày tại mục 3.3.5.1, trang 96

Hình 3.25 Tác dụng bảo vệ thận của hợp chất 1

Chỳ thớch: 0: nhúm chứng bệnh chỉ được xử lý với cisplatin 20 àM; 0,1-50: nhúm được xử lý với panaxynol cú nồng độ 0,1-50 àg/ml trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h NAC 1.000: nhúm được xử lý với N- acetylcystein 1.000 àM trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h #: p < 0,05 so với nhúm chứng õm (100 %);

*: p < 0,05 so với nhóm chứng bệnh

Tỷ lệ tế b ào s ốn g (% )

Phân đoạn Et5 được phân tách bằng cột silica gel với pha động CHCl3-MeOH (10:1) được hợp chất 2 dưới dạng bột màu trắng vô định hình (63,5 mg)

Hợp chất này được đánh giá tác dụng bảo vệ thận và kết quả ở Hình 3.26 cho thấy hợp chất 2 cú khả năng bảo vệ thận trước độc tớnh của cisplatin 20 àM với tỷ lệ phục hồi ở nồng độ 0, 50, 100, 200 àM lần lượt là 63,2 %, 72,4 %, 80,8 % và 91,1 % Vì vậy hợp chất 2 được đánh giá có tiềm năng bảo vệ thận và được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ nghiệm

Hình 3.26 Tác dụng bảo vệ tế bào thận của hợp chất 2

Chỳ thớch: 0: nhúm chứng bệnh chỉ được xử lý với cisplatin 20 àM; 50-200: nhúm được xử lý với hợp chất 2 cú nồng độ 50-200 àg/ml trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h NAC 1.000: nhúm được xử lý với N- acetylcystein 1.000 àM trước khi xử lý với cisplatin 20 àM 2 h #: p < 0,05 so với nhúm chứng õm (100 %);

*: p < 0,05 so với nhóm chứng bệnh

Quá trình phân lập hợp chất 1 và 2 được tóm tắt trong Hình 3.27

SKC Silica gel CHCl 3 -MeOH (10:1)

Hình 3.27 Tóm tắt quá trình phân lập hợp chất 1 và 2 từ phân đoạn diethyl ether

3.3.4 Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ thận của phân đoạn ethyl acetat

Phân đoạn ethyl acetat (EA) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel (5×30 cm) với pha động là hỗn hợp CHCl3-MeOH-H2O với độ phân cực tăng dần (140:25:2,5 → 120:25:2,5 → 100:25:2,5 → 75:25:2,5) thu được 6 phân đoạn EA1- EA6

Hình 3.28 Tác dụng bảo vệ thận của các phân đoạn EA1-EA6

Đánh giá tác dụng bảo vệ thận của cao toàn phần và thành phần có hoạt tính trên mô hình in vivo

3.4.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ thận của panaxynol trên mô hình in vivo

Trên mô hình in vivo, cisplatin tiêm phúc mô ở liều 16 mg/kg làm giảm đáng kể khối lượng cơ thể ở chuột Ở các nhóm thử được dùng panaxynol ở liều 10 mg/kg và 50 mg/kg hoặc NAC ở liều 1000 mg/kg, khối lượng cơ thể chuột tăng đáng kể so với nhóm bệnh (Hình 3.41)

Hình 3.41 Tác dụng của panaxynol phục hồi khối lượng cơ thể của các nhóm chuột bị giảm bởi cisplatin

Chú thích: Control: nhóm không được dùng với cisplatin; Cisplatin 16 mg/kg: nhóm chỉ được xử lý với cisplatin

16 mg/kg; N-acetylcystein 1000 mg/kg: Nhóm được xử lý với N-acetylcystein 1000 mg/kg và cisplatin 16 mg/kg; Panaxynol 10 mg/kg: Nhóm được xử lý với panaxynol 10 mg/kg và cisplatin 16 mg/kg; Panaxynol 50 mg/kg: Nhóm được xử lý với panaxynol 50 mg/kg và cisplatin 16 mg/kg Đối với chỉ số creatinin huyết, ở nhóm chứng, nồng độ creatin huyết là 0,21±0,02 mg/dl trong khi ở nhóm cisplatin 16 mg/kg, nồng độ của chỉ số này tăng lên 0,58 ± 0,08 mg/dl Panaxynol ở liều 10 mg/kg và 50 mg/kg làm giảm nồng độ creatinin huyết xuống lần lượt 0,39 ± 0,04 mg/dl và 0,43 ± 0,03 mg/dl Ở nhóm sử dụng NAC 1000 mg/kg, nồng độ creatinin huyết là 0,32 ± 0,03 mg/dl (Hình 3.42A) Đối với chỉ số BUN, ở nhóm bệnh, cisplatin làm tăng nồng độ BUN lên 55,38±2,38 mg/dl so với nhóm chứng là 25,55±0,88 mg/dl Ở nhóm dùng panaxynol

10 mg/kg và 50 mg/kg, nồng độ BUN giảm lần lượt là 42,90±2,63 mg/dl và 41,60±1,77 mg/dl, tương đương với nhóm dùng NAC 1.000 mg/kg (41,64±2,40 mg/dl) (Hình 3.42B)

Kết quả cho thấy panaxynol ở liều 10 mg/kg và 50 mg/kg có thể phục hồi chức năng thận thông qua việc làm giảm BUN và creatinin huyết tăng lên do cisplatin ở liều 16 mg/kg

Hình 3.42 Panaxynol ở nồng độ 10 mg/kg và 50 mg/kg làm giảm nồng độ creatinin huyết (A) và BUN (B) tăng lên do độc tính của cisplatin trên thận Để đánh giá khả năng của panaxynol làm giảm phản ứng viêm trên tế bào thận gây ra do cisplatin, mức độ biểu hiện của COX-2 mRNA và MCP-1 mRNA được đánh giá bằng RT-PCR Ở nhóm chứng âm (100 %), tỷ lệ tương đối của COX-2 mRNA và MCP-1 mRNA lần lượt là 1,00 ± 0,26 và 1,00 ± 0,10 Ở nhóm chứng bệnh, tỷ lệ này tăng lên lần lượt là 3,29 ± 0,34 và 1,91 ± 0,31 Tỷ lệ COX-2 mRNA ở hai nhóm được dùng panaxynol 10 mg/kg và 50 mg/kg giảm đáng kể còn 0,93 ± 0,05 và 0,94 ± 0,33 Tỷ lệ MCP-1 mRNA ở hai nhóm này lần lượt là 0,78 ± 0,23 và 0,91 ± 0,32 Tỷ lệ tương đối của COX-2 mRNA và MCP-1 mRNA ở nhóm dùng NAC 1.000 mg/kg lần lượt là 0,63 ± 0,08 và 0,96 ± 0,14 (Hình 3.43)

Hình 3.43 Panaxynol ở nồng độ 10 mg/kg và 50 mg/kg làm giảm biểu hiện của COX-2 mRNA (A) và MCP-1 mRNA (B) tăng lên do độc tính của cisplatin trên thận

3.4.2 Tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam chế biến trên chuột nhắt gây tổn thương thận bằng cyclosporin A trên mô hình in vivo

Kết quả cho thấy cyclosporin A tiêm phúc mô ở liều 100 mg/kg làm suy giảm đáng kể chức năng thận thông qua việc làm tăng chỉ số BUN 70,2 % từ 8,42 mM lên 14,33 mM, tăng chỉ số creatinin huyết 93,1 % từ 44,87 mM lên 86,64 mM Cao chiết Sâm Việt Nam chưa chế biến liều 100 mg/kg giúp phục hồi chỉ số BUN và creatinin xuống lần lượt 10,76 mM và 62,29 mM tương đương với chứng dương NAC ở cùng liều 100 mg/kg Cao chiết Sâm Việt Nam chế biến ở liều 100 mg/kg có thể phục hồi chỉ số BUN và creatinin huyết xuống tương đương với lô sinh lý với nồng độ lần lượt là 8,61 mM và 47,92 mM (Hình 3.44 và Hình 3.45)

Hình 3.44 Chỉ số BUN của các mẫu huyết tương chuột

Hình 3.45 Chỉ số creatinin của các mẫu huyết tương chuột

Trên thử nghiệm stress oxy hóa trong mô thận, cysclosporin làm giảm 29,2 % lượng GSH và tăng 33,1 % lượng MDA so với lô sinh lý Cả chứng dương NAC, cao chiết Sâm Việt Nam và Sâm Việt Nam chế biến ở liều 100 mg/kg có thể phục hồi lượng GSH bị giảm do cyclosporin A về tương đương với lô sinh lý (Hình 3.46) Tuy nhiên, đối với chỉ số MDA, chỉ có cao chiết Sâm Việt Nam chế biến có thể làm giảm đáng kể hàm lượng MDA so với lô chứng bệnh (Hình 3.47)

Hình 3.46 Hàm lượng GSH trong mô thận chuột

Hình 3.47 Hàm lượng MDA trong mô thận chuột

Sâm Việt Nam chế biến

Sâm Việt Nam chế biến μ m o l/m l d ịch đồ n g t h ể

BÀN LUẬN

Kiểm nghiệm nguyên liệu rễ Sâm Việt Nam

Sâm Việt Nam là một dược liệu quý và có giá trị cao trên thị trường Vì vậy, việc kiểm nghiệm và đảm bảo chất lượng cho dược liệu này đóng vai trò quan trọng Hiện tại, chuyên luận Sâm Việt Nam trong Dược điển Việt Nam V quy định việc kiểm nghiệm dược liệu này bao gồm các chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, soi bột, định tính bằng sắc ký lớp mỏng, định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cùng với các phân tích độ tinh khiết

4.1.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Để xác định sơ bộ thành phần hóa học của dược liệu nói chung và Sâm Việt Nam nói riêng, sắc ký lớp mỏng là lựa chọn lý tưởng Mặc dù trước đây, một số phương pháp hóa học có thể được sử dụng như phản ứng tạo bọt, phản ứng Liebermann-Burchard nhưng các phản ứng này không đặc hiệu cho các saponin trong Sâm Việt Nam nên không được áp dụng trong nghiên cứu này

Phương pháp định tính các saponin trong Sâm Việt Nam ở nghiên cứu này bằng sắc ký lớp mỏng được tham khảo từ Dược điển Việt Nam V cùng với một số kinh nghiệm cá nhân Đối với pha tĩnh, nghiên cứu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 trên nền nhôm Đây là loại bản mỏng phổ biến với giá thành hợp lý, được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu hợp chất tự nhiên Đối với chuẩn đối chiếu, Dược điển Việt Nam V sử dụng các chất chuẩn đối chiếu M-R2, G-Rg1, G-Rb1 và G-Rd Đây là các saponin đại diện cho các khung OT, PPD và PPT chiếm hàm lượng cao trong rễ Sâm Việt Nam Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thêm chuẩn đối chiếu V-R2 để định tính nguyên liệu Đây là một saponin khung ocotillol chiếm hàm lượng cao và đặc trưng cho Sâm Việt Nam và chưa phát hiện ở các loài sâm khác

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Để khai triển sắc ký và phân tách các saponin, nghiên cứu sử dụng pha động là hai hệ dung môi bao gồm: a: Chloroform– Methanol – Nước (65:35:10, lớp dưới) b: n-Butanol – Nước – Acid acetic (4:5:1, lớp trên)

Hệ dung môi (a) được sử dụng trong Dược điển Việt Nam IV, có thể tách tốt các vết tương ứng với các saponin quan tâm như M-R2, G-Rg1 và G-Rb1 166123 Tuy nhiên do hệ dung môi này bao gồm các dung môi dễ bay hơi như chloroform, methanol nên hệ dung môi này không ổn định, thường không tách được M-R2 và G-

Rg1 (Hình 4.1A), dẫn đến các nhầm lẫn trong phân tích, nhất là một số mẫu trên thị trường gần như không có vết tương ứng với M-R2 (Hình 4.2)

Hệ dung môi (b) được sử dụng trong Dược điển Việt Nam V để định tính các saponin trong thân rễ và rễ củ Sâm Việt Nam 117 và có tính ổn định hơn hệ dung môi (a) do có chứa các thành phần kém bay hơi như n-butanol và nước, quá trình tách lớp khá nhanh Tuy nhiên, thành phần n-butanol có độ nhớt cao nên việc khai triển tốn thời gian Hệ dung môi này có khả năng tách tốt M-R2 và G-Rg1 nên có thể dễ dàng phát hiện các mẫu bất thường với hàm lượng M-R2 rất thấp (Hình 4.1B) Vì vậy việc sử dụng dung môi (b) phù hợp để định tính Sâm Việt Nam

Bản mỏng: Silica gel GF 254 Merck

Sấy ở 105 °C đến khi hiện màu

M-R2: Majonosid-R2 V-R2: Vina-ginsenosid-R2 SVN: cao toàn phần Sâm Việt Nam

Hình 4.1 Bản mỏng sắc ký phân tích Sâm Việt Nam so với các chuẩn G-Rg1, G-Rb1 và

M-R2 triển khai ở hai hệ dung môi khác nhau

Bản mỏng: Silica gel GF 254 Merck Pha động: CHCl 3 – MeOH – H 2 O

(65 : 35 : 10, lớp dưới) Phát hiện: H 2 SO 4 10 %/EtOH

Sấy ở 105 °C đến khi hiện màu

C: hỗn hợp chuẩn G-Rb 1 , G-Rd, G-Rg 1 , M-R2

1-2: các mẫu thử trên thị trường

SVN: saponin toàn phần Sâm Việt Nam

Hình 4.2 Bản mỏng sắc ký định tính một số mẫu sâm trên thị trường so sánh với dịch chiết Sâm Việt Nam

4.1.2.1 Sự cần thiết của việc tinh chế mẫu bằng SPE

Sâm Việt Nam được chiết xuất bằng dung môi methanol 80 % vì đây được xem là dung môi tối ưu để chiết xuất các saponin trong Sâm Việt Nam 69 Mặc dù vậy, methanol 80 % cũng có thể chiết xuất được các hợp chất phân cực như đường, hợp chất màu và các hợp chất kém phân cực như tinh dầu, sterol, polyacetylen Các hợp chất kém phân cực này có thể được lưu giữ mạnh trên tiền cột và cột với pha tĩnh kém phân cực như silica gel C18, rất khó bị rửa giải bằng các dung môi thông dụng dùng cho HPLC pha đảo như methanol, acetonitrile Trên thực tế, khi phân tích dịch chiết toàn phần Sâm Việt Nam, cột rất nhanh bị dơ và áp lực dội cột tăng đáng kể sau khi phân tích 5-10 mẫu Vì vậy cần phải thay tiền cột thường xuyên và tuổi thọ của cột bị giảm, dẫn đến việc tăng chi phí phân tích mẫu Sâm Việt Nam Để giải quyết vấn đề này, một số nghiên cứu trước đây đã sử dụng một số phương pháp tinh chế mẫu Bùi Thế Vinh và Trần Công Luận (2011) đã tinh chế mẫu Sâm Việt Nam bằng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng lần lượt với diethyl ether và n-butanol bão hòa nước Phân đoạn n-butanol bão hòa nước được cô thu hồi dung môi, hòa lại với methanol

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. trước khi bơm vào hệ thống HPLC 68 Phương pháp này tuy có thể loại được các hợp chất kém phân cực nhưng quá trình chiết phân bố lỏng-lỏng nhiều lần có nguy cơ làm mất mát các saponin trong quá trình tinh chế, dẫn đến giảm độ phục hồi Việc tạo nhũ trong quá trình chiết phân bố cũng là một rào cản của phương pháp này Ngoài ra, việc cô thu hồi n-butanol bão hòa nước có nhiệt độ sôi cao cũng là một khó khăn đáng kể Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2001) trong nghiên cứu phương pháp định lượng saponin trong Sâm Việt Nam đã sử dụng diaion HP-20 để tinh chế mẫu 124 Phương pháp này khắc phục được các khó khăn của phương pháp chiết lỏng-lỏng như tránh được việc tạo nhũ, sử dụng dung môi là methanol có thể cô thu hồi dễ dàng hơn n- butanol bão hòa nước Tuy nhiên, nhựa diaion HP-20 có giá thành cao nên không phổ biến ở các phòng kiểm nghiệm Mặc dù loại nhựa này có thể tái chế để sử dụng nhiều lần nhưng quá trình tái chế qua nhiều bước, tốn nhiều thời gian cũng như thải các dung môi hữu cơ (acetone, isopropanol) ra môi trường

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp Chiết pha rắn (Solid-Phase Extraction – SPE) để tinh chế mẫu Về bản chất, đây là một cột sắc ký được nhồi pha tĩnh là silica gel C18 với kớch thước hạt khoảng 50 àm Nghiờn cứu đã thăm dò quy trình tinh chế mẫu Quá trình nạp mẫu cho thấy không có saponin bị thất thoát Quá trình rửa tạp bằng nước giúp loại bỏ các tạp phân cực Nếu không được loại bỏ, các tạp này sẽ được rửa giải ở đầu sắc ký đồ và có thể ảnh hưởng đến các peak rửa giải sớm như G-Rg1, M-R2 Nghiên cứu đã cho thấy 6 ml nước có thể rửa loại bỏ gần như hoàn toàn các tạp phân cực mà không rửa giải các saponin Sau bước rửa giải, khảo sát bản mỏng cho thấy 4×1 ml methanol có thể rửa giải hoàn toàn các saponin trong Sâm Việt Nam Theo khuyến cáo của nhà sản xuất SPE và kinh nghiệm thực tiễn cho thấy việc rửa giải với 4 lần, mỗi lần 1 ml methanol kèm với hút khô SPE có thể cho độ phục hồi các saponin tốt hơn là rửa 1 lần với 4 ml dung môi Sau khi rửa giải, mẫu thử để lại lớp chất màu đen trên SPE không bị rửa giải bằng methanol Đây có thể là những hợp chất kém phân cực và nếu không qua bước tinh chế bằng SPE, các hợp chất này sẽ được giữ lại trên cột sắc ký và làm tăng áp lực cột cũng như ảnh hưởng đến hình dạng và hiệu năng phân tách của cột Vì vậy, quá trình tinh chế mẫu đóng vai trò quan trọng trong định lượng Sâm Việt Nam bằng HPLC Phương pháp SPE có ưu điểm là giá thành hợp lý, việc tinh chế và xử lý mẫu nhanh, có thể thực hiện hàng loạt mẫu với thiết bị hút chân không đa kênh (manifold), giúp tăng hiệu suất phân tích

4.1.2.2 Tính ưu việt của ELSD so với đầu dò UV

Thành phần hóa học chính của thân rễ và rễ củ Sâm Việt Nam là các saponin khung protopanaxadiol (G-Rb1, G-Rd), protopanaxatriol (G-Rg1) và đặc biệt là khung ocotillol (M-R2 và V-R2) với hàm lượng cao 12-14 Dược điển Việt Nam V quy định việc định lượng các saponin chính trong Sâm Việt Nam (G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2) bằng phương pháp HPLC với đầu dò UV ở bước sóng 196 nm Ở bước sóng này, các saponin khung protopanaxadiol và protopanaxatriol có thể được phát hiện và định lượng tốt Tuy nhiên, các saponin khung ocotillol như M-R2 lại không có liên kết đôi trong cấu trúc dẫn đến việc phát hiện bằng đầu dò UV rất hạn chế mặc dù ở bước sóng rất thấp Vì vậy, việc định lượng các saponin này đôi khi gặp khó khăn do đáp ứng thấp và việc biến động bất thường đường nền ở bước sóng thấp (< 200 nm) đôi khi ảnh hưởng lớn đến sự phát hiện và xác định đỉnh của M-R2 trên sắc ký đồ (Hình 4.3A) Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) là một đầu dò vạn năng giúp phát hiện tốt những hợp chất không bay hơi mà không phụ thuộc vào cấu trúc Vì vậy, ELSD có thể phát hiện và định lượng tốt các hợp chất không có liên kết đôi trong phân tử như các saponin khung ocotillol đặc trưng của Sâm Việt Nam (M-R2) vốn hấp thu kém UV Vì vậy, trên sắc ký đồ HPLC-ELSD, peak tương ứng với M-R2 có cường độ cao, phản ánh tỷ lệ tương đối hàm lượng của M-R2 so với các saponin khác Bên cạnh đó, peak tương ứng với M-R2 có thể tách hoàn toàn với peak tạp bên cạnh Ngoài ra, ELSD còn có thể phát hiện V-R2 cũng là một saponin khung ocotillol có hàm lượng cao trong Sâm Việt Nam nhưng không thể phát hiện bằng HPLC-UV do peak có cường độ thấp và lẫn vào nhiễu đường nền (Hình 4.3B) Vì vậy kết quả định lượng các saponin, đặc biệt là khung ocotillol bằng phương pháp HPLC-ELSD có độ tin cậy hơn hẳn so với phương pháp HPLC-UV/DAD Tuy nhiên, ELSD vẫn là một

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. đầu dò ít phổ biến ở các phòng kiểm nghiệm ở Việt Nam so với đầu dò UV Vì vậy, các phòng kiểm nghiệm có nhu cầu kiểm nghiệm Sâm Việt Nam cần trang bị đầu dò này để có thể định lượng chính xác các thành phần chính trong Sâm Việt Nam

Nguồn: Nguyễn Minh Đức và Cộng sự 69

Hình 4.3 Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết Sâm Việt Nam phát hiện bằng

4.1.3 Đánh giá quá trình phát triển sinh khối và tích lũy saponin trong Sâm Việt Nam 2-7 tuổi

Những năm đầu sau khi được phát hiện, Sâm Việt Nam chủ yếu được thu hái từ nguồn thiên nhiên hoang dại Tuy nhiên do việc thu hái quá mức nên nguồn dược liệu thiên nhiên gần như cạn kiệt và nguồn cung chủ yếu nguyên liệu Sâm Việt Nam hiện nay đến từ trồng trọt bán tự nhiên dưới tán rừng Vì vậy, việc nghiên cứu động thái tích lũy saponin trong rễ Sâm Việt Nam qua các độ tuổi đóng vai trò quan trọng nhằm xác định thời điểm thu hái phù hợp Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng saponin tổng trong thân rễ và rễ củ tăng đáng kể trong thời gian 2-4 tuổi sau đó tốc độ tăng chậm lại Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các saponin là thành phần hóa học chính đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam36,37,62,125,126

Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy dịch chiết rễ Sâm Việt Nam từ 2-7 tuổi có số lượng các vết tương tự nhau và có độ đậm tăng dần theo độ tuổi mà không có các vết mới Điều này cho thấy từ độ tuổi thứ 2, Sâm Việt Nam đã tạo ra hầu hết các saponin chính như G-Rb1, G-Rd, G-Rg1, M-R2 Trong quá trình sinh trưởng, rễ Sâm Việt Nam chỉ tích lũy hàm lượng các chất này mà không sinh ra các saponin mới Vì vậy, nếu có sự sai khác về số lượng các vết trong sắc ký đồ của một mẫu Sâm Việt Nam nào đó, điều này có thể sơ bộ xác định mẫu này có thể bị trộn lẫn với một loài khác hoặc có thể là một thứ khác của loài P vietnamensis Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu sâu hơn về sự khác biệt thành phần hóa học của các thứ của loài này để có thể phân biệt các mẫu được gọi là Sâm Việt Nam trên thị trường có phải là các thứ khác nhau của loài P vietnamensis hay là một loài khác được giả mạo

Trên thực tế thị trường mua bán Sâm Việt Nam nói riêng và các loài sâm thuộc chi Panax nói chung, giá trị của củ sâm được tính trên khối lượng của củ hơn là hàm lượng saponin Khác với hàm lượng saponin, khối lượng củ sâm lại tăng nhanh trong thời gian 2-5 tuổi sau đó tăng chậm lại Vì vậy, kết quả này có thể gợi ý thời gian trồng trọt 5 năm là phụ hợp để củ Sâm Việt Nam tích lũy hàm lượng saponin cũng như sinh khối để có thể được thu hoạch và đưa ra thị trường mua bán cũng như đưa vào sản xuất các sản phẩm Việc tăng thời gian trồng trọt Sâm Việt Nam lên hơn 5 tuổi không làm tăng đáng kể hàm lượng saponin cũng như khối lượng củ nhưng sẽ gây tốn kém chi phí cho việc trồng trọt, bón phân, chăm sóc cũng như tăng thêm nguy cơ thất thu do sâu bệnh, thiên tai vốn rất phổ biến ở miền Trung Việt Nam, cũng là vùng bản địa của Sâm Việt Nam Đặc điểm này của Sâm Việt Nam trồng khác biệt với Nhân sâm trồng tại Hàn Quốc và Triều Tiên vốn thường được thu hái ở thời điểm

6 tuổi Việc thời gian trồng trọt của Sâm Việt Nam ngắn hơn cũng như hàm lượng saponin cao gấp nhiều lần so với Nhân sâm tạo ra lợi thế của Sâm Việt Nam trên thị trường Tuy nhiên, hiện nay, Sâm Việt Nam chủ yếu được trồng trọt tại vùng núi cao

Đánh giá sự thay đổi thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam qua quá trình xử lý nhiệt

4.2.1 Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ thận in vitro

4.2.1.1 Lựa chọn phương pháp đánh giá Ở nghiên cứu này, việc thử nghiệm sinh học được thực hiện song song với quá trình phân lập Phương pháp thử nghiệm tác dụng bảo vệ thận trong nghiên cứu này được xây dựng trên dòng tế bào LLC-PK1 với tác nhân gây độc là cisplatin Cisplatin là một thuốc được FDA phê chuẩn năm 1978 và được sử dụng phổ biến để điều trị các bệnh ung thư mô cứng Tuy nhiên độc tính cấp trên thận làm giới hạn việc sử dụng thuốc này trong điều trị 127 Quy trình thử nghiệm tế bào đơn giản được thực hiện trong vòng 24 h dựa vào việc đánh giá mức độ sống của tế bào với thuốc thử là muối tetrazolium formazan tan trong nước (water-soluble tetrazolium salt – WST-8) WST-

8 là loại thuốc thử rẻ tiền, cho kết quả nhanh và chính xác, ít sử dụng dung môi hữu cơ như thuốc thử MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) Ngoài ra, việc đánh giá mức độ sống của tế bào dựa trên mật độ quang ở bước sóng 540 nm sử dụng máy đo đĩa 96 giếng giúp có thể thực hiện thử nghiệm trên hàng loạt mẫu với nhiều nồng độ khác nhau Phương pháp này cho ưu thế hơn phương pháp đếm tế bào với các thuốc nhuộm như trypan blue cần thực hiện từng mẫu riêng biệt Do các ưu thế trên, thử nghiệm này là phương pháp nhanh chóng, đơn giản, rẻ tiền và có thể được xem phần nào là hiệu năng cao (high-throughput) để áp dụng vào trong nghiên cứu tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam

4.2.1.2 Lựa chọn dòng tế bào thận

LLC-PK1 là dòng tế bào biểu mô ống thận lợn và được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu các tác nhân bảo vệ thận trước độc tính của các hợp chất gốc platin nói chung và cisplatin nói riêng Dòng tế bào này biểu hiện các đặc điểm sinh lý và hóa sinh của dòng tế bào biểu mô ống thận 101,128 Đây là vị trí cisplatin tác động dẫn đến hoại tử tế bào và cuối cùng gây suy thận cấp Nghiên cứu của Thomas J Montine và Richard F Borch cho thấy dòng tế bào LLC-PK1 phù hợp với các thử nghiệm trên cisplatin do có những đặc điểm sau:

1 Độc tính xuất hiện chậm 10-15 h sau khi xử lý với cisplatin, điều này có thể tương ứng một cách tương đối với mô hình in vivo, triệu chứng giảm chức năng thận trên ở chuột cống xuất hiện 24-48 h sau khi tiêm cisplatin 129

2 Độc tính của cisplatin phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ phức hợp platin nội bào Điều này được giải thích do việc hấp thụ cisplatin chủ yếu dựa vào quá trình hấp thu chủ động cisplatin dựa vào năng lượng (enrgy-dependent process) 130 Vì vậy, nồng độ cisplatin ngoại bào ảnh hưởng lớn đến độc tính của cisplatin trên tế bào thận Điều này cú thể giải thớch khi tăng nồng độ cispltin lờn hơn 30 àM, tỷ lệ tế bào sống không giảm hơn (Hình 3.16, trang 81)

3 Tế bào LLC-PK1 đặc hiệu cho độc tính của cisplatin Các thuốc gốc platin thế hệ thứ hai như diammin (1,1-cyclobutanedicarboxylato) platinum (II) hoặc cis- dichloro-trans-dihydroxyxo-cis-bis (isopropylamin) platinum (IV) không thể hiện độc tính trên dòng tế bào LLC-PK1 129

Một trong các cơ chế gây độc của cisplatin trên tế bào thận là tạo ra các gốc tự do, làm giảm và bất hoạt glutathione dẫn đến mất cân bằng oxy hóa khử và dẫn đến stress oxy hóa nội bào Vì vậy, nhiều hợp chất có tính chống oxy hóa được sử dụng để làm chứng dương cho các nghiên cứu bảo vệ thận như melatoin, selenium, vitamin

E và N-acetylcystein (NAC) 101 NAC được biết như một chất chống oxy ngoại sinh giúp chống lại các tổn thương do oxy hóa thông qua việc bất hoạt các gốc tự do Ngoài ra, L-cystein cũng là nguồn thiol để kích hoạt việc sản xuất glutathione trong tế bào 131 Điều này giúp bù đắp lượng glutathione bị giảm do độc tính của cisplatin gây thiếu hụt các hợp chất gốc lưu huỳnh trong tế bào Nghiên cứu trên mô hình in vivo và trên lâm sàng cho thấy NAC có khả năng làm giảm độc tính của cisplatin trên chức năng thận 132,133 Nghiên cứu của Hye Lim Lee, et al (2017) 8 cũng sử dụng NAC làm chứng dương trên mô hình in vitro với dòng tế bào LLC-PK1 sử dụng cisplatin làm tác nhân gây độc để đánh giá tác dụng bảo vệ thận của G-Rh3 từ Nhân sâm NAC cũng là một hợp chất tổng hợp hóa dược với giá thành rẻ và được thương mại hóa trên thị trường Vì vậy, trong nghiên cứu này, NAC cũng được sử dụng làm chứng dương để xây dựng mô hình gây độc tế bào thận LLC-PK1 bằng cisplatin cũng như các thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ thận của các cao chiết và hợp chất phân lập được

Nghiên cứu của Montine và Richard F Borch (1988) cho thấy đa số các hợp chất gốc thiol chỉ có tác dụng bảo vệ tế bào thận LLC-PK1 khi được tiếp xúc đồng thời với cisplatin Các hợp chất này bị mất tác dụng bảo vệ khi thêm vào sau cisplatin Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nồng độ của các hợp chất này đạt tối đa trong khoảng

15 phút sau khi tiếp xúc với tế bào và giữ ổn định trong suốt thời gian ủ tế bào 129 Điều này gợi ý các mẫu thử tác dụng bảo vệ thận cần được xử lý trước hoặc đồng thời với cisplatin Thật vậy, trong hầu hết các thử nghiệm các mẫu cao chiết Nhân sâm hoặc các ginsenosid, mẫu thử đều được thêm vào thời gian 2 h trước khi tế bào tiếp xúc với cisplatin 8,11

Việc sử dụng NAC làm chứng dương giúp xác định được nồng độ cisplatin phù hợp và tỷ lệ tế bào sống bị giảm tương ứng với nồng độ này vẫn có thể phục hồi được bằng NAC ở liều 500 àM và 1000 àM Kết quả cho thấy, ở nồng độ cisplatin

20 àM, NAC vẫn cú khả năng làm phục hồi tỷ lệ tế bào sống bị giảm do cisplatin với tỏc dụng phụ thuộc nồng độ Tuy nhiờn, khi tăng nồng độ cisplatin lờn từ 30 àM, tỏc dụng phục hồi của NAC chỉ cũn thể hiện ở liều 1.000 àM và khi tăng liều cisplatin lờn 50 àM, tỏc dụng bảo vệ của NAC bị mất hoàn toàn dự ở liều rất cao (1.000 àM)

Vì vậy, việc sử dụng chứng dương đóng vai trò quan trọng, giúp xác định liều cisplatin phù hợp để có thể đánh giá được khả năng phục hồi tế bào thận của các cao chiết và các hợp chất phân lập được

4.2.1.4 Vai trò của DMSO trong thử nghiệm cisplatin

Dimethyl sulfoxid (DMSO) là dung môi được sử dụng phổ biến trong các thử nghiệm in vitro nhằm tăng cường độ tan của các hợp chất thử nghiệm, đặc biệt là các chất kém phân cực khó tan trong môi trường nuôi cấy tế bào Vì vậy DMSO thường được dùng để pha các dung dịch mẹ với nồng độ cao (đến 100 mmol/l)

Tuy nhiên, DMSO lại chứa nhóm sulfur có tính ái nhân cao và có thể tương tác với gốc platin trong cisplatin và thay đổi cấu trúc của cisplatin 134 Điều này làm cho cisplatin trở nên mất ổn định trong môi trường chứa DMSO Matthew D Hall và cộng sự (2014) đã nghiên cứu và cho thấy cisplatin nói riêng và các hợp chất chống ung thư có gốc platin nói chung đều bị giảm đáng kể hoạt tính trong môi trường DMSO 104

Nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm Việt Nam theo hướng sàng lọc các hợp chất có tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vitro

4.3.1 Quá trình phân lập định hướng tác dụng sinh học

Mô hình thử nghiệm in vitro được áp dụng hiệu quả vào việc phân lập định hướng tác dụng sinh học Cụ thể, cao chiết Sâm Việt Nam chế biến qua các thời điểm được đánh giá bằng thử nghiệm in vitro để lựa chọn được thời gian chế biến phù hợp Dịch chiết Sâm Việt Nam ở điều kiện cho tác dụng bảo vệ thận mạnh nhất tiếp tục được tách thành các phân đoạn có độ phân cực tăng dần dựa vào độ tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau Các phân đoạn này được đánh giá tác dụng bảo vệ thận và phân đoạn diethyl ether và ethyl acetat cho tác dụng mạnh nhất tiếp tục được lựa chọn cho các bước phân lập tiếp theo Kết quả cuối cùng của quá trình này là các hợp chất đều có tác dụng bảo vệ thận và được xác nhận thông qua thử nghiệm tế bào Việc phân lập định hướng tác dụng sinh học này giúp tiết kiệm thời gian, công sức cũng như dung môi hóa chất Điều này khác với phương pháp phân lập cổ điển không định hướng có thể thu được hàng loạt chất tinh khiết nhưng chỉ một tỷ lệ nhỏ các chất thu được có tác dụng sinh học Điều này làm lãng phí thời gian, công sức, đặc biệt là một lượng lớn dung môi hữu cơ thải ra làm ô nhiễm môi trường

Trong nghiên cứu này, các hợp chất có tác dụng phân lập được thuộc nhiều loại hợp chất có độ phân cực khác nhau bao gồm panaxynol là một polyacetylen từ phân đoạn rất kém phân cực, ocotillol genin là một aglycon kém phân cực của các saponin khung ocotillol đặc trưng của Sâm Việt Nam và một số ginsenosid kém phân cực ở dạng glycosid như 20(S) và 20(R)-G-Rh2, 20(S) và 20(R)-G-Rg3, G-Rk1 và G-

Panaxynol là một hợp chất kém phân cực thuộc nhóm polyacetylen Mặc dù hợp chất này rất kém phân cực nhưng với dược liệu có độ mịn dưới 1 mm và chiết nhiều lần bằng phương pháp siêu âm với dung môi MeOH, panaxynol vẫn có thể chiết được Tuy nhiên, trong các nghiên cứu sau này cần thu được phân đoạn giàu panaxynol để thử nghiệm sinh học hoặc sản xuất thuốc, việc chiết xuất bằng các dung môi kém phân cực như n-hexan, diethyl ether cần được cân nhắc áp dụng Tuy nhiên, việc chiết bằng dung môi hữu cơ cần lưu ý việc loại bỏ hoàn toàn các dung môi này ra khỏi bán thành phẩm để tránh gây hại cho sức khỏe người dùng Ngoài ra, panaxynol là hợp chất có nhiều liên kết ba trong phân tử nên dễ bị oxy hóa dưới tác tác nhân của môi trường Vì vậy, trong quá trình phân lập, việc giữ cho hợp chất này không bị phân hủy cần được chú ý bao gồm tránh sự tiếp xúc của phân đoạn này với ánh sáng bằng cách che chắn cột bằng giấy bạc Việc cô loại dung môi phân đoạn giàu polyacethylen cũng cần được thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh sự phân hủy, ảnh hưởng đến độ tinh khiết của hợp chất dẫn đến việc đánh giá không đúng RC50 của hợp chất này Hợp chất panaxynol rất kém phân cực nên không bị lưu giữ mạnh trên pha tĩnh silica gel, vì vậy có thể được phân lập và tinh chế chỉ bằng sắc ký cột cổ điển pha thuận Việc phân lập và tinh chế panaxynol không sử dụng sắc ký pha đảo do đây là hợp chất rất kém phân cực, có thể lưu giữ mạnh trên pha tĩnh và có thể làm thất thoát hợp chất này vốn rất ít trong Sâm Việt Nam Nghiên cứu cũng đi sâu phân tích cơ chế bảo vệ thận của panaxynol theo con đường chết theo chu trình (apoptosis) Thử nghiệm Dòng chảy tế bào (Flow-cytometry) với chất đánh dấu annexin V liên hợp với Alexa Fluor 488 và kết quả cho thấy panaxynol ở liều thấp có thể giảm đáng kể quá trình apoptosis trong tế bào Về mặt cơ chế, cisplatin kích hoạt quá trình apoptosis bằng cách kích hoạt quá trình phosphoryl hóa các protein JNK, p38 và tăng sự biểu hiện caspase-3 bị phân cắt Vì vậy, đây là các protein được quan tâm khi nghiên cứu cơ chế bảo vệ thận chống lại độc tính của cisplatin Trong thử nghiệm Western Blot, panaxynol cho thấy có khả năng ức chế quá trình phosphoryl hóa protetin JNK, p38 cũng như giảm sự biểu hiện của caspase-3 bị phân cắt Nhờ vậy, panaxynol có thể ức chế quá trình apoptosis trên tế bào LLC-PK1 gây ra bởi cisplatin

Ocotillol genin Ginsenosid Rk3 Ginsenosid Rh4

Ocotillol genin là phần aglycon của các saponin khung ocotillol như majonosid-R2 (M-R2), vina-ginsenosid-R2 (V-R2) sau khi bị thủy phân nhóm đường ở vị trí C6 Hợp chất này tương đối kém phân cực do không còn nhóm đường trong phân tử nên được tìm thấy ở phân đoạn diethyl ether Hợp chất này có đặc trưng là vòng epoxy gắn vào vị trí C-20 và được xem là dẫn xuất của khung protopanaxatriol do sự đóng vòng của chuỗi carbon tại vị trí C-20 này Trong các nghiên cứu trước đây của Baek Seung Hoon vào năm 2006 và 2017, hai ginsenosid khung protopanaxatriol kém phân cực đặc trưng của Sun Ginseng là G-Rk3 và G-Rh4 thể hiện tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vitro và in vivo 9,10 Do sự tương đồng giữa ocotillol genin và G-Rk3 và G-Rh4 nên phần nào giải thích được tác dụng bảo vệ thận của ocotillol genin phân lập được từ Sâm Việt Nam chế biến Đây cũng là lần đầu tiên một saponin khung ocotillol được công bố và có tác dụng bảo vệ thận bên cạnh các ginsenosid khung protopanaxadiol 8,11 và protopanaxatriol 9,10 đặc trưng cho Nhân sâm Ocotillol genin có thể được xem là một trong các saponin khung ocotillol đặc trưng cho Sâm Việt Nam chế biến và là điểm khác biệt rõ rệt giữa Sâm Việt Nam chế biến và Sun Ginseng Việc ocotillol genin được chứng minh có tác dụng bảo vệ thận phần nào giải thích được việc tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam chế biến cao hơn hẳn so với Sun Ginseng Mặc dù ocotillol thể hiện tác dụng bảo vệ thận, các glycosid của saponin này là V-R2, M-R2, pseudo-ginsenosid-RT4 lại không thể hiện tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vitro Bên cạnh đó, pseudo-ginsenosid F11 cũng là một saponin ginsenosid chỉ được công bố tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vivo Điều này có thể giải thích do các saponin này có thể được thủy phân bằng hệ vi khuẩn đường ruột để thu được ocotillol genin nên chỉ thể hiện tác dụng bảo vệ thận trên cơ thể chuột Giả thiết này được khẳng định bởi nghiên cứu của Jin-Ju Jeong, et al (2015) 126 về sự biến đổi của các saponin glycosid khung OT trong Sâm Việt Nam bằng hệ vi khuẩn đường ruột của người Nghiên cứu này cũng bổ sung thêm một tác dụng khác cho các saponin khung OT bên cạnh tác dụng chống stress, chống khối u, bảo vệ gan và kháng viêm đã được công bố trước đây36,37,126,137 Điều này cũng gợi ý việc nghiên cứu bào chế ocotillol genin bằng các tác nhân nhiệt độ hoặc hóa học để có thể thu được lượng lớn hợp chất này để dùng làm nguyên liệu để sản xuất thuốc Nghiên cứu của Takao Konoshima, et al (1998) 125 cho thấy M-R2 là dạng glycosid của ocotillol genin thể hiện tác dụng chống khối u mạnh 125,138 Điều này gợi ý việc kết hợp sử dụng ocotillol genin và cisplatin trên bệnh nhân ung thư nhằm tăng cường hiệu quả điều trị ung thư cũng như giảm thiểu độc tính của cisplatin trên thận Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu về tác dụng kháng ung thư của ocotillol genin cũng như tác dụng đồng vận của hợp chất này với cisplatin trên tế bào ung thư

20(R)-G-Rh2 -CH3 -OH 20(S)-G-Rh2 -OH -CH3

Ginsenosid-Rh2 là một ginsenosid hiếm tồn tại ở hai dạng đồng phân là S và R ở vị trí C-20 G-Rh2 là sản phẩm của quá trình thủy phân hoàn toàn nhóm đường ở vị trí C-20 và một nhóm đường ở vị trí C-3 của các ginsenosid khung protopanaxadiol như G-Rb1 và G-Rd Khác với chuỗi đường ở vị trí C-20 rất dễ thủy phân, nhóm đường ở vị trí C-3 rất khó bị thủy phân do tác nhân nhiệt độ Các nghiên cứu trước đây cho thấy G-Rh2 chủ yếu thu được do tác nhân acid hoặc vi khuẩn đường ruột 139 Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên G-Rh2 được phát hiện và phân lập từ Sâm Việt Nam chế biến sử dụng tác nhân nhiệt độ mặc dù ginsenosid này tồn tại chỉ ở dạng vết với thu suất rất thấp (0,08 %), chỉ được phát hiện và phân lập khi làm giàu phân đoạn

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. ethyl acetat của Sâm Việt Nam chế biến G-Rh2 được công bố có tác dụng chống ung thư mạnh thông qua các cơ chế gây chết theo chu trình, dừng dòng đời tế bào, chống di căn 140 Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Hongbo Wang, et al (2012) 141 , G-Rh2 được công bố có tác dụng bảo vệ tế bào tim do độc tính của doxorubicin thông qua cơ chế làm giảm các gốc tự do dẫn đến stress oxy hóa trong tế bào cơ tim gây ra bởi tác nhân gây độc 141 Trong nghiên cứu này, G-Rh2 ở cả dạng S và R đều làm giảm độc tính của cisplatin trên tế bào thận LLC-PK1 Một trong các cơ chế gây độc thận của cisplatin là sản sinh ra các gốc tự do dẫn đến stress oxy hóa nội bào dẫn đến chết tế bào Từ nghiên cứu của Hongbo Wang, et al (2012) 141 có thể gợi ý cơ chế bảo vệ thận của G-Rh2 cũng có thể dựa trên con đường giảm stress oxy hóa tế bào gây ra bởi cisplatin Ngoài ra, tác dụng chống ung thư mạnh của G-Rh2 cũng có thể gợi ý việc sử dụng hợp chất này cùng cisplatin nhằm tạo ra tác dụng đồng vận, tăng cường khả năng chống lại khối u, giảm liều của cisplatin nhằm giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc này, đồng thời có tác dụng bảo vệ thận khỏi các độc tính của cisplatin

20(R)-G-Rg3 -CH3 -OH 20(S)-G-Rg3 -OH -CH3

Trong nghiên cứu trước đây của Jun Yeon Park, et al (2015) 11 , tác dụng bảo vệ thận của các ginsenosid từ Nhân sâm chế biến được đánh giá trên hỗn hợp của hai đồng phân là G-Rk1 + G-Rg5 và 20(S)-G-Rg3 + 20(R)-G-Rg3 mà chưa đánh giá tác dụng riêng lẻ của từng hợp chất đồng phân 20(S)-G-Rg3 và 20(R)-G-Rg3 là hai đồng phân quang học, trong đó 20(R)-G-Rg3 lại không tan trong methanol trong khi đồng phân dạng S của ginsenosid này lại tan tốt trong methanol Dựa vào sự khác biệt về độ tan này, nghiên cứu có thể tinh chế 20(R)-G-Rg3 một cách dễ dàng bằng cách phân tán phân đoạn giàu hỗn hợp hai đồng phân của ginsenosid này trong methanol Dịch phân tán được ly tâm thu lấy cắn giàu đồng phân dạng R, trong khi dạng S lại tan trong dịch nổi Phần cắn được rửa nhiều lần với methanol sẽ thu được hợp chất này tinh khiết Phần dịch nổi và dịch rửa sẽ được gộp chung và tinh chế bằng sắc ký lỏng bán điều chế để thu được 20(S)-G-Rg3 tinh khiết G-Rk1 và G-Rg5 là hai đồng phân hình học vốn rất khó thu được từng hợp chất tinh khiết chỉ với sắc ký cột pha thuận Tuy nhiên, hai đồng phân này tách nhau trên sắc ký pha đảo C18 và điều này được quan sát trên sắc ký đồ HPLC-QToF-MS (Hình 3.13) Vì vậy, trong nghiên cứu này, sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế pha đảo C18 được sử dụng để có thể tách riêng rẽ các đồng phân này và mỗi đồng phân được đánh giá tác dụng riêng biệt Nhờ đó nghiên cứu phát hiện được sự khác biệt lớn về tác dụng bảo vệ thận của hai đồng phân này (Hình 3.38)

4.3.2 Sự liên quan cấu trúc và tác dụng bảo vệ thận của các hợp chất phân lập

4.3.2.1 Liên quan cấu trúc – tác dụng của các hợp chất polyacetylen

Panaxynol thuộc nhóm polyacetylen có cấu trúc khác biệt nhất với các hợp chất còn lại có cấu trúc saponin Đây là hợp chất có nhiều liên kết ba trong phân tử nên dễ dàng bị oxy hóa và có khả năng chống oxy hóa mạnh Trong nghiên cứu này, panaxynol cho thấy khả năng phục hồi đáng kể số lượng tế bào thận bị giảm do độc tính của cisplatin Một trong các cơ chế gây chết tế bào thận của cisplatin là gây stress oxy hóa thông qua việc sản sinh các gốc tự do Vì vậy, panaxynol với khả năng chống oxy hóa mạnh có khả năng “dập tắt” các gốc tự do do cisplatin tạo ra, cải thiện tình trạng stress oxy hóa nội bào

4.3.2.2 Liên quan cấu trúc – tác dụng của các hợp chất saponin

Ngoại trừ ocotillol genin, tất cả các hợp chất saponin phân lập được có tác dụng bảo vệ thận đều là khung hợp chất protopanaxadiol Zai-Qun Liu, et al (2003) 142

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. đã nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất khung PPT và PPD trên mô hình ly giải hồng cầu người do gốc tự do tạo ra do 2,2’-azobis(2-amidinopropane hydrochlorid (AAPH) Kết quả cho thấy các ginsenosid khung PPD là các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ hồng cầu không bị ly giải do gốc tự do Trong khi đó, PPT lại là các chất gây oxy hóa làm gia tăng quá trình ly giải hồng cầu Điều này có thể gợi ý việc các ginsenosid khung PPD có tác dụng bảo vệ thận thông qua cơ chế chống lại các gốc tự do gây stress oxy hóa tế bào thận do cisplatin tạo ra Sự khác biệt trong việc PPD là tác nhân chống oxy hóa trong khi PPT lại là tác nhân gây oxy hóa cũng có thể giải thích tại sao hầu hết các ginsenosid phân lập được trong nghiên cứu này thuộc về khung PPD mà không có ginsenosid nào thuộc khung PPT Nghiên cứu của Myoung-Sik Han, et al (2016) 118 cho thấy hợp chất 20(S)-G-Rg3 có tác dụng bảo vệ thận chống lại độc tính của cisplatin thông qua việc ức chế sự tổng hợp protein caspase-3 bị phân cắt cũng như như quá trình phosphoryl hóa các protein JNK và p53 kích hoạt quá trình apoptosis trong tế bào Điều này gợi ý rằng bên cạnh cơ chế chống oxy hóa, cơ chế bảo vệ thận của các ginsenosid khung PPD có thể còn thông qua việc ức chế các protein tín hiệu của quá trình apoptosis

Khi so sánh về hoạt lực bảo vệ thận của các ginsenosid thông qua RC50, kết quả cho thấy cùng một loại cấu dạng, ginsenosid có chuỗi đường ngắn hơn có RC50 thấp hơn ginsenosid có chuỗi đường dài hơn Ở cùng cấu dạng S, G-Rg3 có RC50 là 88,4 àM, cao gấp 1,9 lần so với G-Rh2 (46,15 àM) Tương tự, ở cấu dạng R, G-Rg3 cú RC50 là 8,39 àM cao hơn 1,2 lần so với G-Rh2 là 6,67 àM Trong khi đú, cỏc ginsenosid phân cực khung PPD có nhiều nhóm đường hơn như G-Rb1, G-Rd lại hoàn toàn không thể hiện tác dụng Điều này cũng được quan sát thấy ở các saponin khung ocotillol Cụ thể, trong nghiên cứu này, các saponin ở dạng glycosid với chuỗi đường gồm 1-2 nhóm đường ở vị trí C6 như vina-ginsenosid-R2, majonosid-R2, pseudo- ginsenosid-RT4 lại hoàn toàn không thể hiện tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vitro Trong khi đó, ocotillol genin là phần aglycon của các saponin kể trên lại thể hiện tác dụng bảo vệ thận Vì vậy có thể sơ bộ khẳng định trong số các hợp chất saponin thể hiện tác dụng bảo vệ thận, các saponin có chuỗi đường càng ngắn thì tác dụng bảo vệ thận càng mạnh Điều này có thể phần nào giải thích do các saponin càng có ít chuỗi đường thì kích thước phân tử càng nhỏ hơn, có thể dễ dàng đi qua màng tế bào và thể hiện tác dụng mạnh hơn

Như đã đề cập ở trên, các nghiên cứu trước đây đều đánh giá tác dụng bảo vệ thận của hỗn hợp hai đồng phân của các ginsenosid 11 hoặc đồng phân dạng S của ginsenosid-Rg3 118 Trong nghiên cứu này, tác dụng bảo vệ thận của từng đồng phân riêng lẻ được khảo sát Kết quả cho thấy đồng phân dạng R mạnh hơn đồng phân dạng

S từ 7-10 lần Cụ thể, đối với G-Rh2, RC50 của dạng S và R lần lượt là 46,15 àM và 6,67 àM Đối với G-Rg3, RC50 của dạng S là 88,4 àM và của dạng R là 8,39 àM Điều này cho thấy sự khác biệt về cấu hình của vị trí C-20 ảnh hưởng lớn đến tác dụng bảo vệ thận của các ginsenosid này Nghiên cứu của Xiaojie Wei, et al (2012) 143 tác dụng của hai dạng cấu hình S và R của G-Rg3 trên độc tính do stress oxy hóa do cyclophosphamid cho thấy tác dụng chống oxy hóa của dạng R cao hơn hẳn so với dạng S Nghiên cứu của Woo-Yong Choi, et al (2012) 144 cũng cho thấy đồng phân 20(R) thể hiện tác dụng chống viêm và chống oxy hóa trên mô hình in vitro 144 Các kết quả nghiên cứu trên phần nào giải thích được sự khác biệt về tác dụng bảo vệ thận của đồng phân dạng S và R của G-Rg3 và G-Rh2 Đặc biệt việc phân lập 20(R)-G-Rg3 tương đối dễ dàng do hợp chất này có độ tan đặc biệt, rất kém tan trong methanol so với đồng phân dạng S Điều này cho phép phân lập hợp chất này ở số lượng lớn để có thể sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc có tác dụng bảo vệ thận để sử dụng ở bệnh nhân ung thư đang điều trị bằng cisplatin Tuy nhiên, việc cải thiện độ tan và sinh khả dụng của 20(R)-G-Rg3 là vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

So với G-Rg3 và G-Rh2 là các ginsenosid có nhóm OH ở vị trí C-20, G-Rk1 và G-Rg5 là hai ginsenosid bị khử nước ở vị trí C-20 có tác dụng bảo vệ thận kém hơn hẳn G-Rk1 cú RC50 là 62,69 àM, gần tương đương với 20(S)-G-Rg3 trong khi G-Rg5 lại cú RC50 là 180,83 àM gấp 2 lần so với 20(S)-G-Rg3 Điều này cho thấy sự hiện diện của nhóm OH ở vị trí C-20 có vai trò quan trọng trong tác dụng bảo vệ thận Nghiên cứu của Byung-Hwan Lee, et al (2007) 145 cho thấy OH ở vị trí C-20 của G-

Rg3 có vai trò nhất định trên các kênh của màng tế bào, ảnh hưởng đến quá trình hấp

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. thu thuốc Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn về sự liên quan cấu trúc – tác dụng cần được tiến hành để đánh giá vai trò của OH ở vị trí C-20 trong sự khác biệt về tác dụng bảo vệ thận của các ginsenosid.

Đánh giá tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vivo

4.4.1 Tác dụng bảo vệ thận của panaxynol trên mô hình in vivo sử dụng cisplatin làm tác nhân gây độc

Trên mô hình in vivo, BUN và creatin huyết được xem là các chất đánh dấu sinh học phản ánh chức năng thận và tăng lên trong tình trạng suy thận Trên cơ thể động vật sống như người cũng như chuột, cisplatin thể hiện độc tính trên ống thận, cầu thận và hệ thống mạch máu thận dẫn đến tăng BUN và creatinin huyết Ngoài ra, cisplatin còn làm tăng phản ứng viêm trên thận thông qua việc tăng các yếu tố TNF- α, IL-6, MCP-1 và COX-2 Đây là các chỉ dấu để đánh giá cơ chế gây suy thận cũng như tác dụng bảo vệ thận của các thuốc

Trên nhóm chuột được dùng panaxynol cùng với cisplatin, nồng độ BUN và creatinin huyết giảm rõ rệt so với nhóm không dùng panaxynol Điều này cho thấy panaxynol có khả năng cải thiện rõ rệt chức năng thận của cơ thể sống bị giảm do độc tính của cisplatin Về thử nghiệm cơ chế, panaxynol cũng làm giảm quá trình viêm dựa trên việc giảm biểu hiện của COX-2 mRNA và MCP-1 mRNA Các kết quả trên cho thấy từ kết quả in vitro thể hiện tác dụng bảo vệ thận, panaxynol cũng thể hiện tác dụng bảo vệ thận trên mô hình in vivo là cơ thể sống vốn có nhiều tương tác phức tạp giữa các loại mô và cơ quan khác nhau Điều này trước hết cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa mô hình in vitro và mô hình in vivo, cho thấy mô hình in vitro xây dựng là tin cậy để sàng lọc các hợp chất có tác dụng bảo vệ thận từ Sâm Việt Nam nói riêng và các thuốc từ tự nhiên nói chung Việc nghiên cứu sâu về cơ chế bảo vệ thận của panaxynol này khẳng định mạnh mẽ tác dụng bảo vệ thận của hợp chất này, cho thấy hợp chất này có tiềm năng cao để phát triển thuốc có tác dụng bảo vệ thận Ngoài ra, nhiều nghiên cứu chứng minh panaxynol có độc tính cao và thể hiện tác dụng chống phân bào mạnh trên tế bào ung thư 146,147 Điều này gợi ý việc sử dụng panaxynol cùng với cisplatin có thể có tác dụng đồng vận giúp tăng cường tác dụng chống ung thư, đồng thời hạn chế được tác dụng phụ trên thận, cải thiện hiệu quả điều trị cũng như chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư Tuy nhiên để có thể sử dụng panaxynol làm nguyên liệu làm thuốc vẫn còn nhiều rào cản Vấn đề đầu tiên là độ ổn định, panaxynol là hợp chất có nhiều liên kết ba trong phân tử nên rất dễ bị oxy hóa bởi oxy môi trường và ánh sáng Vấn đề thứ hai là độ tan do panaxynol là hợp chất rất kém phân cực và rất khó tan trong nước Vì vậy, cần có những phương pháp thích hợp để cải thiện độ tan của hợp chất này trong dịch sinh học, tăng cường sự hấp thu và sinh khả dụng của hợp chất này trong cơ thể Ngoài ra, việc sử dụng panaxynol ở liều cao cũng thể hiện độc tính trên tế bào thận trên mô hình in vitro, vì vậy, cần có những nghiên cứu thêm để tối ưu hóa liều dùng của hợp chất này, giúp sử dụng hợp chất này một cách an toàn và hiệu quả

4.4.2 Tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam chế biến trên mô hình in vivo sử dụng cyclosporin A làm tác nhân gây độc

Cyclosporin A là một thuốc ức chế miễn dịch được sử dụng để điều trị các bệnh tự miễn cũng như chống thải ghép trong phẫu thuật ghép tạng Tuy nhiên, tương tự như cisplatin, độc tính trên thận cũng là một trong những tác dụng phụ nghiêm trọng hạn chế việc sử dụng tác nhân này trong điều trị Mặc dù cơ chế gây độc thận của cyclosporin A chưa được hiểu rõ hoàn toàn, nhưng stress oxy hóa là một trong các nguyên nhân chính gây ra độc tính trên thận của cyclosporin A 148 Trong nghiên cứu này, bên cạnh việc đánh giá tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam chế biến trên với tác nhân cisplatin gây độc thận, chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu tác dụng bảo vệ thận của dược liệu này với tác nhân cyclosporin A

Trong nghiên cứu này, chứng dương được dùng vẫn là N-acetylcystein trên chủng chuột Swiss albino nhưng với liều 100 mg/kg, khác với trong nghiên cứu tác dụng bảo vệ thận của panaxynol chống lại độc tính của cisplatin Liều này được thăm dò tham khảo từ nghiên cứu của M Tariq, et al (1999) 149 và Mehmet Duru, et al

(2008) 150 cùng với sự thăm dò liều của nhóm nghiên cứu NAC là một thiol và là tiền

Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. chất của L-cyctein và GSH Việc cho chuột dùng NAC giúp làm tăng lượng GSH giúp giảm hàm lượng ROS cũng như những tác nhân oxy hóa khác vốn tăng lên do độc tính của cyclosporin A Vì vậy NAC được dùng như một chứng dương cho nghiên cứu này

Trong nghiên cứu này, dịch chiết Sâm Việt Nam chế biến ở 105 °C trong vòng

8 h được dùng do có những ưu điểm trên thực tế hơn so với Sâm Việt Nam chế biến ở 120 °C trong 8 h Nghiên cứu của Le Thi Hong Van, et al (2015) 20 cho thấy có sự tương đồng về thành phần hóa học của dịch chiết Sâm Việt Nam chế biến ở điều kiện

105 °C trong 8 h và 120 °C trong 10 h với sự xuất hiện của các ginsenosid kém phân cực như G-Rg3, G-Rk3, G-Rh4, G-Rk1 và G-Rg5 Nghiên cứu của Cho Rong Hwang, et al (2014) 151 cho thấy quá trình hấp Nhân sâm ở nhiệt độ cao làm tăng hàm lượng các ginsenosid kém phân cực 20(R)-G-Rg3, G-Rk3, G-Rh4, G-Rk1 và G-Rg5 cùng với sự tăng khả năng đánh bắt gốc tự do Điều này có thể giải thích phần nào khả năng bảo vệ thận của dịch chiết Sâm Việt Nam chế biến ở 105 °C trong 8 h Thật vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy bên cạnh việc phục hồi chức năng thận thông qua các chỉ số BUN và creatinin huyết tương, cả dịch chiết Sâm Việt Nam chế biến và chứng dương NAC đều làm giảm hàm lượng MDA và tăng hàm lượng GSH trong dịch đồng thể tế bào thận GSH và MDA là những chất đánh dấu nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hóa của tế bào động vật và cyclosporin A làm tăng đáng kể hàm lượng MDA và giảm mạnh hàm lượng GSH trong tế bào thận

Tuy nhiên do điều kiện nghiên cứu giới hạn về thời gian và thiết bị, chúng tôi chưa đánh giá được việc xuất hiện của ocotillol genin trong dịch chiết Sâm Việt Nam ở điều kiện này để xác định được vai trò của hợp chất này trong tác dụng bảo vệ thận trước độc tính của cyclosporin A Tuy nhiên, việc phát hiện và định lượng ocotillol genin trong Sâm Việt Nam chế biến gặp khó khăn do đây cũng là một hợp chất không có liên kết đôi trong phân tử, đáp ứng kém với đầu dò UV mặc dù ở bước sóng rất thấp Vì vậy, để tiến hành nghiên cứu sự tạo thành ocotillol genin qua quá trình chế biến đòi hỏi việc trang bị các đầu dò vạn năng như ELSD, CAD hoặc MS

Trên thực tế, Sâm Việt Nam chế biến ở điều kiện 105 °C khả thi trong điều kiện chế biến quy mô lớn do có thể thực hiện ở áp suất khí quyển Trong khi đó, việc chế biến ở 120 °C với áp suất cao cần các thiết bị chuyên dụng để đảm bảo an toàn, nhất là ở quy mô lớn Vì vậy, hiện nay trên thị trường thế giới, chỉ mới có sản phẩm Thái dương sâm (Sun Ginseng) được chế biến ở nhiệt độ và áp suất cao được thương mại hóa 9,10

TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Nghiên cứu đã khảo sát sự phát triển về sinh khối và tích lũy saponin trong Sâm Việt Nam trồng tại Trà Linh bằng phương pháp HPLC-ELSD và kết quả cho thấy Sâm Việt Nam sau 5 năm trồng đạt sinh khối và hàm lượng saponin cao nhất và có thể được xem là thời điểm tối ưu để thu hoạch

2 Đề tài đã khảo sát và tối ưu các thông số cho phương pháp in vitro sử dụng dòng tế bào LLC-PK1 và tác nhân cisplatin gây độc thận để đánh giá tác dụng bảo vệ thận Từ điều kiện này, chúng tôi đã khảo sát và cho thấy quá trình hấp ở 120 °C với thời gian hấp 12 h cho tác dụng bảo vệ thận cao nhất Từ Sâm Việt Nam chế biến, đã phân lập được 8 hợp chất có tác dụng bảo vệ thận bao gồm panaxynol, ocotillol genin, 20(S)-ginsenosid-Rh2, 20(R)-ginsenosid-Rh2, 20(S)-ginsenosid-Rg3, 20(R)-ginsenosid-Rg3, ginsenosid-Rk1 và ginsenosid-

Rg5 Đây là lần đầu tiên ginsenosid-Rh2 được phân lập từ Sâm Việt Nam chế biến Đây cũng là lần đầu tiên một saponin thuộc khung ocotillol là ocotillol genin được công bố có tác dụng bảo vệ thận Tác dụng bảo vệ thận của các hợp chất saponin đã phân lập được so sánh và kết quả cho thấy saponin khung protopanaxadiol cho tác dụng mạnh nhất Đề tài đã phát hiện ginsenosid càng có ít nhóm đường càng cho tác dụng bảo vệ thận mạnh, đồng phân dạng R cho tác dụng mạnh hơn dạng S

3 Tác dụng bảo vệ thận của panaxynol đã được chứng minh trên mô hình in vitro và cho thấy cơ chế của quá trình này thông qua việc giảm quá trình apoptosis cũng như giảm quá trình viêm của tế bào thận gây ra bởi cisplatin Tác dụng bảo vệ thận của Sâm Việt Nam chế biến cũng đã được chứng minh trên mô hình in vivo với tác nhân gây độc là cyclosporin A bên cạnh tác nhân cisplatin.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Sâm Việt Nam (Panax Vietnamensis, Araliaceae) Theo Hướng Tác Động Bảo Vệ Thận
Tác giả	Vũ Huỳnh Kim Long
Người hướng dẫn	GS. TS. Nguyễn Minh Đức
Trường học	Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Dược Học Cổ Truyền
Thể loại	Luận Án Tiến Sĩ Dược Học
Năm xuất bản	2023
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	267
Dung lượng	10,38 MB